本發(fā)明屬于中藥材提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種菌草靈芝流浸膏的集成提取方法。
背景技術(shù)：
靈芝是《神農(nóng)本草經(jīng)》記載的名符其實的“上上藥”，被視為吉祥長壽的象征，享有“仙草”的美譽。而菌草鹿角靈芝比一般靈芝的有效成分高3%，安全性也較高，具有提高免疫力、改善睡眠、抗腫瘤、保肝、輔助治療關(guān)節(jié)炎等保健作用。目前已從靈芝中分離得到：三萜類化合物、多糖類、核苷類、甾醇類、生物堿類、呋喃衍生物、氨基酸多肽類、無機元素和脂肪酸等多種成分。多糖類化合物是靈芝所含的重要的化學成分，是靈芝的主要有效成分之一，因其抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和抗衰老等作用倍受人們關(guān)注?，F(xiàn)代科學研究表明，靈芝中的三萜類成分也是其主要有效成分之一，具有抗腫瘤、保肝、抗氧化、抑制血小板聚集、抗真菌等多種藥理作用。
將靈芝切碎，按一定工藝參數(shù)提取、濃縮，蒸干，得到的呈深黃褐色的膏狀物，稱為靈芝流浸膏。凡生產(chǎn)靈芝片劑、膠囊劑、沖劑或糖漿劑均需首先制備靈芝浸膏，其質(zhì)量的優(yōu)劣對靈芝制劑成型工藝及制劑成品的質(zhì)量起著舉足輕重的作用。通過改良流浸膏提取方法，提高流浸膏中有效成分的提取率，將能有效提高工業(yè)中靈芝流浸膏的生產(chǎn)效率、降低生產(chǎn)成本、提高藥物的質(zhì)量及穩(wěn)定性，從而加速靈芝類產(chǎn)品的現(xiàn)代化進程。
關(guān)于段木靈芝方面的研究很多，有大量的文獻可查，技術(shù)和方法都比較成熟，但對于菌草靈芝的研究不是很多，而現(xiàn)今菌草靈芝憑借其生產(chǎn)成本低、成品質(zhì)量好等優(yōu)勢，已逐漸在全國推廣，菌草靈芝這一品種將逐漸成為靈芝研究這一領(lǐng)域的重要品種。特別是，目前關(guān)于菌草靈芝流浸膏方面的研究是空白的，因此，開展菌草靈芝流浸膏方面的研究特別有意義。
本發(fā)明選取菌草鹿角靈芝作為酶法提取的對象，通過復合酶破壞靈芝的細胞壁結(jié)構(gòu)，來提高靈芝有效成分的提取效率；而在提取過程中，利用超聲波產(chǎn)生的強烈振動、攪拌作用以及強烈的空化效應，可加速物質(zhì)有效成分進入溶劑，并提高酶與有效提取物的充分接觸，縮短提取時間，提高提取率，為生產(chǎn)靈芝流浸膏的工藝改進提供理論依據(jù)。并為復合酶和超聲波協(xié)同技術(shù)在中藥制劑方面的應用提供依據(jù)，有助于更好地控制靈芝流浸膏的產(chǎn)量和質(zhì)量。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種靈芝流浸膏的集成提取方法，其可明顯提高菌草鹿角靈芝流浸膏得率，并有效縮短提取時間。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
一種靈芝流浸膏的集成提取方法，其是以菌草鹿角靈芝為原料，采用復合酶解法協(xié)同超聲波法進行提取，獲得所述靈芝流浸膏。其具體包括以下步驟：
1）將菌草鹿角靈芝切成片狀，65℃烘干、粉碎后過篩，得細度為80目的靈芝粉；
2）在所得靈芝粉中加入醋酸-醋酸鈉緩沖液及復合酶進行酶解；
3）酶解結(jié)束后，將其于100℃水浴中放置10min，使酶滅活，然后冷卻至室溫，并進行超聲波提??；
4）所得提取液經(jīng)過濾，減壓濃縮，冷凍干燥，制得所述靈芝流浸膏。
步驟2）中復合酶的加入量為纖維素酶2wt%、木瓜蛋白酶0.8wt%、果膠酶3wt%；復合酶解的條件為：酶解溫度60℃，ph值為5.5，酶解時間為80min。
步驟3）中超聲波提取的條件為：超聲功率300w，溫度35℃，超聲時間15min。
本發(fā)明的顯著優(yōu)點在于：傳統(tǒng)水熱法提取菌草鹿角靈芝流浸膏的得率為2.71%，而本發(fā)明復合酶解協(xié)同超聲波法提取菌草鹿角靈芝流浸膏的得率為45.29%，即采用本發(fā)明方法提取菌草鹿角靈芝，可使其流浸膏得率較常規(guī)方法提高16.71倍，并可有效縮短提取時間。且采用超聲波法提取，其提取過程無需高溫，避免了因高溫對靈芝多糖等化學分子結(jié)構(gòu)的破壞，且無論多糖含量還是dpph自由基的清除能力、還原力、orac值均明顯高于常規(guī)方法所得流浸膏。
具體實施方式
1.材料與方法
1.1材料
1.1.1研究對象
菌草鹿角靈芝，購于福建農(nóng)林大學。
1.1.2主要儀器
超離心研磨儀（德國，retschzm200）；數(shù)控超聲波清洗器（kq-500de型，昆山市超聲儀器有限公司）、紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）、ph計（雷磁phs-3c，廈門精藝興科技有限公司福州辦）、磁力攪拌器（ika-werkegmbhandco.kg）、冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）、恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器re52cs（上海亞榮生化儀器廠）、shz-d(iii)循環(huán)水式真空泵（貢義市予華儀器有限責任公司）、數(shù)顯恒溫水浴鍋hh-6（國華電器有限公司）。
1.1.3主要試劑
纖維素酶400（μ/mg）、木瓜蛋白酶（1000μ/mg）、果膠酶（500μ/mg）、醋酸、醋酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉。
1.2方法
1.2.1靈芝流浸膏的提取
將菌草鹿角靈芝子實體切成片狀，65℃烘干，粉碎，過篩成80目，然后稱取5.0g所得靈芝粉，加入一定ph值的緩沖液（醋酸-醋酸鈉緩沖液ph值為4.6-5.5）100.0ml，并加入適量的酶，充分混勻，恒溫酶解。反應結(jié)束后，將其置于100℃水浴中10min，使酶滅活，然后冷卻至室溫，提取液經(jīng)過濾，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮至10ml左右，冷凍干燥至恒重，計算所得靈芝流浸膏的提取率。其計算方法如下：
靈芝流浸膏提取率/%=
1.2.2復合酶用量配比正交試驗設(shè)計
在60min、50℃、ph值為5的酶解條件下，以纖維素酶、木瓜蛋白酶和果膠酶的用量為正交試驗的3個因素。每個因素各設(shè)定4個水平，進行l(wèi)16(43)正交試驗（表1）。
表１復合酶用量配比正交試驗因素水平表
1.2.3復合酶酶解條件正交試驗設(shè)計
根據(jù)最佳復合酶用量配比試驗結(jié)果，以溫度、ph值、酶提時間作為考察因素，每個因素各設(shè)定3個水平，進行l(wèi)9（33）正交試驗（表2）。
表2復合酶酶解條件正交試驗因素水平表
1.2.4超聲波條件正交實驗設(shè)計
根據(jù)最佳復合酶用量配比試驗以及最佳酶解條件試驗結(jié)果，以時間、溫度、功率作為考察因素，每個因素各設(shè)定3個水平，進行l(wèi)9（33）正交試驗（表3）。
表3超聲波條件正交實驗因素水平表
1.2.5復合酶-超聲協(xié)同提取法與傳統(tǒng)水浴浸提法的比較
稱取5.0g靈芝粉8份，其中4份按照復合酶協(xié)同超聲波提取最佳工藝條件進行提取，另外4份分別加入100ml濃度40％的乙醇溶液，60℃水浴浸提80min。
2結(jié)果與分析
2.1.1復合酶用量配比正交試驗
表4復合酶用量配比正交試驗結(jié)果
從表4中所得正交試驗結(jié)果可以直觀看出，a因素的k4高于k1、k2、k3，可知因素a的4水平優(yōu)于其他水平，b因素的k4高于k1、k2、k3，可知因素b的4水平優(yōu)于其他水平，c因素的k3高于k1、k2、k4，可知因素c的3水平優(yōu)于其他水平。因此確定菌草鹿角靈芝流浸膏的復合酶用量配比為a4b4c3，即纖維素酶（a）2.0%，木瓜蛋白酶（b）0.8%，果膠酶（c）3.0%組合，在60min、50℃、ph值為4.6的酶解條件下，靈芝流浸膏的平均提取率為56.81%。
極差r反映了同一因素取不同水平時k值的變化幅度，為同一因素下不同水平對應的最大值與最小值之差。變化幅度越大，說明該因素對試驗結(jié)果的影響越大，就越重要。纖維素酶（a）、木瓜蛋白酶（b）、果膠酶（c）的極差r值分別為17.64、15.84、13.45，由此可以推導出纖維素酶（a）對結(jié)果的影響最大，果膠酶（c）對結(jié)果的影響最小。三者對結(jié)果的影響從大到小依次為纖維素酶（a）、木瓜蛋白酶（b）、果膠酶（c），其中，纖維素酶（a）是最重要，果膠酶（c）最不重要。由直觀分析數(shù)據(jù)看，因素a、b、c的g值均大于1.5，即各因素均為主要因素，選取不同水平均對菌草靈芝流浸膏提取產(chǎn)生較大影響，影響程度依次為a、b、c。
為了進一步判斷試驗誤差與試驗條件是否影響試驗結(jié)果，將正交試驗數(shù)據(jù)進行方差分析和顯著性檢驗，找出這些因素中起主導作用的主要因素。從表5正交實驗方差分析結(jié)果可知，纖維素酶（a）、木瓜蛋白酶（b）、果膠酶（c）對菌草鹿角靈芝流浸膏提取率的影響都有顯著性，即纖維素酶（a）、木瓜蛋白酶（b）、果膠酶（c）都為主效因子。
表5復合酶用量配比試驗方差分析結(jié)果
2.1.2提取工藝試驗驗證
按正交試驗推導的最佳組合a4b4c3，重復三次。結(jié)果顯示其靈芝流浸膏提取率的平均值為56.81%，rsd=6.65%，為最大值。
2.2復合酶酶解條件正交試驗
表6復合酶酶解條件正交試驗結(jié)果
從表6正交試驗結(jié)果可以直觀看出，a因素的k3高于k1、k2，可知因素a的3水平優(yōu)于其他水平，b因素的k2高于k1、k3，可知因素b的2水平優(yōu)于其他水平，c因素的k2高于k1、k3，推導因素c的2水平優(yōu)于其他水平。因此確定菌草鹿角靈芝流浸膏的酶解條件為a3b2c2，即酶解溫度（a）為60℃，ph值（b）5.5，時間（c）80分鐘。溫度（a）、ph（b）、時間（c）的r值分別為3.01，3.30，11.83，由此可知時間（c）對結(jié)果的影響最大，溫度（a）對結(jié)果的影響最小。因素主次排列順序為c>b>c，即最重要的因素時間80min（c）、ph5.5（b）、溫度40℃（a)。由直觀分析數(shù)據(jù)看，因素a、b的g值均小于1.5，即溫度（a）、ph值（b)因素均為次要因素，時間（c）的g值大于1.5，即時間（c）因素為重要因素。
為了進一步判斷試驗誤差與試驗條件是否影響試驗結(jié)果，將正交試驗數(shù)據(jù)進行方差分析和顯著性檢驗，找出這些因素中起主導作用的主要因素。從表7正交實驗方差分析結(jié)果可知，溫度（a）、ph（b）、時間（c）對菌草鹿角靈芝流浸膏提取率的影響都沒有顯著性，溫度（a）、ph（b）、時間（c）都不是主效因子。
表7復合酶酶解條件方差分析結(jié)果
2.3超聲波條件正交實驗
表８超聲波條件正交實驗結(jié)果
從表8正交實驗結(jié)果可以直觀看出，a因素的k2高于k1、k3，可知因素a的2水平優(yōu)于其他水平，b因素的k3高于k1、k2，可知因素b的3水平優(yōu)于其他水平，c因素的k1高于k2、k3，推導因素c的1水平優(yōu)于其他水平。因此確定菌草鹿角靈芝流浸膏的超聲波條件為a2b3c1，即超聲時間（a）為15min，功率（b)為500w，溫度為35℃。由極差分析可知，因素主次排列順序為c>a>b，即最重要因素為溫度（c），其次為時間（a）、功率（b）。由直觀分析數(shù)據(jù)看，因素a、b、c的g值均小于1.5，即時間（a）、功率（b)、溫度（c）因素均為次要因素。
為了進一步判斷試驗誤差與試驗條件是否影響試驗結(jié)果，將正交試驗進行方差分析，找出各因素中起主導作用的主要因素。從表9方差分析結(jié)果可見，a、b、c的顯著水平都大于0.05，說明時間（a）、功率（b)、溫度（c）對菌草靈芝流浸膏提取率的影響都不顯著，也就是說時間（a）、功率（b)、溫度（c）都不是影響菌草靈芝流浸膏提取率的主效因子（p＞0.05）。
表９超聲波試驗方差實驗結(jié)果
2.4復合酶-超聲協(xié)同提取法與傳統(tǒng)水浴浸提法比較
為了考察復合酶-超聲協(xié)同提取法與傳統(tǒng)水熱提取法對靈芝流浸膏提取率的影響，稱取5.0g靈芝粉8份，其中4份按照復合酶協(xié)同超聲波提取最佳工藝條件進行提取，另外4份分別加入100ml的水，92℃水熱提取11小時。
結(jié)果顯示，采用傳統(tǒng)水熱法提取的菌草鹿角靈芝流浸膏的平均得率為2.71%，其中多糖的平均含量為0.23g，而采用復合酶協(xié)同超聲波法提取的菌草鹿角靈芝流浸膏的平均得率為45.29%，其中多糖的平均含量為2.95g，即復合酶協(xié)同超聲波法提取的菌草鹿角靈芝流浸膏的得率是傳統(tǒng)水熱法提取的16.71倍，而所得流浸膏中多糖含量是傳統(tǒng)水熱法提取的12.83倍。這可能是由于超聲波輔助提取技術(shù)作為一種新型分離技術(shù)，具有攪拌作用、較強的共振效應和高加速度而產(chǎn)生的空化效應等，并且加強了傳質(zhì)過程，致使有效成分進入溶劑加快，提高提取效率，且其不會因產(chǎn)生較高溫度而減弱有機成分的活性。同時，靈芝的細胞質(zhì)地堅硬，細胞壁比較厚，在提取過程中的傳質(zhì)阻力比較大，而通過酶解破壞細胞結(jié)構(gòu)來強化有效成分的傳質(zhì)過程。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。