一種使用載體組合的新型治療性疫苗及使用方法與流程

本發(fā)明屬于疫苗領(lǐng)域，尤其涉及一種使用載體組合的新型治療性疫苗及使用方法。

背景技術(shù)：

慢性病毒感染疾病，如艾滋，乙肝，丙肝等，仍是人類健康面臨的重大威脅。全球約有3400萬(wàn)人攜帶艾滋病毒(hiv)，約有4億人攜帶乙肝病毒(hbv)，1.5億人感染丙肝病毒(hcv)(1)。在中國(guó)，僅hbv攜帶者就超過(guò)9000萬(wàn)人，慢性活動(dòng)性乙肝約3000萬(wàn)人，高居世界第一，hiv的感染率和發(fā)病率均呈上升趨勢(shì)。因此，慢性病毒感染是我國(guó)公共健康面臨的重大挑戰(zhàn)，造成日益嚴(yán)重的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)(每年約消耗我國(guó)gdp的2％)。疫苗接種是針對(duì)病毒感染最有效，最經(jīng)濟(jì)的一種免疫學(xué)手段。根據(jù)who估計(jì)，1美元的疫苗接種投入可節(jié)約5～10美元的健康保障費(fèi)用。

現(xiàn)在常用的疫苗包括預(yù)防性疫苗(文獻(xiàn)1)和治療性疫苗兩種，預(yù)防性疫苗主要通過(guò)作用于未曾抗原暴露過(guò)的淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生免疫記憶以預(yù)防可能的相應(yīng)感染。然而，在慢性病毒感染的特殊免疫環(huán)境下，病原特異性的淋巴細(xì)胞已抗原暴露，并受到長(zhǎng)期慢性刺激而耗竭，喪失絕大部分功能，不能建立免疫記憶庫(kù)(文獻(xiàn)2、文獻(xiàn)3)?？梢?jiàn)感染性質(zhì)的不同決定了預(yù)防性疫苗不適合直接用于治療慢性病毒感染。

經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，針對(duì)慢性病毒感染，治療性疫苗因其可逆轉(zhuǎn)已耗竭的免疫細(xì)胞的功能，直接殺滅包含病毒的感染靶細(xì)胞，并可能最終清除感染而成為對(duì)抗慢性病毒感染新策略與技術(shù)。而慢性病毒感染除病毒抗原持續(xù)存在外，還同時(shí)伴隨著抑制性免疫微環(huán)境的形成。治療性疫苗免疫慢性病毒感染的機(jī)體后，相同的免疫微環(huán)境也會(huì)作用于新產(chǎn)生的效應(yīng)性cd8+t細(xì)胞，從而導(dǎo)致新一輪的功能耗竭，造成疫苗的效力低下。在此背景下，由治療性疫苗誘導(dǎo)而新形成的效應(yīng)cd8+t細(xì)胞需具有在抑制性免疫微環(huán)境下抵抗耗竭的能力，從而使治療性疫苗能在免疫后有效持久的發(fā)揮其抗病毒效力。然而，目前為止還沒(méi)有很好的直接作用于cd8+t細(xì)胞本身而干預(yù)免疫耗竭的手段，而且已有研究提示，在慢性病毒感染環(huán)境下過(guò)度刺激病毒特異性cd8+t細(xì)胞反而易促使其凋亡(文獻(xiàn)4、文獻(xiàn)5)。

當(dāng)前，國(guó)內(nèi)外治療性疫苗的研究大多依然遵循預(yù)防性疫苗研究的研究方式，采用不同類型的免疫原，如重組蛋白、合成肽，重組dna或病毒載體，抗原-抗體復(fù)合物等，配伍傳統(tǒng)或新型佐劑，以期產(chǎn)生類似預(yù)防性疫苗引起的免疫反應(yīng)而控制病毒的復(fù)制(文獻(xiàn)6-文獻(xiàn)9)。但此類研發(fā)尚未取得關(guān)鍵性的突破，仍然亟需研發(fā)新的策略及手段制備的高效持久的慢性病毒感染治療性疫苗。

文獻(xiàn)1：plotkin，s.a.complexcorrelatesofprotectionaftervaccination.clinicalinfectiousdiseases：anofficialpublicationoftheinfectiousdiseasessocietyofamerica(2013)；

文獻(xiàn)2：wherry，e.j.tcellexhaustion.natureimmunology12，492-499(2011)；

文獻(xiàn)3：wherry，e.j.etal.hiv-specificcd8tcellsexpresslowlevelsofil-7ralpha：implicationsforhiv-specifictcellmemory.virology353，366-373(2006)；

文獻(xiàn)4：west，e.e.etal.tightregulationofmemorycd8(+)tcellslimitstheireffectivenessduringsustainedhighviralload.immunity35，285-298(2011)；

文獻(xiàn)5：nolz，j.c.&harty，j.t.protectivecapacityofmemorycd8+tcellsisdictatedbyantigenexposurehistoryandnatureoftheinfection.immunity34，781-793(2011)；

文獻(xiàn)6：王萱怡，聞?dòng)衩芬耘R床-實(shí)驗(yàn)室-臨床模式研究抗原-抗體復(fù)合物型治療性乙型肝炎疫苗.傳染病信息23，193-196(2010)；

文獻(xiàn)7：lan，p.，zhang，c.，han，q.，zhang，j.&tian，z.therapeuticrecoveryofhbv-inducedhepatocyte-intrinsicimmunedefectreversessystemicadaptiveimmunetolerance.hepatology(2013)；

文獻(xiàn)8：cobleigh，m.a.，wei，x.&robek，m.d.avesicularstomatitisvirus-basedtherapeuticvaccinegeneratesafunctionalcd8tcellresponsetohepatitisbvirusintransgenicmice.journalofvirology87，2969-2973(2013)；

文獻(xiàn)9：陳永紅，陳小麗乙型肝炎疫苗的研究新進(jìn)展.免疫學(xué)雜志28，266-271(2012)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，本發(fā)明提供了一種使用載體組合的新型治療性疫苗及使用方法。

一種使用載體組合的新型治療性疫苗，包括第一免疫物質(zhì)和第二免疫物質(zhì)，所述第一免疫物質(zhì)由重組載體細(xì)菌組成，所述第二免疫物質(zhì)由重組載體病毒組成；所述重組載體細(xì)菌為基因組中包含并表達(dá)了目標(biāo)病毒或者目標(biāo)腫瘤中主要cd4+t細(xì)胞抗原表位的脫氧核糖核酸序列的載體細(xì)菌，使得第一免疫物質(zhì)能夠特異性地刺激宿主cd4+t細(xì)胞，產(chǎn)生針對(duì)目標(biāo)病毒或者目標(biāo)腫瘤的特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答；所述重組載體病毒為基因中包含并表達(dá)了與所述重組載體細(xì)菌所含相同的針對(duì)目標(biāo)病毒或者目標(biāo)腫瘤中主要cd4+t細(xì)胞抗原表位的脫氧核糖核酸序列的載體病毒，使得第二免疫物質(zhì)能進(jìn)一步地加強(qiáng)刺激宿主針對(duì)目標(biāo)病毒或者目標(biāo)腫瘤的cd4+t細(xì)胞免疫應(yīng)答，并且增強(qiáng)的cd4+t細(xì)胞免疫應(yīng)答能夠輔助其它針對(duì)目標(biāo)病毒或者目標(biāo)腫瘤的細(xì)胞免疫應(yīng)答；所述載體細(xì)菌為適用于人體的、安全的作為疫苗及基因治療的細(xì)菌；所述載體病毒為適用于人體的、安全的作為疫苗及基因治療的病毒；所述載體細(xì)菌和所述載體病毒都能夠被人體免疫系統(tǒng)所清除。

優(yōu)選的，獲得重組載體細(xì)菌的方法如下：在載體細(xì)菌基因組中整合目標(biāo)病毒或者目標(biāo)腫瘤針對(duì)cd4+t細(xì)胞主要抗原表位的蛋白編碼基因，得到重組載體細(xì)菌；獲得重組載體病毒的方法如下：在載體病毒基因中插入目標(biāo)病毒或者目標(biāo)腫瘤針對(duì)cd4+t細(xì)胞主要抗原表位的蛋白編碼基因，并通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染方式得到重組載體病毒。

優(yōu)選的，所述目標(biāo)病毒為造成人體慢性感染的病毒。

優(yōu)選的，所述目標(biāo)腫瘤為人體腫瘤。

優(yōu)選的，所述重組載體細(xì)菌和重組載體病毒表達(dá)了相同的目標(biāo)病毒或目標(biāo)腫瘤的cd4+t細(xì)胞抗原表位或串聯(lián)的抗原表位組合。

一種使用載體組合的新型治療性疫苗的使用方法，包括下列步驟：

步驟a：在被感染機(jī)體進(jìn)入被目標(biāo)病毒感染的感染期后，對(duì)被感染機(jī)體注射含有重組載體細(xì)菌的第一免疫物質(zhì)；

步驟b：在被感染機(jī)體注射第一免疫物質(zhì)后的合適時(shí)間，對(duì)被感染機(jī)體注射含有重組載體病毒的第二免疫物質(zhì)。

優(yōu)選的，在步驟a中采用腹腔或肌肉注射的方法對(duì)被感染機(jī)體注射第一免疫物質(zhì)；在步驟b中采用腹腔或肌肉注射的方法對(duì)被感染機(jī)體注射第二免疫物質(zhì)。

一種使用載體組合的新型治療性疫苗的使用方法，包括下列步驟：

步驟a：對(duì)荷瘤機(jī)體注射含有重組載體細(xì)菌的第一免疫物質(zhì)；

步驟b：在荷瘤機(jī)體注射第一免疫物質(zhì)后的合適時(shí)間，對(duì)荷瘤機(jī)體注射含有重組載體病毒的第二免疫物質(zhì)。

優(yōu)選的，在步驟a中采用腹腔、肌肉或瘤體內(nèi)注射的方法對(duì)荷瘤機(jī)體注射第一免疫物質(zhì)；在步驟b中采用腹腔、肌肉或瘤體內(nèi)注射的方法對(duì)荷瘤機(jī)體注射第二免疫物質(zhì)。

使用本發(fā)明所述的一種使用載體組合的新型治療性疫苗，在載體細(xì)菌和載體病毒兩種不同載體的基因中加入了目標(biāo)病毒或者目標(biāo)腫瘤針對(duì)cd4+t細(xì)胞主要抗原表位的蛋白編碼基因，使得被感染機(jī)體或者荷瘤機(jī)體在使用所述疫苗的過(guò)程中通過(guò)依次注射第一免疫物質(zhì)和第二免疫物質(zhì)后產(chǎn)生效果加強(qiáng)的針對(duì)目標(biāo)病毒或者目標(biāo)腫瘤的cd4+t細(xì)胞的免疫應(yīng)答，從而增強(qiáng)被感染機(jī)體或者荷瘤機(jī)體中的cd8+t細(xì)胞免疫應(yīng)答，大大改善cd8+t細(xì)胞的耗竭狀態(tài)，有效的提高治療性疫苗控制病毒感染或者控制腫瘤的效果。

附圖說(shuō)明

圖1：顯示了實(shí)施例1中本發(fā)明所述的一種使用載體組合的新型治療性疫苗降低慢性病毒感染小鼠體內(nèi)病毒滴度；

圖2：顯示了實(shí)施例1中本發(fā)明所述的一種使用載體組合的新型治療性疫苗加強(qiáng)cd8t細(xì)胞特異性抗病毒免疫反應(yīng)的效果；

圖3：顯示了實(shí)施例1中本發(fā)明所述的一種使用載體組合的新型治療性疫苗加強(qiáng)cd4t細(xì)胞特異性抗病毒免疫反應(yīng)的效果；

圖4：顯示了實(shí)施例1中本發(fā)明所述的一種使用載體組合的新型治療性疫苗加強(qiáng)抗病毒體液免疫的效果；

圖5：顯示了實(shí)施例1中本發(fā)明所述的一種使用載體組合的新型治療性疫苗降低抑制性信號(hào)表達(dá)的效果；

圖6：顯示了實(shí)施例1中本發(fā)明所述的一種使用載體組合的新型治療性疫苗降低treg細(xì)胞頻率的效果；

圖7：顯示了實(shí)施例2中本發(fā)明所述的一種使用載體組合的新型治療性疫苗抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果。

具體實(shí)施方式

一種使用載體組合的新型治療性疫苗，包括第一免疫物質(zhì)和第二免疫物質(zhì)，用于治療慢性病毒感染或腫瘤。第一免疫物質(zhì)由重組載體細(xì)菌組成，第二免疫物質(zhì)由重組載體病毒組成，完成制備并達(dá)到合格要求的第一免疫物質(zhì)與第二免疫物質(zhì)分別冷藏存儲(chǔ)。其中重組載體細(xì)菌為基因組中包含并表達(dá)了目標(biāo)病毒或者目標(biāo)腫瘤中主要cd4+t細(xì)胞抗原表位或串聯(lián)的抗原表位組合的脫氧核糖核酸序列的載體細(xì)菌，使得第一免疫物質(zhì)能夠特異性地刺激宿主cd4+t細(xì)胞，產(chǎn)生針對(duì)目標(biāo)病毒或者目標(biāo)腫瘤的特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答；重組載體病毒為基因中包含并表達(dá)與所述重組載體細(xì)菌所含相同的針對(duì)目標(biāo)病毒或者目標(biāo)腫瘤的主要cd4+t細(xì)胞抗原表位或串聯(lián)的抗原表位組合的脫氧核糖核酸序列的載體病毒，使得第二免疫物質(zhì)能進(jìn)一步地加強(qiáng)刺激宿主針對(duì)目標(biāo)病毒或者目標(biāo)腫瘤的cd4+t細(xì)胞免疫應(yīng)答，并且增強(qiáng)的cd4+t細(xì)胞免疫應(yīng)答能夠輔助其它針對(duì)目標(biāo)病毒或者目標(biāo)腫瘤的細(xì)胞免疫應(yīng)答。最終獲得的重組載體細(xì)菌和重組病毒表達(dá)了相同的目標(biāo)病毒或目標(biāo)腫瘤的cd4+t細(xì)胞抗原表位或串聯(lián)的抗原表位組合。

本發(fā)明所述的一種使用載體組合的新型治療性疫苗所針對(duì)的目標(biāo)病毒為造成人體慢性感染的病毒，所針對(duì)的目標(biāo)腫瘤為人體腫瘤。其中目標(biāo)病毒或者目標(biāo)腫瘤的cd4+t細(xì)胞抗原表位的脫氧核糖核酸序列為30-105堿基對(duì)，編碼10-35氨基酸序列。

制備本發(fā)明所述的一種使用載體組合的新型治療性疫苗所使用的載體細(xì)菌為適用于人體的、安全的能作為疫苗及基因治療的細(xì)菌，并且所使用的載體病毒也為適用于人體的、安全的能作為疫苗及基因治療的病毒，確保進(jìn)行基因重組前所選用的載體細(xì)菌和載體病毒都能夠被人體免疫系統(tǒng)所消滅。本發(fā)明疫苗第一免疫物質(zhì)和第二免疫物質(zhì)的具體制備及使用方法將在具體實(shí)施例中詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1

一、使用載體組合的新型治療性疫苗的制備方法：

實(shí)施例1中本發(fā)明所述的一種使用載體組合的新型治療性疫苗針對(duì)的目標(biāo)病毒為淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(lcmv)，為一種慢性感染病毒，其中淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(lcmv)中能引起cd4+t細(xì)胞免疫反應(yīng)的主要抗原表位的蛋白編碼基因?yàn)間p61-gp66基因；選擇單核細(xì)胞增多性李斯特菌(lm)為載體細(xì)菌，選擇甲型流感病毒(iav)為載體病毒，本實(shí)施例中被選作為載體細(xì)菌和載體病毒的細(xì)菌和病毒本身或者在減毒處理后對(duì)人體沒(méi)有傷害，都能夠被人體免疫系統(tǒng)所消滅。

實(shí)施例1疫苗制備包括步驟a和步驟b：

步驟a：制備第一免疫物質(zhì)，包括步驟a1和步驟a2。

步驟a1：對(duì)單核細(xì)胞增多性李斯特菌(lm)進(jìn)行減毒處理，然后利用同源重組的方法，將gp66蛋白編碼基因定點(diǎn)整合于減毒后的單核細(xì)胞增多性李斯特菌(lm)基因組中的hly基因啟動(dòng)子和信號(hào)肽序列的下游，得到表達(dá)gp66(gp61)的重組載體細(xì)菌為rlm-gp66(lcmvgp61)；

步驟a2：取lm-gp66(lcmvgp61)細(xì)菌儲(chǔ)存液涂bhi平板，挑單菌落接種bhi肉湯培養(yǎng)基，在37℃環(huán)境下培養(yǎng)，每6至8小時(shí)測(cè)定細(xì)菌濃度a600的吸收值，調(diào)整細(xì)菌濃度為6×10⁵/ml，并涂平板計(jì)數(shù)校正，最后將培養(yǎng)合格的rlm-gp66(lcmvgp61)細(xì)菌冰凍存儲(chǔ)于-80℃冰箱中。

步驟b：制備第二免疫物質(zhì)，包括步驟b1和步驟b2。

步驟b1：利用反向遺傳技術(shù)將gp66蛋白編碼基因插入到甲型流感病毒(iav)的na基因中，然后將嵌合的na基因插入phw2000中，并與phw-pb1、phw-pb2、phw-pa、phw-ha、phw-np、phw-m和phw-ns等基因轉(zhuǎn)錄/表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞，最后將轉(zhuǎn)染后含有甲型流感病毒(iav)的293t細(xì)胞培養(yǎng)上清接種spf雞胚，獲得有血凝價(jià)的重組載體病毒為iav-gp66。

步驟b2：iav-gp66病毒的培養(yǎng)參照國(guó)際通行的方法，采用原代雞胚成纖維細(xì)胞(cef)在150平方厘米的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)瓶中包括mem培養(yǎng)液，當(dāng)雞胚成纖維細(xì)胞(cef)長(zhǎng)成單層后，接種iav-gp66病毒的病毒株，并使病毒moi＝1；在37℃環(huán)境培養(yǎng)3天后，離心并棄上清，在干冰和37℃水浴凍融細(xì)胞3次，在冰上超聲1分鐘，然后將培養(yǎng)合格的iav-gp66病毒冰凍存儲(chǔ)于-80℃冰箱中。其中iav-gp66病毒的濃度測(cè)定采用半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量測(cè)定方法簡(jiǎn)稱tcid50進(jìn)行測(cè)定，具體方法如下：將系列稀釋的iav-gp66病毒液共計(jì)0.2ml與100μl1×105mlmdck細(xì)胞混合置于微量細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37℃孵箱中培養(yǎng)18至22小時(shí)后，測(cè)定細(xì)胞半數(shù)感染劑量。

二、使用載體組合的新型治療性疫苗的使用方法

在本實(shí)施例中，使用的小鼠為c57bl/6j(cd45.2)，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司；所有小鼠均飼養(yǎng)于第三軍醫(yī)大學(xué)spf(specificpathogen-free)級(jí)動(dòng)物房。所有實(shí)驗(yàn)中所用小鼠均為6-10周齡，且同一實(shí)驗(yàn)中使用的小鼠均為同一性別隨機(jī)分組。本實(shí)施例所使用的重組后的rlm-gp66(lcmvgp61)細(xì)菌菌株從美國(guó)biourcesinc.公司購(gòu)買得到，同時(shí)使用的重組后的iav-gp66病毒的病毒株來(lái)自中國(guó)人民解放軍免疫學(xué)研究所。

關(guān)于在本實(shí)施例中所使用的重組載體病毒iav-gp66，及其構(gòu)建方法在文獻(xiàn)《qualitativelydifferentmemorycd8+tcellsaregeneratedafterlymphocyticchoriomeningitisvirusandinfluenzavirusinfections》中進(jìn)行了描述，該文獻(xiàn)于2010年發(fā)表在journalofimmunology雜志(august15，2010，185(4)2182-2190；doi：https://doi.org/10.4049/jimmunol.1001142)。文中說(shuō)明了重組載體病毒iav-gp66是通過(guò)由八個(gè)質(zhì)粒組成的質(zhì)體逆向遺傳學(xué)系統(tǒng)構(gòu)建的；pcr引導(dǎo)的基因突變技術(shù)將lcmv病毒的gp(九個(gè)氨基酸長(zhǎng)度)序列從流感病毒h1n1pr8株的神經(jīng)氨酸酶(na)蛋白基因42位插入；為保證重組na蛋白的長(zhǎng)度保持不變，qnhtgicnq序列從重組蛋白序列中被刪除。

原文如下：

recombinantinfluenzaviruswasproducedusinganestablishedeight-plasmidinfluenzareverse-geneticssystem.theplasmidsusedintheconstructionoftherecombinantinfluenzavirusesweredescribedpreviously(18).thelcmvgpepitopewasinsertedintothenaofa/pr/8/34(h1n1)atresidue42usingapcrmutagenesisapproach.acorrespondingnumberofaminoacids(nine-qnhtgicnq)wasdeletedfromtherecombinantvirusestomaintaintheproteinlengthequaltothewild-typenaprotein.

步驟a：使用目標(biāo)病毒lcmv-cl13感染小鼠，在小鼠進(jìn)入lcmv-cl13慢性病毒感染期后的第21天，cd8+t細(xì)胞進(jìn)入全面的耗竭狀態(tài)，從此時(shí)開(kāi)始使用組合治療性疫苗，通過(guò)腹腔注射或者肌肉注射的方法對(duì)被感染小鼠注射1x10⁶cfu含有l(wèi)m-gp66(lcmvgp61)細(xì)菌的第一免疫物質(zhì)，注射量為0.2ml，并且第一免疫物質(zhì)采用rpmi培養(yǎng)基稀釋。

步驟b：在小鼠注射第一免疫物質(zhì)后的第7天，即小鼠進(jìn)入lcmv-cl13慢性病毒感染期后的第28天，通過(guò)腹腔注射或者肌肉注射的方法對(duì)步驟a中被感染小鼠注射0.5tcid50含有iav-gp66病毒的第二免疫物質(zhì)，用于boost高數(shù)量的病毒特異性cd4+t細(xì)胞，注射量為0.1ml，第二免疫物質(zhì)采用rpmi培養(yǎng)基稀釋。

三、使用載體組合的新型治療性疫苗使用效果檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

在第二免疫物質(zhì)注射后的第8天，分離各組織樣品利用流式細(xì)胞儀分析cd8+t細(xì)胞的數(shù)量、功能和表型，同時(shí)也分析cd4+t細(xì)胞的數(shù)量和功能。最后，滴定小鼠脾臟、肺臟以及肝臟內(nèi)的病毒滴度，確定治療性疫苗的效力。在疫苗效果檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，將未注射組合治療性疫苗的lcmv-cl13感染小鼠作為對(duì)照。

1.病毒特異性的cd4+t細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量分析

1.1數(shù)量分析：將從脾臟分離的細(xì)胞先紀(jì)錄細(xì)胞總數(shù)，再直接用含gp66短肽的四聚體染色，輔以cd3、cd4和cd44，用live/dead染料區(qū)分死細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞分析，以live/dead-tetramer+cd3+cd4+cd44+界定活的病毒特異性的cd4+t細(xì)胞，根據(jù)其在總細(xì)胞的頻率和總細(xì)胞數(shù)量，確定病毒特異性的cd4+t細(xì)胞的數(shù)量。

1.2質(zhì)量分析：通過(guò)上述的流式細(xì)胞分析，首先確定病毒特異性的cd4+t細(xì)胞，然后再進(jìn)一步從分化方向、細(xì)胞因子分泌等方面界定病毒特異性的cd4+t細(xì)胞的質(zhì)量。相關(guān)方法如下：用gp66短肽刺激細(xì)胞混合液5小時(shí)，再采用相應(yīng)抗體進(jìn)行細(xì)胞表面和胞內(nèi)染色。

2.病毒特異性的cd8+t細(xì)胞耗竭分析

cd8+t細(xì)胞的耗竭程度從以下6個(gè)方面進(jìn)行分析：

2.1細(xì)胞數(shù)量，將從脾臟分離的細(xì)胞先紀(jì)錄細(xì)胞總數(shù)，再直接用含gp33+短肽的四聚體染色，輔以cd3、cd4和cd44，用live/dead染料區(qū)分死細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞分析，以live/dead-tetramer+cd3+cd4+cd44+界定活的病毒特異性的cd8+t細(xì)胞，根據(jù)其在總細(xì)胞的頻率和總細(xì)胞數(shù)量，確定病毒特異性的cd8+t細(xì)胞的數(shù)量

2.2細(xì)胞表面抑制性受體的表達(dá)，包括pd-1，2b4，lag3，tim3等，這些受體均可以使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量分析；

2.3細(xì)胞因子的分泌，主要包括il-2，ifn-，tnf，分泌水平的定量可以采用特異性的gp33短肽刺激5小時(shí)，再采用胞內(nèi)染色的方法，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析；

2.4殺傷功能，細(xì)胞的殺傷功能可以用細(xì)胞儀及相應(yīng)抗體檢測(cè)cd107a/b的表達(dá)進(jìn)行顯示；

2.5增殖能力，細(xì)胞的增殖可以通過(guò)用流式細(xì)胞儀及相應(yīng)抗體檢測(cè)ki-67的表達(dá)進(jìn)行顯示；

3.組織病毒清除分析

3.1將免疫及未免疫的感染小鼠不同的組織取樣，稱重，勻漿，離心，取上清，使用tianampvirusrnakit(dp315-r)組織病毒rna提取試劑盒提取組織內(nèi)的病毒rna；

3.2用nanodrop對(duì)所提取的病毒rna定量后，將其逆轉(zhuǎn)錄為cdna，逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中使用病毒特異性引物(gp-r：gcaactgctgtgttcccgaaac)；

3.3qrt-pcr的方法檢測(cè)病毒拷貝數(shù)：檢測(cè)未知樣本的時(shí)，需用已經(jīng)過(guò)噬斑法金標(biāo)準(zhǔn)滴定的已知濃度的病毒十倍倍比稀釋，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。所用引物序列為：gp-fcattcacctggactttgtcagactc及gp-rgcaactgctgtgttcccgaaac；

3.4根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出所提取的病毒rna拷貝數(shù)，再根據(jù)記錄的組織重量計(jì)算每克組織中的病毒滴度。

4.抗體滴度檢測(cè)

分離出小鼠血清使用elisa法測(cè)定lcmv特異性igg滴度。用pbs緩沖液將bhk-lcmvlysate稀釋至濃度為3μg/ml。每孔中加100ul，在4℃環(huán)境過(guò)夜，并于第二天棄去孔內(nèi)溶液，用pbst洗3次。每孔加入200ul封閉液(pbs+0.2％tween-20+10％fcs)，室溫放置1小時(shí)。在第一排孔中，加入一定稀釋的待測(cè)血清，后排依次梯度稀釋，室溫孵育九十分鐘，并同時(shí)做空白孔、陰性對(duì)照孔和陽(yáng)性對(duì)照孔，然后用pbst洗三次。在封閉液中配置goatanti-mouseigg-hrp(1∶5000)酶標(biāo)二抗。室溫孵育九十分鐘，用pbst洗三次。將4mgopd(sigma，p8787)溶解于10ml檸檬酸緩沖液中，再加入33ul3％的h2o2(fisher，h324500)。每孔加入100ul。待底物與酶反應(yīng)完全后，于各反應(yīng)孔中加入100ul1mhcl。使用酶標(biāo)儀讀取每孔在490nm處od值。

5.使用載體組合的新型治療性疫苗與pd-l1抗體聯(lián)用的效果檢測(cè)

已感染lcmv-cl13的小鼠自感染后第26天起每三天接受一次pd-l1抗體(ratanti-mousepd-l1antibody；10f.9g2；bioxcell)注射，共三次，每次注射劑量為200μg，采用腹腔注射的方式。與此同時(shí)，在小鼠感染后第21天起接受使用載體組合的新型治療性疫苗的免疫，即在小鼠感染后第21天注射lm-gp61，在小鼠感染后28天注射iav-gp61。

四、使用載體組合的新型治療性疫苗的有益效果

如圖1-圖6所示，實(shí)施例1中使用的本發(fā)明所述的使用載體組合的新型治療性疫苗通過(guò)依次組合使用重組載體細(xì)菌及重組載體病毒兩種不同載體，加強(qiáng)病毒特異性cd4+t細(xì)胞的免疫應(yīng)答，從而增強(qiáng)慢性病毒感染中cd8+t細(xì)胞的應(yīng)答，改善cd8+t細(xì)胞的耗竭狀態(tài)。本發(fā)明所述的使用載體組合的新型治療性疫苗免疫被慢性病毒感染的小鼠后，小鼠體內(nèi)脾臟、肺臟及肝臟組織中病毒滴度顯著下降100-1000倍。

經(jīng)過(guò)本發(fā)明所述的使用載體組合的新型治療性疫苗的免疫，慢性病毒感染的小鼠體內(nèi)病毒特異性cd8+t細(xì)胞數(shù)目提高兩倍左右，同時(shí)功能性cd8+t細(xì)胞數(shù)目的提高約三到四倍；因此可見(jiàn)，病毒特異性cd8+t細(xì)胞的免疫反應(yīng)得到顯著提升，cd8+t細(xì)胞的功能耗竭狀態(tài)得到顯著改善，并且cd8+t細(xì)胞恢復(fù)較強(qiáng)的抗病毒效應(yīng)功能。

本發(fā)明所述的使用載體組合的新型治療性疫苗在改善cd8+t細(xì)胞功能的同時(shí)，有效提升了病毒特異性cd4+t細(xì)胞的數(shù)目及功能，病毒特異性cd4+t細(xì)胞的數(shù)目增加約四倍，從而可為cd8+t細(xì)胞提供更多的幫助，增強(qiáng)cd8+t細(xì)胞抵抗耗竭的能力。并且，本疫苗在增強(qiáng)細(xì)胞免疫的同時(shí)還能增強(qiáng)慢病毒感染中的體液免疫。在免疫小鼠體內(nèi)，濾泡輔助性t細(xì)胞tfh細(xì)胞數(shù)目提高兩倍，生發(fā)中心b細(xì)胞比例升高兩倍，并且在血清中病毒特異性抗體igg滴度顯著提高，約為1.5倍。最后，本疫苗還能改善機(jī)體體內(nèi)免疫抑制環(huán)境，經(jīng)疫苗免疫的小鼠巨噬細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞表面抑制性配體分子表達(dá)下降，調(diào)節(jié)性t細(xì)胞頻率也有所下降，大約下降百分之五。

圖1中a部分顯示了小鼠使用載體組合的新型治療性疫苗的方法流程；b-d部分顯示了使用疫苗免疫小鼠與對(duì)照小鼠脾臟(b部分)、肺臟(c部分)和肝臟(d部分)內(nèi)病毒滴度值，可見(jiàn)小鼠使用載體組合的新型治療性疫苗后有效的降低脾臟、肺臟和肝臟等內(nèi)臟組織內(nèi)的病毒滴度。

圖2中a部分顯示對(duì)照組小鼠和疫苗組小鼠病毒激活的cd44hicd8t細(xì)胞的頻率和數(shù)目的比較；b部分顯示對(duì)照組小鼠和疫苗組小鼠病毒特異性cd8t細(xì)胞的頻率和數(shù)目的比較；c部分顯示對(duì)照組小鼠和疫苗組小鼠病毒特異性cd8t細(xì)胞表面表達(dá)抑制性分子水平的比較；d部分顯示對(duì)照組小鼠和疫苗組小鼠cd8t細(xì)胞表達(dá)增殖標(biāo)志物ki-67水平的比較；e-f部分顯示對(duì)照組小鼠和疫苗組小鼠cd8t細(xì)胞體外經(jīng)病毒特異性肽gp33刺激后效應(yīng)功能的比較；g-h部分顯示對(duì)照組小鼠和疫苗組小鼠組cd8t細(xì)胞體外經(jīng)病毒特異性肽gp276刺激后效應(yīng)功能的比較。

圖3中a-c部分顯示對(duì)照組小鼠和疫苗組小鼠病毒激活的cd44hicd4t細(xì)胞以及病毒特異性gp66+cd4t細(xì)胞的頻率和數(shù)目的比較；d-e部分顯示對(duì)照組小鼠和疫苗組小鼠cd4t細(xì)胞體外經(jīng)特異性肽gp66刺激后分泌細(xì)胞因子的比較。

圖4中a部分顯示對(duì)照組小鼠和疫苗組小鼠病毒特異性tfh數(shù)目的比較；b部分顯示對(duì)照組小鼠和疫苗組小鼠生發(fā)中心b細(xì)胞(gcb)頻率的比較；c部分顯示對(duì)照組小鼠和疫苗組小鼠血清中l(wèi)cmv特異性igg的比較。

圖5顯示使用載體組合的新型治療性疫苗可以降低巨噬細(xì)胞(macrophage)及樹(shù)突狀細(xì)胞(dc)表面抑制性信號(hào)分子pd-l1的表達(dá)。

圖6顯示使用載體組合的新型治療性疫苗可以降低調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(treg)的頻率。

可見(jiàn)將本發(fā)明所述的使用載體組合的新型治療性疫苗用于慢性病毒感染時(shí)，能通過(guò)刺激cd4+t細(xì)胞的免疫應(yīng)答進(jìn)而有效的增強(qiáng)cd8+t細(xì)胞抗病毒能力以及抵抗耗竭的能力，具有良好的抗病毒效果。

實(shí)施例2

一、使用載體組合的新型治療性疫苗的制備方法：

實(shí)施例2中本發(fā)明所述的一種使用載體組合的新型治療性疫苗針對(duì)的目標(biāo)腫瘤為表達(dá)lcmv病毒糖蛋白的黑色素瘤細(xì)胞(b16-gp)，為一種實(shí)體瘤，其中黑色素瘤細(xì)胞(b16-gp)能引起cd4+t細(xì)胞免疫反應(yīng)的主要抗原表位的蛋白編碼基因也為gp61-gp66基因；同樣選擇單核細(xì)胞增多性李斯特菌(lm)為載體細(xì)菌，選擇甲型流感病毒(iav)為載體病毒，本實(shí)施例中被選作為載體細(xì)菌和載體病毒的細(xì)菌和病毒本身或者在減毒處理后對(duì)人體沒(méi)有傷害，都能夠被人體免疫系統(tǒng)所消滅。

實(shí)施例2疫苗制備步驟同實(shí)施例1相同。

二、使用載體組合的新型治療性疫苗的使用方法

在本實(shí)施例中，使用的小鼠為c57bl/6j(cd45.2)，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司；所有小鼠均飼養(yǎng)于第三軍醫(yī)大學(xué)spf(specificpathogen-free)級(jí)動(dòng)物房。所有實(shí)驗(yàn)中所用小鼠均為6-10周齡，且同一實(shí)驗(yàn)中使用的小鼠均為同一性別隨機(jī)分組。本實(shí)施例所使用的重組后的rlm-gp66(lcmvgp61)細(xì)菌菌株從美國(guó)biourcesinc.公司購(gòu)買得到，同時(shí)使用的重組后的iav-gp66病毒的病毒株來(lái)自中國(guó)人民解放軍免疫學(xué)研究所。

步驟a：將目標(biāo)腫瘤細(xì)胞表達(dá)lcmv病毒糖蛋白的黑色素瘤細(xì)胞(b16-gp)通過(guò)皮下注射的方式在小鼠皮膚表層移植種植黑色素瘤細(xì)胞(b16-gp)。待移植黑色素瘤細(xì)胞(b16-gp)成瘤后開(kāi)始使用組合治療性疫苗，通過(guò)腹腔注射、肌肉注射或者瘤體內(nèi)注射的方法對(duì)荷瘤小鼠注射1x10⁶cfu含有l(wèi)m-gp66(lcmvgp61)細(xì)菌的第一免疫物質(zhì)，注射量為0.2ml，并且第一免疫物質(zhì)采用rpmi培養(yǎng)基稀釋。

步驟b：在小鼠注射第一免疫物質(zhì)后的5-7天內(nèi)，通過(guò)腹腔注射、肌肉注射或者瘤體內(nèi)注射的方法對(duì)步驟a中荷瘤小鼠注射0.5tcid50含有iav-gp66病毒的第二免疫物質(zhì)，用于boost高數(shù)量的病毒特異性cd4+t細(xì)胞，注射量為0.1ml，第二免疫物質(zhì)采用rpmi培養(yǎng)基稀釋。

三、使用載體組合的新型治療性疫苗使用效果的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

在本發(fā)明所述的使用載體組合的新型治療性疫苗注射前、注射過(guò)程中以及注射后的，多次測(cè)量荷瘤小鼠表皮黑色素瘤體積大小的變化，確定本發(fā)明疫苗的效力。同時(shí)在本發(fā)明疫苗的效果檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，將未注射本發(fā)明所述的使用載體組合的新型治療性疫苗的荷瘤小鼠作為對(duì)照。

如圖7所示，將本發(fā)明所述的使用載體組合的新型治療性疫苗用于腫瘤模型，通過(guò)cd4+t細(xì)胞途徑可以有效的增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤能力，具有良好的減緩腫瘤生長(zhǎng)的效果，是一種具有良好潛在應(yīng)用前景的新型疫苗。

本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為說(shuō)明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其他不同形式的變化和變動(dòng)。這里無(wú)法所有的實(shí)施方式予以窮舉。凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引申出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。