一種硫代異鼠李糖基二酰甘油酯的用途的制作方法

本發(fā)明涉及一種甘油酯類化合物的醫(yī)藥用途，特別涉及一種硫代異鼠李糖基二酰甘油酯在止血藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：臨床上常見的止血方法有手術(shù)、壓迫止血、藥物止血等，其中以藥物止血方法最為常見。止血藥或凝血藥可通過加速血液凝固過程或者阻止纖維蛋白溶解作用而起到止血效果（參見魏偉等，“藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)”，人民衛(wèi)生出版社，第四版，第1075-1076頁），常用的局部止血藥物包括凝血酶、血凝酶、纖維素、明膠、甲殼素等。除此之外止血中藥、復(fù)方制劑，如云南白藥、婦人膠囊、槐花口服液等，也常用于咯血、婦科出血以及痔瘡出血等病癥（參見何希瑞等，“常用止血中藥及其止血機(jī)制研究進(jìn)展”，中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010年，第15期，第217-221頁）。然而復(fù)方藥物成分復(fù)雜，作用機(jī)制不明確，毒副作用大。硫代異鼠李糖基二酰甘油酯（sulfoquinovosyldiacylglycerols，sqdgs），即1,2-二?；?3-o-(6′-硫代-α-d-脫氧吡喃葡萄糖基)甘油，是光合膜上唯一在生理狀況下帶負(fù)電荷的糖脂，存在于所有的光合植物、海藻、藍(lán)細(xì)菌、紫色硫細(xì)菌以及非硫細(xì)菌的類囊體膜中。生物活性研究顯示，硫代異鼠李糖基二酰甘油酯具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、抗白血病等多種生物活性（參見maciele等，“bioprospectingofmarinemacrophytesusingms-basedlipidomicsasanewapproach”,marinedrugs.2016,14(3):49；蔣志國等，“甘油糖脂生物活性最新研究進(jìn)展”，中國糧油學(xué)報(bào)，2009年，第9期，第163-168頁；jainck等，“sulfonoquinovosyldiacylglycerideselectivelytargetsacutelymphoblasticleukemiacellsandexertspotentanti-leukemiceffectsinvivo”,scientificreports,2015,5.）。目前，未見有對硫代異鼠李糖基二酰甘油酯在制備止血藥物的應(yīng)用研究報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種具有如式所示結(jié)構(gòu)的硫代異鼠李糖基二酰甘油酯化合物用于制備止血藥物的應(yīng)用。i式i中的r1或r2代表?；?，所述酰基片段為含1-30個(gè)碳原子的直鏈或支鏈脂肪酸；且酰基片段中含0-15個(gè)順式或反式雙鍵。優(yōu)選地，式i中的r1或r2代表?；?，所述?；螢楹?2-24個(gè)碳原子的直鏈脂肪酸；且?；沃泻?-5個(gè)順式雙鍵。特別的，如式所示結(jié)構(gòu)的化合物用于制備治療出血相關(guān)疾病，如創(chuàng)傷及外科手術(shù)出血；咯血、婦科出血、痔瘡出血以及治療單純血管因素所致表面局部出血、鼻出血、牙齦出血；衄血的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種藥物組合物，其含有如式所示結(jié)構(gòu)的硫代異鼠李糖基二酰甘油酯化合物作為止血藥物，以及藥學(xué)上可接受的載體。在本發(fā)明中，所述藥物組合物可以按照本領(lǐng)域熟知的方法配制，可以將活性成分與常規(guī)的賦型劑、調(diào)味劑、崩解劑、防腐劑、潤滑劑、濕潤劑、粘合劑、溶劑、增稠劑或增溶劑等藥物輔料混合，制成任何一種適合于臨床使用的劑型，如片劑、膠囊劑、顆粒劑、注射劑、口服液體制劑、巴布劑、無菌粉劑、貼劑等。優(yōu)選地，所述的藥物組合物含有1-99.9wt%的如式i所示的化合物。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種硫代異鼠李糖基二酰甘油酯提取物的制備方法，包括如下步驟：（1）以海藻為原料，加入5-15倍體積醇的水溶液，回流提取2-5次，合并提取液；（2）將所得提取液經(jīng)過濾、濃縮后，用有機(jī)溶劑萃取1-3次，合并有機(jī)層，減壓濃縮，干燥后得提取物。優(yōu)選地，以海藻為原料，加10-12倍體積含水的醇溶液，回流提取3次，合并提取液；所得液體經(jīng)過濾、濃縮后，用有機(jī)試劑萃取3次，合并有機(jī)層，減壓濃縮，干燥后得的萃取物；將萃取物通過硅膠柱層析梯度洗脫，再經(jīng)sephadexlh-20凝膠柱層析，洗脫得硫代異鼠李糖基二酰甘油酯。更選地，所述醇的水溶液為75%的乙醇水溶液；所述的有機(jī)溶劑為正丁醇。上述所制得的提取物中硫代異鼠李糖基二酰甘油酯含量為50%-99%，該提取物具有良好的止血活性，可用于制備止血藥物的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明的化合物止血效果好，作用機(jī)制明確，毒副作用小。原料來源廣泛，凡光合作用植物都含有本發(fā)明所述的硫代異鼠李糖基二酰甘油酯類成分。特別是海藻類原料，因能完成地球90%以上的光合作用，故sqdg含量極為豐富，且來源廣泛、價(jià)格便宜，如海帶、馬尾藻、羊棲菜、裙帶菜、鼠尾藻、石莼、滸苔、麒麟菜、螺旋藻等，沒有毒副作用，且提取工藝簡單。附圖說明圖1為硫代異鼠李糖基二酰甘油酯1h-nmr譜。圖2為硫代異鼠李糖基二酰甘油酯13c-nmr譜。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖并通過具體實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明，其目的在于幫助更好地理解本
發(fā)明內(nèi)容而非限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1：硫代異鼠李糖基二酰甘油酯的提取及分離取褐藻門馬尾藻科植物羊棲菜500g，置于反應(yīng)容器中，加入5000ml的75%乙醇，回流提取2h，重復(fù)3次。合并提取液，過濾、濃縮至無醇味。所得液體過濾濃縮后，經(jīng)正丁醇萃取3次，合并正丁醇層，濃縮蒸干，得正丁醇層萃取物。正丁醇層萃取物用二氯甲烷/甲醇溶解后，用200-300目硅膠h（青島海洋化工集團(tuán)公司產(chǎn)品）拌樣，減壓除去溶劑；用硅膠柱層析，以二氯甲烷-甲醇為溶劑進(jìn)行梯度洗脫，二氯甲烷-甲醇（v/v90:10）的洗脫物，再經(jīng)sephadexlh-20凝膠柱層析（二氯甲烷-甲醇1:1洗脫），洗脫得硫代異鼠李糖基二酰甘油酯。硫代異鼠李糖基二酰甘油酯為淡黃色固體。1h-nmr(500hz,cd3od，如圖1)峰形顯示出甘油糖脂類化合物的典型特征：δh4.52(1h,dd,j=12.0;2.5,h-1)，δh4.22(1h,dd,j=12.0;6.9,h-2)，δh5.35(4h,m,h-3a)，δh4.11(2h,m,overlapped,h-3b)為甘油骨架信號；δh4.79(1h,d,j=3.7,h-1′)，δh3.43(1h,dd,j=9.7,3.7,h-2′)，δh3.66(1h,t,j=9.3,h-3′)，δh3.12(1h,t,j=9.4,h-4′)，δh4.11(2h,m,overlapped,h-5′)，δh3.38(1h,dd,j=14.3,1.8,h-6′a)，δh2.96(1h,dd,j=14.3,9.0,h-6′b)為硫代異鼠李糖基信號；δh0.92的三重峰為脂肪?；糠种械哪┒思谆盘栔械哪┒思谆盘?，δh1.32寬單峰是脂肪酰基部分中眾多的亞甲基信號。13c-nmr(150mhz,cd3od，如圖2)給出了兩個(gè)羰基碳信號δc174.9(-co-)和δc175.1(-co-)，提示為二?；〈视?。與文獻(xiàn)比較糖基上的碳信號δc100.0(c-1′)，δc73.4(c-2′)，δc74.8(c-3′)，δc74.9(c-4′)，δc69.8(c-5′)，δc54.2(c-6′)，確定含硫代異鼠李糖。經(jīng)與文獻(xiàn)比對，確定為硫代異鼠李糖基二酰甘油酯。采用gc-ms法分析該樣品的脂肪?；M成情況，每種脂肪酸的相對含量以該脂肪酸色譜峰面積占總脂肪酸色譜峰面積的百分比表示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下。表1硫代異鼠李糖基二酰甘油酯混合物的脂肪?；M成情況脂肪酸種類相對含量/%c14:02.06c15:00.20c16:067.23c18:00.39c16:1n-72.02c18:1n-99.27c20:1n-94.39c22:1n-97.60c18:2n-61.15c18:3n-34.41c20:4n-60.43c20:5n-30.85總計(jì)100.00實(shí)施例2：體外凝血酶時(shí)間（tt）的測試精密稱取2.5mg實(shí)施例1中所制得的硫代異鼠李糖基二酰甘油酯，加入1ml生理鹽水，配成濃度為2.5mg/ml的樣品溶液。取綿羊血漿（鄭州九龍生物制品有限公司），加入樣品溶液，混勻即成待測血樣。使用tt試劑盒（南京建成生物工程研究所），按照sl-318型血凝儀（濟(jì)南森藍(lán)科貿(mào)有限公司）操作流程測定待測血樣凝固時(shí)間。實(shí)驗(yàn)前將tt試劑預(yù)先水浴加熱至37℃。取標(biāo)準(zhǔn)配制待測血樣50μl于血凝槽中，在37℃下孵育3min。計(jì)時(shí)槍加入100μltt試劑，混勻，開始計(jì)時(shí)，記錄血漿凝固時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)以生理鹽水為空白對照，每組測定平行3次。結(jié)果表明，空白對照組tt時(shí)間為12.52±0.26s，在100μg/ml濃度下硫代異鼠李糖基二酰甘油酯組的tt時(shí)間為7.46±0.56s。與空白對照組相比，100μg/ml的硫代異鼠李糖基二酰甘油酯可明顯縮短tt時(shí)間（p<0.001），縮短率為40.42%。以上實(shí)驗(yàn)證實(shí)，所制取的硫代異鼠李糖基二酰甘油酯是通過作用于凝血共同途徑過程從而發(fā)揮止血作用。實(shí)施例3：凝血時(shí)間的測定通過玻片法評價(jià)實(shí)施例1中所制得的硫代異鼠李糖基二酰甘油酯對小鼠凝血時(shí)間的影響。取昆明種雄性小鼠，隨機(jī)分組，每組8只，腹腔注射給藥30min后用毛細(xì)管左眼眶內(nèi)眥取血，迅速滴血于玻片上，立即開始計(jì)時(shí)。此后每隔30s用干燥針頭挑動血液一次，直至挑起細(xì)纖維血絲止，即為凝血時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)以生理鹽水為空白對照組，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用t-檢驗(yàn)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，50mg·kg-1濃度硫代異鼠李糖基二酰甘油酯，能明顯縮短小鼠凝血時(shí)間；與空白對照組相比縮短百分率為52.92%，且存在顯著性差異（p<0.05）。表2玻片法測定對小鼠凝血時(shí)間的影響組別劑量(mg·kg-1)凝血時(shí)間(min)縮短百分率(%)空白對照組-2.57±0.95-硫代異鼠李糖基二酰甘油酯組501.21±0.29*52.92%注：與生理鹽水組比較，*p<0.05。實(shí)施例4：出血時(shí)間的測定通過小鼠斷尾法實(shí)驗(yàn)評價(jià)實(shí)施例1中所制得的硫代異鼠李糖基二酰甘油酯對小鼠出血時(shí)間的影響。取昆明種雄性小鼠，隨機(jī)分組，每組8只，腹腔注射給藥，固定，以毫米尺測鼠尾長度并標(biāo)記之，給藥30min后以利剪將小鼠尾尖3mm處橫斷，待血液自行溢出開始計(jì)時(shí)，每隔30s用濾紙吸去血滴1次，直到血液自然停止為止，即為出血時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)以生理鹽水為空白對照組，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用t-檢驗(yàn)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，與空白對照組相比，硫代異鼠李糖基二酰甘油酯在50mg·kg-1濃度下能顯著縮短小鼠出血時(shí)間（p<0.05），縮短百分率為28.96%。表3小鼠斷尾法測定對出血時(shí)間的影響組別劑量(mg·kg-1)出血時(shí)間(min)縮短百分率(%)空白對照組-19.44±4.61-硫代異鼠李糖基二酰甘油酯組5013.81±1.33*28.96%注：與生理鹽水組比較，*p<0.05。實(shí)施例5：外用止血作用取雄性昆明種小鼠，隨機(jī)分組，每組8只。在距小鼠尾尖1.0cm處剪短。待血液自行溢出時(shí)，將實(shí)施例1中所制硫代異鼠李糖基二酰甘油酯外敷于創(chuàng)面，空白對照組在創(chuàng)面外敷等量的普通淀粉。開始計(jì)時(shí)，直到血液自然停止為止，即為出血時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，硫代異鼠李糖基二酰甘油酯組可顯著減少小鼠的出血時(shí)間（p<0.01），縮短百分率為19.3%，即硫代異鼠李糖基二酰甘油酯具有較好的外用止血作用。實(shí)施例6：提取物的止血活性稱取褐藻門馬尾藻科植物銅藻200g，置于反應(yīng)容器中，加入2400ml的80%乙醇，回流提取2h，重復(fù)3次。合并提取液，過濾、濃縮至無醇味。所得液體過濾濃縮后，經(jīng)乙酸乙酯萃取3次后，取水層提取物。再用正丁醇萃取3次，合并正丁醇層，濃縮蒸干，得提取物。精密稱取2.5mg上述提取物，加入1ml生理鹽水，配成濃度為2.5mg/ml的樣品溶液。取綿羊血漿（鄭州九龍生物制品有限公司），加入樣品溶液，混勻即成待測血樣。使用tt試劑盒（南京建成生物工程研究所），按照sl-318型血凝儀（濟(jì)南森藍(lán)科貿(mào)有限公司）操作流程測定待測血樣凝固時(shí)間。實(shí)驗(yàn)前將tt試劑預(yù)先水浴加熱至37℃。取標(biāo)準(zhǔn)配制待測血樣50μl于血凝槽中，在37℃下孵育3min。計(jì)時(shí)槍加入100μltt試劑，混勻，開始計(jì)時(shí)，記錄血漿凝固時(shí)間，以生理鹽水作為空白對照組，每組測定平行3次。結(jié)果表明，空白對照組tt時(shí)間為12.54±0.29s，在100μg/ml濃度下提取物組的tt時(shí)間為12.02±0.10s。與空白對照組相比，100μg/ml的提取物可明顯縮短tt時(shí)間（p<0.05）。以上實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)上述實(shí)驗(yàn)方法所制取的提取物具有止血作用。實(shí)施例7：無菌粉劑的制備將實(shí)施例1中所制得的硫代異鼠李糖基二酰甘油酯進(jìn)行研磨粉碎，過300目篩，獲得粒度均勻的粉散劑，輻照滅菌，即得硫代異鼠李糖基二酰甘油酯無菌粉，密閉保存。需要說明的是，以上所述的僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也不應(yīng)排除在本發(fā)明的保護(hù)范圍之外。當(dāng)前第1頁12