利克飛龍聯(lián)合氟康唑的抗真菌產品及其應用的制作方法

本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，具體涉及一種利克飛龍聯(lián)合氟康唑的抗真菌產品及其應用。

背景技術：

近年來，隨著免疫力低下人群(惡性腫瘤、艾滋病、自身免疫病等患者)的增多，導管插管和器官移植等技術的開展，廣譜抗生素、皮質激素和免疫抑制劑的廣泛使用，真菌感染的發(fā)病率急劇上升(AJ.Antifungal agents:mode of action in yeast cells.Rev Esp Quimioter.2006,19:130-9)。白色念珠菌是臨床真菌感染中常見的分離菌，它可以造成淺表感染也可以侵入體內造成系統(tǒng)感染。

氟康唑(fluconazole，F(xiàn)LC)作為安全、有效、價格低廉的抗真菌藥物，對白色念珠菌有很好的療效。但隨著FLC在臨床上的廣泛應用，使得白色念珠菌對唑類藥物的耐藥性不斷增高，因此尋找新的抗真菌手段迫在眉睫。

新藥研究與聯(lián)合用藥研究均是解決真菌耐藥的重要途徑。但新藥研究周期長，成本高，而聯(lián)合用藥前期投入少、效果顯著，受到國內外的關注。聯(lián)合用藥研究包括兩種抗真菌藥聯(lián)合和非抗真菌藥與抗真菌藥聯(lián)合。由于抗真菌藥物品種有限，且新的具有抗真菌作用的藥物價格昂貴且副作用明顯，使得非抗真菌藥物與抗真菌藥物的聯(lián)合應用研究備受關注。

利克飛龍(licofelone)是一種環(huán)氧合酶(COX)、5-脂氧合酶(5-LOX)的雙重抑制劑，是具有雙重抗炎作用的非甾體抗炎藥，與COX和LOX的活性位點都能結合，產生高效的抗炎作用，而且能夠緩解、改善和克服NSAIDs對胃腸道、心血管系統(tǒng)和腎臟等毒性。目前，利克飛龍已經作為治療骨關節(jié)炎的藥物進入了三期臨床實驗(Payandemehr B.A COX/5-LOX Inhibitor Licofelone Revealed Anticonvulsant PropertiesThrough iNOS Diminution in Mice.Neurochemical research.2015,40:1819-28)。但是利克飛龍和氟康唑聯(lián)用是否能抑制白色念珠菌的生長，目前尚無相關研究報道。

技術實現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術，本發(fā)明的目的提供一種利克飛龍聯(lián)合氟康唑的抗真菌產品及其在治療耐藥的白色念珠菌感染中的應用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

本發(fā)明的第一方面，提供利克飛龍聯(lián)合氟康唑在制備抗真菌產品中的用途。

優(yōu)選的，聯(lián)合應用時，利克飛龍與氟康唑的最低抑菌濃度分別為：16μg/ml、1μg/ml。

結果表明，大于16μg/ml利克飛龍與大于1μg/ml的氟康唑聯(lián)合應用均有效。

進一步優(yōu)選的，聯(lián)合應用時，利克飛龍與氟康唑的濃度分別為：16-128μg/ml、1-64μg/ml。

所述真菌為耐藥白色念珠菌。

本發(fā)明的第二方面，提供一種抗真菌的藥物組合物。該藥物組合物包含利克飛龍和氟康唑。

上述藥物組合物中，利克飛龍的濃度大于或等于16μg/ml，氟康唑的濃度大于或等于1μg/ml。

優(yōu)選的，上述藥物組合物中，利克飛龍的濃度為16-128μg/ml，氟康唑的濃度為1-64μg/ml。

進一步優(yōu)選的，上述藥物組合物中，利克飛龍的濃度為16μg/ml，氟康唑的濃度為1μg/ml。

所述真菌為耐藥白色念珠菌。

抗菌藥物聯(lián)用在體外或動物體內可表現(xiàn)為“無關”、“相加”、“協(xié)同”和“拮抗”四種作用，對于不同類的藥物聯(lián)用，由于藥物的作用機制和作用方式不同，很有可能會增加毒性或因誘導滅活酶的產生或競爭同一靶位而出現(xiàn)拮抗作用；而且，同一類藥物不一定都具有相同的作用，如頭孢菌素類，一代頭孢主要抗革蘭氏陽性菌，三、四代頭孢菌素主要抗革蘭氏陰性菌，并且只有部分的三代頭孢品種與四代頭孢才具有抗銅綠假單胞菌的作用，因此，對于抗菌藥物的聯(lián)用而言，其聯(lián)合使用后的抗菌效果具有極大的不可預測性。

為克服白色念珠菌對氟康唑藥物的耐藥性，經過廣泛的深入研究，本發(fā)明的發(fā)明人意外的發(fā)現(xiàn)，作為非抗真菌的藥物，利克飛龍單用濃度小于128μg/ml時，對白色念珠菌的作用很弱或甚至沒有，只有在高于128μg/ml濃度下才會對白色念珠菌產生抑菌作用；而將利克飛龍與氟康唑聯(lián)用時，呈現(xiàn)出強大的協(xié)同抗真菌作用。

本發(fā)明定量評價了利克飛龍與氟康唑的聯(lián)合抗真菌作用，分析了其對氟康唑的增敏效果，并進行了靜態(tài)與動態(tài)的系統(tǒng)評價。

兩種藥物聯(lián)用的濃度會影響兩者的相互作用，本發(fā)明采用耐藥白色念珠菌細胞進行研究，利用液體定量法，測定氟康唑與利克飛龍聯(lián)合用藥時最低有效濃度，并以FICI法選擇最佳藥物組合濃度及評價藥物聯(lián)合用藥的作用；本發(fā)明還采用時間-殺菌曲線法評價藥物聯(lián)用動態(tài)抗真菌作用。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明為臨床提供了聯(lián)合用藥作為治療耐藥真菌感染的治療方案。另外，環(huán)氧合酶/脂氧合酶雙效抑制劑對氟康唑的增效作用，揭示其協(xié)同作用機制可能與細胞內前列腺素E有關，為研究抗真菌藥物作用的新靶點提供思路。

本發(fā)明表明，氟康唑與利克飛龍聯(lián)用時，可以產生協(xié)同抗真菌作用。對抗氟康唑耐藥的白色念珠菌菌株(MIC_FLC>512μg/ml)時，16μg/ml的利克飛龍可以使氟康唑的最低抑菌濃度從512降到1μg/ml，濃度再增大，效果更強。

本發(fā)明表明，破壞細胞內前列腺素E合成可能是聯(lián)合抗真菌作用的機制，為新藥的開發(fā)及老藥新用提供可能的研究方向。

本發(fā)明表明，利克飛龍可明顯增強氟康唑抗真菌作用，并且降低FLC的最低有效濃度，減少抗真菌藥物的用藥量，從而降低藥物的不良反應的發(fā)生。

附圖說明

圖1為氟康唑聯(lián)合利克飛龍對抗CA10作用三維效果圖(X軸：FLC濃度；Y軸：利克飛龍濃度；Z軸：各濃度組合下的ΔE值)；

圖2為氟康唑聯(lián)合利克飛龍對抗CA16作用三維效果圖(X軸：FLC濃度；Y軸：利克飛龍濃度；Z軸：各濃度組合下的ΔE值)；

圖3為氟康唑聯(lián)合利克飛龍對抗CA10的時間-殺菌曲線；

圖4為氟康唑聯(lián)合利克飛龍對抗CA16的時間-殺菌曲線。

具體實施方式

結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，應該說明的是，下述實施例說明僅是為了解釋本發(fā)明，并不對其內容進行限定。

實施例1：氟康唑與利克飛龍聯(lián)合抗真菌作用測定

1.材料

1.1藥品與試劑

氟康唑(fluconazole，F(xiàn)LC)，山東誠創(chuàng)醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；

利克飛龍(licofelone)，上海鉑法姆醫(yī)藥科技有限公司；

科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基，鄭州博賽生物工程有限公司；

TTC-沙保羅瓊脂，杭州天和微生物試劑有限公司；

氫氧化鈉，國營山東單縣有機化工廠，批號940420；

磷酸二氫鉀，上海新寶精細化工廠，批號200602132；

二甲基亞砜(DMSO)，天津市廣成化學試劑有限公司；

RPMI 1640原料藥粉，美國GIBCO公司；

3-(N-嗎啉代)丙磺酸(MOPS)，濟南朋遠生物技術有限公司；

甲萘醌(Menadione)，美國Sigma公司；

XTT(二甲氧唑黃)，南京旋光科技有限公司；

乳酸林格氏液(復方氯化鈉溶液)，山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司；

丙酮，上海振興化工一廠，批號200209510；

XTT(3,3'-[1-(苯氨?；?-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸鈉)-甲萘醌溶液的配制：取XTT粉末0.0500g，溶解于100ml已滅菌的林格氏液配成0.5mg/ml的溶液，用0.22μm濾膜濾過滅菌；加入10μl的10mmol/L的甲萘醌丙酮溶液(取甲萘醌0.0860g溶解于5ml丙酮)，使其終濃度為1μmol/L，搖勻，2℃～8℃避光保存。

藥物溶液：氟康唑用無菌蒸餾水溶解，其他藥物用二甲基亞砜溶解，分別配成2560μg/ml的儲備液，過濾(0.22μm)分裝。所有藥液于-20℃冰箱保存，備用。

PBS(磷酸鹽緩沖液)：用北京鼎國昌盛生物技術有限公司的PBS磷酸鹽緩沖劑(粉劑)，小包裝一袋溶于1L蒸餾水中，即配成0.01M，PH7.4的PBS磷酸鹽緩沖液，121℃高溫高壓濕熱滅菌20min，冷卻備用。

RPMI(Roswell Park Memorial Institute)1640液體培養(yǎng)液：取RPMI 1640(含L-谷氨酰胺，不含碳酸氫鈉)粉末2.08g，加入10％葡萄糖溶液40ml(含糖終濃度2％)及MOPS(3-(N-嗎啉基)丙磺酸)粉6.906g，加蒸餾水至200ml，混合均勻后在22℃用1mol/L的NaOH溶液調pH為7.0±0.1，臨用前用0.22μm混合纖維膜過濾滅菌。

1.2儀器

1.3實驗菌株

質控菌株：白念珠菌ATCC10231，山東大學藥理教研室惠贈；

實驗菌株：省立醫(yī)院、千佛山醫(yī)院臨床分離的白色念珠菌；

菌株鑒定：實驗菌株在科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基35℃下培養(yǎng)48小時，菌落呈綠色或翠綠色所有菌株，再經山東省疾病預防控制中心微生物研究室以標準微生物學方法鑒定為白色念珠菌。得到的白色念珠菌菌株分別編號為：CA4、CA8、CA10和CA16，根據(jù)藥敏性試驗結果，CA10和CA16為對氟康唑耐藥的菌株，CA4、CA8為對氟康唑敏感的菌株。

菌液制備：-20℃下保存的白色念珠菌室溫下解凍，接種到TTC-沙保羅瓊脂培養(yǎng)基上，35℃培養(yǎng)24～48h，取發(fā)育良好的單一菌落再次接種，35℃培養(yǎng)24h，以保證菌株處于生長期。選取若干單個較大菌落，PBS配制成菌懸液，經渦旋器振蕩均勻后以中國細菌濁度標準管比濁，調整樣品管與標準管濁度一致，此時白色念珠菌的菌濃度約為4.5×10⁶CFU/ml，系列稀釋即得到工作菌液，并以活菌計數(shù)進行濃度驗證。

2.內容與方法

2.1氟康唑與利克飛龍的聯(lián)合抗真菌作用測定

2.1.1微量稀釋法

根據(jù)CLSI M27-A3方案的棋盤法，以RPMI-1640液體培養(yǎng)基稀釋藥液使其成為4倍工作濃度，篩選利克飛龍和氟康唑濃度應用范圍，即利克飛龍的終濃度分別為128～2μg/ml，氟康唑為64～0.125μg/ml。按濃度從低到高的順序吸取唑類藥液50μl，分別加入96孔平板的第2～12列，按濃度從低到高的順序吸取利克飛龍藥液50μl，分別加入96孔平板的第G～A行，除A12外各孔再分別加100μl菌液，其余不足200μl的孔用RPMI-1640培養(yǎng)液補足。其中H1為生長對照，只含菌液不含藥物，A12為空白對照，只含藥液不含菌液。將96孔平板置35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，用XTT負載后以酶標儀測定并記錄結果。所有實驗重復三次。

2.1.2時間-殺菌曲線法

將濃度為2560μg/ml的氟康唑和利克飛龍藥物儲備液以RPMI 1640液體培養(yǎng)基10倍稀釋成工作濃度。

取TTC-沙保羅瓊脂培養(yǎng)基上傳代兩次的實驗菌株(CA10)，挑取單個較大菌落，以PBS制成菌懸液，采用中國細菌濁度標準進行比濁，當標準管與樣品管濃度一致時，菌液初始濃度約為4.5×10⁶CFU/ml，以RPMI-1640稀釋菌液為10倍工作濃度，并通過活菌計數(shù)法進行濃度驗證。

取上述制備的藥液500μl加入到相應試管內，再加入RPMI 1640液體培養(yǎng)基至液體總體積為4.5ml；此時取按上述方法制備的菌液500μl加入到此4.5ml含(或不含)藥物的培養(yǎng)基內，震蕩混勻。本實驗分為四組，即：生長對照組(不加藥)、利克飛龍藥物單用組、氟康唑單用組、利克飛龍與氟康唑聯(lián)合用藥組，共4個體系。每個體系總體積為5ml，體系內氟康唑和利克飛龍的終濃度分別為1μg/ml和16μg/ml，體系內菌液終濃度約為4.5×10³CFU/ml。將制備完畢的體系于35℃靜置培養(yǎng)，于藥物作用的第0、6、12、24、36、48h的時間點取樣測定。

2.2評價方法與結果判定

2.2.1 LA理論

Loewe additivity(LA)理論的基本思想認為藥物不可能和它本身發(fā)生相互作用，因此將藥物單用或聯(lián)用產生相同藥效的濃度(等效位點)進行比較。其分析方法分數(shù)抑菌濃度指數(shù)法(fractional inhibitory concentration index,FICI)，表述如下：

ΣFIC＝FIC_A+FIC_B＝C_A/MIC_A+C_B/MIC_B

MIC_A和MIC_B分別是藥物A和B單用時的最小抑菌濃度，C_A與C_B為兩藥聯(lián)用時達到相同藥效時各自的濃度。FICI＞4為拮抗作用，F(xiàn)ICI在0.5與4之間為相加或無關作用，F(xiàn)ICI≤0.5定義為協(xié)同作用。

2.2.2 XTT法(二甲氧唑黃比色法)

在取樣時間點將各體系在蝸旋振蕩器上混勻，吸取100μl某體系內的菌懸液加入到96孔平底培養(yǎng)板內，在以100μl無菌RPMI 1640液體培養(yǎng)基為空白對照的情況下，再分別向每個加樣后的孔內加入100μl配制好的XTT-甲萘醌溶液，培養(yǎng)板在35℃下避光培養(yǎng)2小時，酶標儀設置單孔空白，在492nm處測各孔的OD值，每個體系做三組，取平均值記錄結果，試驗重復3次。

3.結果

3.1氟康唑與非抗菌藥物的聯(lián)合抗真菌作用結果

3.1.1氟康唑與非抗菌藥物聯(lián)合的最低有效菌濃度

各孔中真菌生長百分數(shù)的計算方法為：

真菌生長百分數(shù)＝(各孔OD值-空白對照孔OD值)/生長對照孔OD值

按上述公式計算平板中各孔真菌生長百分數(shù)，取能夠抑制真菌生長80％的最低聯(lián)用藥物濃度為判讀終點，如果真菌生長率不恰好等于20％，取與之最接近的藥物聯(lián)合孔為判讀終點。

氟康唑與利克飛龍的聯(lián)合抗真菌作用，對敏感株來說不明顯，多為無關，而對耐藥株，則呈現(xiàn)強協(xié)同作用。其中耐藥株CA10平板中的生長百分數(shù)實驗結果如表1所示；耐藥株CA16平板中的生長百分數(shù)實驗結果如表2所示。

表.1.用棋盤表示氟康唑與利克飛龍的聯(lián)合用藥抗耐藥白色念珠菌CA10生長百分率(以FICI法換算的藥物最佳作用組合用灰色標出)。

表.2.用棋盤表示氟康唑與利克飛龍的聯(lián)合用藥抗耐藥白色念珠菌CA16生長百分率(以FICI法換算的藥物最佳作用組合用灰色標出)。

3.1.2 FICI法評價FLC/利克飛龍的協(xié)同作用

三次重復性實驗所得結果見表3。由測定結果可見，利克飛龍與氟康唑聯(lián)合應用時，對耐藥白色念珠菌的作用FICI均<0.5，呈現(xiàn)協(xié)同作用。而對敏感白色念珠菌的FICI值則在0.5和1之間，呈現(xiàn)無關作用。

表3以FICI法評氟康唑/利克飛龍聯(lián)合用藥抗真菌作用

3.1.3時間殺菌曲線法評價氟康唑/利克飛龍協(xié)同作用結果

將各個時間點聯(lián)合抗真菌作用的結果連接成曲線，可觀察聯(lián)合用藥后的動態(tài)作用效果，如圖1、2所示：在4.5×10³的菌液中在6h之前加藥組和對照組OD值的變化不大，與對照組相比，6h之后含有氟康唑的各組開始出現(xiàn)生長延遲，其中氟康唑/利克飛龍聯(lián)用組處理的真菌生長延遲更明顯。與對照組相比，各藥物作用組在24h對真菌的抑制效果最好，最終效果隨著時間慢慢變弱。

4.結論

面對臨床應用中抗真菌藥物較少且出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象的現(xiàn)狀，研制新型的抗真菌藥物是解決這一問題的途徑之一，同時通過聯(lián)合用藥的方式來增加真菌對藥物的敏感性也是一種較好的選擇。利克飛龍作為環(huán)氧合酶/脂氧合酶雙效抑制劑高濃度單用時有一定的抗真菌作用，當與FLC聯(lián)用對抗耐藥白色念珠菌時，利克飛龍能顯著降低FLC的MIC值，表現(xiàn)強協(xié)同作用。但是利克飛龍與氟康唑聯(lián)用對非白色念珠菌和敏感的白色念珠菌幾乎無作用?，F(xiàn)有研究表明環(huán)氧合酶抑制劑單用或與氟康唑聯(lián)用都具有一定的抗真菌作用，該抗真菌作用與抑制前列腺素E的合成有密切關系。作為環(huán)氧合酶/脂氧合酶雙效抑制劑的利克飛龍與FLC的協(xié)同作用機制是否也與影響了前列腺素E合成有關，有待進一步研究。本發(fā)明表明FLC和利克飛龍聯(lián)合治療耐藥的白色念珠菌感染在臨床上有一定的應用前景。

上述雖然結合實施例對本發(fā)明的具體實施方式進行了描述，但并非對本發(fā)明保護范圍的限制，所屬領域技術人員應該明白，在本發(fā)明的技術方案的基礎上，本領域技術人員不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護范圍以內。