一種醫(yī)用鈦或鈦合金表面抗菌涂層的構(gòu)建方法與流程

本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種醫(yī)用鈦或鈦合金表面抗菌涂層的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

醫(yī)用鈦及鈦合金由于其優(yōu)異的生物學(xué)性能、綜合力學(xué)性能及耐腐性，被廣泛應(yīng)用于外科植入手術(shù)，常作為如牙種植體、人工關(guān)節(jié)和骨創(chuàng)傷產(chǎn)品等人體硬組織替代物和修復(fù)物的首選材料。但隨著植入材料的廣泛應(yīng)用，植入物相關(guān)感染已經(jīng)成為臨床上一個(gè)非常棘手的問(wèn)題。研究表明細(xì)菌在生物材料表面的黏附、繁殖并形成細(xì)菌生物膜是引發(fā)植入物相關(guān)感染的主要原因之一。因此，對(duì)鈦及鈦合金植入材料進(jìn)行表面改性，從而賦予其優(yōu)異抗菌性能是目前生物醫(yī)用材料領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。隨著抗生素濫用導(dǎo)致了嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥性問(wèn)題，傳統(tǒng)抗生素已不能滿足要求，因此具有高效、廣譜抗菌且不易產(chǎn)生耐藥性的抗菌多肽成為抗感染植入材料研究的熱點(diǎn)趨勢(shì)之一?？咕嚯膹V泛存在于生物體內(nèi)，一般有10～50個(gè)氨基酸序列組成，帶正電荷并呈疏水性，一般認(rèn)為抗菌多肽殺菌機(jī)理主要是抗菌多肽的正電荷與細(xì)菌的細(xì)胞膜的負(fù)電荷發(fā)生作用,致使細(xì)菌細(xì)胞膜破碎,導(dǎo)致細(xì)菌胞內(nèi)物溢出而使細(xì)菌死亡。由于其殺菌機(jī)理是直接破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，導(dǎo)致不易產(chǎn)生耐藥性而受到廣泛的關(guān)注。而由于物理吸附抗菌多肽涂層，會(huì)有突釋、藥物利用率低、毒性大等缺點(diǎn)，化學(xué)接枝可以很好地克服這些問(wèn)題。但直接在植入物材料表面接枝抗菌多肽，會(huì)導(dǎo)致抗菌多肽不能完全達(dá)到和游離的抗菌多肽的構(gòu)象，從而影響其抗菌性能，因此通過(guò)peg作為鏈接劑可以很好地解決這一問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種醫(yī)用鈦及鈦合金表面抗菌涂層的構(gòu)建方法。該方法通過(guò)對(duì)樣品表面的piranha溶液處理，硅烷化，peg的接枝和抗菌多肽的接枝，實(shí)現(xiàn)了抗菌多肽成功的接枝在金屬鈦及鈦合金表面，使抗菌多肽在化學(xué)接枝的情況下仍能保持原有的抗菌構(gòu)象，能夠顯著提高鈦及鈦合金的抗菌性能，并使抗菌效果長(zhǎng)時(shí)間維持，提高抗菌多肽的利用率，并使其保持良好的生物相容性。

本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。

一種醫(yī)用鈦或鈦合金表面抗菌涂層的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)將醫(yī)用鈦或鈦合金樣品用砂紙打磨拋光進(jìn)行表面處理；

(2)將拋光后的樣品表面用piranha溶液(70％h2so4+30％h2o2)處理；

(3)以無(wú)水甲苯為溶劑溶解帶有氨基的硅烷偶聯(lián)劑，得到硅烷偶聯(lián)劑溶液，將步驟(2)所得樣品浸泡于硅烷偶聯(lián)劑溶液中反應(yīng)，然后固化；

(4)將含有mal-pegn-nhs(馬來(lái)酰亞胺-聚乙二醇-羥基琥珀酰亞胺)的dmf溶液滴至步驟(3)所得樣品表面進(jìn)行反應(yīng)；

(5)將含有抗菌多肽的點(diǎn)擊反應(yīng)溶液滴至步驟(4)所得樣品表面進(jìn)行反應(yīng)，再超聲清洗，得到抗菌涂層；所述含有抗菌多肽的點(diǎn)擊反應(yīng)溶液的濃度為0.5～3μm，每平方厘米樣品表面滴加1～4μl。

優(yōu)選的，步驟(1)所述打磨拋光至樣品表面ra小于40nm。

優(yōu)選的，步驟(2)所述piranha溶液處理的時(shí)間為5min～30min。

優(yōu)選的，步驟(3)所述硅烷偶聯(lián)劑溶液的體積濃度為2％～5％。

優(yōu)選的，步驟(3)所述反應(yīng)的條件為：時(shí)間1-3h，溫度60-90℃，反應(yīng)中含氧量低于2ppm。

優(yōu)選的，步驟(4)所述含有mal-pegn-nhs的dmf溶液的濃度為0.5～3μm，每平方厘米樣品表面滴加1～4μl。

優(yōu)選的，步驟(4)所述反應(yīng)是在室溫下反應(yīng)6-12h。

優(yōu)選的，步驟(4)所述mal-pegn-nhs中peg的分子量為100～10000。

優(yōu)選的，步驟(5)所述反應(yīng)是在室溫下反應(yīng)12-24h。

優(yōu)選的，步驟(5)所述的抗菌多肽為c-peg2-peg2-grrrrsvqwca；其中c-peg2-peg2-grrrrsvqwca的結(jié)構(gòu)式如下：

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明的抗菌涂層的構(gòu)建方法得到的醫(yī)用鈦及鈦合金表面具有優(yōu)異的抗菌性能及生物相容性。

(2)本發(fā)明使用點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)接枝抗菌多肽，反應(yīng)條件溫和，效率高。

(3)本發(fā)明使用化學(xué)法接枝抗菌多肽，提高了抗菌多肽的利用率并提高了有效抗菌時(shí)間。

(4)本發(fā)明使用peg作為鏈接劑接枝抗菌多肽，可以使抗菌多肽保持游離的構(gòu)象從而達(dá)到更好的抗菌效果。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明所用的抗菌多肽的分子式結(jié)構(gòu)圖。

圖2a為本發(fā)明醫(yī)用鈦對(duì)金黃色葡萄球菌的掃描電鏡圖。

圖2b為本發(fā)明實(shí)施例1所得涂層對(duì)金黃色葡萄球菌的掃描電鏡圖。

圖2c為本發(fā)明實(shí)施例2所得涂層對(duì)金黃色葡萄球菌的掃描電鏡圖。

圖2d為本發(fā)明實(shí)施例3所得涂層對(duì)金黃色葡萄球菌的掃描電鏡圖。

圖2e為本發(fā)明實(shí)施例4所得涂層對(duì)金黃色葡萄球菌的掃描電鏡圖。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1～4所得涂層對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌效果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

以下所用的抗菌多肽的分子式結(jié)構(gòu)圖如圖1所示。

實(shí)施例1

(1)將待處理的醫(yī)用鈦樣品進(jìn)行表面處理，即用砂紙打磨拋光至ra小于40nm；

(2)將拋光后的樣品表面放入piranha溶液中處理20min；

(3)以無(wú)水甲苯為溶劑溶解帶有氨基的硅烷偶聯(lián)劑kh-550，得到硅烷偶聯(lián)劑溶液(體積濃度為2％)，將樣品浸泡于硅烷偶聯(lián)劑溶液中反應(yīng)2h，反應(yīng)溫度為70℃，含氧量小于2ppm，然后在常溫下固化2h；

(4)將含有mal-pegn-nhs的dmf溶液滴至步驟(3)的樣品表面，在常溫下反應(yīng)6h；peg分子量為250，mal-pegn-nhs的dmf溶液濃度為1μm，每平方厘米表面滴加1μl；

(5)將含有抗菌多肽的點(diǎn)擊反應(yīng)溶液滴至步驟(4)的樣品表面，在常溫下反應(yīng)12h，超聲清洗，在醫(yī)用鈦表面得到抗菌涂層；含有抗菌多肽的點(diǎn)擊反應(yīng)溶液的濃度為1μm，每平方厘米表面滴加1μl。

在醫(yī)用鈦表面培養(yǎng)金黃色葡萄球菌(菌液濃度為10⁶cfu/ml)2h后的掃描電鏡圖如圖2a所示。圖2b為在該抗菌涂層表面培養(yǎng)金黃色葡萄球菌(菌液濃度為10⁶cfu/ml)2h后的掃描電鏡圖。和圖2a相比，表面細(xì)菌數(shù)量有所減少，表明該抗菌圖層具有一定的抗菌性能。

實(shí)施例2

(1)將待處理的醫(yī)用鈦樣品進(jìn)行表面處理，即用砂紙打磨拋光至ra小于40nm；

(2)將拋光后的樣品表面放入piranha溶液中處理20min；

(3)以無(wú)水甲苯為溶劑溶解帶有氨基的硅烷偶聯(lián)劑kh-550，得到硅烷偶聯(lián)劑溶液(體積濃度為2％)，將樣品浸泡于硅烷偶聯(lián)劑溶液中反應(yīng)2h，反應(yīng)溫度為70℃，含氧量小于2ppm，然后在常溫下固化2h；

(4)將含有mal-pegn-nhs的dmf溶液滴至步驟(3)的樣品表面，在常溫下反應(yīng)6h；peg分子量為1000，mal-pegn-nhs的dmf溶液的濃度為1μm，每平方厘米表面滴加1μl；

(5)將含有抗菌多肽的點(diǎn)擊反應(yīng)溶液滴至步驟(4)的樣品表面，在常溫下反應(yīng)12h，超聲清洗，在醫(yī)用鈦表面得到抗菌涂層；含有抗菌多肽的點(diǎn)擊反應(yīng)溶液的濃度為1μm，每平方厘米表面滴加1.5μl。

如圖2c所示為在該抗菌涂層表面培養(yǎng)金黃色葡萄球菌(菌液濃度為10⁶cfu/ml)2h后的掃描電鏡圖。和圖2a相比，表面細(xì)菌數(shù)量有所減少，表明該抗菌圖層具有一定的抗菌性能。

實(shí)施例3

(1)將待處理的醫(yī)用鈦樣品進(jìn)行表面處理，即用砂紙打磨拋光至ra小于40nm；

(2)將拋光后的樣品表面放入piranha溶液中處理20min；

(3)以無(wú)水甲苯為溶劑溶解帶有氨基的硅烷偶聯(lián)劑kh-550，得到硅烷偶聯(lián)劑溶液(體積濃度為5％)，將樣品浸泡于硅烷偶聯(lián)劑溶液中反應(yīng)2h，反應(yīng)溫度為70℃，含氧量小于2ppm，然后在常溫下固化2h；

(4)將含有mal-pegn-nhs的dmf溶液滴至步驟(3)的樣品表面，在常溫下反應(yīng)6h；peg分子量為3400，mal-pegn-nhs的dmf溶液濃度為1μm，每平方厘米表面滴加1μl；

(5)將含有抗菌多肽的點(diǎn)擊反應(yīng)溶液滴至步驟(4)的樣品表面，在常溫下反應(yīng)12h，超聲清洗，在醫(yī)用鈦表面得到抗菌涂層；含有抗菌多肽的點(diǎn)擊反應(yīng)溶液的濃度為1μm，每平方厘米表面滴加1.5μl。

如圖2d所示為在該抗菌涂層表面培養(yǎng)金黃色葡萄球菌(菌液濃度為10⁶cfu/ml)2h后的掃描電鏡圖。和圖2a相比，表面細(xì)菌數(shù)量明顯減少，表明該抗菌圖層具有優(yōu)異的抗菌性能。

實(shí)施例4

(1)將待處理的醫(yī)用鈦樣品進(jìn)行表面處理，即用砂紙打磨拋光至ra小于40nm；

(2)將拋光后的樣品表面放入piranha溶液中處理20min；

(3)以無(wú)水甲苯為溶劑溶解帶有氨基的硅烷偶聯(lián)劑kh-550，得到硅烷偶聯(lián)劑溶液(體積濃度為5％)，將樣品浸泡于硅烷偶聯(lián)劑溶液中反應(yīng)2h，反應(yīng)溫度為70℃，含氧量小于2ppm，然后在常溫下固化2h；

(4)將含有mal-pegn-nhs的dmf溶液滴至步驟(3)的樣品表面，在常溫下反應(yīng)6h；peg分子量為10000，mal-pegn-nhs的dmf溶液濃度為1μm，每平方厘米表面滴加1μl；

(5)將含有抗菌多肽的點(diǎn)擊反應(yīng)溶液滴至步驟(4)的樣品表面，在常溫下反應(yīng)12h，超聲清洗，在醫(yī)用鈦表面得到抗菌涂層；含有抗菌多肽的點(diǎn)擊反應(yīng)溶液的濃度為1μm，每平方厘米表面滴加1.5μl。

如圖2d所示為在該抗菌涂層表面培養(yǎng)金黃色葡萄球菌(菌液濃度為10⁶cfu/ml)2h后的掃描電鏡圖。和圖2a相比，表面細(xì)菌數(shù)量明顯減少，表明該抗菌圖層具有優(yōu)異的抗菌性能。

由圖3可知，與醫(yī)用鈦相比，本發(fā)明實(shí)施例1-4所制得的涂層對(duì)金黃色葡萄球菌具有更好的抗菌效果。