魯斯可皂苷元異構體在制備藥物中的應用的制作方法

本發(fā)明屬于天然藥物技術領域，具體涉及魯斯可皂苷元異構體在治療癌癥及治療急性肺損傷方面的用途。

背景技術：

魯斯可皂苷元(ruscogenin，rus)，是中藥麥冬中的主要皂苷元和有效成分之一，又名假葉樹苷元。具有顯著的抗炎、抗血栓、抗腫瘤、降低毛細血管通透性等作用。

前期研究發(fā)現(xiàn)，魯斯可皂苷元異構體混合物對多種腫瘤細胞具有殺傷作用并能顯著減輕脂多糖(lps)誘導的急性肺損傷(ali)，且藥理活性顯著。由于甾體皂苷/皂苷元c-25位的異構現(xiàn)象，魯斯可皂苷元存在兩種異構體即(25s)-ruscogenin(式ⅰ)和(25r)-ruscogenin(式ⅱ)。

天然來源的魯斯可皂苷元多是25r/s兩種差向異構體混合物，且不同產地或不同時期植物源的魯斯可皂苷元其異構體的比例也會不同。上述研究的藥理活性均為使用25r/s魯斯可皂苷元的混合物所得，而現(xiàn)代研究表明不同異構體其藥理活性可能存在不一致的現(xiàn)象，所以研究并比較魯斯可皂苷元異構體的藥理活性差異成為必要。

參考文獻：

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技術實現(xiàn)要素：

解決的技術問題：本發(fā)明的目的是提供魯斯可皂苷元異構體在制備藥物中的應用，包括(25s)-ruscogenin用于制備治療癌癥藥物中的應用和(25r)-ruscogenin用于制備治療急性肺損傷藥物中的應用。

技術方案：

魯斯可皂苷元異構體(25s)-ruscogenin在制備治療癌癥藥物中的應用。

魯斯可皂苷元異構體(25s)-ruscogenin在制備治療乳腺癌藥物中的應用。

魯斯可皂苷元異構體(25s)-ruscogenin在制備治療肺癌藥物中的應用。

魯斯可皂苷元異構體(25s)-ruscogenin在制備治療肝癌藥物中的應用。

魯斯可皂苷元異構體(25s)-ruscogenin在制備治療宮頸癌藥物中的應用。

魯斯可皂苷元異構體(25r)-ruscogenin在制備治療/預防急性肺損傷藥物中的應用。

所述的急性肺損傷為非心源性的多種內外致病因素如吸入有害氣體、嚴重感染、創(chuàng)傷、中毒、休克等導致的急性、進行性、缺氧性呼吸功能不全或衰退，嚴重者引起急性呼吸窘迫綜合征。

有益效果：本發(fā)明公開了魯斯可皂苷元異構體的不同藥物用途，(25s)-ruscogenin可用于制備治療癌癥藥物，(25r)-ruscogenin可用于制備治療/預防急性肺損傷藥物。

附圖說明

圖1為實施例2中魯斯可皂苷元異構體對lps致ali模型小鼠肺組織形態(tài)學切片圖，a為空白組，b為模型組，c為(25s)-rus給藥組，d為(25r)-rus給藥組；

圖2為實施例2中魯斯可皂苷元異構體對lps致ali模型小鼠肺組織干濕比的影響，##表示與空白組相比p<0.01，**表示與模型組相比p<0.01，&表示25(s)rus與25(r)rus相比p<0.05；

圖3為實施例2中魯斯可皂苷元異構體對lps致ali模型小鼠肺泡灌洗液(balf)中蛋白含量，細胞數(shù)和mpo含量的影響，a為肺泡灌洗液中蛋白含量，b為肺泡灌洗液中細胞數(shù)量，c為肺泡灌洗液中mpo含量，d為肺組織中mpo含量，##表示與空白組相比p<0.01，#表示與空白組相比p<0.05，**表示與模型組相比p<0.01，*表示與模型組相比p<0.05，&表示25(s)rus與25(r)rus相比p<0.05，&&表示25(s)rus與25(r)rus相比p<0.01；

圖4為實施例3中魯斯可皂苷元異構體對正常huvec細胞活力的影響，*表示與空白組相比p<0.05，**表示與空白組相比p<0.01；

圖5為實施例3中魯斯可皂苷元異構體對lps損傷huvec細胞通透性的影響，a為(25r)-rus對lps損傷huvec細胞通透性的影響，b為(25s)-rus對lps損傷huvec細胞通透性的影響，c為(25r/s)-rus混合物對lps損傷huvec細胞通透性的影響，d為不同構型魯斯可皂苷元對lps誘導huvec細胞通透性改善程度匯總圖，##表示與空白組相比p<0.01，**表示與模型組相比p<0.01；

圖6為實施例3中魯斯可皂苷元異構體對lps損傷huvec細胞跨內皮電阻的影響，a為(25r)-rus:(25s)-rus＝1:0時對lps損傷huvec細胞跨內皮電阻的影響，b為(25r)-rus:(25s)-rus＝0.8:0.2時對lps損傷huvec細胞跨內皮電阻的影響，c為(25r)-rus:(25s)-rus＝0.6:0.4時對lps損傷huvec細胞跨內皮電阻的影響，d為(25r)-rus:(25s)-rus＝0.4:0.6時對lps損傷huvec細胞跨內皮電阻的影響，e為(25r)-rus:(25s)-rus＝0.2:0.8時對lps損傷huvec細胞跨內皮電阻的影響，f為(25r)-rus:(25s)-rus＝0:1時對lps損傷huvec細胞跨內皮電阻的影響，##表示與空白組相比p<0.01，**表示與模型組相比p<0.01。

具體實施方式

下面將結合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。顯然，所描述的實施例僅為本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

為了進一步理解本發(fā)明，下面結合實施例對本發(fā)明進行詳細闡述，其中，如無特殊說明，實施例中涉及的各種反應試劑均可以通過商業(yè)渠道購買得到。

本發(fā)明所述的魯斯可皂苷元兩種異構體(25s)-ruscogenin和(25r)-ruscogenin可以從天然產物中分離得到，或通過進一步的化學合成、結構修飾及生物轉化所得。

兩種異構體可以從百合科植物短葶山麥冬(liriopemuscari(decne.)baily)、湖北麥冬(liriopespicata(thunb.)lour.var.proliferay.t.ma)、禾葉山麥冬(liriopegraminifolia(linn.)baker)、麥冬(ophiopogonjaponicus(l.f)kergawl.)等植物和天門冬科假葉樹屬植物假葉樹(ruscusaculeatus)等植物中分離得到。具體制備方法如下：

短葶山麥冬(liriopemuscari(decne.)baily)藥材5kg粉碎，40l75％乙醇熱回流提取三次，每次2h，合并提取液，濃縮得浸膏，乙酸乙酯萃取，合并萃取液，經硅膠柱石油醚：乙酸乙酯，氯仿：甲醇交替梯度洗脫，反復柱層析可得兩種異構體混合物。混合物經watersxbridgec-18制備液相色譜柱以70％甲醇制備得到兩種異構體，經高效液相檢測，兩種異構體純度均為98％以上。

實施例1

魯斯可皂苷元異構體的抑瘤作用

實驗方法：

a)腫瘤細胞培養(yǎng)

mda-mb-435、hepg2、hela及a549腫瘤細胞株以含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)，95d和mcf-7細胞含10％胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基在37℃、5％co2條件下培養(yǎng)。當細胞密度達到8×10⁵個/ml時，進行傳代培養(yǎng)(離心法)，即以1000rpm、離心5分鐘，棄掉上清，以新鮮的10％dmem培養(yǎng)基或rpmi1640培養(yǎng)基重懸細胞，以2×10⁵個/ml的密度傳代接種。

b)實驗藥物的配制

稱取適量各魯斯可皂苷元異構體分別溶解于dmso中，使之濃度為100mm，儲存液4℃保存。

實驗之前，將儲存液用無血清的dmem高糖培養(yǎng)基或rpmi1640培養(yǎng)基稀釋，使藥物濃度為100μm，并且保證dmso的最終濃度低于1‰。加入不同體積的無血清的培養(yǎng)基稀釋成不同濃度，同時用含有1‰dmso的無血清的dmem或rpmi1640培養(yǎng)基作為陰性對照。

c)mtt法檢測細胞活力

將各腫瘤細胞株分別以含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)和rpmi1640培養(yǎng)基懸浮，以1×10⁶cell/ml的細胞密度接種96孔培養(yǎng)板(150μl/孔)，37℃、5％co2培養(yǎng)24小時。在腫瘤細胞株的對數(shù)生長期，加入不同濃度的藥物，37℃、5％co2培養(yǎng)48小時。藥物作用48小時后棄去原培養(yǎng)液，按照終濃度0.5mg/ml加入mtt在培養(yǎng)箱中孵育3小時后去除mtt溶液，加入150μldmso，振蕩器震蕩10分鐘使結晶溶解，酶標儀570nm，650nm雙波長檢測。利用ic50計算軟件，計算藥物的ic50(半數(shù)抑制濃度)。

實驗結果：

表1魯斯可皂苷元異構體對人腫瘤細胞的抑制作用(ic50值)

na:noactivity(ic50>50μm)

上述實驗結果表明：(25s)-ruscogenin對各腫瘤細胞均具有一定的抑制作用，具有較好的量效關系，而(25r)-ruscogenin對各腫瘤細胞均無抑制作用。

實施例2

魯斯可皂苷元異構體對lps誘導ali小鼠肺血管內皮屏障損傷的藥效研究

實驗方法：雄性c57小鼠共24只，隨機分為4組，分別是：空白組(生理鹽水n.s.)、模型組(lps,5mg/kg)、(25s)-ruscogenin組(1mg/kg)和(25r)-ruscogenin組(1mg/kg)。灌胃給藥，1h后氣管滴注lps復制ali小鼠模型，6h后處死小鼠。取左肺精確測定肺濕重后將肺組織置于120℃的烘箱烘干24h得肺干重，計算肺干濕比來確定肺組織水腫程度。

對魯斯可皂苷元異構體對lps致ali模型小鼠肺組織形態(tài)學進行切片觀察，如圖1所示，(25r)-ruscogenin能明顯減輕血管周圍水腫，但(25s)-ruscogenin不能。

對魯斯可皂苷元異構體對lps致ali模型小鼠肺組織干濕比進行計算，統(tǒng)計結果如圖2所示，(25r)-ruscogenin干預能有顯著的改善lps誘導的小鼠肺干濕比增加，(25s)-ruscogenin干預效果不明顯。

對魯斯可皂苷元異構體對lps致ali模型小鼠肺泡灌洗液(balf)中蛋白含量和細胞數(shù)進行計算，統(tǒng)計結果如圖3所示，(25r)-ruscogenin能顯著改善lps誘導的小鼠肺泡灌洗液中蛋白含量和細胞數(shù)的升高，但(25s)-ruscogenin的改善效果不明顯。

實施例3

(25r/s)-ruscogenin對lps誘導人臍靜脈內皮(huvec)細胞屏障損傷的藥效研究

實驗方法：huvec細胞在培養(yǎng)瓶中生長至融合狀態(tài)，采用胰蛋白酶溶液消化，并反復吹打至細胞懸液，以含10％fbs的1640培養(yǎng)基稀釋成5×10⁵個/ml，每孔100μl接種于96孔培養(yǎng)板中，在37℃、5％co2條件下培養(yǎng)24h，成融合狀態(tài)，于實驗前換無血清培養(yǎng)基同步化培養(yǎng)1h。分為六組，每組五個復孔，分別向各組加入終濃度為0、1、10、20、30、40μmol/l不同比例(25r/s)-ruscogenin混合物，作用48h后mtt法檢測藥物對正常huvec細胞毒作用。

mtt法測定細胞活力：各組細胞棄去培養(yǎng)基，pbs洗兩次，每組加入0.5mg/mlmtt，37℃、5％co2條件下孵育3h，除去mtt工作液，每孔加入150μldmso溶解結晶，振搖10min，測定每孔的od值(測定波長570nm，參比波長650nm)。

細胞接入millicell懸掛式培養(yǎng)小室，細胞培養(yǎng)7天后進行實驗。預先加入不同濃度的魯斯可皂苷元，1h后加入終濃度為5μg/mllps刺激細胞，刺激2天，實驗結束前1h在小室內加入伊文思藍白蛋白溶液50μl作為示蹤劑，外室加入150μl4％bsa溶液，結束后收集外室液體，200μl加入96孔板，酶標儀620nm下測定吸光度，計算各組伊文思藍透過率。

細胞通透性保護率％＝(給藥組—模型組)/(空白組—模型組)×100％

將細胞200μl(50000個/孔)接入millicell懸掛式培養(yǎng)小室(0.4μm)內，外室24孔板中加入1ml完全培養(yǎng)基，放入co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。在種植細胞2h貼壁后測定電阻值，以后每天固定時間點測定電阻值一次，連續(xù)測定九天。電阻穩(wěn)定后根據(jù)實驗設計處理細胞，加入預先加入不同濃度的魯斯可皂苷元作用1小時后加入終濃度為5μg/mllps刺激細胞，刺激2天，測量teer值。

單位面積電阻＝(樣品孔電阻-空白孔電阻)×有效膜面積

測定魯斯可皂苷元對正常huvec細胞活力的影響，結果如圖4所示，(25r/s)-ruscogenin不同比例混合物，隨著(25s)-ruscogenin含量增加，藥物對正常huvec細胞的ic50值不斷降低(如表2)，(25s)-ruscogenin細胞毒作用較(25r)-ruscogenin明顯。

表2魯斯可皂苷元異構體對正常huvec細胞的抑制作用(ic50值)

測定魯斯可皂苷元對lps損傷huvec細胞通透性的影響，結果如圖5所示，(25r)-ruscogenin能顯著改善lps損傷導致的蛋白滲透率，但(25s)-ruscogenin無改善作用。

測定(25r/s)-ruscogenin對lps損傷huvec細胞跨內皮電阻的影響，結果如圖6所示，不同比例(25r/s)-ruscogenin混合物預先給藥后，隨著(25r)-ruscogenin含量的增加huvecs細胞通透性不斷降低，表明對降低細胞間通透性起主要作用的為(25r)-ruscogenin。

由以上結果可知，在lps不影響細胞活力的情況下，(25r/s)-ruscogenin混合物中，隨著(25r)-ruscogenin比例增加，細胞的通透性不斷降低，提示穩(wěn)定huvec單層細胞屏障功能的主要為(25r)-ruscogenin。(25r)-ruscogenin在改善小鼠氣管滴注lps誘導的ali方面相較于(25s)-ruscogenin更低毒高效，因此(25r)-ruscogenin具備成為防治ali前體藥物的潛能。