本發(fā)明涉及中藥領(lǐng)域，特別涉及一種烏骨藤提取物及其用途。
背景技術(shù)：
：白血病是一類造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病。克隆性白血病細(xì)胞因?yàn)樵鲋呈Э?、分化障礙、凋亡受阻等機(jī)制在骨髓和其他造血組織中大量增殖累積，并浸潤(rùn)其他組織和器官，同時(shí)正常造血受抑制。臨床可見不同程度的貧血、出血、感染發(fā)熱以及肝、脾、淋巴結(jié)腫大和骨骼疼痛。我國(guó)白血病的發(fā)病率在各種腫瘤中占第六位。其中急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)屬于淋巴組織惡性腫瘤，根據(jù)免疫表型將急性淋巴細(xì)胞白血病分為B細(xì)胞型、T細(xì)胞型及T/B混合型，其中T細(xì)胞型ALL(T-ALL)是以T細(xì)胞增殖失控，大量分化障礙的T細(xì)胞惡性克隆性增生、積聚，從而大量T細(xì)胞浸潤(rùn)組織為特征的血液系統(tǒng)惡性疾病，占ALL的15％-25％。T-ALL患者預(yù)后差，特別是一些患兒。醫(yī)學(xué)發(fā)展到今天，多種抗腫瘤藥物聯(lián)合的化療方案及大劑量化療的臨床應(yīng)用，使得T-ALL的預(yù)后相比過去有了較大改善，但總體緩解率仍是所有白血病類型中最低的，因此T-ALL的治療仍是目前白血病治療的難點(diǎn)和重點(diǎn)。由于腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因互相調(diào)控的過程，白血病的分子病理學(xué)機(jī)制研究也已從過往的單基因的研究逐漸轉(zhuǎn)移到多基因的信號(hào)通路調(diào)控及其信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的研究中。烏骨藤為蘿藦科牛奶菜屬植物通光藤的藤莖，其化學(xué)成分主要有甾體酯苷、多糖、樹脂、色素、有機(jī)酸以及生物堿等，藥理作用廣泛，有抗癌、平喘、降壓、免疫調(diào)節(jié)、止痛、保肝利尿等，烏骨藤提取物在肝癌、胃癌、食管癌等消化系統(tǒng)腫瘤已有較好療效，但烏骨藤提取物在血液病中的研究仍然缺乏，療效不明確。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供一種治療白血病效果良好、副作用小的烏骨藤提取物、其制備方法和用途。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明一方面提供：一種含有烏骨藤提取物的藥物組合物，所述烏骨藤提取物的提取方法為：取烏骨藤干燥藤莖，粉碎，用體積比為50-95％乙醇浸提2-4次，將浸提液合并減壓蒸餾，濃縮并回收乙醇，得到烏骨藤粗提物浸膏，將浸膏加入蒸餾水制成混懸液后加入乙酸乙酯和/或丙酮萃取，重復(fù)萃取1-3次，有機(jī)相減壓濃縮，即得烏骨藤提取物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述藥物組合物還含有其他活性成分。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述其他活性成分為雷公藤甲素、雷公藤乙素中的一種或多種。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述藥物組合物還包含一種或多種藥學(xué)上可接受的輔料。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述藥物組合物的劑型為片劑、膠囊劑、注射液、凍干粉針。本發(fā)明第二方面提供：一種烏骨藤提取物的制備方法：取烏骨藤干燥藤莖，粉碎，用體積比為50-95％乙醇浸提2-4次，將浸提液合并減壓蒸餾，濃縮并回收乙醇，得到烏骨藤粗提物浸膏，將浸膏加入蒸餾水制成混懸液后加入乙酸乙酯和/或丙酮萃取，重復(fù)萃取1-3次，有機(jī)相減壓濃縮，即得烏骨藤提取物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述萃取部分使用的有機(jī)溶劑為乙酸乙酯和丙酮的混合物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述有機(jī)溶劑為乙酸乙酯和丙酮體積比為1：1的混合物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述浸提使用的乙醇優(yōu)選體積比為75％的乙醇，浸提次數(shù)優(yōu)選為4次，每次5天。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述萃取步驟中加入的蒸餾水與有機(jī)溶劑的體積比為5:1～1:1，優(yōu)選為4:1；重復(fù)萃取次數(shù)優(yōu)選為3次。本發(fā)明第三方面提供：上述含有烏骨藤提取物的藥物組合物在制備治療白血病藥物中的應(yīng)用。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的白血病為急性淋巴細(xì)胞白血病。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的白血病與人早幼粒白血病細(xì)胞株HL-60相關(guān)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的白血病與人髓性白血病細(xì)胞株K562相關(guān)。本發(fā)明取得的優(yōu)點(diǎn)和積極效果：1、本發(fā)明通過優(yōu)化烏骨藤的提取方法，最終確定先采用一定濃度乙醇提取，在使用乙酸乙酯和/或丙酮萃取的方法制備烏骨藤提取物。使用上述方法獲得的烏骨藤提取物對(duì)多種白血病細(xì)胞株均具有顯著的增殖抑制作用，為新型抗癌藥物的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。2、本發(fā)明意外發(fā)現(xiàn)，將烏骨藤提取物與雷公藤甲素/雷公藤乙素等其他抗癌活性成分聯(lián)合使用，治療白血病的效果更佳，證實(shí)烏骨藤提取物與其他抗癌活性成分能產(chǎn)生協(xié)同增效效果，對(duì)使用復(fù)合制劑臨床治療白血病具有一定的指導(dǎo)意義。具體實(shí)施方式下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明中所使用的原料，如無特殊說明，均為常規(guī)的市售產(chǎn)品；本發(fā)明中所使用的方法，如無特殊說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。烏骨藤提取物的制備實(shí)施例1：取烏骨藤干燥藤莖10kg，粉碎，95％乙醇浸提4次，每次5天，將浸提液合并減壓蒸餾濃縮并回收乙醇，得到烏骨藤粗提物浸膏。浸膏加入2L蒸餾水制成混懸液后加入0.5L乙酸乙酯萃取，重復(fù)萃取3次，有機(jī)相減壓濃縮得到烏骨藤提取物A1。實(shí)施例2：取烏骨藤干燥藤莖10kg，粉碎，75％乙醇浸提4次，每次5天，將浸提液合并減壓蒸餾濃縮并回收乙醇，得到烏骨藤粗提物浸膏。浸膏加入2L蒸餾水制成混懸液后加入0.5L乙酸乙酯萃取，重復(fù)萃取3次，有機(jī)相減壓濃縮得到烏骨藤提取物A2。實(shí)施例3：取烏骨藤干燥藤莖10kg，粉碎，50％乙醇浸提4次，每次5天，將浸提液合并減壓蒸餾濃縮并回收乙醇，得到烏骨藤粗提物浸膏。浸膏加入2L蒸餾水制成混懸液后加入0.5L乙酸乙酯萃取，重復(fù)萃取3次，有機(jī)相減壓濃縮得到烏骨藤提取物A3。實(shí)施例4：取烏骨藤干燥藤莖10kg，粉碎，75％乙醇浸提4次，每次5天，將浸提液合并減壓蒸餾濃縮并回收乙醇，得到烏骨藤粗提物浸膏。浸膏加入2L蒸餾水制成混懸液后加入0.5L丙酮萃取，重復(fù)萃取3次，有機(jī)相減壓濃縮得到烏骨藤提取物A4。實(shí)施例5：取烏骨藤干燥藤莖10kg，粉碎，75％乙醇浸提4次，每次5天，將浸提液合并減壓蒸餾濃縮并回收乙醇，得到烏骨藤粗提物浸膏。浸膏加入2L蒸餾水制成混懸液后加入0.25L乙酸乙酯和0.25L丙酮的混合溶劑萃取，重復(fù)萃取3次，有機(jī)相減壓濃縮得到烏骨藤提取物A5。實(shí)施例6：取烏骨藤干燥藤莖10kg，粉碎，75％乙醇浸提4次，每次5天，將浸提液合并減壓蒸餾濃縮并回收乙醇，得到烏骨藤提取物A6。試驗(yàn)例1：烏骨藤提取物治療白血病效果初篩為篩選烏骨藤提取物對(duì)人白血病細(xì)胞的抑制作用，分別選擇人早幼粒白血病細(xì)胞株HL-60和人髓性白血病細(xì)胞株K562進(jìn)行試驗(yàn)。一、人早幼粒白血病細(xì)胞株HL-60試驗(yàn)當(dāng)HL-60細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)，分別給予相同體積的實(shí)施例1-6制備的烏骨藤提取物A1-A6，濃度均為10μg/ml，未加烏骨藤提取物組作為空白對(duì)照組，各組孵育24小時(shí)后采用新型四氮唑鹽(MTS)還原法測(cè)定對(duì)烏骨藤提取物對(duì)HL-60細(xì)胞增殖的影響，記錄吸光度(OD)值，并計(jì)算各組烏骨藤提取物對(duì)HL-60細(xì)胞的抑制率。每組烏骨藤提取物均實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取3次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值作為最終抑制率結(jié)果，具體結(jié)果見表1。表1烏骨藤提取物對(duì)HL-60細(xì)胞增殖抑制率實(shí)驗(yàn)組HL-60細(xì)胞增殖抑制率A142.3％A250.7％A345.9％A455.8％A561.2％A621.8％試驗(yàn)結(jié)果顯示，烏骨藤提取物A1-A5對(duì)HL-60細(xì)胞均有顯著的增殖抑制作用，而未采用有機(jī)溶劑萃取的烏骨藤提取物A6對(duì)HL-60細(xì)胞的增殖抑制作用較小，證實(shí)僅采用乙醇提取后的烏骨藤提取物藥理效果較弱。此外，與其他實(shí)驗(yàn)組相比，A2、A4和A5組增殖抑制作用更加明顯，其中尤以A5組最佳，相比其他實(shí)驗(yàn)組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異，說明采用乙酸乙酯和丙酮混合物作為萃取溶劑的方法得到的烏骨藤提取物藥效最好。二、人髓性白血病細(xì)胞株K562試驗(yàn)當(dāng)K562細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)，分別給予相同體積的實(shí)施例1-6制備的烏骨藤提取物A1-A6，濃度均為10μg/ml，未加烏骨藤提取物組作為空白對(duì)照組，各組孵育24小時(shí)后采用新型四氮唑鹽(MTS)還原法測(cè)定對(duì)烏骨藤提取物對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響，記錄吸光度(OD)值，并計(jì)算各組烏骨藤提取物對(duì)K562細(xì)胞的抑制率。每組烏骨藤提取物均實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取3次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值作為最終抑制率結(jié)果，具體結(jié)果見表2。表2烏骨藤提取物對(duì)K562細(xì)胞增殖抑制率實(shí)驗(yàn)組K562細(xì)胞增殖抑制率A138.7％A252.4％A343.6％A449.2％A559.9％A624.7％試驗(yàn)結(jié)果顯示，烏骨藤提取物A1-A5對(duì)K562細(xì)胞均有顯著的增殖抑制作用，而未采用有機(jī)溶劑萃取的烏骨藤提取物A6對(duì)HL-60細(xì)胞的增殖抑制作用較小。此外，與其他實(shí)驗(yàn)組相比，A2和A5組增殖抑制作用更加明顯，其中尤以A5組最佳，相比其他實(shí)驗(yàn)組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異，說明采用乙酸乙酯和丙酮混合物作為萃取溶劑的方法得到的烏骨藤提取物藥效最好。試驗(yàn)例2：烏骨藤提取物與其他藥物聯(lián)用治療白血病效果為驗(yàn)證烏骨藤提取物與其他抗癌藥物對(duì)人白血病細(xì)胞的聯(lián)合抑制作用，分別選擇人早幼粒白血病細(xì)胞株HL-60和人髓性白血病細(xì)胞株K562進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)HL-60和K562細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)，分別給予相同體積的10μg/ml烏骨藤提取物A5、10μg/ml雷公藤甲素、10μg/ml雷公藤乙素、5μg/ml烏骨藤提取物A5+5μg/ml雷公藤甲素、5μg/ml烏骨藤提取物A5+5μg/ml雷公藤乙素，未加藥物組作為空白對(duì)照組，各組孵育24小時(shí)后采用新型四氮唑鹽(MTS)還原法測(cè)定對(duì)烏骨藤提取物對(duì)HL-60和K562細(xì)胞增殖的影響，記錄吸光度(OD)值，并計(jì)算各組烏骨藤提取物對(duì)HL-60和K562細(xì)胞的抑制率。每組烏骨藤提取物均實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取3次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值作為最終抑制率結(jié)果，具體結(jié)果見表3。表3烏骨藤提取物與其他藥物聯(lián)合對(duì)HL-60和K562細(xì)胞的增殖抑制率試驗(yàn)結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)組對(duì)HL-60和K562細(xì)胞均具有明顯的增殖抑制作用。此外，在給藥量相同的前提下，烏骨藤提取物A5與雷公藤甲素、雷公藤乙素聯(lián)合使用對(duì)白血病細(xì)胞的增殖抑制均產(chǎn)生了協(xié)同增效作用，細(xì)胞增殖抑制率均顯著高于單獨(dú)使用相同用量的烏骨藤提取物A5、雷公藤甲素或雷公藤乙素，產(chǎn)生了難以預(yù)料的優(yōu)異增殖抑制效果。試驗(yàn)例3：烏骨藤提取物治療白血病患者臨床試驗(yàn)效果采用本發(fā)明實(shí)施例5制備的烏骨藤提取物對(duì)白血病患者臨床治療效果如下：病歷1：何某某，男，16歲，浙江杭州人。一年前診斷為急性粒細(xì)胞白血病，實(shí)驗(yàn)室檢查：紅細(xì)胞2.91*1012/L，血小板60*109/L，白細(xì)胞92.0*109/L，其中原粒細(xì)胞占43％。骨髓象：有核細(xì)胞顯著增生，原粒加早幼粒細(xì)胞為84％。經(jīng)化療藥物和本發(fā)明藥物聯(lián)合治療，七個(gè)療程后，病情好轉(zhuǎn)，不再出血，體溫正常，食欲增加，臨床檢查無白細(xì)胞浸潤(rùn)表現(xiàn)，復(fù)查血象：紅細(xì)胞4.2*1012/L，血小板210*109/L，白細(xì)胞1.6*109/L，其中原粒1％，早幼粒2％，晚幼粒3％，桿核7％，分葉核30％；骨髓象復(fù)查：有核細(xì)胞顯著增生，原粒加早幼粒5.5％?；颊咦允龇幒鬅o明顯不適。病歷2：段某某，男，44歲，一年前診斷為淋巴細(xì)胞性白血病，實(shí)驗(yàn)室檢查：紅細(xì)胞1.2*1012/L，白細(xì)胞1.08*1010/L，血紅蛋白71g/L，血小板計(jì)數(shù)98*109/L。骨髓象：骨髓有核細(xì)胞增生活躍，粒系以成熟期細(xì)胞為主；紅系中晚幼紅常見；偶見幼稚巨細(xì)胞，血小板少見。經(jīng)化療藥物和本發(fā)明藥物聯(lián)合治療，五個(gè)療程后，病情好轉(zhuǎn)，不再出血，體溫正常，食欲增加，復(fù)查血象：紅細(xì)胞3.2*1012/L，白細(xì)胞3.2*109/L，血紅蛋白115g/L，血小板計(jì)數(shù)110*109/L。骨髓象復(fù)查：骨髓有核細(xì)胞增生活躍，可見粒系各期，以中晚期幼細(xì)胞為主，紅系以中晚期幼紅居多，可見血小板成堆。病歷3：李某某，女，13歲，診斷為急性淋巴細(xì)胞白血病，實(shí)驗(yàn)室檢查：紅細(xì)胞2.8*1012/L，白細(xì)胞2.5*109/L，血紅蛋白70g/L，血小板計(jì)數(shù)67*109/L。骨髓象：增生明顯活躍，淋巴系增生異常，原始及幼稚淋巴細(xì)胞76％，血小板散在可見。確診后經(jīng)化療藥物(VDLDEX)和本發(fā)明藥物聯(lián)合治療，七個(gè)療程后，骨髓象完全緩解。試驗(yàn)結(jié)論：本發(fā)明制備的烏骨藤提取物能對(duì)臨床急性白血病患者的淋巴細(xì)胞、人早幼粒白血病細(xì)胞株HL-60、人髓性白血病細(xì)胞株K562等均起到穩(wěn)定、顯著的抑制增殖，促進(jìn)凋亡等作用；同時(shí)對(duì)正常人淋巴細(xì)胞安全，毒性小，適合作為白血病的治療藥物。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 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