一種羧甲基?β?環(huán)糊精接枝殼聚糖離子交聯(lián)納米粒、制備方法及其應(yīng)用與流程

本發(fā)明屬于一種離子交聯(lián)納米粒、制備方法及其應(yīng)用，特別屬于羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖離子交聯(lián)納米粒、制備方法及其應(yīng)用

背景技術(shù)：

隨著蛋白質(zhì)生物技術(shù)時代的到來，許多治療性蛋白質(zhì)類藥物，如胰島素、生長激素、干擾素等已經(jīng)上市。目前注射蛋白質(zhì)藥物是最常見的給藥途徑，但是注射的不便及易感染的風(fēng)險造成患者的依從性差?？诜徽J(rèn)為是蛋白質(zhì)藥物最方便和舒適的給藥途徑，但是蛋白質(zhì)類藥物易被胃液變性和多種蛋白酶降解，從而無法達(dá)到良好的治療效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的第1個技術(shù)問題是制備一種包載蛋白質(zhì)藥物的納米粒，使包載的蛋白質(zhì)藥物不被胃液所降解，從而達(dá)到良好的治療效果。

本發(fā)明所要解釋的第2個問題是上述納米粒的制備方法。

本發(fā)明所要解決的第3個問題是上述納米粒的應(yīng)用。

本發(fā)明解決第1個技術(shù)問題的技術(shù)方案為：一種羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖離子交聯(lián)納米粒，其結(jié)構(gòu)式如下：

結(jié)構(gòu)式中n＝1200-3200,粒徑分布區(qū)間為100-260nm，平均粒徑為190nm。

所述羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖離子交聯(lián)納米粒的制備方法，包括以下步驟：

a)活化羧甲基-β-環(huán)糊精的羧基：將羧甲基-β-環(huán)糊精溶于去離子水中，再加入N-羥基琥珀酰亞胺和碳二亞胺鹽酸鹽，在室溫、攪拌的條件下反應(yīng)1-2小時，活化其羧基；羧甲基-β-環(huán)糊精的羧基、N-羥基琥珀酰亞胺、碳二亞胺鹽酸鹽的重量比為1：(0.5-1)：(0.9-1.5)；

b)制備羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖：用重量濃度1％的冰乙酸溶解殼聚糖成濃度為1-2％的溶液，再將a步驟制備的活化的羧甲基-β-環(huán)糊精加入到殼聚糖溶液中，在室溫、攪拌條件下，反應(yīng)不小于24小時，將產(chǎn)物透析，離心，于零下70攝氏度冷凍干燥至恒重，獲得的白色絮狀物即為羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖；羧甲基-β-環(huán)糊精與殼聚糖的重量比1：1-1.2；

c)制備羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖離子交聯(lián)納米粒：將b步驟制備的羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖溶于重量濃度為1％的冰乙酸溶液，形成重量濃度為1％的羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖溶液，超聲處理5-10分鐘，用微孔過濾器過濾，得到羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖濾液，在室溫、攪拌速度為180-200轉(zhuǎn)/分鐘的條件下滴加重量濃度為0.1-1％的三聚磷酸鈉溶液，反應(yīng)1-2小時，過濾，濾液于零下70攝氏度冷凍干燥至恒重，得到干燥的羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖離子交聯(lián)納米粒；羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖與三聚磷酸的重量比為0.02-0.2:1。

所述的納米粒子作為口服蛋白質(zhì)載藥物載體的應(yīng)用。

所述的藥物為具有疏水性肽片段的蛋白質(zhì)類藥物。

所述的室溫為20-25攝氏度。

本發(fā)明通過N-羥基琥珀酰亞胺和乙基[3-(二甲氨基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽的催化，使羧甲基-β-環(huán)糊精的羧基與殼聚糖的氨基發(fā)生酰胺化反應(yīng)，成為羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖。羧甲基-β-環(huán)糊精具有一個疏水的空腔，可以與疏水性物質(zhì)形成包合物。同時，殼聚糖在酸性條件下帶有正電荷，能夠與帶負(fù)電荷的三聚磷酸鈉發(fā)生離子交聯(lián)作用，形成納米顆粒。制備的納米顆粒大小在100-260nm之間，顆粒大小均一，表面光滑且分散均勻。羧甲基-β-環(huán)糊精的疏水空腔可以包合蛋白質(zhì)的疏水結(jié)構(gòu)域，從而達(dá)到包載蛋白質(zhì)類藥物的效果。在酸性條件下，羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖納米?？杀Ｗo(hù)蛋白質(zhì)藥物避免酸性胃液的變性作用，而在腸道的生理pH條件下藥物可以逐步釋放出來。由于殼聚糖有腸壁黏膜附著特性，所以羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖能促進(jìn)腸道對蛋白質(zhì)藥物的吸收，而羧甲基-β-環(huán)糊精、殼聚糖和三聚磷酸鈉的簡單物理交聯(lián)，不能使羧甲基-β-環(huán)糊精的羧基與殼聚糖的氨基發(fā)生酰胺化反應(yīng)，從而環(huán)糊精包載的蛋白質(zhì)在納米粒崩解時與殼聚糖發(fā)生分離，蛋白質(zhì)不能有效透過腸壁的黏膜層。

相較于其它劑型，載體羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖納米粒更易于腸道吸收載體所包載的蛋白質(zhì)藥物，提高所包載的蛋白質(zhì)藥物的療效。殼聚糖無毒，生物相容性好，可生物降解及具有腸壁粘附性能，羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖后，分子中的環(huán)糊精包載的蛋白質(zhì)與殼聚糖聯(lián)成一體，由于殼聚糖的腸壁粘附性能，使得包載的蛋白質(zhì)藥物與腸壁充分接觸，蛋白質(zhì)藥物更容易被腸道吸收。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，所制備的羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖離子交聯(lián)納米粒藥物載體，具有形態(tài)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，納米粒粒徑分布區(qū)間為100-260nm，平均粒徑約為190nm，能有效包載疏水性蛋白質(zhì)類藥物，有利于在胃酸等環(huán)境中保護(hù)蛋白質(zhì)類藥物。

附圖說明

圖1羧甲基-β-環(huán)糊精、殼聚糖、羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖的傅里葉紅外光譜圖。

A為羧甲基-β-環(huán)糊精,B為殼聚糖，C為羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖；

圖2為羧甲基-β-環(huán)糊精(A)的¹H-NMR圖譜；

圖3為殼聚糖(B)的¹H-NMR圖譜；

圖4為羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖(C)的¹H-NMR圖譜；

圖5為羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖離子交聯(lián)納米粒電鏡照片。

圖6為羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖離子交聯(lián)納米粒動態(tài)光散射圖。

圖7為不同pH值條件下載藥羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖離子交聯(lián)納米粒的牛血清白蛋白的累積釋放圖。

具體實(shí)施例

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作詳細(xì)的說明。

實(shí)施例1：

羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖離子交聯(lián)納米粒制備

實(shí)驗(yàn)原理如下，

具體制備方法如下：

a)活化羧甲基-β-環(huán)糊精的羧基：將1g羧甲基-β-環(huán)糊精、0.5g乙基[3-(二甲氨基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽和0.9g N-羥基琥珀酰亞胺按溶于20ml去離子水中，室溫攪拌反應(yīng)1小時以活化羧甲基-β-環(huán)糊精的羧基。

b)制備羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖：制備濃度為1％的殼聚糖溶液，將殼聚糖溶液與已活化的羧甲基-β-環(huán)糊精混合，在室溫、攪拌速度為180轉(zhuǎn)/分鐘的條件下，反應(yīng)24小時，將反應(yīng)后的混合物裝入透析袋，置于去離子水中透析，每隔4小時換一次去離子水，連續(xù)透析3天，透析產(chǎn)物離心(4000轉(zhuǎn)/分鐘)，除去底部沉淀物，將上層溶液于零下70攝氏度，真空凍干獲得羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖，羧甲基-β-環(huán)糊精：殼聚糖＝1g:1g；

c)制備羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖離子交聯(lián)納米粒：將b步驟所制備的羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖溶于1％的冰乙酸溶液中，制成重量濃度為1％羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖溶液；用探針型超聲儀在100W功率下超聲處理6分鐘，經(jīng)0.45微米微孔過濾器過濾除去灰塵和不溶性雜質(zhì)，得到羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖濾液；配置0.1％的三聚磷酸鈉溶液，將經(jīng)0.22微米微孔過濾器過濾的三聚磷酸鈉溶液溶液滴加到羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖溶液中，在室溫、攪拌速度為180轉(zhuǎn)/分鐘的條件反應(yīng)1小時，反應(yīng)結(jié)束后的產(chǎn)物經(jīng)過1.0微米的微孔過濾器過濾，得到乳白色溶液即為羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖離子交聯(lián)納米顆粒，濾液于零下70攝氏度冷凍干燥至恒重，得到干燥的羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖離子交聯(lián)納米粒，三聚磷酸鈉：羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖＝0.02g:1g。

實(shí)施例1所制的羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖表征：

在圖1的傅里葉紅外光譜圖中，羧甲基-β-環(huán)糊精的紅外光圖譜(A)在3420cm^-1處的吸收帶由羥基伸縮振動產(chǎn)生；2928cm^-1，1600cm^-1和1420cm^-1的吸收帶分別對應(yīng)于脂肪族CH₂的對稱伸縮振動，羧基C＝O的非對稱和對稱伸縮振動。殼聚糖的紅外圖譜(B)在3360cm^-1處的寬吸收帶由O-H的伸縮振動和伯胺N-H分子間氫鍵的伸縮振動重疊而成。合成的羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖的紅外圖譜(C)在1600cm^-1位置有明顯的酰胺I帶的吸收帶。根據(jù)以上數(shù)據(jù)結(jié)果初步證實(shí)羧甲基-β-環(huán)糊精已接枝到殼聚糖上。

比較圖3、圖4、圖5的¹H-NMR譜圖：羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖的¹H-NMR譜圖(圖5)上5.198ppm處出現(xiàn)了羧甲基-β-環(huán)糊精的¹H-NMR譜圖(圖3)H-1的特征峰，而在化學(xué)位移3.01ppm處出現(xiàn)了殼聚糖的¹H-NMR譜圖(圖4)H-2的特征峰，進(jìn)一步證實(shí)羧甲基-β-環(huán)糊精已接枝到殼聚糖上。

圖5的透射電子顯微鏡照片顯示：羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖離子交聯(lián)納米粒為表面光滑、粒徑均勻的球形結(jié)構(gòu)；

圖6的動態(tài)光散射法測定的實(shí)施例的的納米粒粒徑分布區(qū)間為100-260nm，平均粒徑約為190nm。

實(shí)施例2：

羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖的制備

具體制備方法如下：

a)活化羧甲基-β-環(huán)糊精的羧基：將1g羧甲基-β-環(huán)糊精、0.75g乙基[3-(二甲氨基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽和1.2g N-羥基琥珀酰亞胺按溶于20ml去離子水中，室溫攪拌反應(yīng)1小時以活化羧甲基-β-環(huán)糊精的羧基。

b)制備羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖：制備濃度為1％的殼聚糖溶液，將殼聚糖溶液與已活化的羧甲基-β-環(huán)糊精混合，在室溫、攪拌速度為180轉(zhuǎn)/分鐘的條件下，反應(yīng)36小時，將反應(yīng)后的混合物裝入透析袋，置于去離子水中透析，每隔4小時換一次去離子水，連續(xù)透析3天，透析產(chǎn)物離心(4000轉(zhuǎn)/分鐘)，除去底部沉淀物，將上層溶液于零下70攝氏度，真空凍干獲得羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖，羧甲基-β-環(huán)糊精：殼聚糖＝1g:1.1g；

c)制備羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖離子交聯(lián)納米粒：將b步驟所制備的羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖溶于1％的冰乙酸溶液中，制成重量濃度為1％羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖溶液；用探針型超聲儀在100W功率下超聲處理8分鐘，經(jīng)0.45微米微孔過濾器過濾除去灰塵和不溶性雜質(zhì)，得到羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖濾液；配置0.5％的三聚磷酸鈉溶液，將經(jīng)0.22微米微孔過濾器過濾的三聚磷酸鈉溶液溶液滴加到羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖溶液中，在室溫、攪拌速度為190轉(zhuǎn)/分鐘的條件反應(yīng)1小時，反應(yīng)結(jié)束后的產(chǎn)物經(jīng)過1.0微米的微孔過濾器過濾，得到乳白色溶液即為羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖離子交聯(lián)納米顆粒，濾液于零下70攝氏度冷凍干燥至恒重，得到干燥的羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖離子交聯(lián)納米粒，三聚磷酸鈉：羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖＝0.1g:1g。

實(shí)施例3

羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖離子交聯(lián)納米粒制備

具體制備方法如下：

a)活化羧甲基-β-環(huán)糊精的羧基：將1g羧甲基-β-環(huán)糊精、1g乙基[3-(二甲氨基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽和1.5g N-羥基琥珀酰亞胺按溶于20ml去離子水中，室溫攪拌反應(yīng)2小時以活化羧甲基-β-環(huán)糊精的羧基。

b)制備羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖：制備濃度為2％的殼聚糖溶液，將殼聚糖溶液與已活化的羧甲基-β-環(huán)糊精混合，在室溫、攪拌速度為200轉(zhuǎn)/分鐘的條件下，反應(yīng)48小時，將反應(yīng)后的混合物裝入透析袋，置于去離子水中透析，每隔4小時換一次去離子水，連續(xù)透析3天，透析產(chǎn)物離心(4000轉(zhuǎn)/分鐘)，除去底部沉淀物，將上層溶液于零下70攝氏度，真空凍干獲得羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖，羧甲基-β-環(huán)糊精：殼聚糖＝1g:1.2g；

c)制備羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖離子交聯(lián)納米粒：將b步驟所制備的羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖溶于1％的冰乙酸溶液中，制成重量濃度為1％羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖溶液；用探針型超聲儀在100W功率下超聲處理6分鐘，經(jīng)0.45微米微孔過濾器過濾除去灰塵和不溶性雜質(zhì)，得到羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖濾液；配置1％的三聚磷酸鈉溶液，將經(jīng)0.22微米微孔過濾器過濾的三聚磷酸鈉溶液溶液滴加到羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖溶液中，在室溫、攪拌速度為200轉(zhuǎn)/分鐘的條件反應(yīng)2小時，反應(yīng)結(jié)束后的產(chǎn)物經(jīng)過1.0微米的微孔過濾器過濾，得到乳白色溶液即為羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖離子交聯(lián)納米顆粒，濾液于零下70攝氏度冷凍干燥至恒重，得到干燥的羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖離子交聯(lián)納米粒，三聚磷酸鈉：羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖＝0.2g:1g。

實(shí)施例4：

載藥羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖離子交聯(lián)納米粒制備及牛血清白蛋白釋放

牛血清白蛋白常被用來作為模擬蛋白質(zhì)藥物，以其為例研究羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖離子交聯(lián)納米粒對蛋白質(zhì)藥物的包載與釋放。稱取5mg、10mg、15mg、20mg的牛血清白蛋白，分別加入到10ml 1％的羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖溶液中(實(shí)施例1)，攪拌包合24小時。然后滴加0.4％的三聚磷酸鈉溶液，制備載藥羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖離子交聯(lián)納米粒。然后在轉(zhuǎn)速12000轉(zhuǎn)，4℃條下離心30分鐘。分離上清液和底部沉淀，上清液用于測試包封率和載藥量。底部沉淀即為載藥納米粒。

取上清液，用BCA試劑盒測試未包載的牛血清白蛋白的含量。計(jì)算未包載的藥物含量，然后分別計(jì)算包封率和載藥量：

包封率(％)＝100％(W₀-W_r)/W₀

載藥量(％)＝100％(W₀-W_r)/W_n

公式中的W_n,W₀和W_r分別為空白納米載體質(zhì)量，牛血清白蛋白總用量，未包載的牛血清白蛋白質(zhì)量。

實(shí)驗(yàn)測得隨著增加牛血清白蛋白對納米載體的比值，牛血清白蛋白的載藥量增加，但包封率下降。羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖離子交聯(lián)納米粒對牛血清白蛋白的載藥率為4.28-8.75％，藥物包封率為13.08-76.70％(表1)。

表1羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖離子交聯(lián)納米粒的藥物包封率和載藥量

實(shí)施例5：

稱取載藥納米粒0.2mg置于錐形瓶中，分別加入10ml不同pH的緩沖溶液(pH 1.2；6.8；7.4)，在37℃，50轉(zhuǎn)/分鐘的恒溫?fù)u床里溫育。在預(yù)定的時間間隔取1ml樣品并離心，取離心后的上清液0.1ml通過BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)含量，從而計(jì)算出釋放出的牛血清白蛋白的量。將取出的樣品放回錐形瓶中，并用新鮮的相應(yīng)緩沖溶液補(bǔ)充其體積至10ml，連續(xù)測定72小時。

其結(jié)果如圖7所示：在腸道的生理環(huán)境下(pH 7.4)牛血清白蛋白72小時內(nèi)的累積釋放量達(dá)到71.6％，而在胃的酸性環(huán)境下(pH 1.2)牛血清白蛋白累積釋放量只有18％。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明制備的羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖離子交聯(lián)納米粒形態(tài)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，具有優(yōu)異的pH敏感的藥物釋放機(jī)制，制備過程簡單；制備的羧甲基-β-環(huán)糊精接枝殼聚糖離子交聯(lián)納米粒子可以作為蛋白類藥物口服給藥載體來提高藥物的生物利用度。