具有改善的儲(chǔ)存穩(wěn)定性的藥物組合物及其制備方法與流程

本發(fā)明涉及具有改善的儲(chǔ)存穩(wěn)定性的藥物組合物及其制備方法，更具體地涉及包含兩親性嵌段共聚物的水溶性差的藥物的藥物組合物，其中特定相關(guān)化合物的含量保持在規(guī)定限量以內(nèi)；并且涉及其制備方法。
背景技術(shù)：
：水溶性差的藥物的溶解是經(jīng)由口服或腸胃外給藥將藥物遞送到體內(nèi)的關(guān)鍵技術(shù)。這種溶解方法包括在水溶液中添加表面活性劑以形成膠束，然后在其中包埋(entrapping)水溶性差的藥物的方法。用作表面活性劑的兩親性嵌段共聚物包含親水性聚合物嵌段和疏水性聚合物嵌段。由于親水性聚合物嵌段在體內(nèi)直接接觸血液蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜，因此已使用具有生物相容性的聚乙二醇或單甲氧基聚乙二醇等。疏水性聚合物嵌段改善與疏水性藥物的親和性，因此已使用具有可生物降解的聚丙交酯、聚乙交酯、聚(乳酸-乙交酯)(poly(lactic-glycolide))、聚己內(nèi)酯、聚氨基酸或聚原酸酯等。特別地，因?yàn)榫郾货パ苌锞哂袃?yōu)異的生物相容性并且在體內(nèi)水解為無(wú)害的乳酸，因此它們已經(jīng)以各種形式應(yīng)用于藥物載體。聚丙交酯衍生物隨其分子量變化具有不同的物理性質(zhì)，并且已經(jīng)開發(fā)出各種形式，例如微球、納米顆粒、聚合物凝膠和植入劑。第6,322,805號(hào)美國(guó)專利公開了用于遞送水溶性差的藥物的組合物，其由聚合物膠束型藥物載體和水溶性差的藥物組成，其中所述聚合物膠束型藥物載體由二嵌段共聚物或三嵌段共聚物形成，所述二嵌段共聚物或三嵌段共聚物不由交聯(lián)劑交聯(lián)，其由選自聚丙交酯、聚乙交酯、聚(丙交酯-乙交酯)、聚己內(nèi)酯及其衍生物的至少一種可生物降解的疏水性聚合物和聚(環(huán)氧烷)作為親水性聚合物組成，其中將水溶性差的藥物物理地包埋在藥物載體中并溶解，并且其中所述聚合物膠束型藥物載體在水中形成透明水溶液并將水溶性差的藥物有效地遞送到體內(nèi)。根據(jù)上述美國(guó)專利，聚乙二醇-聚丙交酯二嵌段共聚物是通過(guò)以下步驟合成的：從單甲氧基聚乙二醇中除去水分，向其中加入溶解在甲苯中的辛酸亞錫并減壓除去甲苯，向所得混合物中加入D,L-丙交酯并進(jìn)行聚合反應(yīng)，加入氯仿以溶解所產(chǎn)生的嵌段共聚物，在攪拌下小份地滴加過(guò)量的乙醚以形成沉淀，過(guò)濾形成的沉淀，并用乙醚洗滌數(shù)次。然而，該方法難以在大規(guī)模生產(chǎn)中使用，因此不可商用。此外，用于純化的醚可能殘留在最終的聚合物膠束組合物中。第8,853,351號(hào)美國(guó)專利公開了一種制備兩親性嵌段共聚物的方法，其包括(a)將兩親性嵌段共聚物溶解在水混溶性有機(jī)溶劑中；(b)向步驟(a)中獲得的聚合物溶液中加入并混合堿金屬鹽(碳酸氫鈉、碳酸鈉、碳酸氫鉀、碳酸鉀或碳酸鋰)的水溶液；(c)通過(guò)鹽析對(duì)步驟(b)中獲得的溶液進(jìn)行有機(jī)相和水相分離；和(d)分離步驟(c)中獲得的有機(jī)相并除去其中的有機(jī)溶劑以回收聚合物。然而，該方法涉及復(fù)雜的步驟，需要額外的步驟以除去堿金屬鹽和用于鹽析的鹽(氯化鈉或氯化鉀)，并且即使在將其除去后也可能具有殘留的金屬鹽。必須在各個(gè)方面嚴(yán)格控制藥物的雜質(zhì)。特別地，在雜質(zhì)源于活性藥物成分(API)的情況下，每個(gè)國(guó)家在其藥物審批指南中設(shè)定了藥物產(chǎn)品中源自API的、已知或未知雜質(zhì)(相關(guān)化合物)的量的上限。此外，還有一些國(guó)際上使用的標(biāo)準(zhǔn)，ICH指南Q3A是有代表性的一個(gè)。在該指南中，在審批藥物時(shí)，藥物中每種相關(guān)化合物的量限制為最多0.1％或0.2％等，并且根據(jù)超過(guò)限量的相關(guān)化合物，有差別地適用應(yīng)當(dāng)規(guī)定的諸如毒性相關(guān)數(shù)據(jù)等的信息。這意味著在制備藥物的過(guò)程中必須減少相關(guān)化合物的量，因?yàn)樗幬锏南嚓P(guān)化合物在體內(nèi)如何作用是未知的。因此，用于減少相關(guān)化合物的制造方法和根據(jù)每種相關(guān)化合物的特性(結(jié)構(gòu)和毒性)設(shè)定其量的上限是藥物質(zhì)量控制中的必要因素。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的一個(gè)目的為提供含有兩親性嵌段共聚物的水溶性差的藥物的聚合物膠束型藥物組合物，其含有在規(guī)定限量以內(nèi)的量的特定相關(guān)化合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的為提供制備所述藥物組合物的方法。技術(shù)手段本發(fā)明的一方面提供了聚合物膠束藥物組合物，其包含：包含親水性嵌段(A)和疏水性嵌段(B)的純化的兩親性嵌段共聚物，以及一種或多種水溶性差的藥物，其選自紫杉醇和多西紫杉醇，其中當(dāng)所述藥物組合物在40℃下儲(chǔ)存6個(gè)月時(shí)，其含有以所述水溶性差的藥物的初始量為100重量份計(jì)的小于0.17重量份的由下式1表示的相關(guān)化合物：[式1]其中：R1為H或COCH3，R2為苯基或O(CH3)3。本發(fā)明的另一方面提供了制備聚合物膠束藥物組合物的方法，其包括：(a)純化包含親水性嵌段(A)和疏水性嵌段(B)的兩親性嵌段共聚物；(b)將選自紫杉醇和多西紫杉醇的一種或多種水溶性差的藥物和純化的兩親性嵌段共聚物溶解在有機(jī)溶劑中；和(c)向步驟(b)中獲得的溶液中加入水性溶劑以形成聚合物膠束；當(dāng)所述藥物組合物在40℃下儲(chǔ)存6個(gè)月時(shí)，其含有以所述水溶性差的藥物的初始量為100重量份計(jì)的小于0.17重量份的由上式1表示的相關(guān)化合物。有益效果根據(jù)本發(fā)明，可以獲得具有減少的相關(guān)化合物和改善的儲(chǔ)存穩(wěn)定性的水溶性差的藥物的藥物組合物。附圖說(shuō)明圖1為對(duì)實(shí)驗(yàn)例1中使用的、經(jīng)過(guò)六個(gè)月加速試驗(yàn)的、含有紫杉醇的聚合物膠束組合物進(jìn)行HPLC分析所得的色譜圖。圖2顯示實(shí)驗(yàn)例1中獲得的相關(guān)化合物(RRT0.87±0.02(0.85～0.89)，其在下文中可與RRT0.87互換使用)的LC/MS/MS分析結(jié)果。圖3顯示對(duì)實(shí)驗(yàn)例3中用酸處理紫杉醇所得的混合物中在RRT0.87處獲得的物質(zhì)進(jìn)行LC/MS/MS分析的結(jié)果。圖4顯示對(duì)實(shí)驗(yàn)例3中用酸處理紫杉醇所得的混合物中在RRT0.87處獲得的物質(zhì)進(jìn)行LC/MS/MS分析的產(chǎn)物離子掃描的結(jié)果，以及經(jīng)過(guò)六個(gè)月加速試驗(yàn)的含有紫杉醇的聚合物膠束藥物組合物樣品的結(jié)果：(a)六個(gè)月加速試驗(yàn)后聚合物膠束組合物的HPLC色譜圖；(b)通過(guò)用酸處理紫杉醇在RRT0.87處所得物質(zhì)的色譜圖。圖5顯示對(duì)實(shí)驗(yàn)例3中用酸處理紫杉醇所得的混合物中在RRT0.87處獲得的物質(zhì)進(jìn)行NMR分析的1HNMR分析結(jié)果。圖6顯示對(duì)實(shí)驗(yàn)例3中用酸處理紫杉醇所得的混合物中在RRT0.87處獲得的物質(zhì)進(jìn)行NMR分析的13CNMR分析結(jié)果。圖7顯示對(duì)實(shí)驗(yàn)例3中用酸處理紫杉醇所得的混合物中在RRT0.87處獲得的物質(zhì)進(jìn)行NMR分析的COSY(相關(guān)光譜)分析結(jié)果。圖8顯示對(duì)實(shí)驗(yàn)例3中用酸處理紫杉醇所得的混合物中在RRT0.87處獲得的物質(zhì)進(jìn)行NMR分析的HMBC(異核多鍵相關(guān)光譜)分析結(jié)果。圖9是在實(shí)驗(yàn)例5中進(jìn)行HPLC分析所得的色譜圖。具體實(shí)施方式下面對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)地說(shuō)明。本發(fā)明實(shí)施方案的藥物組合物包含含有親水性嵌段(A)和疏水性嵌段(B)的純化的兩親性嵌段共聚物。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述兩親性嵌段共聚物包含由親水性嵌段(A)和疏水性嵌段(B)組成的A-B型二嵌段共聚物或B-A-B型三嵌段共聚物。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述兩親性嵌段共聚物可包含，以該共聚物的總重量計(jì)，20-95重量％、更具體地40-95重量％的親水性嵌段。此外，所述兩親性嵌段共聚物可包含，以該共聚物的總重量計(jì)，5-80重量％、更具體地5-60重量％的疏水性嵌段。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述兩親性嵌段共聚物的數(shù)均分子量可以為1,000-50,000道爾頓，更具體地為1,500-20,000道爾頓。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述親水性嵌段是具有生物相容性的聚合物并且可包含選自聚乙二醇或其衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺及其組合中的一種或多種，更具體地，其可包含選自聚乙二醇、單甲氧基聚乙二醇及其組合中的一種或多種。親水性嵌段的數(shù)均分子量可以為200-20,000道爾頓，更具體地為200-10,000道爾頓。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述疏水性嵌段是具有生物可降解性的聚合物，并且可以為衍生自α-羥基酸的單體的聚合物。具體地，其可包含選自聚丙交酯、聚乙交酯、聚扁桃酸、聚己內(nèi)酯、聚二噁烷-2-酮、聚氨基酸、聚原酸酯、聚酐、聚碳酸酯及其組合的一種或多種，更具體地，其可包含選自聚丙交酯、聚乙交酯、聚己內(nèi)酯、聚二噁烷-2-酮及其組合中的一種或多種。疏水性嵌段的數(shù)均分子量可以為200-20,000道爾頓，更具體地為200-10,000道爾頓。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，包含聚(α-羥基酸)疏水性聚合物嵌段的兩親性嵌段共聚物可以通過(guò)已知的開環(huán)聚合方法合成，所述方法使用具有羥基的親水性聚合物作為引發(fā)劑和α-羥基酸內(nèi)酯單體。例如，以具有羥基的親水性聚乙二醇或單甲氧基聚乙二醇為引發(fā)劑，L-丙交酯或D,L-丙交酯可以通過(guò)開環(huán)聚合。根據(jù)作為引發(fā)劑的親水性嵌段中存在的羥基的數(shù)目，可以合成二嵌段共聚物或三嵌段共聚物。在開環(huán)聚合中，可以使用有機(jī)金屬催化劑，例如氧化錫、氧化鉛、辛酸錫、辛酸銻等，在制備醫(yī)療用聚合物時(shí)優(yōu)選使用具有生物相容性的辛酸錫。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，使用純化的共聚物作為兩親性嵌段共聚物。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，兩親性嵌段共聚物是已通過(guò)升華純化的共聚物。升華提純可以在優(yōu)選80℃以上且低于120℃、更優(yōu)選80-100℃的溫度下，以及在優(yōu)選10托以下、更優(yōu)選5托以下、更加優(yōu)選1托以下的真空度的壓力下進(jìn)行優(yōu)選10-74小時(shí)、更優(yōu)選10-48小時(shí)、更加優(yōu)選24-48小時(shí)。在這種條件下通過(guò)升華進(jìn)行純化可以使共聚物的分子量變化最小化并從共聚物中除去雜質(zhì)。本發(fā)明的藥物組合物包含選自紫杉醇和多西紫杉醇的一種或多種水溶性差的藥物作為活性成分。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，藥物組合物還可包含作為另外的活性成分的除紫杉醇和多西紫杉醇之外的一種或多種水溶性差的藥物。作為這樣的另外的活性成分，可以使用一種或多種選自7-表紫杉醇、t-乙?；仙即?、10-去乙?；仙即肌?0-去乙?；?7-表紫杉醇、7-木糖基紫杉醇、10-去乙酰基-7-戊二酰紫杉醇、7-N,N-二甲基甘氨酰紫杉醇、7-L-丙氨酰紫杉醇和卡巴他賽(cabazitaxel)的紫杉烷抗癌劑。本發(fā)明的實(shí)施方案的藥物組合物可包含，基于100重量份的兩親性嵌段共聚物，0.1-50重量份、更具體地0.5-30重量份的水溶性差的藥物。與兩親性嵌段共聚物的量相比，如果水溶性差的藥物的量太少，則每種藥物使用的兩親性共聚物的重量比較高，因此重構(gòu)時(shí)間會(huì)增加。另一方面，如果水溶性差的藥物的量太多，則可能存在水溶性差的藥物快速沉淀的問(wèn)題。如本文所用的水溶性差的藥物的“初始”量是指制備藥物組合物時(shí)摻入的水溶性差的藥物的重量。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，當(dāng)所述藥物組合物在加速條件下(40℃)儲(chǔ)存6個(gè)月時(shí)，其含有，以所述水溶性差的藥物的初始量為100重量份計(jì)，小于0.17重量份的由下式1表示的相關(guān)化合物：[式1]其中：R1為H或COCH3，R2為苯基或O(CH3)3。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，水溶性差的藥物為紫杉醇，相關(guān)化合物可包括下式1a表示的化合物：[式1a]當(dāng)在加速條件下(40℃)儲(chǔ)存6個(gè)月時(shí)，本發(fā)明實(shí)施方案的藥物組合物可含有，以所述水溶性差的藥物的初始量為100重量份計(jì)，小于0.17重量份，優(yōu)選0.15重量份以下、更優(yōu)選0.1重量份以下、更加優(yōu)選0.08重量份以下、最優(yōu)選0.04重量份以下的式1(特別是式1a)的相關(guān)化合物。當(dāng)在嚴(yán)格條件下(80℃)儲(chǔ)存3周時(shí)，本發(fā)明實(shí)施方案的藥物組合物可含有，以所述水溶性差的藥物的初始量為100重量份計(jì)，小于0.76重量份、優(yōu)選0.5重量份以下、更優(yōu)選0.4重量份以下、更加優(yōu)選0.2重量份以下、最優(yōu)選0.15重量份以下的式1(特別是式1a)的相關(guān)化合物。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，含有規(guī)定限量以內(nèi)的量的特定相關(guān)化合物的藥物組合物是商業(yè)可獲得的組合物，因?yàn)槠淇梢源笠?guī)模生產(chǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物完全不含醚，例如乙醚。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物完全不具有金屬鹽，例如堿金屬鹽和/或用于鹽析的鹽，例如NaCl或KCl。本發(fā)明實(shí)施方案的藥物組合物可以通過(guò)包括以下步驟的方法制備：(a)純化包含親水性嵌段(A)和疏水性嵌段(B)的兩親性嵌段共聚物；(b)將選自紫杉醇和多西紫杉醇的一種或多種水溶性差的藥物以及純化的兩親性嵌段共聚物溶解在有機(jī)溶劑中；和(c)向步驟(b)中獲得的溶液中加入水性溶劑以形成聚合物膠束。兩親性嵌段共聚物的純化如上所述，可用常規(guī)方法形成聚合物膠束。在本發(fā)明實(shí)施方案的制備藥物組合物的方法中，可以使用例如選自醇(例如乙醇)、丙酮、四氫呋喃、乙酸、乙腈和二氧六環(huán)及其組合的水混溶性有機(jī)溶劑作為有機(jī)溶劑，但并不限于此。另外，可以使用選自常規(guī)水、蒸餾水、注射用蒸餾水、生理鹽水、5％葡萄糖、緩沖液及它們的組合中的一種作為水性溶劑，但不限于此。本發(fā)明實(shí)施方案的制備藥物組合物的方法還可包括在所述步驟(a)之后除去有機(jī)溶劑。在實(shí)施方案中，所述方法還可包括加入凍干助劑以凍干膠束組合物?？梢詾閮龈山M合物添加凍干助劑以維持餅狀。在另一個(gè)實(shí)施方案中，凍干助劑可以是選自糖和糖醇中的一種或多種。糖可以是選自乳糖、麥芽糖、蔗糖或海藻糖中的一種或多種。糖醇可以是選自甘露醇、山梨醇、麥芽糖醇、木糖醇和乳糖醇中的一種或多種。凍干助劑還可用于促進(jìn)凍干的聚合物膠束組合物在重構(gòu)時(shí)的均勻溶解。基于凍干組合物的總重量，凍干助劑的含量可以為1-90重量％，特別是1-60重量％，更特別是10-60重量％。通過(guò)以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)地說(shuō)明。然而，這些實(shí)施例僅試圖說(shuō)明本發(fā)明，且實(shí)施例不以任何方式對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。實(shí)施例制備例1：由單甲氧基聚乙二醇和D,L-丙交酯組成的二嵌段共聚物(mPEG-PDLLA)的合成和通過(guò)升華方法純化將150g單甲氧基聚乙二醇(mPEG，數(shù)均分子量＝2,000)加入到配備有攪拌器的500ml圓底燒瓶中，并在120℃真空條件下攪拌2小時(shí)以除去水分。將溶解在200μl甲苯中的0.15g辛酸錫(Sn(Oct)2)加入到反應(yīng)燒瓶中，并在真空條件下再攪拌1小時(shí)以蒸餾并除去甲苯。然后加入150gD,L-丙交酯并在氮?dú)夥障聰嚢枰匀芙?。在D,L-丙交酯完全溶解之后，將反應(yīng)器緊密密封，并在120℃下進(jìn)行聚合反應(yīng)10小時(shí)。反應(yīng)終止后，在磁棒攪拌下，將反應(yīng)器連接到真空泵，產(chǎn)物在1托或更低的壓力下通過(guò)升華方法純化7小時(shí)，得到262g熔融狀態(tài)的mPEG-PDLLA。通過(guò)用1H-NMR分析獲得關(guān)于單甲氧基聚乙二醇的末端基團(tuán)-OCH3的適當(dāng)峰的相對(duì)強(qiáng)度，從而計(jì)算分子量(Mn：～3740)。制備例2：通過(guò)升華方法純化二嵌段共聚物(mPEG-PDLLA)將在制備例1的聚合反應(yīng)過(guò)程中獲得的進(jìn)行純化過(guò)程之前的30gmPEG-PDLLA加入單頸燒瓶中并在80℃下溶解。在磁棒攪拌下，將反應(yīng)器連接到真空泵，并且在1托或更低的壓力下通過(guò)升華方法純化產(chǎn)物24小時(shí)和48小時(shí)。制備例3：通過(guò)升華方法純化二嵌段共聚物(mPEG-PDLLA)除了純化溫度為100℃以外，通過(guò)與制備例2相同的方法進(jìn)行純化。制備例4：通過(guò)升華方法純化二嵌段共聚物(mPEG-PDLLA)除了純化溫度為120℃以外，通過(guò)與制備例2相同的方法進(jìn)行純化。制備例5：使用氧化鋁(Al2O3)通過(guò)吸附法純化二嵌段共聚物(mPEG-PDLLA)將在制備例1的聚合反應(yīng)過(guò)程中獲得的進(jìn)行純化過(guò)程之前的30gmPEG-PDLLA加入單頸燒瓶中并加入丙酮(60ml)溶解。向其中加入氧化鋁(15g)并完全混合。將單頸燒瓶與旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器連接，內(nèi)容物在50℃、60rpm下混合2小時(shí)。然后將溶液在室溫下用PTFE濾紙(1μm)過(guò)濾以除去氧化鋁。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在60℃真空下蒸餾經(jīng)過(guò)濾的丙酮溶液以除去丙酮，由此獲得純化的mPEG-PDLLA。通過(guò)用1H-NMR分析獲得關(guān)于單甲氧基聚乙二醇的末端基團(tuán)-OCH3的適當(dāng)峰的相對(duì)強(qiáng)度，從而計(jì)算分子量(Mn：～3690)。根據(jù)上述制備例2-5中的純化條件的mPEG-PDLLA的分子量變化示于下表1中。表1從表1的結(jié)果可以看出，隨著純化溫度變高，mPEG-PDLLA的分子量的減少量增加。80-100℃和24-48小時(shí)，特別是100℃和24小時(shí)的純化條件可被認(rèn)為是有效的。比較例1：含有紫杉醇的聚合物膠束組合物的制備稱量1g紫杉醇和5g制備例1中得到的mPEG-PDLLA，加入4ml乙醇，在60℃下攪拌直至混合物完全溶解形成澄清溶液。然后使用配備有圓底燒瓶的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在60℃下減壓蒸餾3小時(shí)以除去乙醇。然后將溫度降低至50℃，加入140ml室溫下的蒸餾水，并進(jìn)行反應(yīng)直至溶液變成澄清的藍(lán)色以形成聚合物膠束。向其中加入2.5g無(wú)水乳糖作為凍干助劑并使其完全溶解，使用孔徑為200nm的過(guò)濾器過(guò)濾，并冷凍干燥，得到含有紫杉醇的粉末狀聚合物膠束組合物。實(shí)施例1：含有紫杉醇的聚合物膠束組合物的制備除了使用在制備例3中純化24小時(shí)的mPEG-PDLLA之外，通過(guò)與比較例1相同的方法制備含有紫杉醇的聚合物膠束組合物。實(shí)施例2：含有紫杉醇的聚合物膠束組合物的制備除了使用在制備例5中純化的mPEG-PDLLA以外，通過(guò)與比較例1相同的方法制備含有紫杉醇的聚合物膠束組合物。實(shí)驗(yàn)例1：通過(guò)液相色譜分離相關(guān)化合物向容納有已經(jīng)過(guò)6個(gè)月加速試驗(yàn)(溫度：40℃)的100mg含有紫杉醇的聚合物膠束組合物的小瓶中加入16.7ml去離子水(DW)，使內(nèi)容物完全溶解，取總量的液體并轉(zhuǎn)移到20ml容量瓶中，稀釋至標(biāo)線使總體積為20ml(5.0mg/ml)。取2ml該液體并轉(zhuǎn)移到10ml容量瓶中，加入乙腈至標(biāo)線使總體積為10ml(1mg/ml)。對(duì)于上述組合物，使用以下液相色譜法分離相關(guān)化合物并分段收集。液相色譜條件1)柱：Poroshell120PFP(4.6×150mm，2.7μm，Agilent)2)流動(dòng)相：A：DW/B：乙腈時(shí)間(min)A％B％0.00653525.00455528.00455530.00653535.0065353)流速：0.6ml/min(分鐘)4)注射量：10μl5)檢測(cè)器：紫外吸收分光光度計(jì)(測(cè)量波長(zhǎng)：227nm)得到的HPLC分析的色譜圖顯示在圖1中。實(shí)驗(yàn)例2：使用LC/MS/MS對(duì)相關(guān)化合物進(jìn)行定性分析通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜儀(LC/MS/MS)的MS掃描和產(chǎn)物離子掃描對(duì)實(shí)驗(yàn)例1中分離的相關(guān)化合物(RRT：0.87±0.02(0.85～0.89))進(jìn)行定性分析。在下面的測(cè)量中，使用液相色譜1200系列和電噴霧電離質(zhì)譜儀6400系列(Agilent，美國(guó))作為L(zhǎng)C/MS/MS。分析條件如下。液相色譜條件1)柱：Poroshell120PFP(4.6×150mm，2.7μm，Agilent)2)流動(dòng)相：A：DW/B：乙腈時(shí)間(min)A％B％0.00653525.00455528.00455530.00653535.0065353)流速：0.6ml/min4)注射量：10μl5)檢測(cè)器：紫外吸收分光光度計(jì)(測(cè)量波長(zhǎng)：227nm)電噴霧電離質(zhì)譜儀的條件1)電離：電噴霧電離，正(ESI+)2)MS方法：MS2掃描/產(chǎn)物離子掃描3)離子源：AgilentJetStreamESI4)霧化器氣體(壓力)：氮?dú)?35psi)5)離子噴霧電壓：3500V6)干燥氣體溫度(流速)：350℃℃(7L/min)7)鞘氣溫度(流速)：400℃(10L/min)8)碎裂電壓：135V9)噴嘴電壓：500V10)池加速電壓：7V11)EMV：0V12)碰撞能量：22V13)前體離子：m/z894.214)質(zhì)量掃描范圍：m/z100～1500將從檢測(cè)階段分離并產(chǎn)生的用于分析的物質(zhì)設(shè)置為在質(zhì)譜儀中流動(dòng)，同時(shí)定性分析相關(guān)化合物的檢測(cè)離子，并選擇質(zhì)譜的特征離子[M+Na]。實(shí)驗(yàn)例3：對(duì)酸處理的紫杉醇在RRT0.87下獲得的物質(zhì)進(jìn)行LC/MS/MS分析作為實(shí)驗(yàn)例2中的定性分析的結(jié)果，在含有紫杉醇的聚合物膠束組合物的HPLC分析中出現(xiàn)在RRT0.87處的物質(zhì)被認(rèn)為是當(dāng)紫杉醇存在于酸性條件下時(shí)產(chǎn)生的物質(zhì)。為了證實(shí)這一點(diǎn)，通過(guò)向紫杉醇中加入1NHCl制備化合物，通過(guò)使用制備型LC，分離并分段收集了RRT0.87處的物質(zhì)，并通過(guò)LC/MS/MS對(duì)其進(jìn)行分析。LC/MS/MS分析的結(jié)果顯示在圖3中，LC/MS/MS分析中的產(chǎn)物離子掃描結(jié)果與經(jīng)六個(gè)月加速試驗(yàn)的聚合物膠束組合物樣品的結(jié)果一起顯示在圖4中。根據(jù)分析結(jié)果，通過(guò)用酸處理紫杉醇在RRT0.87處獲得的物質(zhì)顯示與相關(guān)化合物(RRT:0.87±0.02(0.85～0.89))的HPLC峰在完全相同位置的HPLC峰，所述相關(guān)化合物為經(jīng)過(guò)六個(gè)月加速試驗(yàn)的本發(fā)明的含有紫杉醇的聚合物膠束組合物中的相關(guān)化合物。此外，由于這些峰的MS產(chǎn)物離子掃描顯示相同的圖案，因此可以確認(rèn)兩種物質(zhì)具有相同的結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)例4：酸處理的紫杉醇在RRT0.87處獲得的物質(zhì)的NMR分析將通過(guò)向紫杉醇中加入1NHCl制備的化合物分離并在RRT0.87處分段收集，通過(guò)NMR分析其結(jié)構(gòu)。在NMR分析中，1HNMR分析的結(jié)果顯示在圖5中，13CNMR分析的結(jié)果顯示在圖6中，COSY(相關(guān)光譜)分析的結(jié)果顯示在圖7中，HMBC(異核多鍵相關(guān)光譜)分析示于圖8中。根據(jù)分析結(jié)果，可以確認(rèn)通過(guò)用酸處理紫杉醇在RRT0.87處獲得的物質(zhì)(即經(jīng)過(guò)六個(gè)月加速試驗(yàn)的本發(fā)明實(shí)施方案的含有紫杉醇的聚合物膠束組合物中的相關(guān)化合物(RRT：0.87±0.02(0.85～0.89))是紫杉醇和水的以下組合形式的化合物。紫杉醇和一分子水的組合形式：C47H53NO15(871.94g/mol)。核磁共振光譜的條件1.1HNMR1)NMR設(shè)備：裝備有溫度控制器的BruckerDRX-300，AVANCE-4002)樣品/溶劑：在外徑為5mm的NMR管中的1-10mg樣品/0.6mL氯仿-d(在所有NMR實(shí)驗(yàn)中，使用相同的樣品)3)探頭：Brucker5mmQNP或C-H雙探頭4)質(zhì)子90°脈沖寬度/激發(fā)角/捕獲時(shí)間：10.0-11.0微秒/30°/～5.0秒5)弛豫延遲/掃描次數(shù)：1.0～5.0秒/4～642.13CNMR1)探頭：Brucker5mmQNP或C-H雙探頭2)碳90°脈沖寬度/激發(fā)角/捕獲時(shí)間：10.0微秒/30°/2.0～3.0秒3)弛豫延遲/掃描次數(shù)：2.0～5.0秒/大于5,0003.COSY1)NMR設(shè)備：BruckerAVANCE-4002)探頭：Brucker5mmQNP3)脈沖序列：cosygp脈沖序列4)質(zhì)子90°脈沖寬度/捕獲時(shí)間：11.0微秒/0.4～1.6秒5)弛豫延遲/掃描次數(shù)/ω1的實(shí)驗(yàn)次數(shù)：0.5～2.0秒/32～48/400～5004.HMBC1)NMR設(shè)備：BruckerAVANCE-4002)探頭：Brucker5mm反向探頭3)脈沖序列：inv4gptp脈沖序列(對(duì)于HMQC)/inv4gplprnd脈沖序列(對(duì)于HMBC)4)質(zhì)子90°脈沖寬度/碳90°脈沖寬度/獲取時(shí)間：7.5微秒/17～18微秒/0.15～0.2秒5)弛豫延遲/HMQC的掃描次數(shù)/HMBC的掃描次數(shù)/ω1的實(shí)驗(yàn)次數(shù)：1.0～2.0秒/32～96/224/128～2566)溫度/1/2(JCH)：300K/3.5毫秒實(shí)驗(yàn)例5：在嚴(yán)格條件下(80℃)含有藥物的聚合物膠束的儲(chǔ)存穩(wěn)定性的對(duì)比試驗(yàn)將在比較例1和實(shí)施例1-2中制備的紫杉醇的聚合物膠束組合物在80℃的烘箱中保持3周，然后用HPLC分析組合物以比較相關(guān)化合物的量。通過(guò)將膠束組合物溶解在80％乙腈水溶液中并稀釋至紫杉醇濃度為600ppm來(lái)制備測(cè)試溶液。HPLC分析所得的色譜圖顯示在圖9中，并且按照嚴(yán)格試驗(yàn)時(shí)間的相關(guān)化合物的含量變化(％)示于下表2中。HPLC條件柱：直徑2.7μm，Poroshell120PFP(4.6×150mm，2.7μm)(Agilent柱)流動(dòng)相時(shí)間(min)水:乙腈0～2565:35→45:5525～2845:5528～3045:55→65:3530～3565:35檢測(cè)器：紫外吸收分光光度計(jì)(227nm)流速：0.6ml/min各相關(guān)化合物的量(％)＝100(Ri/Ru)Ri：在測(cè)試溶液分析中檢測(cè)到的每種相關(guān)化合物的面積Ru：在測(cè)試溶液分析中檢測(cè)到的所有峰面積的總和[表2]*RRT0.87±0.02：紫杉醇，氧雜環(huán)丁烷開環(huán)化合物RRT0.96±0.02：紫杉醇，氧雜環(huán)丁烷開環(huán)化合物RRT1.00:紫杉醇RRT1.10±0.02：紫杉醇，L-丙交酯反應(yīng)化合物RRT1.12±0.02：紫杉醇，D-丙交酯反應(yīng)化合物RRT1.44±0.05：紫杉醇，去水化合物從表2和圖9可知，與比較例1的組合物相比，實(shí)施例1或2的聚合物膠束藥物組合物的穩(wěn)定性得到提高，紫杉醇量的減少相對(duì)較小，因此可以更穩(wěn)定地維持組合物中所含藥物的效果。實(shí)驗(yàn)例6：在加速條件下(40℃)含有藥物的聚合物膠束的儲(chǔ)存穩(wěn)定性的對(duì)比試驗(yàn)除了將分別在比較例1和實(shí)施例1中制備的紫杉醇的聚合物膠束組合物在穩(wěn)定性試驗(yàn)儀中于40℃下保持6個(gè)月之外，通過(guò)與實(shí)驗(yàn)例5相同的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將按照加速試驗(yàn)時(shí)間的相關(guān)化合物的含量變化示于下表3中。[表3]上述試驗(yàn)結(jié)果顯示了對(duì)不同批次的3種或更多種聚合物膠束組合物進(jìn)行的試驗(yàn)中每種相關(guān)化合物和紫杉醇的量的平均值。通過(guò)實(shí)驗(yàn)例6，已經(jīng)證明當(dāng)在加速儲(chǔ)存溫度下(40℃)儲(chǔ)存6個(gè)月時(shí)，實(shí)施例1的聚合物膠束藥物組合物具有比比較例1的組合物更低量的相關(guān)化合物。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3