本發(fā)明涉及藥物研發(fā)領域，具體公開了化合物HUBIN-1在制備肝臟炎癥性疾病預防和/或治療藥物中的用途。
背景技術：
：肝臟炎癥性疾病是目前臨床上的一種常見疾病，從病因學角度來分類，可分為病毒性肝炎、藥物性肝炎、脂肪性肝炎、酒精性肝炎和自身免疫性肝炎等。我國屬乙型肝炎病毒(HBV)感染高流行國家，全國現(xiàn)有乙型肝炎患者約3000萬人。根據(jù)起病緩急和病程長短，可分為急性肝炎、慢性肝炎、重型肝炎(肝衰竭)等。由于缺乏恰當和有效的干預和治療措施，部分急性肝炎患者和慢性肝炎患者病情可迅速發(fā)展成為重型肝炎。臨床報道顯示重型肝炎的病死率非常高，病死率高達50％～70％。肝炎病毒(在我國主要是乙型肝炎病毒)感染，化學性毒物或藥物，缺血、酒精、放射性刺激，遺傳性代謝障礙及自身免疫病等多種因素均可引起慢或急性肝炎，甚至導致重型肝炎(肝衰竭)。重型肝炎(肝衰竭)病情發(fā)展迅速、兇險，伴有肝細胞廣泛壞死，導致肝臟合成、解毒、排泄和生物轉化等功能發(fā)生嚴重障礙或失代償，表現(xiàn)為以凝血機制障礙和黃疸、肝性腦病、腹水等的一組臨床癥候群。目前，對于重型肝炎(肝衰竭)尚缺乏有效的治療手段及藥物，導致其病死率一直居高不下。臨床上通常只能采取相應的代謝和營養(yǎng)支持等綜合療法。盡管肝移植可用于一些具體原因所致的急性肝功能衰竭患者，但因為臟器來源和治療費用的問題，不能在臨床上大規(guī)模使用。而生物人工肝支持系統(tǒng)和肝、干細胞移植在治療急性重型肝炎(肝衰竭)中的作用尚處在臨床研究早期階段。因此亟待研發(fā)新的治療藥物，開拓新的治療手段和方法，以提升重型肝炎(肝衰竭)的救治存活率，且能改善各種急性和慢性肝炎患者的炎癥程度。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的缺陷，提供化合物HUBIN-1在制備肝臟炎癥性疾病預防和/或治療藥物中的用途。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的及相關目的，本發(fā)明采用如下技術方案：本發(fā)明的第一方面，提供了化合物HUBIN-1在制備肝臟炎癥性疾病預防和/或治療藥物中的用途，所述化合物HUBIN-1的結構式如式Ⅰ所示：所述化合物HUBIN-1的分子式為C13H11CIFN3O2。所述化合物HUBIN-1的分子量為295.0524。所述化合物HUBIN-1為現(xiàn)有技術，可通過現(xiàn)有方法制備獲得，這些均在本領域技術人員所能夠知曉的知識范疇內。優(yōu)選地，所述藥物具備以下作用中的任一項或多項：(1)能夠降低ALT水平；(2)能夠降低AST水平；(3)能夠減輕肝細胞變性和壞死程度；(4)抑制肝細胞凋亡；(5)減少炎癥細胞浸潤；(6)抑制肝臟巨噬細胞(枯否細胞)活化和炎癥因子分泌；(7)抑制肝細胞脂化和細胞脂質毒性；(8)促進肝星狀細胞的凋亡。優(yōu)選地，所述藥物具備以下作用中的任一項或多項：(1)抗肝損傷；(2)抗炎癥細胞浸潤；(3)抗肝細胞脂化；(4)抗肝纖維化。優(yōu)選地，所述肝臟炎癥性疾病包括但不限于急性肝炎、慢性肝炎、重型肝炎、脂肪肝、肝纖維化和肝硬化。優(yōu)選地，所述肝臟炎癥性疾病包括但不限于病毒性肝炎、藥物性肝炎、脂肪性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎等多種肝臟炎癥性疾病，包括急性肝炎、慢性肝炎和急性重型肝炎、亞急性重型肝炎、慢加急性重型肝炎。優(yōu)選地，所述化合物HUBIN-1作為有效成分之一或唯一有效成分。本發(fā)明第二方面公開了一種肝臟炎癥性疾病預防和/或治療藥物，含有安全有效量的化合物HUBIN-1，以及藥學上可接受的載體。優(yōu)選地，所述化合物HUBIN-1作為有效成分之一或唯一有效成分。藥學上可接受的載體為各種藥學上常用的輔料和/或賦形劑，包括(但不限于)糖類(如乳糖、葡萄糖和蔗糖)，淀粉(如玉米淀粉和土豆淀粉)，纖維素及其衍生物(如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素)，黃蓍膠粉末，麥芽，明膠，滑石，固體潤滑劑(如硬脂酸和硬脂酸鎂)，硫酸鈣，植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油，多元醇(如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇)，海藻酸，乳化劑(如Tween、聚氧乙烯蓖麻油)，潤濕劑(如月桂基硫酸鈉)，著色劑，調味劑，壓片劑、穩(wěn)定劑，抗氧化劑，防腐劑，無熱原水，等滲鹽溶液和磷酸鹽緩沖液等；該載體可根據(jù)需要提高配方的穩(wěn)定性、活性及生物有效性等。本發(fā)明藥物使用時，所述化合物HUBIN-1作為唯一有效成分，或者所述化合物HUBIN-1作為有效成分之一，可與一種或多種藥學上可接受的載體或賦形劑混合制成不同給藥途徑的藥物劑型。本發(fā)明的藥物可以按照藥劑學上的通用方法制成任何常規(guī)的制劑形式。所述藥物的制劑形式可以為片劑、膠囊、散劑、顆粒劑、糖漿劑、溶液劑、口服液、醑劑、酊劑、氣霧劑、粉霧劑、注射劑、注射用無菌粉末，或者栓劑。上述制劑類型可以按照藥劑學(第六版，人民衛(wèi)生出版社，崔福德)中的相關定義理解，上述制劑的制備可以按照藥劑學(第六版，人民衛(wèi)生出版社，崔福德)中的相關制劑的方法配制。本發(fā)明的第三方面，提供了一種預防和/或治療肝臟炎癥性疾病的方法，包括步驟：將含有安全有效量的化合物HUBIN-1的藥物施用于作用對象。優(yōu)選地，所述肝臟炎癥性疾病為急性肝炎、慢性肝炎和重型肝炎(肝衰竭)，包括病毒性肝炎、藥物性肝炎、脂肪性肝炎、酒精性肝炎和自身免疫性肝炎等多種肝臟炎癥性疾病。使用劑量可以是1.25～10mg/kg，可根據(jù)使用對象的具體情況選擇。這些均在醫(yī)師所知曉和掌握的知識范圍內。所述方法可以是體內的。也可以體外的，例如僅用于科學研究。本發(fā)明的第四方面，提供了化合物HUBIN-1的新用途，所述化合物HUBIN-1的結構式如式Ⅰ所示：式Ⅰ，包括以下用途中的任一項或多項：(1)能夠降低ALT水平；(2)能夠降低AST水平；(3)能夠減輕肝細胞變性和壞死程度；(4)抑制肝細胞凋亡；(5)減少炎癥細胞浸潤；(6)抑制肝臟巨噬細胞(枯否細胞)活化和炎癥因子分泌；(7)抑制肝細胞脂化和細胞脂質毒性；(8)促進肝星狀細胞的凋亡。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明經過廣泛而深入的研究，首次發(fā)現(xiàn)了化合物HUBIN-1的肝細胞保護作用和抗炎治療作用，且適用于多種類型的肝臟炎癥，開拓了化合物HUBIN-1的應用領域。本發(fā)明為急性肝炎、慢性肝炎和重型肝炎(肝衰竭)，包括病毒性肝炎、藥物性肝炎、脂肪性肝炎、酒精性肝炎和自身免疫性肝炎等多種肝臟炎癥性疾病提供了新的預防和/或治療藥物，具有明顯的社會效益。附圖說明圖1：化合物HUBIN-1不同給藥劑量對小鼠肝炎模型的保護作用；其中，HUBIN-1-0.625組、1.25組、2.5組、5組、10組，分別表示LPS/D-GalN造模前30分鐘進行0.625mg/kg、1.25mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg以及10mg/kg劑量的化合物HUBIN-1腹腔給藥的治療組；化合物HUBIN-1治療組肝臟病理明顯改善，2.5mg/kg、5mg/kg和10mg/kg治療組效果最佳，肝組織幾無肝細胞壞死和炎細胞浸潤。圖2：化合物HUBIN-1不同給藥時間對小鼠肝炎模型的治療作用；化合物HUBIN-1于LPS/D-GalN造模前30分鐘、造模后30分鐘及1小時給藥均能顯著緩解肝細胞壞死和炎細胞浸潤，改善肝臟病理。圖3：化合物HUBIN-1與Nec-1對小鼠肝炎的療效比較；于LPS/D-GalN造模前30分鐘進行同等劑量(5mg/kg)的化合物HUBIN-1或Nec-1(Nec-1①、②、③分別購自Sigma-Aldrich、MerckMillipore、BioVision)的腹腔給藥，化合物HUBIN-1較之Nec-1更能顯著改善肝臟病理。圖4：化合物HUBIN-1對TNF-α/ActD誘導的肝細胞凋亡和壞死的影響；模型組表示以TNF-α/ActD誘導的肝細胞凋亡/壞死模型，HUBIN-1-25μM、-50μM、-100μM分別表示以25μM、50μM、100μM的化合物HUBIN-1預處理1小時，再加TNF-α/ActD刺激；TNF-α/ActD刺激6小時后分析細胞早期凋亡比例，化合物HUBIN-1預處理能顯著下調L02細胞的早期凋亡比例(4A)；TNF-α/ActD刺激24小時后分析壞死比例，化合物HUBIN-1預處理能顯著下調L02細胞的壞死比例。圖5：LPS/D-GalN模型小鼠肝組織Caspase-3剪切體和RIP1蛋白的WesternBlot分析；1為正常對照組，2-4為LPS/D-GalN模型組，5-7為2.5mg/kg劑量HUBIN-1治療組，8-10為5mg/kg劑量HUBIN-1治療組，11為單純化合物HUBIN-1注射組；2.5mg/kg和5mg/kg劑量的HUBIN-1治療組中Caspase-3剪切體和RIP1蛋白表達水平均顯著低于模型組，提示化合物HUBIN-1對LPS/D-GalN誘導的小鼠肝炎的保護作用是通過抑制肝細胞的凋亡和壞死。圖6：化合物HUBIN-1對棕櫚酸誘導的肝細胞脂質毒性的影響；模型組表示以高濃度棕櫚酸(PA)誘導肝細胞脂質毒性模型，HUBIN-1-25μM、-50μM、-100μM分別表示以25μM、50μM、100μM的化合物HUBIN-1預處理1小時，再加PA刺激；化合物HUBIN-1預處理能顯著降低PA導致的細胞毒性，并呈劑量依賴性。圖7：化合物HUBIN-1對STS誘導的肝星狀細胞系LX2凋亡的影響；模型組表示以STS誘導的LX2細胞凋亡模型，HUBIN-1-25μM、-50μM、-100μM分別表示以25μM、50μM、100μM的化合物HUBIN-1預處理1小時，再加STS誘導。化合物HUBIN-1預處理能促進STS誘導的HSC凋亡，并呈劑量依賴性。具體實施方式在進一步描述本發(fā)明具體實施方式之前，應理解，本發(fā)明的保護范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應當理解，本發(fā)明實施例中使用的術語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍。當實施例給出數(shù)值范圍時，應理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術和科學術語與本
技術領域：
技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、材料外，根據(jù)本
技術領域：
的技術人員對現(xiàn)有技術的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術的任何方法、設備和材料來實現(xiàn)本發(fā)明。除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本
技術領域：
常規(guī)的分子生物學、生物化學、染色質結構和分析、分析化學、細胞培養(yǎng)、重組DNA技術及相關領域的常規(guī)技術。這些技術在現(xiàn)有文獻中已有完善說明，具體可參見Sambrook等MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。實施例1化合物HUBIN-1溶液的配制化合物HUBIN-1，采用DMSO助溶后配制成的化合物HUBIN-1的儲存液，于注射前以PBS稀釋配成化合物HUBIN-1的溶劑。實施例2化合物HUBIN-1對LPS/D-GalN誘導的小鼠肝炎的保護作用-量效關系研究動物模型是驗證新的治療藥物、新的治療手段是否有效的研究工具，目前國際上采用的模擬重型肝炎的動物模型有藥物性重型肝炎模型(對-乙酰氨基酚模型、LPS/D-GalN模型、硫代乙酰胺模型、四氯化碳模型等)、急性肝缺血模型、部分肝切除模型等。其中LPS/D-GalN模型，因其可重復性好，肝外毒性不明顯，肝損傷表現(xiàn)接近臨床等優(yōu)勢，是一種較為理想的重型肝炎動物模型。六周齡雄性C57BL/6小鼠(購于南京生物醫(yī)藥研究院)隨機分為正常對照組、化合物HUBIN-1組、模型組(LPS/D-GalN組)、治療組(0.625mg/kgHUBIN-1+LPS/D-GalN組、1.25mg/kgHUBIN-1+LPS/D-GalN組、2.5mg/kgHUBIN-1+LPS/D-GalN組、5mg/kgHUBIN-1+LPS/D-GalN組、10mg/kgHUBIN-1+LPS/D-GalN組)。治療組分別按0.625mg/kg、1.25mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg以及10mg/kg的劑量進行化合物HUBIN-1的溶劑的腹腔注射，30分鐘后LPS/D-GalN(10μg/kgLPS+400mg/kgD-GalN)腹腔注射造模；模型組以等體積的溶劑代替化合物HUBIN-1的溶劑；化合物HUBIN-1組以等體積的PBS代替LPS/D-GalN；正常對照組不做處理。LPS/D-GalN造模6小時摘眼球法取血，并取肝臟組織固定和凍存，生化及病理學檢查評估各組小鼠肝損傷程度。實驗結果：LPS/D-GalN模型組ALT、AST水平均較正常對照組顯著升高(表1)，肝組織病理切片亦顯示肝細胞壞死及炎細胞浸潤明顯；各個劑量的治療組較模型組，其ALT、AST水平均顯著降低，尤以2.5mg/kg、5mg/kg和10mg/kg組降低更為明顯(這3個劑量間無統(tǒng)計學差異)，這三組小鼠肝組織病理切片亦顯示肝細胞幾無壞死，炎細胞浸潤也減少(圖1)；單純化合物HUBIN-1注射組(10mg/kg劑量)的肝功能及病理與正常對照組類似。以上結果表明，化合物HUBIN-1以2.5mg/kg、5mg/kg和10mg/kg劑量給藥對LPS/D-GalN誘導的小鼠肝炎均具有保護作用。優(yōu)選劑量為2.5mg/kg，5mg/kg。表1ALT(U/L)AST(U/L)統(tǒng)計分析正常對照26.3±1.486±1.4a,c單獨化合物HUBIN-125.3±0.787.1±3.9a,cLPS/GalN模型組1631.3±258.4932.5±88.9b,c化合物HUBIN-1-0.625治療組639.5±114.7522.4±61.8a,b,c化合物HUBIN-1-1.25治療組228.7±45.2225.3±40.1a,b,c化合物HUBIN-1-2.5治療組79.4±3.9134.4±5.7a,b化合物HUBIN-1-5治療組93.6±7.1151.8±8.5a,b化合物HUBIN-1-10治療組111.3±12.3161.6±13.2a,b注：數(shù)值為MEAN±SE；a—與模型組相比有統(tǒng)計學差異；b—與正常對照比有統(tǒng)計學差異；c—與化合物-2.5劑量治療組相比有統(tǒng)計學差異。實施例3化合物HUBIN-1對LPS/D-GalN誘導的小鼠肝炎的治療作用-時效關系研究六周齡雄性C57BL/6小鼠(購于南京生物醫(yī)藥研究院)隨機分為正常對照組、模型組(LPS/D-GalN組)、治療組(2.5mg/kgHUBIN-1+LPS/D-GalN組)。治療組腹腔注射LPS/D-GalN造模(10μg/kgLPS+400mg/kgD-GalN)，分別于LPS/D-GalN造模前30分鐘以及造模后30分鐘、1小時、2小時給予化合物HUBIN-12.5mg/kg劑量腹腔注射；模型組以等體積的溶劑代替化合物HUBIN-1；正常對照組不做處理。LPS/D-GalN造模6小時摘眼球法取血，并取肝臟組織固定和凍存，生化及病理學檢查評估各組小鼠肝組織損傷程度。實驗結果：LPS/D-GalN模型組ALT、AST水平均較正常對照組顯著升高，肝組織病理切片亦顯示肝細胞壞死及炎細胞浸潤明顯；LPS/D-GalN造模前30分鐘給予化合物HUBIN-1(2.5mg/kg)腹腔注射，可減輕LPS/D-GalN誘導的肝損傷程度。與模型組相比，化合物HUBIN-1干預組小鼠血清ALT及AST水平顯著下降(表2)。病理切片亦顯示肝細胞幾無壞死，炎細胞浸潤也減少(圖2)；LPS/D-GalN造模后30分鐘及1小時給藥亦能緩解肝臟炎癥，降低血清ALT、AST水平，但其治療效果不及造模前給藥；而造模后2小時再給藥，治療組的肝組織病理與生化指標與模型組相比無顯著差異。以上結果表明，化合物HUBIN-1對LPS/D-GalN誘導的小鼠肝炎不僅具有預防保護作用，早期給藥還具有治療作用。表2ALT(U/L)AST(U/L)統(tǒng)計分析正常對照26.3±1.486±1.4a,cLPS/GalN模型組1631.3±258.4932.5±88.9b,c造模前30分鐘給藥組79.4±3.9134.4±5.7a,b造模后30分鐘給藥組448.3±48.8416.7±34.3a,b,c造模后1小時給藥組718.3±121.9528.3±72.3a,b,c造模后2小時給藥組1461.3±212.7819.4±130.2b,c注：數(shù)值為MEAN±SE；a—與模型組相比有統(tǒng)計學差異；b—與正常對照比有統(tǒng)計學差異；c—與造模前30分鐘給藥組相比有統(tǒng)計學差異。實施例4化合物HUBIN-1與Nec-1在LPS/D-GalN誘導的小鼠肝炎的療效比較Nec-1分別購買自如下公司：表3六周齡雄性C57BL/6小鼠(購于南京生物醫(yī)藥研究院)隨機分為正常對照組、模型組(LPS/D-GalN組)、化合物HUBIN-1治療組(5mg/kg+LPS/D-GalN組)、Nec-1治療組(Nec-1①、②、③均采用5mg/kg劑量)。治療組分別按5mg/kg劑量腹腔注射化合物HUBIN-1或Nec-1①、②、③，30分鐘后LPS/D-GalN(10μg/kgLPS+400mg/kgD-GalN)腹腔注射造模；模型組以等體積的溶劑代替化合物HUBIN-1；正常對照組不做處理。LPS/D-GalN造模6小時摘眼球法取血，并取肝臟組織固定和凍存，生化及病理學檢查評估各組小鼠肝損傷程度。實驗結果：LPS/D-GalN模型組ALT、AST水平均較正常對照組顯著升高，肝組織病理切片亦顯示肝細胞壞死及炎細胞浸潤明顯；化合物HUBIN-1治療組和Nec-1治療組較模型組，其ALT、AST水平，以及肝細胞壞死程度和炎細胞浸潤均顯著降低；尤以化合物HUBIN-1的療效最佳，其較Nec-1①、②、③治療組，血清ALT、AST水平降低更為明顯(而Nec-1①、②、③這三組間無統(tǒng)計學差異)，小鼠肝組織病理切片亦顯示肝細胞幾無壞死，炎細胞浸潤也更少(圖3)。以上結果表明，同等劑量條件下化合物HUBIN-1對LPS/D-GalN誘導的小鼠肝炎的保護作用優(yōu)于商品化Nec-1。表4ALT(U/L)AST(U/L)統(tǒng)計分析正常對照26.3±1.486±1.4a,cLPS/GalN模型組1631.3±258.4932.5±88.9b,c化合物HUBIN-1治療組93.6±7.1151.8±8.5a,bNec-1①治療組765.3±134.4585.7±69.8a,b,cNec-1②治療組692.3±111.3515.3±72.8a,b,cNec-1③治療組559.5±104.7492.4±61.8a,b,c注：數(shù)值為MEAN±SE；a—與模型組相比有統(tǒng)計學差異；b—與正常對照比有統(tǒng)計學差異；c—與化合物HUBIN-1治療組相比有統(tǒng)計學差異。實施例5化合物HUBIN-1抑制LPS誘導的巨噬細胞炎癥因子分泌枯否細胞(肝臟巨噬細胞)在各類肝臟炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，臨床和基礎研究中均發(fā)現(xiàn)肝炎過程中存在枯否細胞活化和炎癥因子分泌異常的現(xiàn)象。體外常采用LPS刺激，誘導巨噬細胞活化及炎癥因子分泌來建模，該細胞模型可用于抗肝炎藥物的體外篩選和療效評估。我們采用小鼠原代肝臟巨噬細胞(枯否細胞)建立巨噬細胞活化模型，LPS購自Sigma公司。分離小鼠原代枯否細胞，分為對照組，LPS模型組(500ng/ml)，化合物HUBIN-1干預組(分別以25μM、50μM、100μM的化合物HUBIN-1預處理1小時，再加LPS刺激)。LPS刺激24小時后，收集細胞培養(yǎng)上清，ELISA檢測炎癥因子TNF-α、HMGB1的水平。實驗結果：LPS刺激會促進枯否細胞分泌TNF-α、HMGB1，而化合物HUBIN-1預處理枯否細胞能顯著降低這些炎癥因子的分泌水平，并呈劑量依賴性(表5)。以上結果表明，化合物HUBIN-1可抑制LPS誘導的巨噬細胞活化和炎癥因子分泌，具有抗炎功效。表5注：數(shù)值為MEAN±SD；a—與模型組相比有統(tǒng)計學差異；b—與對照比有統(tǒng)計學差異；c—與化合物HUBIN-1-25μM組相比有統(tǒng)計學差異；d—與化合物HUBIN-1-100μM組相比有統(tǒng)計學差異。實施例6化合物HUBIN-1抑制TNF-α/ActD誘導的肝細胞凋亡和壞死病毒感染、酒精、高脂及藥物刺激等因素所致的肝炎都存在肝細胞的凋亡和壞死現(xiàn)象。體外常采用TNF-α/ActD刺激來誘導肝細胞凋亡、壞死，建立肝細胞損傷的細胞模型，該細胞模型可用于肝病治療藥物的體外篩選和療效評估。我們采用人肝上皮細胞系L02細胞(購自ATCC)建立肝細胞損傷模型，TNF-α和ActD分別購自PeproTech和MCE公司。L02細胞貼壁過夜后，分為對照組，TNF-α/ActD模型組(10ng/mlTNF-α+0.2μMActD)，化合物HUBIN-1干預組(分別以25、50、100μM的化合物HUBIN-1預處理1小時，再加TNF-α/ActD刺激)。TNF-α/ActD刺激6小時和24小時后收集細胞，采用BD的凋亡/壞死檢測試劑盒進行肝細胞凋亡和壞死的檢測。實驗結果：TNF-α/ActD刺激6小時能誘導L02細胞的早期凋亡，化合物HUBIN-1預處理能顯著下調L02細胞的早期凋亡比例，并呈劑量依賴性(圖4A)；TNF-α/ActD刺激24小時后能明顯誘導L02細胞的壞死，化合物HUBIN-1預處理能顯著下調L02細胞的壞死比例，并呈劑量依賴性(圖4B)。以上結果表明，化合物HUBIN-1對TNF-α/ActD誘導的肝細胞凋亡和壞死具有明顯的緩解作用，有肝細胞保護作用。實施例7化合物HUBIN-1抑制LPS/D-GalN模型小鼠肝組織的凋亡和壞死六周齡雄性C57BL/6小鼠(購于南京生物醫(yī)藥研究院)隨機分為正常對照組、化合物HUBIN-1組、模型組(LPS/D-GalN組)、治療組(2.5mg/kgHUBIN-1+LPS/D-GalN組、5mg/kgHUBIN-1+LPS/D-GalN組)。治療組分別按2.5mg/kg或5mg/kg劑量進行化合物HUBIN-1的溶劑的腹腔注射，30分鐘后LPS/D-GalN(10μg/kgLPS+400mg/kgD-GalN)腹腔注射造模；模型組以等體積的溶劑代替化合物HUBIN-1的溶劑；化合物HUBIN-1組以等體積的PBS代替LPS/D-GalN；正常對照組不做處理。LPS/D-GalN造模6小時后，處死小鼠取其肝臟組織進行Caspase-3(其剪切體提示凋亡)和RIP1(提示壞死)分子的WesternBlot檢測(抗體均購自CST公司)。實驗結果：LPS/D-GalN模型組中Caspase-3剪切體和RIP1蛋白的表達水平顯著增加(圖5)；2.5mg/kg和5mg/kg劑量的HUBIN-1治療組中上述分子的表達水平均顯著下調；單純化合物HUBIN-1注射組上述分子的表達水平亦顯著低于模型組。結合實施例2，該實施例結果表明，優(yōu)選劑量的化合物HUBIN-1對LPS/D-GalN誘導的小鼠肝炎的保護作用是通過抑制肝細胞的凋亡和壞死。實施例8化合物HUBIN-1抑制脂肪酸誘導的肝細胞脂化和細胞脂質毒性脂肪肝是指由于各種原因引起的肝細胞內脂肪堆積過多的病變。脂肪性肝病嚴重威脅國人健康，已被公認為隱蔽性肝硬化的常見原因。體外常采用脂肪酸(如，油酸(OA)和棕櫚酸(PA))誘導法建立肝細胞脂化模型，該細胞模型可用于脂肪肝治療藥物的體外篩選和療效評估。我們采用人肝上皮細胞系L02細胞(購自ATCC)建立肝細胞脂化模型，油酸和棕櫚酸均購自Sigma公司。L02細胞貼壁過夜后，分為對照組，OA/PA模型組(OA:PA按2:1混合配制成終濃度0.5mM的脂肪酸誘導培養(yǎng)基)，化合物HUBIN-1干預組(分別以50μM、100μM的化合物HUBIN-1預處理1小時，再進行OA/PA誘導培養(yǎng))。OA/PA誘導48小時后進行肝細胞脂化檢測。或采用1mM棕櫚酸刺激L02細胞建立肝細胞脂質毒性模型，分析化合物HUBIN-1(分別以25μM、50μM、100μM的化合物HUBIN-1預處理1小時，再進行PA刺激)對PA導致的細胞脂質毒性的干預效果，PA刺激24小時后采用MTS法分析細胞毒性。實驗結果：OA/PA處理48小時后可誘導L02細胞出現(xiàn)明顯的脂肪變性，化合物HUBIN-1預處理能顯著減少L02細胞的脂肪變性程度；高濃度PA會導致明顯的細胞脂質毒性，化合物HUBIN-1預處理能顯著降低PA導致的細胞毒性，并呈劑量依賴性(圖6)。以上結果表明，化合物HUBIN-1能抑制脂肪酸誘導的肝細胞脂化和細胞脂質毒性，有潛在的脂肪肝療效。實施例9化合物HUBIN-1促進肝星狀細胞的凋亡肝星狀細胞(HSC)是肝纖維化/肝硬化過程中的主要效應細胞，當肝臟受到炎癥等損傷時，HSC被激活，激活的HSC一方面通過增生和分泌細胞外基質參與肝纖維化的形成和肝內結構的重建，另一方面通過細胞收縮使肝竇內壓升高。各種致纖維化因素均把HSC作為最終靶細胞。人肝星狀細胞系LX2經誘導活化后可用于抗纖維化藥物的體外篩選和療效評估。星孢菌素(STS)可用于HSC的誘導活化，而高劑量STS可誘導HSC的過度活化進而發(fā)生細胞凋亡。我們采用STS(購自MCE)誘導LX2細胞(購自ATCC)活化建立HSC活化—凋亡細胞模型。分為對照組，STS模型組(50nM)，化合物HUBIN-1干預組(分別以25μM、50μM、100μM的化合物HUBIN-1預處理1小時，再加STS刺激)。STS刺激24小時后收集細胞，采用BD的凋亡檢測試劑盒進行流式細胞凋亡檢測。實驗結果：STS刺激24小時能誘導LX2細胞的晚期凋亡，化合物HUBIN-1預處理能進一步提高LX2細胞的晚期凋亡比例，并呈劑量依賴性(圖7)。以上結果表明，化合物HUBIN-1能促進STS誘導的HSC凋亡，具有潛在的抗纖維化療效。以上的實施例是為了說明本發(fā)明公開的實施方案，并不能理解為對本發(fā)明的限制。此外，本文所列出的各種修改以及發(fā)明中方法、組合物的變化，在不脫離本發(fā)明的范圍和精神的前提下對本領域內的技術人員來說是顯而易見的。雖然已結合本發(fā)明的多種具體優(yōu)選實施例對本發(fā)明進行了具體的描述，但應當理解，本發(fā)明不應僅限于這些具體實施例。事實上，各種如上所述的對本領域內的技術人員來說顯而易見的修改來獲取發(fā)明都應包括在本發(fā)明的范圍內。當前第1頁1 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