一種去壁靈芝孢子粉、顆粒及其制備方法與流程

本發(fā)明涉及醫(yī)藥及保健食品
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種去壁靈芝孢子粉顆粒及其制備方法。
背景技術(shù)：
：人類對健康觀念內(nèi)涵的認(rèn)識隨著科技水平的發(fā)展而進一步深化，世界衛(wèi)生組織50多個國家醫(yī)學(xué)專家研究發(fā)現(xiàn)，對各種疾病最好的治療還是預(yù)防。目前各種醫(yī)院的檢查只能對已經(jīng)產(chǎn)生的疾病進行診斷，一旦確認(rèn)有病，也往往會因發(fā)現(xiàn)太晚而束手無策，即使通過現(xiàn)代醫(yī)療科技手段也難使病人恢復(fù)如初?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》有言：“上工治未病，不治已病，此之謂也”，治未病即采取相應(yīng)的措施，防止疾病的發(fā)生發(fā)展，是我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的主要思想。任何疾病只要預(yù)防和保養(yǎng)在先，發(fā)病的機率就會很低，甚至可以完全化解和避免。預(yù)防疾病最重要的手段是增強機體免疫力。而現(xiàn)有的保健藥品基本上對于免疫力的調(diào)節(jié)都靠“補”，即補充各種各樣的維生素、氨基酸，服用后也有效果，但停用很短一段時間后，免疫力又會下降，沒有達(dá)到從根本上改善人體臟器內(nèi)部環(huán)境，使人體自身具備免疫力的功效。靈芝孢子是靈芝在生長成熟期，從靈芝菌褶中彈射出來的極其微小的卵形生殖細(xì)胞即靈芝的種子。它凝聚了靈芝的精華，富含靈芝多糖、三萜類、蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、核苷類化合物、有機鍺、微量元素和維生素等多種生物活性物質(zhì)，具有增強免疫力、抗輻射、清除自由基等多種功能，且藥性溫和，無副作用，但其表面被堅硬的幾丁質(zhì)纖維素所包圍，人體很難充分吸收。目前市面上破壁靈芝孢子粉多通過機械破碎方法獲得，人體吸收依舊存在一定困難；另外，破壁靈芝孢子粉中含有大量的幾丁質(zhì)纖維素等，導(dǎo)致破壁靈芝孢子粉中真正的有效成分，如粗多糖、總?cè)坪康群康汀⑽针y。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可有效增強免疫力、對輻射危害有輔助保護功能的去壁靈芝孢子粉、顆粒，有效成分如粗多糖、總?cè)频群扛撸孜?，方便靈芝孢子粉、顆粒的攜帶及服用，使人體更有效地吸收營養(yǎng)成分。本發(fā)明提供了一種去壁靈芝孢子粉顆粒，以破壁靈芝孢子粉水提物為活性成分；去壁靈芝孢子粉顆粒中粗多糖含量為10～20g/100g，總?cè)坪繛?～10g/100g。優(yōu)選的，去壁靈芝孢子粉的粒徑小于0.180mm。本發(fā)明提供了一種去壁靈芝孢子粉的制備方法，包括以下步驟：(1)將破壁靈芝孢子粉浸泡，水提，得到破壁靈芝孢子水提液；(2)將所述步驟(1)得到的水提液濃縮，得到濃縮藥液；(3)將所述濃縮藥液干燥，得到干浸膏；(4)將所述干浸膏進行粉碎后過篩，得到去壁靈芝孢子粉。優(yōu)選的，所述浸泡優(yōu)選為低溫水浸泡，更優(yōu)選的在-5～20℃水中浸泡；優(yōu)選的，浸泡1～4小時，更優(yōu)選的，浸泡2小時。優(yōu)選的，所述水提為將浸泡液10～60分鐘內(nèi)升溫至100～120℃，更優(yōu)選的為30分鐘內(nèi)升溫至100～120℃。優(yōu)選的，所述的濃縮為減壓濃縮，所述減壓濃縮的真空度為-0.07～-0.09mpa，所述減壓濃縮的溫度為60～70℃。優(yōu)選的，所述的干燥為微波干燥，所述微波干燥的真空度為-0.07～-0.09mpa，所述微波干燥的溫度為60～70℃。本發(fā)明提供了一種去壁靈芝孢子顆粒的制備方法，包括以下步驟：將上述得到的去壁靈芝孢子粉制粒，得到去壁靈芝孢子顆粒。優(yōu)選的，制粒為一步制粒；優(yōu)選的，一步制粒步驟為：上述得到的去壁靈芝孢子粉與水混合，在壓力-2.5～-3.0kpa，進風(fēng)溫度60～80℃，出風(fēng)溫度不超過60℃條件下一步制粒。優(yōu)選的，所述制粒后的靈芝孢子顆粒粒度在12～16目之間。本發(fā)明提供了一種破壁靈芝孢子水提液的制備方法，包括以下步驟：將破壁靈芝孢子粉與水混合進行煎煮，破壁靈芝孢子粉與水的質(zhì)量比為4～6:8～15。優(yōu)選的，進行2次水提，將4～6重量份的破壁靈芝孢子粉加入提取罐，先用12重量份的水提取1次，濾出藥液；將濾出殘渣用10重量份的水煎煮，濾出藥液。更優(yōu)選的，進行3次水提，將將4～6重量份的破壁靈芝孢子粉加入提取罐，先用12重量份的水提取1次，濾出藥液；將濾出殘渣用10重量份的水煎煮2次，濾出藥液。優(yōu)選的，水提溫度為80～120℃，每次水提時間為1～2小時。優(yōu)選的，煎煮后還包括：將所述煎煮得到的物料過濾后離心，得到水提液。優(yōu)選的，離心時藥液的溫度為0～4℃，離心轉(zhuǎn)速為2000～4000rpm。有益效果與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明以破壁靈芝孢子粉水提物為原料，制備得到去壁靈芝孢子粉、顆粒；在本發(fā)明中，所述水提物由破壁靈芝孢子粉、顆粒經(jīng)水提、濃縮、干燥和粉碎得到。本發(fā)明提供的產(chǎn)品最大程度保留了靈芝孢子的有效成分，去除靈芝破壁后產(chǎn)生的幾丁質(zhì)及纖維素外殼，使靈芝孢子粉的有效成分含量大幅度提高，且更易吸收；能夠綜合提高人體免疫能力，包括提高細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細(xì)胞功能及nk細(xì)胞活性等；對輻射危害有輔助保護功能；且對斑馬魚人胃癌移植瘤、人肺腺癌移植瘤和人淋巴癌移植瘤均有抑制作用，其中對斑馬魚人胃癌移植瘤和人淋巴癌移植瘤的抑制作用較強，達(dá)到了78％及83％。而且，本發(fā)明提供的產(chǎn)品為粉劑、顆粒劑，方便攜帶及服用，使人體可更有效地吸收靈芝孢子中的營養(yǎng)成分。附圖說明圖1為去壁靈芝孢子粉、顆粒對斑馬魚人胃癌(sgc-7901)移植瘤的抑制作用表型圖；圖2為去壁靈芝孢子粉、顆粒對斑馬魚人胃癌(sgc-7901)移植瘤的抑制作用圖；圖3為去壁靈芝孢子粉、顆粒對斑馬魚人胃癌(sgc-7901)移植瘤的抑制作用圖；圖4為去壁靈芝孢子粉、顆粒對斑馬魚人淋巴癌(ramos)移植瘤的抑制作用表型圖；圖5為去壁靈芝孢子粉、顆粒對斑馬魚人淋巴癌(ramos)移植瘤的抑制作用圖；圖6為去壁靈芝孢子粉、顆粒對斑馬魚人淋巴癌(ramos)移植瘤的抑制作用圖；圖7為去壁靈芝孢子粉、顆粒對斑馬魚人肺腺癌(a549)移植瘤的抑制作用表型圖；圖8為去壁靈芝孢子粉、顆粒對斑馬魚人肺腺癌(a549)移植瘤的抑制作用；圖9為去壁靈芝孢子粉、顆粒對斑馬魚人肺腺癌(a549)移植瘤的抑制作用圖。具體實施方式本發(fā)明提供了一種去壁靈芝孢子粉、顆粒，以破壁靈芝孢子粉水提物為活性成分；去壁靈芝孢子粉顆粒中粗多糖含量為10～20g/100g，總?cè)坪繛?～10g/100g。本發(fā)明提供的去壁靈芝孢子粉、顆粒的粒徑優(yōu)選小于0.180mm，更優(yōu)選為0.100～0.160mm。本發(fā)明還提供了一種去壁靈芝孢子粉的制備方法，包括以下步驟：(1)將破壁靈芝孢子粉浸泡，水提，得到破壁靈芝孢子水提液；(2)將所述步驟(1)得到的水提液濃縮，得到濃縮藥液；(3)將所述濃縮藥液干燥，得到干浸膏；(4)將所述干浸膏進行粉碎后過篩，得到去壁靈芝孢子粉制粒。本發(fā)明中，所述浸泡優(yōu)選為低溫水浸泡，更優(yōu)選的在-5～20℃水中浸泡；優(yōu)選的，浸泡1～4小時，更優(yōu)選的，浸泡2小時。優(yōu)選的，所述水提為將浸泡液10～60分鐘內(nèi)升溫至100～120℃，更優(yōu)選的，30分鐘內(nèi)升溫至100～120℃。將破壁靈芝孢子粉進行水提，得到水提液。水提還具有熟化滅菌的作用。在本發(fā)明中，所述破壁靈芝孢子粉可以市售常規(guī)品種，也可自制，破壁采用的方式有機械破壁，機械破壁又劃分為振動磨破壁、超音速氣流粉碎破壁還有剪切式擠壓破壁；所述水提優(yōu)選為：將破壁靈芝孢子粉與水混合進行煎煮，得到水提液。在本發(fā)明中，所述破壁靈芝孢子粉與水的質(zhì)量比優(yōu)選為4～6:8～15，更優(yōu)選為5：12。在本發(fā)明中，所述水提的次數(shù)優(yōu)選為三次，具體為將上次煎煮得到的藥渣再與水混合依次進行兩次煎煮，將三次煎煮得到的濾液合并，得到提取液。在本發(fā)明中，一次煎煮的時間優(yōu)選為2小時；將濾出殘渣用10重量份的水煎煮2次，每次2小時，濾出藥液。在本發(fā)明中，所述水提的溫度優(yōu)選為80～120℃，更優(yōu)選為90～100℃；所述水提的時間優(yōu)選為每次1～4小時，更優(yōu)選的為每次2小時；在本發(fā)明中，所述煎煮后優(yōu)選將所述煎煮得到的物料過濾后離心，得到水提液。在本發(fā)明中，所述過濾也可以是板框過濾；所述離心的轉(zhuǎn)速優(yōu)選為2000～4000rpm，更優(yōu)選為2500～3000rpm。得到水提液后，本發(fā)明將所述水提液濃縮，得到濃縮藥液。在本發(fā)明中，所述濃縮優(yōu)選為減壓濃縮；所述減壓濃縮的真空度優(yōu)選為-0.07～-0.09mpa，所述減壓濃縮的溫度優(yōu)選為60～70℃。本發(fā)明中，減壓濃縮的時間以密度為控制，所述減壓濃縮后的密度優(yōu)選為1.05～1.15更優(yōu)選的為1.08～1.12，最優(yōu)選為1.10。。得到濃縮藥液后，本發(fā)明將所述濃縮藥液干燥，得到干浸膏。在本發(fā)明中，所述干燥優(yōu)選為微波干燥；所述微波干燥的真空度優(yōu)選為-0.07～-0.09mpa，所述微波干燥的溫度優(yōu)選為60～70℃；優(yōu)選的，微波功率為30kw。在本發(fā)明中，微波干燥的時間以水分控制，最優(yōu)選的水分控制在2％-7％，更優(yōu)選的為3-6％，最優(yōu)選為4％。得到干浸膏后，本發(fā)明將所述干浸膏粉碎后過篩，得到去壁靈芝孢子粉水提物。在本發(fā)明中所述的粉碎采用本領(lǐng)域常規(guī)的粉碎方法即可，具體的在本發(fā)明實施例中采用粉碎機進行，過篩收集篩下組分；所述粉碎的過程中過篩的目數(shù)優(yōu)選的為60～100目，更優(yōu)選的為80目。得到去壁靈芝孢子粉后，本發(fā)明將所述去壁靈芝孢子粉制粒，得到去壁靈芝孢子顆粒。在本發(fā)明中，所述制粒優(yōu)選為一步制粒；所述制粒優(yōu)選沸騰制粒機；所述制粒的過程優(yōu)選為：將所述去壁靈芝孢子粉與水混合，在壓力-2.5～-3.0kpa，進風(fēng)溫度60～80℃，出風(fēng)溫度不超過60℃條件下一步制粒；更優(yōu)選為：設(shè)定風(fēng)機頻率26hz，進風(fēng)溫度55-60℃，將原料加入流化床中，通過向上運動的熱空氣進行加熱，使物料保持良好的懸浮狀態(tài)，混合10分鐘，將粘合劑(水)通過噴霧系統(tǒng)進行制粒，進風(fēng)溫度設(shè)置60℃左右，控制物料溫度35-55℃，霧化壓力內(nèi)層壓力1.5-2.5kg/cm2，外層壓力1.5-2.5kg/cm2，開始制粒時，設(shè)定蠕動泵的轉(zhuǎn)速200-250rpm，漸成顆粒后設(shè)定轉(zhuǎn)速150-200rpm；制粒結(jié)束后進行物料干燥，設(shè)定進風(fēng)溫度80-85℃左右，風(fēng)機頻率30-35hz，直至物料溫度達(dá)到55℃-60℃左右，停止加熱，物料溫度降至40℃左右停機，出料；制粒車間內(nèi)，溫度控制在18℃-26℃，濕度控制在45％-65％。在本發(fā)明中，所述制粒制得顆粒粒度在12～16目之間，水分≤4％；更優(yōu)選的，粒度為14目。下面將結(jié)合本發(fā)明中的實施例，對本發(fā)明中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述。顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。實施例1將4重量份破壁靈芝孢子粉與48重量份的水混合浸泡，在80℃下水提2h，得到第一提取液和第一濾渣；將得到的第一濾渣與40重量份的水混合在99℃下煎煮2h，得到第二提取液和第二濾渣；將得到的第二濾渣與44重量份的水混合在98℃下煎煮2h，得到第三提取液；將第一提取液、第二提取液和第三提取液合并后在真空度為-0.09mpa和溫度為65℃的條件下減壓濃縮到密度為1.15，得到濃縮藥液；將濃縮藥液在真空度為-0.08mpa、溫度為65℃的條件下進行微波干燥，到含水量為6％，得到干浸膏；將干浸膏粉碎后過80目篩，得到去壁靈芝孢子粉；本發(fā)明在獲得破壁靈芝孢子粉后，將破壁靈芝孢子粉與水混合，在壓力-2.5kpa，進風(fēng)溫度60℃，出風(fēng)溫度50℃條件下，進行14目制粒，得到去壁靈芝孢子顆粒。本發(fā)明所獲得的去壁靈芝孢子粉及顆粒的總多糖含量為15.2g/100g，總?cè)坪繛?.87g/100g，去壁靈芝孢子粉的提取率高于市面上常見破壁靈芝孢子粉。實施例2將5重量份破壁靈芝孢子粉與55重量份的水混合浸泡，在80℃下水提2h，得到第一提取液和第一濾渣；將得到的第一濾渣與50重量份的水混合在99℃下煎煮2h，得到第二提取液和第二濾渣；將得到的第二濾渣與60重量份的水混合在98℃下煎煮2h，得到第三提取液；將第一提取液、第二提取液和第三提取液合并后在真空度為-0.09mpa和溫度為65℃的條件下減壓濃縮到密度為1.10，得到濃縮藥液；將濃縮藥液在真空度為-0.08mpa、溫度為65℃的條件下進行微波干燥到含水量為4％，得到干浸膏；將干浸膏粉碎后過80目篩，得到去壁靈芝孢子粉；本發(fā)明在獲得破壁靈芝孢子粉后，將破壁靈芝孢子粉與水混合，在壓力-2.8kpa，進風(fēng)溫度65℃，出風(fēng)溫度55℃條件下，進行15目制粒，得到去壁靈芝孢子顆粒。本發(fā)明所獲得的去壁靈芝孢子粉、顆粒的總多糖含量為15.8g/100g，總?cè)坪繛?.19g/100g，去壁靈芝孢子粉的提取率高于市面上常見破壁靈芝孢子粉。實施例3將6重量份破壁靈芝孢子粉與72重量份的水混合浸泡，在80℃下水提2h，得到第一提取液和第一濾渣；將得到的第一濾渣與60重量份的水混合在99℃下煎煮2h，得到第二提取液和第二濾渣；將得到的第二濾渣與60重量份的水混合在98℃下煎煮2h，得到第三提取液；將第一提取液、第二提取液和第三提取液合并后在真空度為-0.09mpa和溫度為65℃的條件下減壓濃縮到密度為1.12，得到濃縮藥液；將濃縮藥液在真空度為-0.08mpa、溫度為65℃的條件下進行微波干燥到含水量為3％，得到干浸膏；將干浸膏粉碎后過80目篩，得到去壁靈芝孢子粉；本發(fā)明在獲得破壁靈芝孢子粉后，將破壁靈芝孢子粉與水混合，在壓力-3.0kpa，進風(fēng)溫度70℃，出風(fēng)溫度60℃條件下，進行16目制粒，得到去壁靈芝孢子顆粒。本發(fā)明所獲得的去壁靈芝孢子粉、顆粒的總多糖含量為15.4g/100g，總?cè)坪繛?.94g/100g，去壁靈芝孢子粉的提取率高于市面上常見破壁靈芝孢子粉。實施例4骨髓有核細(xì)胞實驗設(shè)置去壁靈芝孢子粉、顆粒及陰性對照組，陰性對照組給予同等容積的去離子水。各組小鼠灌胃給樣品，每天一次，每次用量1.00g/kg·bw/d，連續(xù)20天，進行60co-γ射線照射，照射后第3天進行骨髓有核細(xì)胞實驗，結(jié)果見表1。表1骨髓有核細(xì)胞實驗結(jié)果組別動物數(shù)(只)溶血空斑數(shù)(個/106脾細(xì)胞)骨髓有核細(xì)胞數(shù)(107/ml)陰性對照組1095±281.47±0.31實施例110132±232.01±0.45由表1可以看出，實施例1中的去壁靈芝孢子粉、顆粒能夠顯著增加溶血空斑數(shù)和骨髓有核細(xì)胞數(shù)，提高細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細(xì)胞功能及nk細(xì)胞活性，對輻射危害有輔助保護功能。急性毒性試驗：按《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》(2003年版)進行急性毒性試驗，雌、雄性小鼠急性經(jīng)口mtd大于20000mg/kg·bw，根據(jù)急性毒性劑量分級標(biāo)準(zhǔn)，該樣品屬無毒級。微核試驗：按《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》(2003年版)進行微核試驗，設(shè)受試物2.5、5.0、10.0g/kg·bw3個劑量組，對小鼠灌胃。受試物微核試驗結(jié)果為陰性。精子畸形試驗：按《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》(2003年版)進行精子畸形試驗，設(shè)受試物2.5、5.0、10.0g/kg·bw3個劑量組，對雄性小鼠灌胃。受試物精子畸形試驗結(jié)果為陰性。ames試驗：按《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》(2003年版)進行ames試驗，采用平板摻入法，測試劑量為5000、1000、200、40和8μg/皿。受試物ames試驗結(jié)果為陰性。大鼠30天喂養(yǎng)試驗：按《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》(2003年版)進行大鼠30天喂養(yǎng)試驗，雌性設(shè)4.06、2.63、1.18g/kg·bw/d(相當(dāng)于人體推薦量的122倍、79倍、35倍)三個劑量組，雄性設(shè)3.79、2.45、1.13g/kg·bw/d(相當(dāng)于人體推薦量的114倍、74倍、34倍)三個劑量組。受試動物一般情況良好，體重、食物利用率、臟器重量、臟器系數(shù)均無異常改變；血液學(xué)指標(biāo)及生化指標(biāo)顯示，各項指標(biāo)均在正常范圍，各臟器病理組織學(xué)檢查未見與受試樣品有關(guān)的病理改變。實驗結(jié)果表明：去壁靈芝孢子粉劑、顆粒劑大鼠30天喂養(yǎng)試驗各劑量組各項指標(biāo)均未觀察到有害作用。由以上實施例可知，本發(fā)明所述去壁靈芝孢子粉、顆粒中有效成分總多糖的含量為10～20g/100g，總?cè)频暮繛?～10g/100g，相比現(xiàn)有技術(shù)中的靈芝孢子粉中有效成分的含量有了極大的提高，使得有效成分易吸收，安全無毒，能夠有效增強機體免疫力；并且去壁靈芝孢子粉、顆粒劑的劑型使得其攜帶和服用非常方便。實驗動物1.野生型ab品系斑馬魚，以自然成對交配繁殖方式進行。共330尾，每實驗組為30尾，年齡為受精后2天(330尾用于樣品抗肺腺癌作用評價)。2.野生型ab品系斑馬魚，以自然成對交配繁殖方式進行。共480尾，每實驗組為30尾，年齡為受精后2天(330尾用于樣品抗肺腺癌作用評價，150尾用于抗肺腺癌作用評價重復(fù)實驗)。3.野生型ab品系斑馬魚，以自然成對交配繁殖方式進行。共660尾，每實驗組為30尾，年齡為受精后2天(330尾用于樣品抗淋巴癌作用評價，330尾用于樣品抗淋巴癌作用評價重復(fù)實驗)。飼養(yǎng)于28℃的養(yǎng)魚用水中(水質(zhì)：每1l反滲透水中加入200mg速溶海鹽，電導(dǎo)率為480～510μs/cm；ph為6.9～7.2；硬度為53.7～71.6mg/lcaco3)，實驗動物使用許可證號為：syxk(浙)2012-0171。飼養(yǎng)管理符合國際aaalac認(rèn)證的要求。實驗藥物樣品去壁靈芝孢子粉，褐色粉末，批號為16042301，溶于超純水中，常溫干燥保存，由浙江壽仙谷醫(yī)藥股份有限公司，2016年05月10日接收。臨用前用超純水配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。硫酸長春新堿，白色粉末，lot#k1306055，購于阿拉丁，陰涼柜保存。臨用時用二甲基亞砜(dmso)配制成5mm母液，最終工作液中dmso濃度為0.1％。順鉑，黃色粉末，lot#k1520124，購于阿拉丁，陰涼柜保存。臨用時用二甲基亞砜(dmso)配制成50mm母液，最終工作液中dmso濃度為0.1％。儀器與試劑電動聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡(az100，nikon公司)；解剖顯微鏡(szx7，olympus，japan)；與顯微鏡相連的相機(tk-c1481ec)；精密電子天平(cp214，奧豪斯)；6孔板(nestbiotech)；甲基纖維素(aladdin,shanghai,china)。實施例5去壁靈芝孢子粉、顆?？刮赴┳饔迷u價1.濃度組別實驗1組模型對照組實驗2組陽性對照藥順鉑50μm實驗3組樣品28μg/ml實驗4組樣品83μg/ml實驗5組樣品250μg/ml2.濃度確定依據(jù)樣品在35℃的mtc均為250μg/ml；根據(jù)項目方案，樣品抗腫瘤評價濃度設(shè)置為：28μg/ml(1/9mtc)、83μg/ml(1/3mtc)和250μg/ml(mtc)。3.模型制作用紅色熒光染料(cm-dil)標(biāo)記人胃癌(sgc-7901)細(xì)胞，以顯微注射的方式移植到斑馬魚卵黃囊內(nèi)，每尾移植約200個細(xì)胞，建立斑馬魚人胃癌移植瘤模型。4.實驗方法4.1確定最大耐受濃度(mtc)隨機選取野生型ab品系斑馬魚于六孔板中，分別水溶給予樣品，濃度均分別為10、100、250、500、1000和2000μg/ml，同時設(shè)置正常對照組。供試品處理期間，每天對死亡的斑馬魚計數(shù)并移除死魚；供試品處理斑馬魚2天后，觀察記錄斑馬魚的運動狀態(tài)和死亡情況，確定供試品對斑馬魚的mtc。4.2樣品去壁靈芝孢子粉抗胃癌作用評價使用cm-dil標(biāo)記人胃癌(sgc-7901)細(xì)胞，以顯微注射的方式移植到2dpf野生型ab品系斑馬魚卵黃囊內(nèi)，每尾移植約200個細(xì)胞，建立斑馬魚人胃癌(sgc-7901)移植模型；將注射了sgc-7901細(xì)胞的斑馬魚放置于35℃培養(yǎng)至3dpf。在顯微鏡下挑選出移植腫瘤細(xì)胞一致性較好的斑馬魚，隨機分配至6孔板中，以水溶給藥方法分別給予樣品28、83和250μg/ml濃度，陽性對照藥順鉑50μm濃度，同時設(shè)置模型對照組，每孔(濃度組)30尾斑馬魚，每孔容量為5ml。將各實驗(濃度)組斑馬魚繼續(xù)置于35℃培養(yǎng)，2天后，每個實驗(濃度)組隨機選10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下進行觀察、拍照并保存圖片；利用尼康nis-elementsd3.10高級圖像處理軟件進行圖像分析，計算癌細(xì)胞熒光強度，以熒光強度分別評價樣品對斑馬魚胃癌(sgc-7901)移植瘤的抑制作用，并用以下公式計算腫瘤抑制作用。根據(jù)移植瘤的生長抑制作用繪制濃度效應(yīng)曲線；統(tǒng)計學(xué)分析采用方差分析和dunnett’st-檢驗，p<0.05為顯著性差異；提供具有代表性的實驗圖譜。特別說明：野生型ab系斑馬魚本身并不產(chǎn)生紅色熒光，cm-dil標(biāo)記的細(xì)胞注射到斑馬魚卵黃囊后，在一定波長下能激發(fā)產(chǎn)生紅色熒光，熒光強度總和與癌細(xì)胞的數(shù)量成正相關(guān)，熒光強度總和越大，癌細(xì)胞數(shù)量越多。5.實驗結(jié)果5.1mtc根據(jù)表2，樣品在500μg/ml到1000μg/ml濃度范圍內(nèi)斑馬魚均出現(xiàn)死亡；因此確定樣品對斑馬魚的mtc為250μg/ml，評價實驗濃度均選取28μg/ml(1/9mtc)、83μg/ml(1/3mtc)和250μg/ml(mtc)。表2.供試品“濃度-死亡率”統(tǒng)計表5.2樣品去壁靈芝孢子粉抗胃癌作用評價陽性對照藥順鉑在50μm濃度下斑馬魚人胃癌(sgc-7901)移植瘤細(xì)胞熒光強度值總和為237655像素，與模型對照組比較(368978像素)p<0.001，腫瘤抑制作用為36％，顯示順鉑對斑馬魚人胃癌(sgc-7901)移植瘤的生長有明顯抑制作用。樣品在28、83和250μg/ml的濃度下斑馬魚人胃癌(sgc-7901)移植瘤細(xì)胞熒光強度值總和分別為173669、126373和83004像素，與模型對照組比較p<0.001&p<0.001&p<0.001，腫瘤抑制作用分別為53％、66％和78％。詳見表3、圖1、圖2和圖3。表3.樣品對斑馬魚人胃癌(sgc-7901)移植瘤的抑制作用(n＝10)注：與模型對照組比較，*p<0.05，***p<0.001實施例6去壁靈芝孢子粉、顆粒抗淋巴癌作用評價1.濃度組別實驗1組模型對照組實驗2組陽性對照藥長春新堿5μm實驗3組樣品28μg/ml實驗4組樣品83μg/ml實驗5組樣品250μg/ml2.濃度確定依據(jù)同實施例5。3.模型制作用紅色熒光染料(cm-dil)標(biāo)記人淋巴癌(ramos)細(xì)胞，以顯微注射的方式移植到斑馬魚卵黃囊內(nèi)，每尾移植約200個細(xì)胞，建立斑馬魚人淋巴癌移植瘤模型。4.實驗方法使用cm-dil標(biāo)記人淋巴癌(ramos)細(xì)胞，以顯微注射的方式移植到野生型ab品系2dpf斑馬魚卵黃囊內(nèi)，每尾移植約200個細(xì)胞，建立斑馬魚人淋巴癌移植模型；將注射了人淋巴癌細(xì)胞的斑馬魚放置于35℃培養(yǎng)至3dpf。在顯微鏡下挑選出移植腫瘤細(xì)胞一致性較好的斑馬魚，隨機分配至6孔板中，以水溶給藥方法分別給予樣品28、83和250μg/ml濃度，陽性對照藥長春新堿5μm濃度，同時設(shè)置模型對照組，每孔(濃度組)30尾斑馬魚，每孔容量為5ml。將各實驗組斑馬魚繼續(xù)置于35℃培養(yǎng)，2天后，每個實驗組隨機選10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下進行觀察、拍照并保存圖片；利用尼康nis-elementsd3.10高級圖像處理軟件進行圖像分析，計算癌細(xì)胞熒光強度，以熒光強度評價樣品對斑馬魚人淋巴癌(ramos)移植瘤的抑制作用，并用以下公式計算腫瘤抑制作用。根據(jù)移植瘤的生長抑制作用繪制濃度效應(yīng)曲線；統(tǒng)計學(xué)分析采用方差分析和dunnett’st-檢驗，p<0.05為顯著性差異；提供具有代表性的實驗圖譜。特別說明：野生型ab系斑馬魚本身并不產(chǎn)生紅色熒光，cm-dil標(biāo)記的細(xì)胞注射到斑馬魚卵黃囊后，在一定波長下能激發(fā)產(chǎn)生紅色熒光，熒光強度總和與癌細(xì)胞的數(shù)量成正相關(guān)，熒光強度總和越大，癌細(xì)胞數(shù)量越多(lietal.2011)。5.實驗結(jié)果陽性對照品長春新堿在5μm濃度下對斑馬魚人淋巴癌(ramos)移植瘤細(xì)胞熒光強度為153919像素，與模型對照組比較(228110像素)p<0.001，腫瘤抑制作用為33％，顯示長春新堿對斑馬魚人淋巴癌(ramos)移植瘤的生長有明顯抑制作用。樣品在28、83和250μg/ml的濃度下對斑馬魚人淋巴癌(ramos)移植瘤細(xì)胞熒光強度值總和分別為40284、40166和37884像素，與模型對照組比較，3個濃度組p均<0.001，腫瘤抑制作用為82％、82％和83％。詳見表4、圖4、圖5和圖6。表4.樣品去壁靈芝孢子粉對斑馬魚人淋巴癌(ramos)移植瘤的抑制作用(n＝10)注：與模型對照組比較，***p<0.001實施例7去壁靈芝孢子粉、顆?？狗蜗侔┳饔迷u價1.濃度組別實驗1組模型對照組實驗2組陽性對照藥順鉑50μm實驗3組樣品28μg/ml實驗4組樣品83μg/ml實驗5組樣品250μg/ml2.濃度確定依據(jù)同實施例5。3.模型制作用紅色熒光染料(cm-dil)標(biāo)記人肺腺癌(a549)細(xì)胞，以顯微注射的方式移植到斑馬魚卵黃囊內(nèi)，每尾移植約200個細(xì)胞，建立斑馬魚人肺腺癌移植瘤模型。4.實驗方法使用cm-dil標(biāo)記人肺腺癌(a549)細(xì)胞，以顯微注射的方式移植到野生型ab品系2dpf斑馬魚卵黃囊內(nèi)，每尾移植約200個細(xì)胞，建立斑馬魚人肺腺癌(a549)移植模型；將注射了a549細(xì)胞的斑馬魚放置于35℃培養(yǎng)至3dpf。在顯微鏡下挑選出移植腫瘤細(xì)胞一致性較好的斑馬魚，隨機分配至6孔板中，以水溶給藥方法分別給予樣品樣品28、83和250μg/ml濃度，陽性對照藥順鉑50μm濃度，同時設(shè)置模型對照組，每孔(濃度組)30尾斑馬魚，每孔容量為5ml。將各實驗(濃度)組斑馬魚繼續(xù)置于35℃培養(yǎng)，2天后，每個實驗(濃度)組隨機選10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下進行觀察、拍照并保存圖片；利用尼康nis-elementsd3.10高級圖像處理軟件進行圖像分析，計算癌細(xì)胞熒光強度，以熒光強度評價樣品對斑馬魚肺腺癌(a549)移植瘤的抑制作用，并用以下公式計算腫瘤抑制作用。根據(jù)移植瘤的生長抑制作用繪制濃度效應(yīng)曲線；統(tǒng)計學(xué)分析采用方差分析和dunnett’st-檢驗，p<0.05為顯著性差異；提供具有代表性的實驗圖譜。特別說明：野生型ab系斑馬魚本身并不產(chǎn)生紅色熒光，cm-dil標(biāo)記的細(xì)胞注射到斑馬魚卵黃囊后，在一定波長下能激發(fā)產(chǎn)生紅色熒光，熒光強度總和與癌細(xì)胞的數(shù)量成正相關(guān)，熒光強度總和越大，癌細(xì)胞數(shù)量越多(lietal.2011)。5.實驗結(jié)果陽性對照藥順鉑在50μm濃度下對斑馬魚人肺腺癌(a549)移植瘤細(xì)胞熒光強度值總和為137287像素，與模型對照組比較(203330像素)p<0.001，腫瘤抑制作用為32％，顯示順鉑對斑馬魚人肺腺癌(a549)移植瘤的生長有明顯抑制作用。樣品在28、83和250μg/ml的濃度下對斑馬魚人肺腺癌(a549)移植瘤細(xì)胞熒光強度值總和分別為161737、147640和140415像素，與模型對照組比較，28μg/ml組p<0.05，腫瘤抑制作用分別為20％；83μg/ml組p<0.01，腫瘤抑制作用為27％；250μg/ml組p<0.001，腫瘤抑制作用為31％。詳見表5、圖7、圖8和圖9。表5.樣品去壁靈芝孢子粉對斑馬魚人肺腺癌(a549)移植瘤的抑制作用(n＝10)注：與模型對照組比較，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001試驗結(jié)果表明：本實驗濃度條件下，本發(fā)明的去壁靈芝孢子粉、顆粒對斑馬魚人胃癌移植瘤、人肺腺癌移植瘤和人淋巴癌移植瘤均有抑制作用，其中對斑馬魚人胃癌移植瘤和人淋巴癌移植瘤的抑制作用較強。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。當(dāng)前第1頁12