一種負(fù)載血根堿/明膠微球的復(fù)合水凝膠支架及其制備方法和應(yīng)用與流程

本發(fā)明屬于天然高分子材料技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種負(fù)載血根堿/明膠微球的復(fù)合水凝膠支架及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

皮膚是人體最大的器官，約占人體重量的16％，同時(shí)也是最容易受到傷害的器官之一。皮膚具有體溫調(diào)節(jié)，機(jī)械保護(hù)，感知和機(jī)體保護(hù)功能，潰爛、創(chuàng)傷、手術(shù)損傷和燒傷是皮膚受損的重要原因。其中燒傷是一個(gè)世界公認(rèn)的治療問(wèn)題，當(dāng)缺乏適當(dāng)?shù)闹委?，使得皮膚傷口經(jīng)常暴露于細(xì)菌易引發(fā)感染，延長(zhǎng)炎癥，干擾再加上皮化，抑制膠原產(chǎn)生，延遲傷口愈合。此外，一旦細(xì)菌粘附于固體表面，它們形成可以保護(hù)細(xì)菌免受免疫系統(tǒng)和抗生素的生物膜，同時(shí)釋放內(nèi)毒素引起敗血癥可導(dǎo)致死亡。因此，在傷口處理中防止細(xì)菌感染并且生物膜形成是最重要的。燒傷愈合之后通常會(huì)出現(xiàn)很小的疤痕，但是現(xiàn)階段對(duì)于二級(jí)和三級(jí)燒傷的治療遠(yuǎn)沒(méi)有達(dá)到讓人們滿意的程度。總的來(lái)說(shuō)，燒傷的治療有三個(gè)步驟：消炎、增殖、再塑形。但是，燒傷后的皮膚很難恢復(fù)到燒傷前的強(qiáng)度。為了解決這個(gè)問(wèn)題，研究人員把目光轉(zhuǎn)向了研發(fā)皮膚敷料或者替代物上，其中水凝膠的結(jié)構(gòu)和人體細(xì)胞外基質(zhì)相似，因此可以提供有利于血管網(wǎng)絡(luò)再生重組的三維環(huán)境。

常用于構(gòu)建水凝膠的材料包括天然材料如膠原、透明質(zhì)酸、海藻酸鹽、殼聚糖、細(xì)菌纖維素、明膠、葡聚糖等和合成材料如聚乙烯醇(pva)、聚乙二醇(peg)等。其中多糖基水凝膠無(wú)細(xì)胞毒性，具有生物降解性，從結(jié)構(gòu)角度而言，多糖具有可反應(yīng)的官能團(tuán)，通過(guò)化學(xué)改性可形成多種特定功能的水凝膠。葡聚糖是天然的、非動(dòng)物源的多糖，哺乳動(dòng)物組織中含有葡聚糖酶，因此葡聚糖具有良好的生物相容性，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)和制藥學(xué)領(lǐng)域。葡聚糖結(jié)構(gòu)中含有豐富的活性羥基官能團(tuán)，使得它易于化學(xué)改性，可以將改性后的葡聚糖制備成多種支架，包括微球、微管和水凝膠。透明質(zhì)酸(hyaluronicacid,ha)是一種獨(dú)特的線性大分子粘多糖，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，透明質(zhì)酸不僅可以促進(jìn)細(xì)胞的黏附與增殖，而且在生物性修復(fù)術(shù)中，透明質(zhì)酸可隔離組織表面，作為一種機(jī)械保護(hù)劑，在手術(shù)后可防止粘連及纖維性組織形成。高濃度、高分子量的透明質(zhì)酸不但能抑制出血，減少能形成永久粘連骨架的血塊數(shù)量，而且能抑制成纖維細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和活性。透明質(zhì)酸芐酯的微孔膜已被研究證明是培養(yǎng)和輸送活性角質(zhì)化細(xì)胞進(jìn)行燒傷、慢性潰瘍治療的一種優(yōu)良的材料。

臨床上常用的如硫酸慶大霉素，萬(wàn)古霉素等應(yīng)用于敏感菌引起的系統(tǒng)感染或局部感染，但長(zhǎng)期服用或者在體內(nèi)的血藥濃度過(guò)高，會(huì)帶來(lái)一系列的毒副作用，例如耳中毒、腎中毒、血尿，甚至過(guò)敏性休克后導(dǎo)致死亡，降低了臨床治療效果。血根堿是一種季苯并菲啶生物堿在植物中通過(guò)應(yīng)激刺激產(chǎn)生，用作植物抗毒素，抗真菌和細(xì)菌病原體，具有抗微生物，抗氧化，抗炎和促凋亡作用，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌都很有效，可以避免常用抗生素引起的耐藥性。同時(shí)血根堿因其氧化性容易失效，必須研發(fā)出一種新型的藥物載體體系保證其藥效。

明膠，具有良好的生物相容性，已經(jīng)廣泛被運(yùn)用在生物醫(yī)學(xué)和藥物載體等方面上，特別是由明膠制備出來(lái)的微球，已經(jīng)成為了一種很成熟的藥物載體體系。

近年來(lái)，很多關(guān)于水凝膠支架的研究都致力于外傷方面的應(yīng)用。然而，水凝膠不僅僅可以作為支架還可以負(fù)載藥物、細(xì)胞因子、抗體或者是細(xì)胞來(lái)幫助皮膚實(shí)現(xiàn)完全的恢復(fù)。在組織工程中，需要多孔支架作為模板和指導(dǎo)細(xì)胞粘附，延伸，增殖。同時(shí)理想的皮膚組織工程材料應(yīng)具有高液體吸收性容量，適當(dāng)?shù)臍怏w滲透，生物相容性和抗菌。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于此，為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種復(fù)合水凝膠支架及其制備方法和應(yīng)用，該復(fù)合水凝膠支架負(fù)載血根堿/明膠微球。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：

一種負(fù)載血根堿/明膠微球的復(fù)合水凝膠支架的制備方法，包括以下步驟：

(1)將濃度為10～20mg/ml血根堿溶液滴加到明膠微球中，于4～22℃放置過(guò)夜，然后冷凍干燥，得到血根堿/明膠微球復(fù)合物；其中每克明膠微球加入血根堿溶液的量為2～10ml；

(2)將步驟(1)的血根堿/明膠微球復(fù)合物加入到醛基化葡聚糖-氨基化透明質(zhì)酸鈉預(yù)凝膠溶液中，攪拌均勻，常溫下靜置凝膠，然后冷凍干燥，得到負(fù)載血根堿/明膠微球的復(fù)合水凝膠支架；其中，醛基化葡聚糖-氨基化透明質(zhì)酸鈉預(yù)凝膠溶液與血根堿/明膠微球復(fù)合物的用量比為0.6～1.2ml：2～10mg。

在其中一些實(shí)施例中，所述醛基化葡聚糖-氨基化透明質(zhì)酸鈉預(yù)凝膠溶液采用以下方法進(jìn)行制備：將2wt％的氨基化透明質(zhì)酸鈉溶液和2-10％wt的醛基化葡聚糖溶液以2:1、1:1或1:2的體積比攪拌均勻，即得；所述醛基化葡聚糖溶液是通過(guò)溶解于ph＝7.4的pbs緩沖液中得到的。

在其中一些實(shí)施例中，步驟(2)中所述的氨基化透明質(zhì)酸鈉采用以下方法進(jìn)行制備：

a、將透明質(zhì)酸鈉溶解于去離子水中，于37℃，搖床速度100r/min條件下得到2mg/ml的透明質(zhì)酸鈉溶液，再加入10倍量的己二酰肼，常溫下以400r/min的速率磁力攪拌溶解，調(diào)節(jié)ph至6.8；

b、取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和1-羥基苯并三唑溶于二甲基亞砜和水的混合液中，所述二甲基亞砜和水的體積比為1：1；

c、將步驟b得到的混合液滴加到步驟a的反應(yīng)液中，常溫下保持ph6.8混合6～12h，再調(diào)節(jié)ph至7.0，去離子水透析2～4天，經(jīng)冷凍干燥，得到氨基化透明質(zhì)酸鈉。

在其中一些實(shí)施例中，步驟c中所述透析的截留分子量為8000～12000。

在其中一些實(shí)施例中，步驟a中所述透明質(zhì)酸鈉為低分子量醫(yī)藥級(jí)別的透明質(zhì)酸鈉。

在其中一些實(shí)施例中，步驟(2)中所述醛基化葡聚糖采用以下方法進(jìn)行制備：在100mg/ml的葡聚糖水溶液中加入100mg/ml的高碘酸鈉水溶液，避光混合12h得混合液，再加入乙二醇溶液，反應(yīng)12～30min，去離子水透析2～4天，冷凍干燥得到醛基化葡聚糖；所述葡聚糖水溶液與所述高碘酸鈉水溶液的體積比為2:1，所述乙二醇溶液與所述混合液的體積比為1:6。

在其中一些實(shí)施例中，所述葡聚糖是從以蔗糖為培養(yǎng)基經(jīng)腸膜狀明串珠菌菌屬發(fā)酵獲取的。

在其中一些實(shí)施例中，所述透析的截留分子量為8000～12000。

在其中一些實(shí)施例中，步驟(1)和(2)中所述冷凍干燥的條件為：-20℃干燥24h。

本發(fā)明還提供了上述制備方法制備得到的負(fù)載血根堿/明膠微球的復(fù)合水凝膠支架。

本發(fā)明還提供了上述負(fù)載血根堿/明膠微球的復(fù)合水凝膠支架在制備促進(jìn)皮膚傷口愈合的藥物中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明的負(fù)載血根堿/明膠微球的復(fù)合水凝膠支架吸水率為23～30倍，孔隙率為68～88％，孔徑為20～200μm，該復(fù)合水凝膠支架能達(dá)到藥物緩釋，能夠降低由于高的血藥濃度帶來(lái)的對(duì)人體的傷害，避免臨床上常用抗生素的耐藥性，而且該支架抗菌范圍廣，效果明顯；

(2)本發(fā)明的負(fù)載血根堿/明膠微球的復(fù)合水凝膠支架制備工藝簡(jiǎn)單、材料來(lái)源廣泛，生產(chǎn)效率高，成本低，可應(yīng)用于工業(yè)化大生產(chǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的負(fù)載血根堿/明膠微球復(fù)合水凝膠支架的掃描電鏡圖；

圖2是對(duì)比例1的葡聚糖-透明質(zhì)酸水凝膠冷凍干燥支架的掃描電鏡圖；

圖3是對(duì)比例2的負(fù)載血根堿的復(fù)合水凝膠冷凍干燥支架的掃描電鏡圖；

圖4是對(duì)比實(shí)例2的負(fù)載血根堿的復(fù)合水凝膠支架和實(shí)施例1的負(fù)載血根堿/明膠微球復(fù)合物以及負(fù)載血根堿/明膠微球復(fù)合水凝膠支架的血根堿釋放圖；其中：a為對(duì)比例2的負(fù)載血根堿的復(fù)合水凝膠支架的血根堿釋放圖；b為實(shí)施例1的負(fù)載血根堿/明膠微球復(fù)合物的血根堿釋放圖；c為實(shí)施例1負(fù)載血根堿/明膠微球復(fù)合水凝膠支架的血根堿釋放圖；

圖5是實(shí)施例1的負(fù)載血根堿/明膠微球復(fù)合水凝膠支架、對(duì)比例1的葡聚糖-透明質(zhì)酸水凝膠支架、對(duì)比例2的負(fù)載血根堿的復(fù)合水凝膠支架和對(duì)比例3商品化敷料alginateag對(duì)綠膿桿菌的抗菌環(huán)效果圖；其中：a為對(duì)比例1的葡聚糖-透明質(zhì)酸水凝膠支架效果圖；b為對(duì)比例3商品化敷料alginateag的抗菌效果圖；c為對(duì)比例2的負(fù)載血根堿的復(fù)合水凝膠支架的抗菌效果圖；d為實(shí)施例1的負(fù)載血根堿/明膠微球復(fù)合水凝膠支架的抗菌效果圖；

圖6是實(shí)施例1的負(fù)載血根堿/明膠微球復(fù)合水凝膠支架、對(duì)比例1的葡聚糖-透明質(zhì)酸水凝膠支架、對(duì)比例2的負(fù)載血根堿的復(fù)合水凝膠支架和對(duì)比例3商品化敷料alginateag對(duì)金黃色葡糖球菌的抗菌環(huán)效果圖；其中：a為對(duì)比例1的葡聚糖-透明質(zhì)酸水凝膠支架效果圖；b為對(duì)比例3商品化敷料alginateag的抗菌效果圖；c為對(duì)比例2的負(fù)載血根堿的復(fù)合水凝膠支架的抗菌效果圖；d為實(shí)施例1的負(fù)載血根堿/明膠微球復(fù)合水凝膠支架的抗菌效果圖；

圖7是實(shí)施例1的負(fù)載血根堿/明膠微球復(fù)合水凝膠支架、對(duì)比例1的葡聚糖-透明質(zhì)酸水凝膠支架、對(duì)比例2的負(fù)載血根堿的復(fù)合水凝膠支架和對(duì)比例3商品化敷料alginateag對(duì)大腸桿菌的抗菌環(huán)效果圖；其中：a為對(duì)比例1的葡聚糖-透明質(zhì)酸水凝膠支架效果圖；b為對(duì)比例3商品化敷料alginateag的抗菌效果圖；c為對(duì)比例2的負(fù)載血根堿的復(fù)合水凝膠支架的抗菌效果圖；d為實(shí)施例1的負(fù)載血根堿/明膠微球復(fù)合水凝膠支架的抗菌效果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此，本發(fā)明未述及之處適用于現(xiàn)有技術(shù)。

以下實(shí)施例中所使用的試劑或原料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均來(lái)源于市售。

實(shí)施例1

本實(shí)施例的一種負(fù)載血根堿/明膠微球的復(fù)合水凝膠支架的制備方法，包括以下步驟：

(1)取100mg透明質(zhì)酸鈉溶解于20ml去離子水中，在搖床上以37℃，100r/min條件下得到2mg/ml的透明質(zhì)酸鈉溶液，再加入10倍量的己二酰肼(1g)于常溫下以400r/min的速率磁力攪拌溶解，用0.1mol/l的hcl和0.1mol/lnaoh溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)后的ph至6.8。取192mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和132mg1-羥基苯并三唑溶于1ml(二甲基亞砜：水＝1:1)的混合液中。將現(xiàn)配的混合液滴加到調(diào)節(jié)ph＝6.8的反應(yīng)液中在常溫下繼續(xù)混合6～12h，ph維持在6.8。向反應(yīng)6～12h后的溶液中用0.1mol/l的hcl和0.1mol/lnaoh溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)后的ph至7.0，用去離子水透析(截留分子量為8000～12000)2～4天，經(jīng)冷凍干燥(-20℃干燥24h)得到氨基化透明質(zhì)酸鈉白色粉末；

(2)取1g葡聚糖溶解于10ml的去離子水中，得到100mg/ml的葡聚糖水溶液，向葡聚糖溶液中加入100mg/ml的高碘酸鈉水溶液2ml混合12h，避光，向混合后的溶液加入1ml乙二醇溶液，反應(yīng)20min左右，用去離子水透析(截留分子量為8000～12000)2～4天，經(jīng)冷凍干燥(-20℃干燥24h)得到醛基化葡聚糖白色粉末；

(3)將步驟(1)的氨基化透明質(zhì)酸鈉粉末溶解于去離子水中配制得到2wt％的氨基化透明質(zhì)酸鈉溶液，將步驟(2)醛基化葡聚糖溶解于ph＝7.4的pbs緩沖液中得到6wt％的醛基化葡聚糖，將2wt％的氨基化透明質(zhì)酸鈉溶液和6wt％的醛基化葡聚糖溶液以2:1的體積比攪拌均勻得到醛基化葡聚糖-氨基化透明質(zhì)酸鈉預(yù)凝膠溶液；

(4)將血根堿溶于去離子水中，攪拌均勻，得到濃度為10mg/ml血根堿溶液；將濃度為10mg/ml血根堿溶液滴加到明膠微球中，于4～22℃放置過(guò)夜，然后冷凍干燥，得到血根堿/明膠微球復(fù)合物；其中每克明膠微球加入血根堿溶液的量為2ml；

(2)將10mg步驟(4)的血根堿/明膠微球復(fù)合物加入到1.2ml步驟(3)的醛基化葡聚糖-氨基化透明質(zhì)酸鈉預(yù)凝膠溶液，靜置成凝膠后，-20℃冷凍干燥24h，得到本實(shí)施例的負(fù)載血根堿/明膠微球的復(fù)合水凝膠支架。

實(shí)施例2

本實(shí)施例的一種負(fù)載血根堿/明膠微球的復(fù)合水凝膠支架的制備方法，包括以下步驟：

(1)取100mg透明質(zhì)酸鈉溶解于20ml去離子水中，在搖床上以37℃，100r/min條件下得到2mg/ml的透明質(zhì)酸鈉溶液，再加入10倍量的己二酰肼(1g)于常溫下以400r/min的速率磁力攪拌溶解。用0.1mol/l的hcl和0.1mol/lnaoh溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)后的ph至6.8。取192mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和132mg1-羥基苯并三唑溶于1ml(二甲基亞砜：水＝1:1)的混合液中。將現(xiàn)配的混合液滴加到調(diào)節(jié)ph＝6.8的反應(yīng)液中在常溫下繼續(xù)混合6～12h，ph維持在6.8。向反應(yīng)6～12h后的溶液中用0.1mol/l的hcl和0.1mol/lnaoh溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)后的ph至7.0，用去離子水透析(截留分子量為8000～12000)2～4天，經(jīng)冷凍干燥(-20℃干燥24h)得到氨基化透明質(zhì)酸鈉白色粉末；

(2)取1g葡聚糖溶解于10ml的去離子水中，得到100mg/ml的葡聚糖水溶液，向葡聚糖溶液中加入100mg/ml的高碘酸鈉水溶液2ml混合12h，避光，向混合后的溶液加入1ml乙二醇溶液，反應(yīng)20min左右，用去離子水透析(截留分子量為8000～12000)2～4天，經(jīng)冷凍干燥(-20℃干燥24h)得到醛基化葡聚糖白色粉末；

(3)將步驟(1)的氨基化透明質(zhì)酸鈉粉末溶解于去離子水中配制得到2wt％的氨基化透明質(zhì)酸鈉溶液，將步驟(2)醛基化葡聚糖溶解于ph為7.4的pbs緩沖液中得到2wt％的醛基化葡聚糖，將2wt％的氨基化透明質(zhì)酸鈉溶液和2wt％的醛基化葡聚糖溶液以1:1的體積比攪拌均勻得到醛基化葡聚糖-氨基化透明質(zhì)酸鈉預(yù)凝膠溶液；

(4)將血根堿溶于去離子水中，攪拌均勻，得到濃度為10mg/ml血根堿溶液；將濃度為10mg/ml血根堿溶液滴加到明膠微球中，于4℃放置過(guò)夜，然后冷凍干燥，得到血根堿/明膠微球復(fù)合物；其中每克明膠微球加入血根堿溶液的量為2ml；

(2)將2mg步驟(4)的血根堿/明膠微球復(fù)合物加入到0.6ml步驟(3)的預(yù)凝膠溶液，靜置成凝膠后，-20℃冷凍干燥24h，得到負(fù)載血根堿/明膠微球復(fù)合水凝膠支架。

實(shí)施例3

本實(shí)施例的一種負(fù)載血根堿/明膠微球的復(fù)合水凝膠支架的制備方法，包括以下步驟：

(1)取100mg透明質(zhì)酸鈉溶解于20ml去離子水中，在搖床上以37℃，100r/min條件下得到2mg/ml的透明質(zhì)酸鈉溶液，再加入10倍量的己二酰肼(1g)于常溫下以400r/min的速率磁力攪拌溶解。用0.1mol/l的hcl和0.1mol/lnaoh溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)后的ph至6.8。取192mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和132mg1-羥基苯并三唑溶于1ml(二甲基亞砜：水＝1:1)的混合液中。將現(xiàn)配的混合液滴加到調(diào)節(jié)ph＝6.8的反應(yīng)液中在常溫下繼續(xù)混合6～12h，ph維持在6.8。向反應(yīng)6～12h后的溶液中用0.1mol/l的hcl和0.1mol/lnaoh溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)后的ph至7.0，用去離子水透析(截留分子量為8000～12000)2～4天，經(jīng)冷凍干燥(-20℃干燥24h)得到氨基化透明質(zhì)酸鈉白色粉末；

(2)取1g葡聚糖溶解于10ml的去離子水中，得到100mg/ml的葡聚糖水溶液，向葡聚糖溶液中加入100mg/ml的高碘酸鈉水溶液2ml混合12h，避光，向混合后的溶液加入1ml乙二醇溶液，反應(yīng)20min左右，用去離子水透析(截留分子量為8000～12000)2～4天，經(jīng)冷凍干燥(-20℃干燥24h)得到醛基化葡聚糖白色粉末；

(3)將步驟(1)的氨基化透明質(zhì)酸鈉粉末溶解于去離子水中配制得到2wt％的氨基化透明質(zhì)酸鈉溶液，將步驟(2)醛基化葡聚糖溶解于ph＝7.4的pbs緩沖液中得到10wt％的醛基化葡聚糖，將2wt％的氨基化透明質(zhì)酸鈉溶液和10wt％的醛基化葡聚糖溶液以1:2的體積比攪拌均勻得到醛基化葡聚糖-氨基化透明質(zhì)酸鈉預(yù)凝膠溶液；

(4)將血根堿溶于去離子水中，攪拌均勻，得到濃度為20mg/ml血根堿溶液；將濃度為20mg/ml血根堿溶液滴加到明膠微球中，于4～22℃放置過(guò)夜，然后冷凍干燥，得到血根堿/明膠微球復(fù)合物；其中每克明膠微球加入血根堿溶液的量為3ml；

(2)將2mg步驟(4)的血根堿/明膠微球復(fù)合物加入到0.6ml步驟(3)的醛基化葡聚糖-氨基化透明質(zhì)酸鈉預(yù)凝膠溶液，靜置成凝膠后，-20℃冷凍干燥24h，得到負(fù)載血根堿/明膠微球復(fù)合水凝膠支架。

對(duì)比例1

本對(duì)比例的一種葡聚糖-透明質(zhì)酸復(fù)合水凝膠支架的制備方法，包括以下步驟：

(1)取100mg透明質(zhì)酸鈉溶解于20ml去離子水中，在搖床上以37℃，100r/min條件下得到2mg/ml的透明質(zhì)酸鈉溶液，再加入10倍量的己二酰肼(1g)于常溫下以400r/min的速率磁力攪拌溶解。用0.1mol/l的hcl和0.1mol/lnaoh溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)后的ph至6.8。取192mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和132mg1-羥基苯并三唑溶于1ml(二甲基亞砜：水＝1:1)的混合液中。將現(xiàn)配的混合液滴加到調(diào)節(jié)ph＝6.8的反應(yīng)液中在常溫下繼續(xù)混合6～12h，ph維持在6.8。向反應(yīng)6～12h后的溶液中用0.1mol/l的hcl和0.1mol/lnaoh溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)后的ph至7.0，用去離子水透析(截留分子量為8000～12000)2～4天，經(jīng)冷凍干燥(-20℃干燥24h)得到氨基化透明質(zhì)酸鈉白色粉末；

(2)取1g葡聚糖溶解于10ml的去離子水中，得到100mg/ml的葡聚糖水溶液，向葡聚糖溶液中加入100mg/ml的高碘酸鈉水溶液2ml混合12h，避光，向混合后的溶液加入1ml乙二醇溶液，反應(yīng)20min左右，用去離子水透析(截留分子量為8000～12000)2～4天，經(jīng)冷凍干燥(-20℃干燥24h)得到醛基化葡聚糖白色粉末；

(3)將步驟(1)的氨基化透明質(zhì)酸鈉粉末溶解于去離子水中配制得到2wt％的氨基化透明質(zhì)酸鈉溶液，將步驟(2)醛基化葡聚糖溶解于ph＝7.4的pbs緩沖液中得到6wt％的醛基化葡聚糖，將2wt％的氨基化透明質(zhì)酸鈉溶液和6wt％的醛基化葡聚糖溶液以2:1的體積比攪拌均勻得到醛基化葡聚糖-氨基化透明質(zhì)酸鈉預(yù)凝膠溶液，常溫下靜置成凝膠，-20℃冷凍干燥24h，得到葡聚糖-透明質(zhì)酸水凝膠支架。

對(duì)比例2

本對(duì)比例的一種負(fù)載血根堿的葡聚糖-透明質(zhì)酸水凝膠復(fù)合支架的制備方法，包括以下步驟：

(1)取100mg透明質(zhì)酸鈉溶解于20ml去離子水中，在搖床上以37℃，100r/min條件下得到2mg/ml的透明質(zhì)酸鈉溶液，再加入10倍量的己二酰肼(1g)于常溫下以400r/min的速率磁力攪拌溶解。用0.1mol/l的hcl和0.1mol/lnaoh溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)后的ph至6.8。取192mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和132mg1-羥基苯并三唑溶于1ml(二甲基亞砜：水＝1:1)的混合液中。將現(xiàn)配的混合液滴加到調(diào)節(jié)ph＝6.8的反應(yīng)液中在常溫下繼續(xù)混合6～12h，ph維持在6.8。向反應(yīng)6～12h后的溶液中用0.1mol/l的hcl和0.1mol/lnaoh溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)后的ph至7.0，用去離子水透析(截留分子量為8000～12000)2～4天，經(jīng)冷凍干燥(-20℃干燥24h)得到氨基化透明質(zhì)酸鈉白色粉末；

(2)取1g葡聚糖溶解于10ml的去離子水中，得到100mg/ml的葡聚糖水溶液，向葡聚糖溶液中加入100mg/ml的高碘酸鈉水溶液2ml混合12h，避光，向混合后的溶液加入1ml乙二醇溶液，反應(yīng)20min左右，用去離子水透析(截留分子量為8000～12000)2～4天，經(jīng)冷凍干燥(-20℃干燥24h)得到醛基化葡聚糖白色粉末；

(3)將步驟(1)的氨基化透明質(zhì)酸鈉粉末溶解于去離子水中配制得到2wt％的氨基化透明質(zhì)酸鈉溶液，將步驟(2)醛基化葡聚糖溶解于ph＝7.4的pbs緩沖液中得到6wt％的醛基化葡聚糖，將2wt％的氨基化透明質(zhì)酸鈉溶液和6wt％的醛基化葡聚糖溶液以2:1的體積比攪拌均勻得到醛基化葡聚糖-氨基化透明質(zhì)酸鈉預(yù)凝膠溶液；

(4)將20μl、10mg/ml血根堿與0.6ml的步驟(3)的醛基化葡聚糖-氨基化透明質(zhì)酸鈉預(yù)凝膠溶液混合，-20℃冷凍干燥24h，得到負(fù)載血根堿的葡聚糖-透明質(zhì)酸水凝膠復(fù)合支架。

對(duì)比例3

本對(duì)比例的復(fù)合水凝膠支架為商品化敷料alginateag。

性能試驗(yàn)

1、掃描電鏡及物理性能測(cè)試

對(duì)實(shí)施例1、對(duì)比例1和2的掃描電鏡圖分別如圖1～3所示。

實(shí)施例1的負(fù)載血根堿/明膠微球的復(fù)合水凝膠支架的吸水率為23倍，孔隙率為68～88％，孔徑為20～200μm；

對(duì)比例1的葡聚糖-透明質(zhì)酸水凝膠支架的吸水率為22倍，孔隙率為68～88％，孔徑為20～200μm；

對(duì)比例2的負(fù)載血根堿的葡聚糖-透明質(zhì)酸的水凝膠復(fù)合支架的吸水率為24倍，孔隙率為62～82％，孔徑為20～200μm。

實(shí)施例1的負(fù)載血根堿/明膠微球的復(fù)合水凝膠支架、對(duì)比例1的葡聚糖-透明質(zhì)酸水凝膠支架和對(duì)比例2的負(fù)載血根堿的葡聚糖-透明質(zhì)酸的水凝膠復(fù)合支架加入血根堿以及血根堿/明膠微球復(fù)合物對(duì)葡聚糖-透明質(zhì)酸水凝膠支架尺寸孔徑大小并無(wú)太大影響，且均具有高吸水率，良好的孔徑和孔隙率符合皮膚細(xì)胞的生存環(huán)境。

2、血根堿的釋放效果

將實(shí)施例1步驟(4)的血根堿/明膠微球復(fù)合物、步驟(2)的負(fù)載血根堿/明膠微球復(fù)合水凝膠支架、對(duì)比例2步驟(4)的負(fù)載血根堿的葡聚糖-透明質(zhì)酸水凝膠復(fù)合支架分別置于ph＝7.4的pbs溶液中，剛開(kāi)始時(shí)每隔4h取樣一次，12h后每隔12h取樣一次，24h后每隔24h取樣一次，每次取樣1ml，測(cè)試血根堿的釋放效果；結(jié)果如圖4所示，從圖4可以看出，實(shí)施例1的負(fù)載血根堿/明膠微球復(fù)合物具有藥物緩釋作用，藥物釋放時(shí)間長(zhǎng)達(dá)140h；對(duì)比例2的血根堿的葡聚糖-透明質(zhì)酸水凝膠復(fù)合支架的血根堿的釋放時(shí)間為44h，其血根堿主要是通過(guò)溶解于葡聚糖-透明質(zhì)酸水凝膠復(fù)合三維支架中的水分子中，所以對(duì)比例2的血根堿的葡聚糖-透明質(zhì)酸水凝膠相對(duì)于實(shí)施例1的負(fù)載血根堿/明膠微球復(fù)合水凝膠支架緩釋作用較弱，釋放速率更快，所以在4h內(nèi)，釋放率接近79％，并在44h后釋放完全。

3、抗菌環(huán)實(shí)驗(yàn)

將實(shí)施例1步驟(2)的負(fù)載血根堿/明膠微球復(fù)合水凝膠支架、對(duì)比例1步驟(3)的葡聚糖-透明質(zhì)酸水凝膠支架、對(duì)比例2步驟(4)的負(fù)載血根堿的葡聚糖-透明質(zhì)酸水凝膠復(fù)合支架、對(duì)比例3的商品化敷料alginateag分別置于涂有綠膿桿菌，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的固體培養(yǎng)基上，37℃放置過(guò)夜，進(jìn)行抗菌環(huán)實(shí)驗(yàn)，觀察各復(fù)合水凝膠支架的抗菌效果，結(jié)果分別如圖2，圖6，圖7所示。

從圖可知，實(shí)施例1的負(fù)載血根堿/明膠微球復(fù)合水凝膠支架的抗菌環(huán)的直徑分別為：13.0mm，12.1mm和14.0mm，具有較好的抗菌效果。對(duì)比例1的葡聚糖-透明質(zhì)酸水凝膠復(fù)合支架沒(méi)有抗菌效果；對(duì)比例2的負(fù)載血根堿的葡聚糖-透明質(zhì)酸水凝膠復(fù)合支架的抗菌環(huán)直徑分別為16.0mm，12.1mm和14.2mm，具有一定的抗菌效果。由于對(duì)比例2的負(fù)載血根堿的葡聚糖-透明質(zhì)酸水凝膠復(fù)合支架的血根堿直接與預(yù)凝膠溶液混合，經(jīng)過(guò)冷凍干燥制備而成的，因此血根堿的釋放量大，所以其抗菌效果比實(shí)施例1的負(fù)載血根堿/明膠微球復(fù)合水凝膠支架優(yōu)越一些，但是兩者都達(dá)到抗菌的要求，而且實(shí)施例1的負(fù)載血根堿/明膠微球復(fù)合水凝膠支架具有緩釋藥物的功能，所以其長(zhǎng)期抗菌效果會(huì)更加優(yōu)越。

對(duì)比例3商品化敷料alginateag的抗菌環(huán)直徑分別為12mm，13.1mm和11.2mm，說(shuō)明其對(duì)綠膿桿菌，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有一定的抗菌效果。但與實(shí)施例1所制備的血根堿/明膠微球復(fù)合水凝膠支架以對(duì)比例2所制備的血根堿/復(fù)合水凝膠支架相比，商品化敷料alginateag對(duì)綠膿桿菌的抗菌效果較弱。由于血根堿有更廣闊的抑菌性能，而銀離子僅對(duì)于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌效果較好，實(shí)際臨床治療中綠膿桿菌也是常見(jiàn)感染菌。所以本發(fā)明制備的負(fù)載血根堿和明膠微球復(fù)合水凝膠支架抗菌性能明顯優(yōu)于商品化敷料alginateag具有更好，更全面的抗菌能力和效果，使用的范圍更加全面的優(yōu)勢(shì)。

以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡(jiǎn)潔，未對(duì)上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說(shuō)明書(shū)記載的范圍。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。