含高濃度人間充質(zhì)干細(xì)胞分泌活性因子的修復(fù)面膜及其制備方法與流程

本發(fā)明涉及修復(fù)面膜，尤其是一種含高濃度人間充質(zhì)干細(xì)胞分泌活性因子的修復(fù)面膜及其制備方法。
背景技術(shù)：
：間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcell，msc)是干細(xì)胞的一種，因能分化為間質(zhì)組織而得名。msc來源于中胚層間充質(zhì)，主要存在于生物體全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中。間充質(zhì)干細(xì)胞廣泛分布于胎兒和成體的骨髓、脂肪、臍帶、臍帶血中，其中臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞質(zhì)量高，純凈，數(shù)量多。間充質(zhì)干細(xì)胞具有干細(xì)胞的共性，即自我更新、多向分化、組織修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)和歸巢的能力。間充質(zhì)干細(xì)胞具有亞全能分化潛能，在特定的體內(nèi)、外環(huán)境下能夠誘導(dǎo)分化成為神經(jīng)、心臟、肝臟、骨、軟骨、肌腱、脂肪、上皮等多種組織細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)體系中含有多種大量的活性成分，如：干細(xì)胞生長因子(scf)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bfgf)、表皮細(xì)胞生長因子(egf)、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vegf)、角化細(xì)胞生長因子(kgf)、胰島素生長因子(igf)、白細(xì)胞介素-6(il-6)、白細(xì)胞介素-8(il-8)、超氧化物歧化酶2(superoxidedismutase2，sod2)、膠原蛋白、透明質(zhì)酸等多種活性物質(zhì)。這些活性物質(zhì)能夠影響多種細(xì)胞的存活、增殖、遷移和基因表達(dá)，促進(jìn)組織再生，對皮膚組織和細(xì)胞有抗氧化保護(hù)作用，抑制黑色素的形成，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)重塑，促進(jìn)血管新生，激活成纖維細(xì)胞促進(jìn)傷口愈合，加速表皮再生，增強(qiáng)皮膚修復(fù)能力，對于解決皮膚的干燥、粗糙、皺紋、色素沉著、傷口愈合等各種問題都有很好的效果。在面膜基礎(chǔ)配方中另外添加的寡肽-1能促進(jìn)皮膚修復(fù)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化，以新生細(xì)胞代替衰老細(xì)胞和死亡細(xì)胞。寡肽-2能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)成纖維細(xì)胞透明質(zhì)酸和真皮中膠原蛋白的合成。寡肽-5能夠促進(jìn)表皮角質(zhì)細(xì)胞生長，修復(fù)受損細(xì)胞，加速細(xì)胞的新陳代謝。目前，已經(jīng)有將人間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的活性因子應(yīng)用于皮膚的修復(fù)及治療的報道，但是用于化妝品中修復(fù)面部皮膚的各種問題未有報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種具有高效修復(fù)活性的含高濃度人間充質(zhì)干細(xì)胞分泌活性因子的修復(fù)面膜及其制備方法，利用人間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子用于皮膚的修復(fù)、保濕、美白、除皺、傷口愈合等問題，使皮膚細(xì)膩有光澤。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種含高濃度人間充質(zhì)干細(xì)胞分泌活性因子的修復(fù)面膜的制備方法，包括以下步驟：(1)人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)：從細(xì)胞庫中選取p2-p6的人間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇，接種批次記為第一批次、第二批次、第三批次，接種密度分別為最大融合度的50％-60％、35％-45％、20％-30％；細(xì)胞接種完成，放于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，溫度37℃，二氧化碳體積比濃度5％；(2)第一批次細(xì)胞融合度達(dá)到70％-80％時，以生理鹽水清洗細(xì)胞2次，用復(fù)方電解質(zhì)注射液進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；(3)饑餓培養(yǎng)12-24小時后，第一批次細(xì)胞融合度達(dá)90％-95％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，3000-4500g條件下離心5-8min除去沉淀，取離心后上清備用；(4)取培養(yǎng)的第二批次細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70％-80％，以生理鹽水清洗第二批次細(xì)胞2次，用步驟(3)中細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；(5)饑餓培養(yǎng)12-24小時后，第二批次細(xì)胞融合度達(dá)90％-95％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，3000-4500g條件下離心5-8min除去沉淀，取離心后上清備用；(6)取培養(yǎng)的第三批次細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70％-80％，以生理鹽水清洗第三批次細(xì)胞2次，用步驟(5)中細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；(7)饑餓培養(yǎng)12-24小時后，第三批次細(xì)胞融合度達(dá)90％-95％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，3000-4500g條件下離心5-8min除去沉淀，取離心后上清，得到高濃度人間充質(zhì)干細(xì)胞活性因子提取物；(8)將步驟(7)中得到的高濃度人間充質(zhì)干細(xì)胞活性因子提取物按照質(zhì)量比1:10到1:100的比例與面膜基礎(chǔ)配方進(jìn)行充分混合。(9)將無紡布面膜紙浸入步驟(8)得到的混合液，即得到含高濃度人間充質(zhì)干細(xì)胞分泌活性因子的修復(fù)面膜；所述修復(fù)面膜基礎(chǔ)配方中如下，百分比為質(zhì)量百分比：上述制備方法制得的含高濃度人間充質(zhì)干細(xì)胞分泌活性因子的修復(fù)面膜。本發(fā)明的有益效果是：將人間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行饑餓培養(yǎng)，使得細(xì)胞分泌的各種活性成分的濃度都得到了提高，對皮膚組織和細(xì)胞有抗氧化保護(hù)作用，抑制黑色素的形成，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)重塑，促進(jìn)血管新生，激活成纖維細(xì)胞促進(jìn)傷口愈合，加速表皮再生，增強(qiáng)皮膚修復(fù)能力。附圖說明圖1為本發(fā)明實施例1的方法培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞圖；圖2為本發(fā)明實施例2的方法培養(yǎng)的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞圖。具體實施方式下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明：本發(fā)明的的含高濃度人間充質(zhì)干細(xì)胞分泌活性因子的修復(fù)面膜的制備方法，包括以下步驟：(1)人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)：從細(xì)胞庫中選取p2-p6的人間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇，接種批次記為第一批次、第二批次、第三批次，接種密度分別為最大融合度的50％-60％、35％-45％、20％-30％；細(xì)胞接種完成，放于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，溫度37℃，二氧化碳體積比濃度5％；(2)第一批次細(xì)胞融合度達(dá)到70％-80％時，以生理鹽水清洗細(xì)胞2次，用復(fù)方電解質(zhì)注射液進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；(3)饑餓培養(yǎng)12-24小時后，第一批次細(xì)胞融合度達(dá)90％-95％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，3000-4500g條件下離心5-8min除去沉淀，取離心后上清備用；(4)取培養(yǎng)的第二批次細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70％-80％，以生理鹽水清洗第二批次細(xì)胞2次，用步驟(3)中細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；(5)饑餓培養(yǎng)12-24小時后，第二批次細(xì)胞融合度達(dá)90％-95％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，3000-4500g條件下離心5-8min除去沉淀，取離心后上清備用；(6)取培養(yǎng)的第三批次細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70％-80％，以生理鹽水清洗第三批次細(xì)胞2次，用步驟(5)中細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；(7)饑餓培養(yǎng)12-24小時后，第三批次細(xì)胞融合度達(dá)90％-95％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，3000-4500g條件下離心5-8min除去沉淀，取離心后上清，得到高濃度人間充質(zhì)干細(xì)胞活性因子提取物；(8)將步驟(7)中得到的高濃度人間充質(zhì)干細(xì)胞活性因子提取物按照質(zhì)量比1:10到1:100的比例與面膜基礎(chǔ)配方進(jìn)行充分混合。(9)將無紡布面膜紙浸入步驟(8)得到的混合液，即得到含高濃度人間充質(zhì)干細(xì)胞分泌活性因子的修復(fù)面膜；所述修復(fù)面膜基礎(chǔ)配方中如下，百分比為質(zhì)量百分比：上述制備方法制得的含高濃度人間充質(zhì)干細(xì)胞分泌活性因子的修復(fù)面膜。本發(fā)明人間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)過程中會分泌大量的細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子能夠影響多種細(xì)胞的存活、增殖、遷移和基因表達(dá)，促進(jìn)組織再生，對皮膚組織和細(xì)胞有抗氧化保護(hù)作用，抑制黑色素的形成，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)重塑，促進(jìn)血管新生，激活成纖維細(xì)胞促進(jìn)傷口愈合，加速表皮再生，增強(qiáng)皮膚修復(fù)能力，對于解決皮膚的干燥、粗糙、皺紋、色素沉著、傷口愈合等各種問題都有很好的效果。其中人間充質(zhì)干細(xì)胞活性因子為饑餓培養(yǎng)后提取，其余成分為面膜基礎(chǔ)配方成分，另外添加的寡肽-1能促進(jìn)皮膚修復(fù)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化，以新生細(xì)胞代替衰老細(xì)胞和死亡細(xì)胞。寡肽-2能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)成纖維細(xì)胞透明質(zhì)酸和真皮中膠原蛋白的合成。寡肽-5能夠促進(jìn)表皮角質(zhì)細(xì)胞生長，修復(fù)受損細(xì)胞，加速細(xì)胞的新陳代謝。實施例1(1)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)：從細(xì)胞庫中選取p4的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇，細(xì)胞總數(shù)4.2*107。接種批次記為第一批次、第二批次、第三批次，接種密度分別為最大融合度的60％(每瓶接種細(xì)胞數(shù)：9*106，接種細(xì)胞三瓶)、40％(每瓶接種細(xì)胞數(shù)：6*106，接種細(xì)胞兩瓶)、20％(接種細(xì)胞數(shù)：3*106，接種細(xì)胞一瓶)，培養(yǎng)體系均為40ml。培養(yǎng)細(xì)胞所用完全培養(yǎng)基為無酚紅dmem/df12和體積比濃度為10％胎牛血清，接種細(xì)胞瓶為t-175培養(yǎng)瓶。細(xì)胞接種完成，放于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，溫度37℃，二氧化碳濃度5％；(2)培養(yǎng)30小時，此時第一批次細(xì)胞融合度達(dá)到75％時，見圖1，以生理鹽水清洗細(xì)胞2次，每瓶用40ml復(fù)方電解質(zhì)注射液(中國大冢制藥有限公司生產(chǎn)的復(fù)方電解質(zhì)葡萄糖mg3注射液)進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；(3)饑餓培養(yǎng)18小時后，第一批次細(xì)胞融合度達(dá)95％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，4000g條件下離心8min除去沉淀，取離心后上清放于4℃?zhèn)溆茫?4)取培養(yǎng)的第二批次細(xì)胞，此時細(xì)胞融合度達(dá)到70％，以生理鹽水清洗第二批次細(xì)胞2次，用步驟(3)中細(xì)胞培養(yǎng)上清40ml進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；(5)饑餓培養(yǎng)18小時后，第二批次細(xì)胞融合度達(dá)95％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，4000g條件下離心8min除去沉淀，取離心后上清放于4℃?zhèn)溆茫?6)取培養(yǎng)的第三批次細(xì)胞，此時細(xì)胞融合度達(dá)到70％，以生理鹽水清洗第三批次細(xì)胞2次，用步驟(5)中細(xì)胞培養(yǎng)上清40ml進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；(7)饑餓培養(yǎng)24小時后，第三批次細(xì)胞融合度達(dá)90％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，4000g條件下離心8min除去沉淀，取離心后上清，得到高濃度人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞活性因子提取物。(8)將步驟(7)中得到的高濃度人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞活性因子提取物按照質(zhì)量百分比1:80比例與面膜基礎(chǔ)配方進(jìn)行充分混合，基礎(chǔ)配方為：名稱添加量范圍(質(zhì)量百分比％)水73.0991甘油20甘油聚甲基丙烯酸酯3甘油聚甲基丙烯酸酯/丙二醇3卡波姆0.2三乙醇胺0.5透明質(zhì)酸鈉0.1羥苯甲脂0.1寡肽10.0003寡肽20.0003寡肽50.0003(9)將無紡布面膜紙浸入25ml步驟(8)中得到的混合液，即得到含高濃度人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌活性因子的修復(fù)面膜。實施例2(1)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)：從細(xì)胞庫中選取p5的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇，細(xì)胞總數(shù)3.84*107。接種批次記為第一批次、第二批次、第三批次，接種密度分別為最大融合度的50％(每瓶接種細(xì)胞數(shù)：8*106，接種細(xì)胞三瓶)、35％(每瓶接種細(xì)胞數(shù)：5.6*106，接種細(xì)胞兩瓶)、20％(接種細(xì)胞數(shù)：3.2*106，接種細(xì)胞一瓶)，培養(yǎng)體系均為40ml。培養(yǎng)細(xì)胞所用完全培養(yǎng)基為無酚紅amem和體積比濃度為10％胎牛血清，接種細(xì)胞瓶為t-175培養(yǎng)瓶。細(xì)胞接種完成，放于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，溫度37℃，二氧化碳濃度5％；(2)培養(yǎng)35小時，此時第一批次細(xì)胞融合度達(dá)到70％時，見圖2，以生理鹽水清洗細(xì)胞2次，每瓶用40ml復(fù)方電解質(zhì)注射液進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；(3)饑餓培養(yǎng)18小時后，第一批次細(xì)胞融合度達(dá)95％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，4000g條件下離心8min除去沉淀，取離心后上清放于4℃?zhèn)溆茫?4)取培養(yǎng)的第二批次細(xì)胞，此時細(xì)胞融合度達(dá)到70％，以生理鹽水清洗第二批次細(xì)胞2次，每瓶用步驟(3)中細(xì)胞培養(yǎng)上清40ml進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；(5)饑餓培養(yǎng)18小時后，第二批次細(xì)胞融合度達(dá)95％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，4000g條件下離心8min除去沉淀，取離心后上清放于4℃?zhèn)溆茫?6)取培養(yǎng)的第三批次細(xì)胞，此時細(xì)胞融合度達(dá)到75％，以生理鹽水清洗第三批次細(xì)胞2次，用步驟(5)中細(xì)胞培養(yǎng)上清40ml進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；(7)饑餓培養(yǎng)24小時后，第三批次細(xì)胞融合度達(dá)90％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，4000g條件下離心8min除去沉淀，取離心后上清，得到高濃度人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞活性因子提取物。(8)將步驟(7)中得到的高濃度人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞活性因子提取物按照質(zhì)量百分比1:30比例與面膜基礎(chǔ)配方進(jìn)行充分混合，基礎(chǔ)配方為：(9)將無紡布面膜紙浸入25ml步驟(8)中得到的混合液，即得到含高濃度人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌活性因子的修復(fù)面膜。典型案例：例1：宋某，女性，20歲，到海南旅游后皮膚被曬傷，面部皮膚干燥、脫皮、泛紅、色素沉著，在使用了普通曬后修復(fù)面膜約一個月后未見明顯好轉(zhuǎn)，于是宋某使用了實施例1中步驟(9)得到的含高濃度人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌活性因子的修復(fù)面膜，使用一周后，面部泛紅情況明顯好轉(zhuǎn)，皮膚逐漸恢復(fù)彈性、有光澤，脫皮情況也有所減輕，連續(xù)使用三周后，曬傷情況基本消退，恢復(fù)健康容貌。例2：范某，女性，35歲，由于生活壓力與工作壓力過大，內(nèi)分泌紊亂，面部長出許多紅腫的痘，于某用手?jǐn)D掉紅腫的痘后在面部留下了許多痘印痘坑。使用了市面上普通的祛痘印痘坑產(chǎn)品后無明顯效果，于是范某使用了實施例2中步驟(9)得到的含高濃度人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分泌活性因子的修復(fù)面膜，使用兩周后，痘印痘坑明顯減輕，繼續(xù)使用一個月后，痘印痘坑幾乎完全消失。綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實施例中，相同領(lǐng)域內(nèi)的有識之士可以在本發(fā)明的技術(shù)指導(dǎo)思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實施例，但這種實施例都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12