一種RGD噬菌體/絲素復(fù)合止血材料及其制備方法與流程

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域，涉及了一種可控降解的rgd噬菌體/絲素復(fù)合快速止血材料的制備方法。

背景技術(shù)：

在臨時(shí)性事故的急救治療、手術(shù)過程中的創(chuàng)傷止血都需要合適的止血方法進(jìn)行快速止血，而病患者局部有效地快速止血非常重要，可有效降低人員傷亡。目前報(bào)道的快速止血材料種類主要有三類：粉末狀(如沸石、膠原粉末等)、纖維膜(如氧化再生纖維素等)、多孔海綿材料(如明膠海綿等)。然而這些原料做成的止血材料的作用機(jī)理和使用方法不盡相同，止血藥主要通過增強(qiáng)體內(nèi)凝血因素或抑制抗凝血因素以促使凝血、達(dá)到止血目的，止血效果也有差別。沸石粉末能夠在創(chuàng)傷部位快速止血，但是在吸收血液中的水分后會(huì)放出大量的熱，導(dǎo)致傷口二次創(chuàng)傷和炎癥反應(yīng)；明膠和膠原對(duì)血細(xì)胞的黏附力較差，又因?yàn)槟z原和明膠都是從動(dòng)物體內(nèi)提取的產(chǎn)物，因此用于人體當(dāng)中存在免疫原性的問題；雖然以上研究成果能夠促進(jìn)止血材料的發(fā)展和提升止血材料的性能，但至今尚沒有一種很好的能夠快速止血的材料。

隨著對(duì)止血材料止血性能要求的不斷提高，開發(fā)出止血速度更快、效果更佳的止血材料勢(shì)在必行?；罨难“逄堑鞍讖?fù)合物作為受體能識(shí)別并結(jié)合纖維蛋白原等粘附蛋白所共有的rgd序列(精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸)，導(dǎo)致血小板聚集和血栓形成。

但是在這些相關(guān)的研究中，止血因子或者止血?jiǎng)┏榛瘜W(xué)小分子或者為力學(xué)性能欠缺的多孔材料，不適于大面積創(chuàng)口的止血。還未曾有過將rgd噬菌體與絲素蛋白水溶液進(jìn)行復(fù)合混，然后制備具有優(yōu)良力學(xué)性能、快速止血、高孔隙率的止血材料，用于人體創(chuàng)傷止血的報(bào)道。

絲素纖維是一種天然纖維蛋白，含有對(duì)人體所需的18種氨基酸，家蠶絲蛋白因其獨(dú)特的力學(xué)性能和良好的生物相容性、降解可控性、抗菌性、穩(wěn)定性，以及無免疫原性，在生物材料領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，如可制備成纖維狀、膜狀、多孔狀、凝膠狀、粉末狀等多種形式，應(yīng)用于固定化酶、抗原抗體載體、藥物緩釋載體及凝血材料等的研究。絲素蛋白在開發(fā)快速止血材料方面有著更大的優(yōu)勢(shì)。再生絲素材料對(duì)細(xì)胞的粘附性較強(qiáng)，表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和其它成體細(xì)胞都可以在絲素膜上良好地生長，發(fā)揮其功能。絲素大分子在細(xì)胞周圍構(gòu)成高度水合的凝膠或纖維狀網(wǎng)絡(luò)，對(duì)血液中的特定細(xì)胞群有支持、粘附、保護(hù)的作用。同時(shí)，絲素蛋白溶液可以通過材料制備方法制備出2維或者3維材料，為止血因子或者止血?jiǎng)┨峁┮粋€(gè)合適的儲(chǔ)藏微環(huán)境，充當(dāng)“骨架”的作用。噬菌體結(jié)構(gòu)跨越了一般化學(xué)和材料科學(xué)的典型尺度，在水中具有優(yōu)越的分散性。其外殼蛋白展示有大量的含氧活性基團(tuán)，如羰基、羧基、羥基與環(huán)氧基等。因此，為氧化石墨烯與絲素蛋白之間的相互作用提供了大量的結(jié)合位點(diǎn)。因此基于絲素蛋白的止血支架材料在生物材料領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)傳統(tǒng)制備技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供了一種由絲蛋白制成的生物可吸收的天然生物材料作為支撐部分，結(jié)合rgd噬菌體的可控降解的rgd噬菌體/絲素止血材料，具有顯著的促進(jìn)凝血效應(yīng)。主要用于皮膚創(chuàng)面、臟器的的止血，是一種理想的止血材料。

一種rgd噬菌體/絲素復(fù)合止血材料，以天然高分子材料絲素蛋白材料為載體，以rgd噬菌體為核心止血?jiǎng)?，制成可控降解的止血支架材料?/p>

其中，復(fù)合止血材料中絲素終濃度：0.001％～40％,rgd噬菌體終濃度：10²pfu/ml～10²⁰pfu/ml。

優(yōu)選的，所述rgd噬菌體包含活性成分rgd肽的止血材料,所述rgd肽序列為:精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(arg-gly-asp)；rgd肽是通過噬菌體展示技術(shù)得到，方法如下：1)噬菌體展示載體的構(gòu)建；2)tg1細(xì)胞的活化及擴(kuò)增；3)連接和轉(zhuǎn)化tg1細(xì)胞；4)基因測(cè)序；5)噬菌體展示及擴(kuò)增。

另外，本發(fā)明提供了一種快速性止血紗布，由rgd噬菌體/絲素復(fù)合止血材料制備而成。

絲素蛋白材料本身止血能力有限，目前絲素蛋白止血材料的研究是從材料的結(jié)構(gòu)、電荷以及界面性質(zhì)等方面進(jìn)行。絲素蛋白是一種含有賴氨酸、精氨酸等陽離子氨基酸的高分子蛋白質(zhì)，能夠與帶負(fù)電的血小板和紅細(xì)胞產(chǎn)生一定的靜電吸附作用。而申請(qǐng)?zhí)枮?01510953638.1(一種rgd-m13噬菌體/氧化再生纖維素氧化再生纖維素)的專利，其采用的策略為使用氧化再生纖維素為材料支撐部分，氧化再生纖維素止血原理為酸性羧基會(huì)導(dǎo)致溶血，使得血紅細(xì)胞溶解、破裂，并釋放出血紅蛋白參與凝血。因此使用絲蛋白作為凝血材料不破壞血液中細(xì)胞的活性，具有生物相容性高的特性。凝絲素蛋白的活性基團(tuán)化學(xué)特性不同，可以與血小板、紅細(xì)胞膜表面的抗體分子進(jìn)行多重反應(yīng)，同時(shí)也存在離子鍵和氫鍵等非共價(jià)鍵的結(jié)合作用。由于氨基的親水性，能夠促進(jìn)纖維蛋白原吸附的數(shù)量，從而會(huì)增加血小板粘附和促進(jìn)血栓，達(dá)到止血效果。絲素材料表面吸附了血液中的蛋白質(zhì),激發(fā)血小板和凝血因子,從而發(fā)生凝血。因此，在應(yīng)用研究方面,可以用絲素作為一種止血?jiǎng)┑妮d體,一方面又能夠提高和改善凝血因子的保存，增強(qiáng)止血效果。

本發(fā)明高濃度絲素與rgd噬菌體共混水溶液具有良好的混合性，如圖2所示為高濃度絲素與rgd噬菌體的共混水溶液的原子力顯微圖：長纖維狀物體為噬菌體，白色顆粒為絲素，絲素顆粒能夠均勻分布在噬菌體纖維的表面(圖2b為圖2a的放大圖)，制得的復(fù)合支架材料的止血效果優(yōu)良，并且具有可控的降解率，具有廣泛的應(yīng)用前景。

另外本發(fā)明還提供了一種可控降解的rgd噬菌體/絲素止血材料的制備方法，工藝簡單，處理方便。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種可控降解的rgd噬菌體/絲素止血材料的制備方法，采用如下步驟：

1)將蠶繭脫膠后得到的纖維狀絲素依次經(jīng)過溶解、過濾、透析和離心后，濃縮至質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為1％～25％的絲素蛋白水溶液；

2)將濃度為10⁷pfu/ml～10¹⁵pfu/ml的噬菌體溶液超聲進(jìn)行分散，與0.001％-40％絲素蛋白溶液混合，攪拌均勻，得到rgd噬菌體/絲素復(fù)合溶液；

3)再采用冷凍干燥法得到不同形貌的三維蜂窩狀多孔結(jié)構(gòu)的rgd噬菌體/絲素復(fù)合止血材料；

4)根據(jù)所需rgd噬菌體/絲素復(fù)合止血材料的降解速率，在30％-100％的酒精溶液中處理0.1-24h，止血材料的降解速率能夠控制在10min至1個(gè)月降解。

所述步驟1)中的絲素原料也可采用家蠶絲膠、絲腺蛋白、野蠶絲蛋白、蜘蛛絲蛋白或重組絲蛋白等絲蛋白，但不限于此。

所述步驟1)中的絲素質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.001％～40％的水溶液，絲素蛋白水溶液質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.10％～25％。

步驟2)中所述的rgd-噬菌體懸液的濃度為：10²pfu/ml～10²⁰pfu/ml，優(yōu)先使用濃度為：10⁷pfu/ml～10¹⁵pfu/ml。

步驟2)中所述的rgd-噬菌體是在噬菌體外殼蛋白展示有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(rgd)的序列。

其中，rgd-噬菌體的制備方法，包括如下步驟：

1)噬菌體展示載體的構(gòu)建，其具體步驟如下：

a.設(shè)計(jì)前引物和后引物用于制備rgd插入片段肽對(duì)應(yīng)堿基序列：

primer1，引入ncoi酶切位點(diǎn)：5′-atccatggcgcgtggcgacgatcccgcaaaagcg-3′；

primer2，引入hindiii酶切位點(diǎn)：5′-gcaagcttttatcagcttgctttcgag-3′；

b.將primer1和primer1分別配成寡聚核苷酸單鏈溶液，以m13dna為模板使用phusiondna聚合酶擴(kuò)增整個(gè)編碼序列；

c.將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶酶切；

d.退火寡聚核苷酸鏈與質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物在t4dna連接酶作用下連接入載體，得到重組質(zhì)粒；

2)tg1細(xì)胞的活化及質(zhì)粒重組到tg1細(xì)胞；

a.將tg1細(xì)胞接種至lb培養(yǎng)基中，37℃，220r/min培養(yǎng)4h活化；以步驟1)中的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)到宿主菌tg1細(xì)胞，37℃繼續(xù)培養(yǎng)，得到感受態(tài)細(xì)胞；

b.挑取單菌落用于擴(kuò)增細(xì)胞，質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒測(cè)序以驗(yàn)證質(zhì)粒為陽性，證明rgd基因序列在tg1細(xì)胞表達(dá)，得到感受態(tài)tg1細(xì)胞；

3)rgd噬菌體擴(kuò)增及純化

將步驟2)中的感受態(tài)tg1細(xì)胞在37℃培養(yǎng)2個(gè)小時(shí)后加入輔助噬菌體，再加入iptg作為誘導(dǎo)劑，過夜培養(yǎng)；之后高速離心收集上清去除tg1細(xì)胞；peg/nacl沉淀、離心收集沉淀得到rgd噬菌體顆粒，重復(fù)該步驟2次，rgd噬菌體在去離子水中溶解分散，得到rgd噬菌體水溶液，通過uv光譜計(jì)算噬菌體數(shù)量；

4)rgd噬菌體冷凍干燥；

將步驟3)中的rgd噬菌體水溶液在冷凍干燥機(jī)中-40℃冷凍干燥12-24小時(shí)，得到rgd噬菌體粉末。

其中，所述多肽展示在噬菌體的pⅷ外殼蛋白上，或piii、pvi、pix或pvii蛋白位點(diǎn)上。

所述步驟3)得到的rgd噬菌體水溶液濃度為：10⁵pfu/ml～10¹⁵pfu/ml。

所述步驟3)得到的rgd噬菌體水溶液濃度為：10¹¹pfu/ml～10¹³pfu/ml。

本專利給出了快速止血材料的制備工藝及最佳條件。根據(jù)不同的手術(shù)類型，可以用于皮膚以及不同器官創(chuàng)面的止血，例如腫瘤切除的手術(shù)創(chuàng)面或骨組織外傷性破裂的傷口，在發(fā)揮止血功能的同時(shí)，起到促進(jìn)損傷組織再生修復(fù)的作用，其止血效果要優(yōu)于單獨(dú)使用絲素蛋白材料，凝血試驗(yàn)表明，制備的快速性止血紗布，具有快速止血、生物相容性高的特點(diǎn)。通過進(jìn)一步臨床試驗(yàn)研究，有望給出一種新型的可吸收止血制品。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下突出特點(diǎn)：

(1)處理后的絲素蛋白，能吸引血液里帶負(fù)電荷的血小板和紅細(xì)胞，增加血小板粘附和促進(jìn)血栓；

(2)在一定時(shí)間后，rgd噬菌體/絲素多孔狀止血材料能夠降解，再被機(jī)體吸收，使得傷口部位不留結(jié)痂。

(3)不單純依賴于絲素蛋白的止血能力，通過復(fù)合rgd噬菌體，加速止血材料的止血速度和效果。

附圖說明

圖1為rgd肽展示在噬菌體外殼pⅷ蛋白的n-端示意圖。

圖2為高濃度絲素與rgd噬菌體的共混水溶液的原子力顯微圖。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的解釋而本發(fā)明并不局限于以下實(shí)施例。

本申請(qǐng)所用噬菌體止血?jiǎng)┯缮暾?qǐng)人制備，具體方法如下：

1)噬菌體展示載體的構(gòu)建，其具體步驟如下：

a.設(shè)計(jì)前引物和后引物用于制備rgd插入片段肽對(duì)應(yīng)堿基序列：

primer1：5′-atccatggcgcgtggcgacgatcccgcaaaagcg-3′(引入ncoi酶切位點(diǎn))

primer2：5′-gcaagcttttatcagcttgctttcgag-3′(引入hindiii酶切位點(diǎn))；

b.將primer1和primer1分別配成寡聚核苷酸單鏈溶液，以m13dna為模板擴(kuò)增整個(gè)編碼序列(使用phusiondna聚合酶)；

c.將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶酶切；

d.退火寡聚核苷酸鏈與質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物在t4dna連接酶作用下連接入載體，得到重組質(zhì)粒。

2)tg1細(xì)胞的活化及質(zhì)粒重組到tg1細(xì)胞；

a.將tg1細(xì)胞接種至lb培養(yǎng)基中，37℃，220r/min培養(yǎng)4h活化。以步驟1)中的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)到宿主菌tg1細(xì)胞，37℃繼續(xù)培養(yǎng)，得到感受態(tài)細(xì)胞；

b.挑取單菌落用于擴(kuò)增細(xì)胞，質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒測(cè)序以驗(yàn)證質(zhì)粒為陽性，證明rgd基因序列在tg1細(xì)胞表達(dá)，得到感受態(tài)tg1細(xì)胞。

3)rgd噬菌體擴(kuò)增及純化

將步驟2)中的感受態(tài)tg1細(xì)胞在37℃培養(yǎng)2個(gè)小時(shí)后加入輔助噬菌體，再加入iptg作為誘導(dǎo)劑，過夜培養(yǎng)。之后高速離心收集上清去除tg1細(xì)胞。peg/nacl沉淀、離心收集沉淀得到rgd噬菌體顆粒，重復(fù)該步驟2次，rgd噬菌體在去離子水中溶解分散，得到rgd噬菌體水溶液，通過uv光譜計(jì)算噬菌體數(shù)量。

4)rgd噬菌體冷凍干燥；

將步驟3)中的rgd噬菌體水溶液在冷凍干燥機(jī)中-40℃冷凍干燥24小時(shí)，得到rgd噬菌體粉末(如圖1)。

實(shí)施例1

可控降解的rgd噬菌體/絲素止血材料的制備方法

1)將蠶繭脫膠后得到的纖維狀絲素依次經(jīng)過溶解、過濾、透析和離心后，濃縮至質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為100mg/ml的絲素蛋白水溶液；

2)將濃度為10⁷pfu/ml的噬菌體溶液超聲進(jìn)行分散，與絲素蛋白溶液混合，攪拌均勻，得到rgd噬菌體/絲素復(fù)合溶液；

3)再在溫度為-20℃下真空冷凍干燥24h，得到三維多孔的rgd噬菌體/絲素復(fù)合止血材料；

4)在30％的酒精處理，能夠使得三維多孔的rgd噬菌體/絲素止血材料的降解速率控制在一天內(nèi)。

實(shí)施例2

可控降解的rgd噬菌體/絲素止血材料的制備方法，包括如下步驟：

1)將蠶繭脫膠后得到的纖維狀絲素依次經(jīng)過溶解、過濾、透析和離心后，濃縮至質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為1mg/ml的絲素蛋白水溶液；

2)將濃度為10¹⁴pfu/ml的噬菌體溶液超聲進(jìn)行分散，與絲素蛋白溶液混合，攪拌均勻，得到rgd噬菌體/絲素復(fù)合溶液；

3)再在溫度為-80℃下真空冷凍干燥48h，得到三維多孔的rgd噬菌體/絲素復(fù)合止血材料；

4)在80％的酒精處理，能夠使得三維多孔的rgd噬菌體/絲素止血材料降解速率基本不發(fā)生降解(1個(gè)月后溶失率大于80％)。

實(shí)施例3

可控降解的rgd噬菌體/絲素止血材料的制備方法，采用如下步驟：

1)將蠶繭脫膠后得到的纖維狀絲素依次經(jīng)過溶解、過濾、透析和離心后，濃縮至質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.1mg/ml的絲素蛋白水溶液；

2)將濃度為10²⁰pfu/ml的噬菌體溶液超聲進(jìn)行分散，與絲素蛋白溶液混合，攪拌均勻，得到rgd噬菌體/絲素復(fù)合溶液；

3)再采用冷凍干燥法得到三維多孔的rgd噬菌體/絲素復(fù)合止血材料；

4)取新鮮兔血2ml，將制備的rgd噬菌體/絲素復(fù)合止血材料放入新鮮兔血中，3分鐘后新鮮兔血發(fā)生凝固。

由此，本發(fā)明工藝簡單，rgd噬菌體和絲素蛋白之間接觸即發(fā)生超分子自組裝制成止血材料；該發(fā)明制得的止血材料具有良好的快速止血效果，而且能夠調(diào)控噬菌體/絲素止血材料的降解速度，克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不成形問題，適合于工業(yè)化生產(chǎn)；最終得到的rgd噬菌體/絲素止血材料用途廣泛，可用于手術(shù)過后止血材料、傷口敷料來使用，有助于創(chuàng)面愈合且無刺激，并且環(huán)保無污染，具有突出顯著的技術(shù)效果。

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。