流腦多糖結(jié)合疫苗可溶性微針貼片及其制備方法與流程

本發(fā)明涉及透皮給藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種流腦多糖結(jié)合疫苗可溶性微針貼片及其制備方法。

背景技術(shù)：

接種疫苗已經(jīng)成為預(yù)防和治療大規(guī)模傳染性疾病、超敏反應(yīng)性疾病和自身免疫性疾病等的最有效和最主要的手段。多糖結(jié)合疫苗為目前比較前沿的組分疫苗類，是疫苗研究熱點(diǎn)。流腦即流行性腦脊髓膜炎(meningococcalmeningitis)，是由腦膜炎雙球菌(腦膜炎奈瑟菌，neisseriameningitides(nm)bacteria.)引起的化膿性腦膜炎，是世界范圍的一個(gè)嚴(yán)重公共健康問題，可造成流行性的腦膜炎疾病,具有高致死率和致殘率，分布廣全世界每年流腦病例可達(dá)30萬到35萬，病原體的發(fā)現(xiàn)至今已超過100年。根據(jù)不同的地理分布和流行潛力不同，2015年世界衛(wèi)生組織流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，以從塞內(nèi)加爾到埃塞俄比亞的撒哈拉沙漠以南地區(qū)為主要流行區(qū)，被稱為“腦膜炎地帶”。我國(guó)由于長(zhǎng)期受經(jīng)濟(jì)和技術(shù)因素的限制，20世紀(jì)60年代，均有試圖研究無毒活疫苗，但未獲成功。1972年開始研制提純疫苗，但純度差未廣泛使用。同年，開始研究a群流腦多糖疫苗。直到1979年，按照1976年who要求的疫苗標(biāo)準(zhǔn)，中國(guó)才能生產(chǎn)符合應(yīng)用的流腦疫苗。2001年a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗獲得生產(chǎn)批準(zhǔn)。對(duì)兩歲以下嬰幼兒，由于流腦多糖疫苗在機(jī)體內(nèi)僅能誘導(dǎo)短期的t細(xì)胞非依賴性免疫反應(yīng)，所以其所發(fā)生的保護(hù)效果差。而結(jié)合了蛋白的疫苗可以提高嬰幼兒的保護(hù)作用。為了多糖抗原結(jié)合到某種蛋白載體上，從而擴(kuò)大了適用人群，增強(qiáng)了免疫學(xué)效果，并且通過多糖與蛋白質(zhì)載體的結(jié)合，完全改變了多糖抗原的免疫學(xué)特性，使多糖刺激產(chǎn)生的抗體由igm為主向igg為主轉(zhuǎn)變，而且產(chǎn)生的抗體親和力更高，滴度更好，持續(xù)時(shí)間也更長(zhǎng)。

通過皮膚免疫的方式又是免疫學(xué)者研究的一個(gè)重要陣地，也是近年來疫苗工作者一直在尋找的更好免疫途徑和最佳免疫器官。而經(jīng)皮免疫(transcutaneousimmunization，tci)是在原有基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型免疫接種方式，主要是通過免疫源性抗原和佐劑組合起來通過皮膚輸入表皮免疫靶點(diǎn)誘導(dǎo)產(chǎn)生全身免疫反應(yīng)的新方法。皮膚具有獨(dú)特的免疫功能且與全身免疫系統(tǒng)密切相關(guān)。bos于1986年提出了皮膚免疫系統(tǒng)(sis)，包括角朊細(xì)胞、郎格罕細(xì)胞、組織細(xì)胞(樹枝狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)、t細(xì)胞、粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞部分和抗微生物肽類、纖維蛋白溶酶、花生四烯酸、補(bǔ)體、免疫球蛋白、細(xì)胞因子等體液部分。皮膚能參與機(jī)體特異性免疫的抗原識(shí)別、免疫細(xì)胞的激活及皮膚免疫應(yīng)答的全過程。

皮膚作為人體最大的免疫器官，表皮層存大量在與免疫反應(yīng)相關(guān)的抗原提呈細(xì)胞，是人體天然的屏障，當(dāng)有外源性物質(zhì)進(jìn)入時(shí)，會(huì)激發(fā)體內(nèi)免疫應(yīng)答，是人體最關(guān)鍵的免疫途徑之一。最外層的角質(zhì)層厚度為10-15μm，由致密的角質(zhì)細(xì)胞組成，是阻礙藥物輸送皮內(nèi)產(chǎn)生免疫反應(yīng)的最大屏障；從外向內(nèi)依次有表皮層，厚度為50-100μm，含有免疫活性細(xì)胞和少量的神經(jīng)組織，沒有血管。表皮層以下是真皮層，是皮膚的主要組成部分，含有大量的免疫活性細(xì)胞、神經(jīng)組織和血管組織，主要是人體受到外界刺激產(chǎn)生痛覺的地方。而能產(chǎn)生免疫反應(yīng)的功能細(xì)胞主要分布在表皮層和真皮層，尤其是樹突狀細(xì)胞(dcs)是體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞，在經(jīng)皮在免疫系統(tǒng)對(duì)抗原的捕獲、處理及提呈過程中居于中心地位。在其它表皮層和真皮層還有大量樹突狀細(xì)胞未成熟亞型郎格漢氏細(xì)胞(lcs)和皮膚內(nèi)樹突狀細(xì)胞(ddcs)，都能有效的攝取、處理和提呈外來抗原，參與機(jī)體的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。其中l(wèi)cs覆蓋了人類皮膚表皮總表面積的約25％，密度約為500-1000細(xì)胞/mm2，占表皮細(xì)胞的3％-5％。同時(shí)，10個(gè)捕獲抗原的dcs即足以產(chǎn)生細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞反應(yīng)，500-1000個(gè)dcs就可導(dǎo)致廣泛的免疫反應(yīng)。因此皮膚也被認(rèn)為是疫苗接種的最佳部位之一。

經(jīng)皮免疫新技術(shù)作為一種確證有效且有藥物傳輸領(lǐng)域新興代表的免疫新方法，已成為國(guó)際新型疫苗遞送系統(tǒng)研究的熱點(diǎn)之一。在進(jìn)行經(jīng)皮免疫時(shí)，疫苗既可以通過體液循環(huán)直接進(jìn)入外周淋巴結(jié)，被外周淋巴結(jié)中的dcs細(xì)胞識(shí)別并呈遞，也可以直接被皮膚中的dcs細(xì)胞處理后直接呈遞到外周淋巴結(jié)中的免疫細(xì)胞，兩種不同的途徑也會(huì)誘導(dǎo)不同的免疫反應(yīng)。經(jīng)皮免疫給藥其具備的主要的優(yōu)點(diǎn)有以下幾個(gè)方面(1)安全性高：能顯著降低給藥過程中因給藥器械所引起的感染幾率以及血源性疾病的傳播。(2)順應(yīng)性良好：微針經(jīng)皮免疫疼痛感低，不良反應(yīng)少，尤其適用于兒童經(jīng)皮免疫。(3)方便性：可自行操作，無需專業(yè)人員；(4)接種效率高：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)接種人數(shù)多，尤適于較大規(guī)模的群體免疫接種；(5)免疫應(yīng)答高效性：其它條件相同的情況下，較少劑量的抗原可達(dá)到大劑量注射免疫的效果，降低使用劑量和投入成本；(6)不經(jīng)過胃腸道吸收，減少藥物不良反應(yīng)，完全避免藥物的首過效應(yīng)，達(dá)到局部或系統(tǒng)的藥物控制釋放的目的。因此經(jīng)皮免疫作為一種免疫接種方式，有著廣闊的應(yīng)用前景。

微針陣列技術(shù)的透皮給藥方法能有效的克服皮膚表面的角質(zhì)層對(duì)藥物的阻擋，能很好的促進(jìn)大分子抗原藥物透皮吸收，該技術(shù)已不斷發(fā)展成熟并得到了研究者的公認(rèn)。從2005年首個(gè)可溶微針經(jīng)皮釋藥文獻(xiàn)報(bào)道起，可溶微針經(jīng)過了近十年的研究，主要集中于可溶微針的制備方法和蛋白、多肽、疫苗等藥物的經(jīng)皮釋藥研究等方面。皮下或肌肉注射接種疫苗，尤其在兒童存在順應(yīng)性差、免疫效率低等問題，因此從藥物給藥領(lǐng)域來講，更需要一種順應(yīng)性好、方便、高效的新的疫苗接種途徑。而經(jīng)皮免疫(transcutaneousimmunization，tci)有望實(shí)現(xiàn)和改善疫苗接種現(xiàn)階段所遇到的困難，它可以將抗原和佐劑局部應(yīng)用于皮膚而誘導(dǎo)產(chǎn)生全身免疫反應(yīng)，可以克服目前注射接種方式存在的缺陷，有著廣闊的應(yīng)用前景。目前國(guó)外針對(duì)微針給藥技術(shù)開發(fā)的經(jīng)皮免疫制劑已經(jīng)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段。如法國(guó)研發(fā)的麻疹減毒活疫苗貼劑rouvax，美國(guó)iomai公司研制針對(duì)流感和旅行者腹瀉的兩種透皮免疫貼劑，分別進(jìn)入了臨床i和ⅲ期試驗(yàn)。因此微針經(jīng)皮免疫方法因其具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，已成為目前國(guó)際新型疫苗遞送系統(tǒng)研究的熱點(diǎn)之一。目前微針透皮免疫貼劑的應(yīng)用，主要是采用微針陣列刺入皮膚形成通道后再移走，然后在治療部位上涂疫苗液或者貼上普通透皮制劑；或者通過在微針表面包裹帶有藥物的膜衣，當(dāng)微針刺入皮膚的時(shí)候?qū)⑺幬镆黄饚塍w內(nèi)，提高藥物的吸收率；上述兩種方法存在給藥劑量不準(zhǔn)確，藥物釋放速度不可控等問題，因此對(duì)一種給藥劑量準(zhǔn)確和釋藥速度可控的可溶性微針免疫貼片的研究具有很好前瞻性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于此，本發(fā)明提供了一種流腦多糖結(jié)合疫苗可溶性微針貼片。

具體技術(shù)方案如下：

一種流腦多糖結(jié)合疫苗可溶性微針貼片，由可溶性微針基底與可溶性微針針體組成，所述可溶性微針基底由第一水溶性高分子材料的水溶液制備而成，所述可溶性微針針體由第二水溶性高分子材料的水溶液和a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗制備而成；所述a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗在所述可溶性微針針體中的重量百分比為不大于8％，且不為0；所述第二水溶性高分子材料由透明質(zhì)酸鈉、右旋糖酐和聚維酮組成，所述水溶性高分子材料的分子量為7000-630000。

在其中一些實(shí)施例中，所述右旋糖酐為右旋糖酐40，所述聚維酮為聚維酮k30；所述透明質(zhì)酸鈉的分子量為7500-8000，所述右旋糖酐40的分子量為32000～42000，所述聚維酮k30的分子量為35000-45000。

在其中一些實(shí)施例中，所述第二水溶性高分子材料中各組分的質(zhì)量比為：

透明質(zhì)酸鈉8-15

右旋糖酐405-12

聚維酮k300.8-2。

在其中一些實(shí)施例中，所述第二水溶性高分子材料中各組分的質(zhì)量比為：

透明質(zhì)酸鈉10-12

右旋糖酐407-9％

聚維酮k300.8-1.2。

在其中一些實(shí)施例中，所述第二水溶性高分子材料中各組分的質(zhì)量比為：

透明質(zhì)酸鈉11

右旋糖酐408

聚維酮k301。

在其中一些實(shí)施例中，所述可溶性微針基底由質(zhì)量比為1:95-105的透明質(zhì)酸鈉和水制備而成，所述基底中的透明質(zhì)酸鈉的分子量為1.80×10⁶-2.01×10⁶。

在其中一些實(shí)施例中，所述可溶性微針基底由質(zhì)量比為1:99-101的透明質(zhì)酸鈉和水制備而成。

在其中一些實(shí)施例中，所述可溶性微針基底由質(zhì)量比為1:100的透明質(zhì)酸鈉和水制備而成。

在其中一些實(shí)施例中，所述a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗在所述可溶性微針針體中的重量百分比為5-8％。

在其中一些實(shí)施例中，所述可溶性微針針體的高度為400um-800um，所述可溶性微針針體的底部直徑為160-200um。

在其中一些實(shí)施例中，所述可溶性微針針體的高度為600um-800um。

本發(fā)明還提供了上述流腦多糖結(jié)合疫苗可溶性微針貼片的制備方法。

具體技術(shù)方案如下：

一種流腦多糖結(jié)合疫苗可溶性微針貼片的制備方法，包括以下步驟：

(1)將所述a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗和所述第二水溶性高分子材料溶解在水中，所得水溶液a作為針體制作液，然后將所述針體制作液覆蓋到陰模模具中，離心，去除陰模模具上方多余的針體制作液；

(2)將所述第一水溶性高分子材料溶解在水中，所得水溶液b作為基底液，然后將所述基底液倒入步驟(1)覆蓋有針體制作液的陰模模具中，離心；

(3)將覆蓋有基底液的陰模模具干燥，即得所述流腦多糖結(jié)合疫苗可溶性微針貼片。

在其中一些實(shí)施例中，所述針體制作液中第二水溶性高分子材料的重量百分比為25％-45％。

在其中一些實(shí)施例中，所述針體制作液中第二水溶性高分子材料的重量百分比為30％-35％。

在其中一些實(shí)施例中，所述離心的轉(zhuǎn)數(shù)為2800-3200rpm/min，溫度為0-8℃，離心時(shí)間為5-15min。

在其中一些實(shí)施中，所述干燥包括將覆蓋有基底液的陰模模具置于溫度為2～25℃、濕度為8-12％的干燥柜中干燥20-28h。

本發(fā)明的流腦多糖結(jié)合疫苗可溶性微針貼片及其制備方法具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

本發(fā)明的發(fā)明人以其長(zhǎng)期的經(jīng)驗(yàn)積累和大量的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，通過選擇特定的安全的具有生物相容性的水溶性高分子材料，可以制備含有流腦多糖結(jié)合疫苗的可溶性微針貼片，該微針貼片具有良好的機(jī)械性能，具有足夠的硬度和強(qiáng)度以及延展性，以保證可溶性微針針體部分可以有效刺穿皮膚；同時(shí)，進(jìn)入皮膚內(nèi)部的可溶性微針針體部分又能快速溶解，從而將可溶性微針針體中含有的a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗釋放入皮膚中，從而起到調(diào)節(jié)疫苗免疫應(yīng)答的效果。

本發(fā)明的可溶性微針貼片免疫小鼠后，小鼠血清抗體陽轉(zhuǎn)率大于80％，能有效的對(duì)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)作用，且效果優(yōu)于同等條件下的皮下注射免疫方式。

本發(fā)明的疫苗可溶性微針貼片的針體可以在15～60分鐘內(nèi)將目標(biāo)藥物釋放到皮膚內(nèi)，給藥時(shí)間優(yōu)選為30分鐘，此時(shí)可以保證刺入皮膚部分的可溶性微針針體完全溶解在皮膚中并將a+c群流腦多糖結(jié)合釋放入皮膚。

本發(fā)明的a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗是均勻地分布在可溶性微針貼片的針體部分，同時(shí)可溶性微針貼片的背襯中不含有a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗，避免了背襯不能進(jìn)入皮膚釋放藥物而造成的藥物浪費(fèi)，實(shí)現(xiàn)藥物利用效率最大化。均勻分布于針體中疫苗可完全釋放于皮膚中，給藥劑量準(zhǔn)確，且釋藥速度可控。

本發(fā)明的流腦多糖結(jié)合疫苗可溶性微針貼片在使用時(shí)，將可溶性微針貼片的針體對(duì)準(zhǔn)所作用的皮膚位置，用手按壓可溶性微針貼片的背襯，可溶性微針貼片的針體刺穿皮膚角質(zhì)層后進(jìn)入表皮，即可進(jìn)行疫苗藥物釋放，使用簡(jiǎn)單方便，不需要技術(shù)熟練的醫(yī)生或護(hù)士來操作，適用于病人自己給藥。

本發(fā)明的流腦多糖結(jié)合疫苗可溶性微針貼片的制備方法簡(jiǎn)單有效。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1制備的金屬陽模模具的示意圖。

圖2為與圖1所示的金屬陽模模具相適配的陰模模具的示意圖。

圖3為本發(fā)明的通過陰模模具所制備的可溶性微針貼片的示意圖。

圖4為本發(fā)明的可溶性微針貼片的整體示意圖，其中1為基底(背襯)，2為針體(針尖)。

圖5為實(shí)施例2中激光共聚焦掃描圖。

圖6為實(shí)施例3中a和c群腦膜炎球菌夾膜多糖抗體滴度柱狀圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的流腦多糖結(jié)合疫苗可溶性微針貼片及其制備方法做進(jìn)一步闡述。

a群流腦多糖結(jié)合疫苗凍干粉、c群流腦多糖結(jié)合疫苗凍干粉、a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗凍干粉均由江蘇無錫羅益生物制藥提供。

實(shí)施例1微針模具的制備

(1)陽模模具的制備：采用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)(cad)設(shè)計(jì)陽模模具的形狀、高度、間距，以及排布微針陣列的密度，模具的具體規(guī)格為：微針針高800μm，針尖間距900μm，針底直徑300μm，陣列10×10行，100個(gè)錐形微針，微針陣列尺寸為1cm×1cm，可根據(jù)模具大小不同，適應(yīng)性設(shè)計(jì)微針陣列的數(shù)目。通過數(shù)模轉(zhuǎn)化將設(shè)計(jì)圖紙轉(zhuǎn)化數(shù)字化機(jī)床設(shè)備的數(shù)字化信息，分別選擇黃銅和不銹鋼作為加工材料按照設(shè)計(jì)尺寸進(jìn)行加工成型；如圖1所示。

(2)陰模模具的制備：將已制備的黃銅和不銹鋼陽模，置于無水乙醇中，超聲20min清洗掉在制備過程中表面殘留的有機(jī)冷卻液，置于室溫下至表面乙醇揮凈為止。取聚二甲基硅氧烷和單體固化劑以11:1(w/w)，用渦旋混合物儀混勻，置于真空箱內(nèi)真空脫氣15min，排盡氣泡后，將液體慢速倒入已制備的黃銅和不銹鋼陽模中，倒入過程避免氣泡的產(chǎn)生，將其放置在烘箱中，烘箱溫度設(shè)置為100℃，保溫1.5小時(shí)，取出，脫模，即得pmds陰模，如圖2所示。

實(shí)施例2

本實(shí)施例中，考察不同含量的a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗對(duì)微針機(jī)械性能的影響。

(1)不同劑量的流腦多糖結(jié)合疫苗微針針尖液制備：取a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗分別用去離子水稀釋濃度為50mg/ml，40mg/ml，30mg/ml，20mg/ml，15mg/ml，10mg/ml，5mg/ml的七個(gè)不同濃度的a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗，分別吸取2.0ml上述六種濃度的疫苗液，分別加入透明質(zhì)酸鈉0.55g、右旋糖酐40(dex40)0.40g、聚維酮k30(pvpk30)0.05g，渦旋混勻，充分溶脹后，放置過夜溶解，即得可溶性微針針尖液(透明質(zhì)酸鈉：右旋糖酐40：聚維酮k30：水的質(zhì)量比為11:8:1：40)。所加入的透明質(zhì)酸鈉的分子量為7775，右旋糖酐40的分子量為37000，聚維酮k30的分子量為40000。

(2)流腦多糖結(jié)合疫苗可溶性微針制備：用注射器吸取步驟(1)制備的可溶性微針針尖液，每個(gè)微針陰?？追湃?50ul針尖液，鋪平后于冷凍離心機(jī)中設(shè)置轉(zhuǎn)速3000rpm/min，溫度為4℃，離心10min，取出吸取多余針尖液，用注射器吸取900ul基底液(透明質(zhì)酸鈉：水＝1:100，透明質(zhì)酸鈉的分子量為1.90×10⁶)，置于覆蓋有針尖液的陰模模具中，于離心機(jī)中設(shè)置轉(zhuǎn)速3000rpm/min，溫度為4℃，離心5min，取出，放入干燥器中干燥固化24小時(shí)(溫度為室溫25℃，濕度為10％)，脫模，即得a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗可溶性微針貼片(微針針體的高度為800um，直徑為180um)。

(3)不同載藥量微針貼片機(jī)械性能測(cè)試：分別用質(zhì)構(gòu)儀、冷場(chǎng)電子顯微鏡測(cè)試觀察不同載藥量疫苗微針的強(qiáng)度和外觀，應(yīng)用明膠模擬皮膚體外溶解時(shí)間，激光共聚焦觀察插入的深度，評(píng)價(jià)各項(xiàng)指標(biāo)的差異性。

(4)不同載藥量的可溶性微針貼片的硬度和延展性見表1：

表1

注：固含量占比是指a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗占可溶性微針針體的重量百分比。

(5)不同載藥量可溶性微針樣品的溶解時(shí)間見表2：

表2

注：固含量占比是指a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗占可溶性微針針體的重量百分比。

(6)不同載藥量可溶性微針樣品插入皮膚深度的激光共聚焦實(shí)測(cè)值見表3,激光共聚焦掃描圖見圖5：

表3

注：固含量占比是指a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗占可溶性微針針體的重量百分比。

結(jié)果分析：當(dāng)以質(zhì)量比為11:8:1的透明質(zhì)酸鈉、右旋糖酐40和聚維酮k30為骨架材料，a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗占可溶性微針針體的重量百分比在8％以內(nèi)時(shí)，所制得的a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗對(duì)可溶性微針的硬度、延展性、溶解時(shí)限、皮膚插入深度均可滿足使用要求，可保證可溶性微針針體部分有效刺穿皮膚，插入深度適中，同時(shí)，進(jìn)入皮膚內(nèi)部的可溶性微針針體部分又能快速溶解。綜合考慮流腦疫苗的劑量要求，優(yōu)選a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗占可溶性微針針體的重量百分比為為5％-8％。當(dāng)a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗的載量過大時(shí)，針體成型后，硬度較低，刺入皮膚深度不夠，無法滿足流腦疫苗的正常劑量要求，且綜合溶解時(shí)間過長(zhǎng)，不能滿足快速溶解的要求。

對(duì)比例1

本對(duì)比例的a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗的可溶性微針的制備方法同實(shí)施例2，a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗占可溶性微針針體的重量百分比為6％，不同在于水溶性高分子材料為透明質(zhì)酸鈉(分子量為7775)，透明質(zhì)酸鈉與水的質(zhì)量比為20：40。

對(duì)比例2

本對(duì)比例的a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗的可溶性微針的制備方法同實(shí)施例2，a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗占可溶性微針針體的重量百分比為6％，不同在于水溶性高分子材料為右旋糖酐40(分子量為37000)，右旋糖酐40與水的質(zhì)量比為20：40。

對(duì)比例3

本對(duì)比例的a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗的可溶性微針的制備方法同實(shí)施例2，a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗占可溶性微針針體的重量百分比為6％，不同在于水溶性高分子材料為透明質(zhì)酸鈉(分子量為7775)和聚維酮k30(分子量為40000)，透明質(zhì)酸鈉、聚維酮k30與水的質(zhì)量比為11:9：40。

對(duì)比例4

本對(duì)比例的a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗的可溶性微針的制備方法同實(shí)施例2，a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗占可溶性微針針體的重量百分比為6％，不同在于水溶性高分子材料為聚乙烯醇1788(124000)和葡聚糖(分子量為7000)，聚乙烯醇1788、葡聚糖與水的質(zhì)量比為11:9：40。

將對(duì)比文件1-4制備得到的a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗的可溶性微針按實(shí)施例2的方法測(cè)試其機(jī)械性能和溶解性能，結(jié)果如表4所示，對(duì)比例制備得到的可溶性微針，其硬度和延展性均比實(shí)施例2差，插入皮膚深度遠(yuǎn)小于實(shí)施例2，不能滿足使用要求。

表4

實(shí)施例3

本實(shí)施例中，通過可溶性微針經(jīng)皮免疫和注射免疫兩種不同給藥方式對(duì)比研究，評(píng)價(jià)可溶性微針經(jīng)皮免疫方式與皮下注射免疫方式免疫作用的差異性。同時(shí)考察針體高度不同的可溶性微針對(duì)免疫效果的影響，主要包括以下步驟：

本實(shí)施例中，透明質(zhì)酸鈉的分子量為7775，右旋糖酐40的分子量為37000，聚維酮k30的分子量為40000。

(1)流腦多糖結(jié)合疫苗注射對(duì)照組的制備：

a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗注射對(duì)照組(ci1)：取a群流腦多糖結(jié)合疫苗凍干粉和c群流腦多糖結(jié)合疫苗凍干粉各5瓶，20μg/瓶，加生理鹽水4.0ml溶解，即得a、c群流腦多糖結(jié)合疫苗濃度分別為25μg/ml的疫苗溶液，作為a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗注射對(duì)照組備用(ci1)。

a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗注射干預(yù)對(duì)照組(ci2)：取a群流腦多糖結(jié)合疫苗凍干粉和c群流腦多糖結(jié)合疫苗凍干粉5瓶，20μg/瓶，加生理鹽水4.0ml溶解，即得a、c群流腦多糖結(jié)合疫苗濃度分別為25μg/ml的疫苗溶液，再精密稱取透明質(zhì)酸鈉1.507mg，右旋糖酐1.096mg，聚維酮0.137mg，加入上述疫苗溶液中，混勻放置4℃冰箱充分溶脹過夜，溶解后備用。作為a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗注射干預(yù)對(duì)照組備用(ci2)。

a+c群流腦多糖疫苗注射組(si)：精密稱取a、c群精制多糖各5.0mg，生理鹽水溶解至20.0ml，精密吸取1.0ml，生理鹽水繼續(xù)稀釋至10.0ml，得25μg/mla+c群流腦多糖疫苗溶液作為多糖疫苗對(duì)照組(si)。

(2)流腦多糖結(jié)合疫苗可溶性微針針尖液的制備

a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗可溶性微針800μm組針尖液：取a群流腦多糖結(jié)合疫苗34.00mg，c群流腦多糖結(jié)合疫苗39.00mg，加入生理鹽水2.0ml溶解后，再精密稱取透明質(zhì)酸鈉0.55g，右旋糖酐0.4g，聚維酮0.05g，加入上述溶液，混勻放置4℃冰箱充分溶脹過夜，溶解后備用。即得a、c群流腦多糖結(jié)合疫苗濃度分別為17mg/ml、19.5mg/ml的針尖液。

a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗可溶性微針600μm組針尖液：取a群流腦多糖結(jié)合疫苗34.00mg，c群多糖結(jié)合流腦疫苗39.00mg，加入生理鹽水2.0ml溶解后，再精密稱取透明質(zhì)酸鈉0.55g,右旋糖酐0.4g，聚維酮0.05g，加入上述溶液，混勻放置4℃冰箱充分溶脹過夜，溶解后備用。即得a和c群流腦多糖結(jié)合疫苗濃度分別為17mg/ml、19.5mg/ml的針尖液。

a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗可溶性微針400μm組針尖液：取a群流腦多糖結(jié)合疫苗34.00mg，c群流腦多糖結(jié)合疫苗39.00mg，加入生理鹽水2.0ml溶解后，再精密稱取透明質(zhì)酸鈉0.55g，右旋糖酐0.4g，聚維酮0.05g，加入上述溶液，混勻放置4℃冰箱充分溶脹過夜，溶解后備用。即得a和c群流腦多糖結(jié)合疫苗濃度分別為17mg/ml、19.5mg/ml的針尖液。(3)流腦多糖結(jié)合疫苗可溶性微針貼片的制備

取a+c群流腦多結(jié)合疫苗可溶性微針800μm組針尖液200μl，注入800μm的pmds陰模模具，使針尖液完全覆蓋整個(gè)模具上表面，置于離心機(jī)中，設(shè)置轉(zhuǎn)數(shù)3000rpm/min，溫度4℃，離心10min。離心完畢后，將模具上方多余的針尖液移去，再注入900μl基底液(透明質(zhì)酸鈉：水＝1:100，透明質(zhì)酸鈉的分子量為1.90×10⁶)，再置于離心機(jī)中，設(shè)置轉(zhuǎn)數(shù)3000rpm/min，溫度4℃，離心10min。離心結(jié)束后取出，將模具整體放置于常溫干燥器中(溫度為室溫25℃、濕度為10％)，干燥24小時(shí)。即得a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗可溶性微針貼片800μm組(8cm)(即可溶性微針針體的高度為800um，直徑為180um)，將所得微針貼片裁剪至貼合小鼠皮膚的小貼片，其中疫苗含量折合a和c群流腦多糖各10μg/片，密閉保存?zhèn)溆谩?/p>

取a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗可溶性微針600μm組針尖液200μl，注入600μm的pmds陰模模具，使針尖液完全覆蓋整個(gè)模具上表面，置于離心機(jī)中，設(shè)置轉(zhuǎn)數(shù)3000rpm/min，溫度4℃，離心10min。離心完畢后，將模具上方多余的針尖液移去，再注入900μl基底液(透明質(zhì)酸鈉：水＝1:100，透明質(zhì)酸鈉的分子量為1.90×10⁶)，再置于離心機(jī)中，設(shè)置轉(zhuǎn)數(shù)3000rpm/min，溫度4℃，離心10min。離心結(jié)束后取出，將模具整體放置于常溫干燥器中(溫度為室溫25℃、濕度為10％)，干燥24小時(shí)。即得a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗可溶性微針貼片600μm組(6cm)(即可溶性微針針體的高度為600um，直徑為180um)，將微針貼片裁剪至貼合小鼠皮膚的小貼片，其中疫苗含量折合a和c群流腦多糖各10μg/片，密閉保存?zhèn)溆谩?/p>

取a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗可溶性微針400μm組針尖液200μl，注入400μm的pmds陰模模具，使針尖液完全覆蓋整個(gè)模具上表面，置于離心機(jī)中，設(shè)置轉(zhuǎn)數(shù)3000rpm/min，溫度4℃，離心10min。離心完畢后，將模具上方多余的針尖液移去，再注入900μl基底液(透明質(zhì)酸鈉：水＝1:100，透明質(zhì)酸鈉的分子量為1.90×10⁶)，再置于離心機(jī)中，設(shè)置轉(zhuǎn)數(shù)3000rpm/min，溫度4℃，離心10min。離心結(jié)束后取出，將模具整體放置于常溫干燥器中(溫度為室溫25℃、濕度為10％)，干燥24小時(shí)。即得a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗可溶性微針貼片400μm組(4cm)(即可溶性微針針體的高度為400um，直徑為180um)，將微針貼片裁剪至貼合小鼠皮膚的小貼片，其中疫苗含量折合a和c群流腦多糖各5μg/片，密閉保存?zhèn)溆谩?/p>

(4)可溶性微針空白對(duì)照組(bm)微針的制備

取200μl空白針尖液(透明質(zhì)酸鈉0.55g，右旋糖酐0.4g，聚維酮0.05g溶解于2.0ml生理鹽水)，注入800μm的pmds陰模模具，使針尖液完全覆蓋整個(gè)模具上表面，置于離心機(jī)中，設(shè)置轉(zhuǎn)數(shù)3000rpm/min，溫度4℃，離心10min。離心完畢后，將模具上方多余的針尖液移去，再注入900μl基底液(透明質(zhì)酸鈉：水＝1:100，透明質(zhì)酸鈉的分子量為1.90×10⁶)，再置于離心機(jī)中，設(shè)置轉(zhuǎn)數(shù)3000rpm/min，溫度4℃，離心10min。離心結(jié)束后取出，將模具整體放置于常溫干燥器中(溫度為室溫25℃、濕度為10％)，干燥24小時(shí)。即得可溶性微針貼片空白對(duì)照組(bm)樣品，密閉保存?zhèn)溆谩?/p>

(5)流腦多糖結(jié)合疫苗免疫小鼠

動(dòng)物分組：選取4-6周齡balb/c雌性小鼠，共48只，適應(yīng)性飼養(yǎng)及檢疫期為3天。將小鼠隨機(jī)分為8組，每組6只，每組用苦味酸染色，用以區(qū)別各組，防止飼養(yǎng)和用藥過程中發(fā)生混淆。

試樣分組：生理鹽水注射對(duì)照組(yi)、可溶性微針貼片空白對(duì)照組(bm)、a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗注射組(ci1)、a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗注射干預(yù)組(ci2)、a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗可溶性微針貼片800μm組(8cm)、a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗可溶性微針貼片600μm組(6cm)、a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗可溶性微針貼片400μm組(4cm)、a+c群流腦多糖疫苗注射組(si)共8組。

免疫程序:生理鹽水注射對(duì)照組(yi)，a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗注射組(ci)，a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗注射干預(yù)組(ci2)，a+c群流腦多糖疫苗注射組(si)分別于0、14、28天皮下注射0.2ml，注射劑量為10μg/劑，其中含a群流腦多糖疫苗、c群流腦多糖疫苗當(dāng)量各5μg。

免疫程序:可溶性微針貼片空白對(duì)照組(bm)、a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗可溶性微針貼片800μm組(8cm)、a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗可溶性微針貼片600μm組(6cm)、a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗可溶性微針貼片400μm組(4cm)分別于給藥前一天對(duì)背部?jī)蓚?cè)皮膚進(jìn)行脫毛處理，于0、14、28天在背部脫毛部位使用可溶性微針貼片給藥。將微針貼片按壓至皮膚表面，使用透氣膠帶粘附在背部，防止貼片脫落，待貼片完全溶解吸收后，取出透氣膠帶，全程免疫共3次。

免疫程序：微針給藥劑量控制，a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗可溶性微針貼片800μm組(8cm)，a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗可溶性微針貼片600μm組(6cm)含有a群流腦多糖結(jié)合疫苗、c群流腦多糖結(jié)合疫苗當(dāng)量各5.0μg，每次貼1片。a+c群流腦結(jié)合疫苗可溶性微針貼片400μm組(4cm)含有a群流腦多糖結(jié)合疫苗、c群流腦多糖結(jié)合疫苗當(dāng)量各2.5μg，每次貼2片。

(6)流腦多糖結(jié)合疫苗免疫小鼠所得血清的制備：小鼠免疫第35天時(shí)或末次免疫后一周，將小鼠摘除眼球后于眼眶采血，37℃放置1h后，4℃放置過夜。置于離心機(jī)中，設(shè)置轉(zhuǎn)數(shù)為3000rpm，離心8min，收集血清，2～8℃冷藏，分離血清于-20℃保存，用于elisa測(cè)定抗體滴度。

(7)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)小鼠血清中igg體液應(yīng)答水平：

①液體制備

包被液配制：0.05mol/碳酸鹽緩沖液(cbs，ph9.6)；na2co3，1.60g；nahco3，2.93g，調(diào)節(jié)ph至9.6，用超純水定容1000ml；

抗體稀釋液配制：0.01mol/l磷酸鹽緩沖液(pbs，ph7.4)；nacl8.0g；kcl0.2g；na2hpo41.44g；kh2po40.24g，調(diào)節(jié)ph至9.6，用超純水定容1000ml；

封閉液配制：稱取1g牛血清白蛋白，溶于100ml抗體稀釋液，混勻；

洗滌液配制：將磷酸鹽溶于1lddh2o，混勻后加入500μltween20，再將ph調(diào)至7.4。

終止液配制：終止液(2mh2so4)的配制：將22.2ml濃硫酸緩慢注入177.8mlddh2o中，混勻

②具體步驟：

包被：用碳酸鹽緩沖液分別稀釋a和c群腦膜炎球菌多糖(抗原)至5μg/ml，分別用100μl/孔包被酶標(biāo)板，4℃過夜(14～16h)；

封閉：將已包被好的酶標(biāo)板取出，棄掉液體，用洗液洗板3次，拍干，每次加入300μl/孔洗液洗板，然后加入封閉液，150μl/孔，置37℃封閉2小時(shí)；

加入一抗：取出已封閉好的酶標(biāo)板，甩掉液體，用洗液洗板3次，拍干。先將供試品血清1:100倍稀釋。對(duì)照組血清先用稀釋液稀釋至1：100，然后加到酶標(biāo)板中，100μl/孔，依次從該孔吸出100μl，梯度稀釋至1：12800。所有血清加入后將酶標(biāo)板放入37℃放置1小時(shí)；

加入二抗：取出已加樣的酶標(biāo)板，甩掉液體，用洗液洗板3次，拍干。將羊抗鼠igg-hrp按適當(dāng)濃度，然后每孔加入100μl該稀釋液，37℃放置1小時(shí)。

加入tmb底物顯色液，100μl/孔，避光顯色10min；

加入終止液(2mh2so4)，50μl/孔，立即置于酶標(biāo)儀上于450nm波長(zhǎng)處測(cè)定od值；

結(jié)果判斷：a樣品/a陰性≥2.1為陽性值

③實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

所有陽性對(duì)照組血清產(chǎn)生抗a和抗c體抗體陽性率均≥80％時(shí)，說明微針經(jīng)皮免疫和皮下注射免疫均已達(dá)預(yù)期免疫效果。各組血清抗體滴度除a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗可溶性微針貼片400μm組(4m)外，a和c群抗體幾何滴度均達(dá)到對(duì)應(yīng)a+c群流腦多糖疫苗注射(si)對(duì)照組的8倍以上，說明流腦多糖結(jié)合疫苗的兩種小鼠接種疫苗方式均到預(yù)期效果。并且a+c群流腦多糖結(jié)合疫苗可溶性微針貼片800μm組(cm)的血清抗體滴度明顯高于同等劑量的注射組抗體滴度，血清a和c抗體幾何平均滴度分別為注射組的1.8倍和1.7倍，表明可溶性微針貼片作為疫苗的傳遞方式能有效的對(duì)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)作用，且優(yōu)于皮下注射免疫。a和c群腦膜炎球菌夾膜多糖抗體滴度見圖6。

以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡(jiǎn)潔，未對(duì)上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。