两个人的电影免费视频_国产精品久久久久久久久成人_97视频在线观看播放_久久这里只有精品777_亚洲熟女少妇二三区_4438x8成人网亚洲av_内谢国产内射夫妻免费视频_人妻精品久久久久中国字幕

共載化療藥物和核酸的腫瘤靶向納米粒子及制備方法與流程

文檔序號:11090479閱讀:1280來源:國知局
共載化療藥物和核酸的腫瘤靶向納米粒子及制備方法與制造工藝

本發(fā)明屬于納米藥物領(lǐng)域,具體地涉及一種共載化療藥物和核酸的腫瘤靶向納米粒子及制備方法。



背景技術(shù):

惡性腫瘤的發(fā)病率、死亡率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢,嚴重威脅著人類的健康。近年來,隨著肝外科技術(shù)、麻醉技術(shù)以及圍手術(shù)期處理水平的不斷進步,手術(shù)治療成為治療惡性腫瘤的首選。然而,臨床絕大多數(shù)的患者在確診時已經(jīng)失去了手術(shù)的機會?;熞彩侵委煇盒阅[瘤的常見策略之一,但是由于腫瘤具有異質(zhì)性,單一的化療往往不能取得理想的療效,且患者易對化療產(chǎn)生耐受。

上個世紀60年代末,美國科學家Michael Blaese首次在醫(yī)學界提出了基因治療的概念。腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中涉及多種基因的表達和功能異常,而這些基因異常與細胞的生長、分化和死亡等密切相關(guān)?;?藥物聯(lián)合治療能夠針對腫瘤細胞內(nèi)的不同靶點發(fā)揮治療作用,從而發(fā)揮協(xié)同治療作用,提高藥物療效;與單一治療方法相比,聯(lián)合治療方法可以減少藥物劑量,從而降低毒副作用;此外,基因/藥物聯(lián)合治療還能夠有效地降低腫瘤耐藥的發(fā)生。

然而,在實際應(yīng)用中,聯(lián)合治療仍然面臨著巨大的挑戰(zhàn),主要包括:如何保證核酸藥物在體內(nèi)不降解,如何解決化療藥物的溶解性問題,以及如何將二者同時靶向輸送至腫瘤部位并實現(xiàn)有效釋放。因此,設(shè)計一種簡單有效的共輸送體系是聯(lián)合治療成功的關(guān)鍵。

聚賴氨酸是一種陽離子多肽,其結(jié)構(gòu)中的伯氨基通過質(zhì)子化作用而使其帶正電荷,通過靜電作用可與表面帶磷酸基的核酸復(fù)合形成納米粒子。低分子量的賴氨酸(<3000)可質(zhì)子化伯氨基數(shù)量少,較難與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物,而高分子的聚賴氨酸雖然可以提高轉(zhuǎn)染效率,但卻有著細胞毒性大的缺點。因此,有必要對其進行結(jié)構(gòu)改造、表面修飾等方法來提高其性能。

天然材料β-環(huán)糊精(β-Cyclodextrin,β-CD),具有良好的生物相容性及可降解性等優(yōu)勢,其可以通過“主-客體”相互作用包合多種疏水性小分子,提高藥物溶解性,增加藥物穩(wěn)定性。然而,單一的β-CD并不能與疏水性藥物實現(xiàn)自組裝。將β-環(huán)糊精引入聚合物的結(jié)構(gòu)中使其具備特殊的結(jié)構(gòu)與性質(zhì),是一種優(yōu)良的藥物載體材料。因此,將β-環(huán)糊精與聚賴氨酸有效的結(jié)合,不僅有效降低了聚賴氨酸的毒性,可以實現(xiàn)藥物和核酸的共載。

目前,尚未有用透明質(zhì)酸與共載化療藥物和核酸制成腫瘤靶向納米粒子的報道。



技術(shù)實現(xiàn)要素:

本發(fā)明目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供一種制備簡捷、省時節(jié)能的共載化療藥物和核酸的腫瘤靶向納米粒子。

本發(fā)明的第二個目的是提供共載化療藥物和核酸的腫瘤靶向納米粒子的制備方法。

本發(fā)明的第三個目的是提供共載化療藥物和核酸的腫瘤靶向納米粒子的用途。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:

一種共載化療藥物和核酸的腫瘤靶向納米粒子的制備方法,包括如下步驟:

(1)將6-醛基化β-環(huán)糊精、聚-L-賴氨酸氫溴酸鹽溶于pH=4.4的醋酸鹽緩沖溶液中,室溫攪拌1-2h,加入氰基硼氫化鈉,室溫繼續(xù)攪拌48~72h;加氫氧化鈉水溶液使體系呈中性,在半透膜截留分子量為7000Da的條件下超純水透析2d、透析液冷凍干燥獲得聚賴氨酸接枝β-環(huán)糊精衍生物;所述聚賴氨酸接枝β-環(huán)糊精衍生物簡稱PLCD;

所述聚-L-賴氨酸氫溴酸鹽粘均分子量為15000~30000Da;

以賴氨酸結(jié)構(gòu)單元計的聚-L-賴氨酸氫溴酸鹽、6-醛基化β-環(huán)糊精和氰基硼氫化鈉的摩爾比為1:(0.5~2):4;

(2)按質(zhì)量比為1:(0.3~0.5)的比例,將PLCD與疏水性化療藥物溶解于二甲基亞砜中,室溫攪拌8~12h,在半透膜截留分子量為8000~14000Da的條件下純水透析24h、冷凍干燥,得到載化療藥物的納米粒子;

(3)將載化療藥物的納米粒子與核酸分別溶于DEPC水中,調(diào)節(jié)兩種溶液的濃度使載化療藥物的納米粒子與核酸的N/P摩爾比為30~50:1,將二者等體積混合,渦旋震蕩20~30s,經(jīng)室溫靜置孵育30~60min,得共載化療藥物和核酸的納米粒子;

(4)將共載化療藥物和核酸的納米粒子滴加于質(zhì)量濃度為0.75~1.0mg/mL的透明質(zhì)酸水溶液中,在200-400rpm的條件下,攪拌5-10min,得共載化療藥物和核酸的腫瘤靶向納米粒子;透明質(zhì)酸與共載化療藥物和核酸的納米粒子的質(zhì)量比為(3~4):6。

疏水性化療藥物優(yōu)選阿霉素、喜樹堿或紫杉醇,也可以用其它的疏水性化療藥物。

核酸優(yōu)選為質(zhì)粒DNA、小干擾RNA、microRNA或無功能核苷酸序列,也可以使用其它的核酸。

質(zhì)粒DNA優(yōu)選質(zhì)粒pEGFP-C1,也可以選其它的質(zhì)粒。

小干擾RNA為c-myc siRNA,所述c-myc siRNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

microRNA為miR-122,所述miR-122核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

無功能核苷酸序列為Control RNA或異硫氰酸熒光素標記的RNA,即FAM-RNA;所述Control RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;所述FAM-RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

透明質(zhì)酸分子量為20000~40000Da。

上述方法制備的共載化療藥物和核酸的腫瘤靶向納米粒子。

上述共載化療藥物和核酸的腫瘤靶向納米粒子在制備抗肝癌或抗乳腺癌藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的優(yōu)點:

本發(fā)明制備工藝簡單,易于操作,省時節(jié)能,且所用載體材料生物安全性高,具有良好生物相容性、可生物降解性、無毒性,無免疫原性。

本發(fā)明的共載化療藥物和核酸的腫瘤靶向納米粒子具有典型的核-殼結(jié)構(gòu),粒徑為150~200nm,可以有效地將化療藥物和核酸同時攜帶進入高表達CD44分子的細胞,抑制細胞增殖,并具有顯著的體內(nèi)外腫瘤靶向性。

附圖說明

圖1,實施例1中β-環(huán)糊精(β-CD)、6-單-(對-甲苯磺?;?-β-環(huán)糊精(6-Ts-CD)、6-醛基化β-環(huán)糊精(6-Ald-CD)、聚賴氨酸接枝β-環(huán)糊精衍生物(PLCD)的紅外光譜圖;

圖2,實施例1中的β-CD、6-Ts-CD、6-Ald-CD、PLCD的核磁氫譜圖;

圖3,實施例1中不同氮磷比時載藥體系PLCD/DOX壓縮寡聚RNA的瓊脂糖電泳結(jié)果;

圖4,實施例1中氮磷比為30:1時共載藥物和基因的納米復(fù)合物(PDR)的電子顯微鏡照片(a)和粒徑分布圖(b);

圖5,實施例1中不同質(zhì)量比時透明質(zhì)酸(HA)包裹PDR納米復(fù)合物后的瓊脂糖電泳結(jié)果;

圖6,實施例1中不同質(zhì)量比時HA包裹PDR納米復(fù)合物后的粒徑和Zeta電位分析;

圖7,實施例1中HA與PDR質(zhì)量比為3:6時的共載藥物和基因的腫瘤靶向納米復(fù)合物(HPDR)的透射電子顯微鏡照片(a)及粒徑分布圖(b);

圖8,實施例2中PDR及HPDR在不同pH值介質(zhì)中阿霉素的體外釋放曲線。

圖9,實施例3中PDR及HPDR分別處理肝癌細胞MHCC-97H后的激光共聚焦顯微鏡照片。

圖10,實施例4中PDR及HPDR分別處理肝癌細胞MHCC-97H的細胞毒性比較。

圖11,實施例5中PDR及HPDR在裸鼠體內(nèi)的組織分布圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明,本發(fā)明的實施例是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明,但并不對本發(fā)明作任何限制。

質(zhì)粒pEGFP-C1(市售)。

6-單-(對-甲苯磺?;?-β-環(huán)糊精(6-Ts-CD)的合成

將180gβ-環(huán)糊精(β-CD)混懸于1.5L蒸餾水中,使用恒壓滴液漏斗向混懸液中緩慢滴加60mL NaOH溶液(8.2M)。滴加完待溶液澄清后,將反應(yīng)體系置于冰水浴中。另將45.4g對甲苯磺酰氯溶于135mL乙腈,逐滴加入至上述反應(yīng)體系。將體系置于23℃水浴中,攪拌反應(yīng)2h后,離心收集生成的沉淀,上清液用HCl調(diào)節(jié)pH至6左右,置于4℃冰箱中過夜,離心收集析出的沉淀。兩次沉淀合并,在水中重結(jié)晶兩次,真空干燥得到白色粉末6-單-(對-甲苯磺?;?-β-環(huán)糊精(6-Ts-CD)(產(chǎn)率為12.9%)

6-醛基化-β-環(huán)糊精(6-Ald-CD)的合成

取4g上述制備的6-Ts-CD溶于40mL干燥的DMSO中,加入16mL三乙胺,反應(yīng)體系在氮氣保護下逐漸升高溫度至135℃,繼續(xù)攪拌反應(yīng)5h,而后將反應(yīng)產(chǎn)物傾入丙酮中,離心收集沉淀,經(jīng)反復(fù)洗滌真空干燥即得6-Ald-CD(產(chǎn)率為69%)。

通過紅外光譜儀和核磁共振波譜儀對β-CD、6-Ts-CD、6-Ald-CD進行化學結(jié)構(gòu)表征,紅外譜圖見圖1,核磁共振氫譜圖見圖2。

實施例1

(1)聚賴氨酸接枝β-環(huán)糊精衍生物(PLCD)的合成

將282mg(0.25mmol)6-Ald-CD、57mg(其中賴氨酸結(jié)構(gòu)單元為0.25mmol)聚-L-賴氨酸氫溴酸鹽溶于5mL pH 4.4的醋酸鹽緩沖溶液(0.2M)中,室溫攪拌反應(yīng)1h,加入62.8mg(1mmol)氰基硼氫化鈉,室溫繼續(xù)攪拌72h,加2M的NaOH水溶液使體系調(diào)節(jié)至中性,而后將反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至透析袋中(截留分子量為7000Da),超純水中透析2d,透析液經(jīng)冷凍干燥,所得白色絮狀產(chǎn)物即為聚賴氨酸接枝β-環(huán)糊精衍生物(PLCD),其中β-CD的取代度為12.9%。

所述聚-L-賴氨酸氫溴酸鹽粘均分子量為15000~30000Da;

通過紅外光譜儀和核磁共振波譜儀對PLCD進行化學結(jié)構(gòu)表征,紅外譜圖見圖1,核磁共振氫譜圖見圖2。

(2)載阿霉素的納米粒子的制備與表征

精密稱取10mg PLCD及3.2mg鹽酸阿霉素(含阿霉素3mg)溶于1mL二甲基亞砜中,加入2.2μL三乙胺使鹽酸阿霉素脫鹽,室溫攪拌8h,將體系轉(zhuǎn)移至透析袋中(截留分子量為8000~14000Da),經(jīng)純水透析24h,透析液經(jīng)冷凍干燥,所得暗紅色絮狀產(chǎn)物即得載阿霉素的納米粒子(PLCD/DOX);采用動態(tài)光散射檢測PLCD/DOX的粒徑為199.1nm,Zeta電位為40.5mV;采用紫外光譜法于480nm處檢測DOX的載藥量為11.0%。

(3)載阿霉素和Control RNA的納米粒子的制備與表征

將Control RNA用DEPC水配制成0.1mg/mL,同時,PLCD/DOX用DEPC水溶解,分別配制成0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL及5.0mg/mL的溶液,然后取50μL各種濃度的PLCD/DOX溶液加入等體積的Control RNA溶液中,使得各個體系中PLCD/DOX與Control RNA的N/P摩爾比為1:1、2:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1及50:1,渦旋震蕩30s,室溫靜置孵育30min,即得共載阿霉素和Control RNA的復(fù)合物(PLCD/DOX)/RNA。

采用瓊脂糖凝膠電泳法考察PLCD/DOX對Control RNA的復(fù)合能力,當N/P比大于等于30:1時,RNA的遷移可以完全被抑制,結(jié)果見圖3。

N/P比為30:1時制備的(PLCD/DOX)/RNA簡稱為PDR。

采用透射電子顯微鏡(TEM)觀察PDR納米粒子呈規(guī)則球形,結(jié)構(gòu)致密;采用動態(tài)光散射法檢測PDR納米粒子的粒徑為168.9nm,Zeta電位為38.7mV;TEM照片與粒徑分布圖見圖4。

(4)共載阿霉素和Control RNA的腫瘤靶向納米粒子的制備與表征

將透明質(zhì)酸(HA)溶于DEPC水中,分別稀釋成0.25mg/mL,0.50mg/mL,0.75mg/mL及1.0mg/mL的水溶液,然后將100μL PDR溶液(1.505mg/mL)逐滴加入等體積的HA溶液中,使各個體系中的HA與PDR的質(zhì)量比分別為1:6,2:6,3:6,4:6;200rpm攪拌5min,得共載阿霉素和Control RNA的腫瘤靶向納米粒子HA/(PLCD/DOX)/RNA;

采用瓊脂糖凝膠電泳法考察個HA修飾PDR后對RNA復(fù)合情況的影響,結(jié)果見圖5,實驗結(jié)果表明修飾HA后不會影響PDR對RNA的復(fù)合;采用動態(tài)光散射法表征不同HA/PDR質(zhì)量比制備的納米復(fù)合物的粒徑及zeta電位變化,當HA/PDR的質(zhì)量比增加至3:6時,納米粒子的粒徑為195.6nm,zeta電位由正電轉(zhuǎn)變?yōu)樨撾姡瑸?22.7mV,變化趨勢如圖6;

HA與PDR的質(zhì)量比為3:6時制備的HA/(PLCD/DOX)/RNA簡稱HPDR。

采用TEM觀察HPDR的形態(tài)呈規(guī)則球形,并具有典型的“核-殼”結(jié)構(gòu);TEM照片及粒徑分布見圖7。

實施例2

體外藥物釋放實驗

將實施例1制備的PDR和HPDR各取三份,每份1mL,轉(zhuǎn)移至透析袋中(截留分子量為8000~14000Da),分別置于10mL pH 5.0、6.5及7.4的PBS溶液中,37℃避光振蕩(100rpm),于不同的時間點(見圖8)取出1.5mL介質(zhì)用于測試,并補充等體積的新鮮透析介質(zhì);采用紫外分光光度儀檢測DOX的釋放量(檢測波長為480nm)。按照以下公式計算藥物累積釋放率:DOX累積釋放率=(DOX釋放量/投入DOX總量)×100%。DOX釋放曲線見圖8,呈現(xiàn)緩慢釋藥的特性,并具有顯著的pH敏感性。

實施例3

細胞攝取研究

以FAM-RNA替代實施例1中的Control RNA,其它同實施例1,制備的PDR和HPDR分別命名為PDRFAM和HPDRFAM。

采用肝癌細胞系MHCC-97H考查PDRFAM和HPDRFAM進入細胞的能力及定位;上述細胞在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)基為含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基;待細胞生長處于對數(shù)生長期,消化細胞按照5×104細胞/孔的密度接種于預(yù)先鋪好激光共聚焦專用玻璃片的12孔板中,培養(yǎng)24h后,加入無血清培養(yǎng)基稀釋的游離DOX,F(xiàn)AM-RNA,PDRFAM和HPDRFAM,使體系中DOX終濃度為3.3μg/mL,F(xiàn)AM-RNA終濃度為1.0μg/mL;孵育4h后,細胞經(jīng)4%多聚甲醛固定,DAPI染細胞核,取出玻璃片,于激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞內(nèi)熒光情況,結(jié)果見圖9。PDRFAM和HPDRFAM均能同時攜載DOX和FMA-DNA進入細胞,且經(jīng)HPDRFAM處理的細胞內(nèi)熒光明顯增強,說明HPDRFAM較PDRFAM具有明顯的腫瘤靶向性。

實施例4

細胞毒性研究

采用肝癌細胞系MHCC-97H研究實施例1中的PDR和HPDR對細胞的殺傷作用。上述細胞在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)基為含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基。待細胞生長處于對數(shù)生長期,消化細胞按照4×104細胞/孔的密度接種于96孔板中,培養(yǎng)24h后,加入不同濃度的PDR和HPDR。孵育48h后,加入CCK-8測定于450nm處測定吸光度。按照以下公式計算細胞存活率:細胞存活率=(實驗孔吸光度-空白孔吸光度)/(對照孔吸光度-空白孔吸光度)×100%,結(jié)果見圖10。結(jié)果表明:PDR和HPDR對肝癌細胞的殺傷作用呈現(xiàn)濃度依賴性,且HPDR具有更強的細胞殺傷作用。

實施例5

小鼠體內(nèi)組織分布考察

以近紅外熒光探針Cy5.5對實施例1制備的PDR和HPDR進行標記,方法如下:

步驟(1)、(2)同實施例1步驟(1)、(2)

(3)Control RNA用DEPC水配制成0.1mg/mL,PLCD/DOX用DEPC水溶解,配制成3.0mg/mL的溶液,Cy5.5溶于二甲基亞砜中,使其終濃度為5mg/mL,取6.0μL Cy5.5的二甲基亞砜溶液加入200μL PLCD/DOX的水溶液中,室溫攪拌4h,然后將其加入200μL的Control RNA液中,使體系中PLCD/DOX與Control RNA的N/P摩爾比為30:1,渦旋震蕩30s,室溫靜置30min,得Cy5.5標記的PDR,命名為PDRCy5.5。

(4)將透明質(zhì)酸(HA)溶于DEPC水中,稀釋成0.75mg/mL,然后將200μL PDRCy5.5溶液(1.505mg/mL)逐滴加入等體積的HA溶液中,使體系中的HA與PDRCy5.5的質(zhì)量比為3:6;200rpm攪拌5min,得Cy5.5標記的HPDR,命名為HPDRCy5.5。

MHCC-97H裸鼠肝癌皮下移植瘤模型:對數(shù)生長期的MHCC-97H細胞經(jīng)胰酶消化離心后,用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸,并調(diào)整細胞濃度至5×107個/mL。然后用注射器吸取200μL上述細胞懸液接種于裸鼠皮下,裸鼠經(jīng)飼養(yǎng)3~4周后,即形成MHCC-97H荷瘤裸鼠用于以下實驗。

將荷瘤裸鼠分為3組,經(jīng)尾靜脈分別注射生理鹽水、PDRCy5.5和HPDRCy5.5,然后利用活體成像分別于2h,8h,24h觀察Cy5.5在裸鼠體內(nèi)各組織臟器中的分布,成像照片見圖11。結(jié)果表明:PDRCy5.5和HPDRCy5.5在8h開始滯留于肝臟,給藥24h后PDRCy5.5主要富集于肝臟和腫瘤,而HPDRCy5.5主要富集于腫瘤部位,說明HPDR具有更強的腫瘤靶向性。

實施例6

一種共載化療藥物和核酸的腫瘤靶向納米粒子的制備方法,包括如下步驟:

(1)將6-醛基化β-環(huán)糊精、聚-L-賴氨酸氫溴酸鹽溶于pH=4.4的醋酸鹽緩沖溶液中,室溫攪拌2h,加入氰基硼氫化鈉,室溫繼續(xù)攪拌48h;加氫氧化鈉水溶液使體系呈中性,在半透膜截留分子量為7000Da的條件下超純水透析2d、透析液冷凍干燥獲得聚賴氨酸接枝β-環(huán)糊精衍生物;所述聚賴氨酸接枝β-環(huán)糊精衍生物簡稱PLCD;

所述聚-L-賴氨酸氫溴酸鹽粘均分子量為15000~30000Da;

以賴氨酸結(jié)構(gòu)單元計的聚-L-賴氨酸氫溴酸鹽、6-醛基化β-環(huán)糊精和氰基硼氫化鈉的摩爾比為1:0.5:4;

(2)按質(zhì)量比為1:0.4的比例,將PLCD與喜樹堿溶解于二甲基亞砜中,室溫攪拌10h,在半透膜截留分子量為8000~14000Da的條件下純水透析24h、冷凍干燥,得到載喜樹堿的納米粒子;

(3)將載喜樹堿的納米粒子與pEGFP-C1分別溶于DEPC水中,調(diào)節(jié)兩種溶液的濃度使載喜樹堿的納米粒子與pEGFP-C1的N/P摩爾比為30:1,將二者等體積混合,渦旋震蕩20s,經(jīng)室溫靜置孵育60min,得共載喜樹堿和pEGFP-C1的納米粒子;

(4)將共載喜樹堿與pEGFP-C1的納米粒子滴加于質(zhì)量濃度為1.0mg/mL的透明質(zhì)酸水溶液中,在300rpm的條件下,攪拌10min,得共載喜樹堿與pEGFP-C1的腫瘤靶向納米粒子;透明質(zhì)酸與共載喜樹堿與pEGFP-C1的納米粒子的質(zhì)量比為3:6。

實施例7

一種共載化療藥物和核酸的腫瘤靶向納米粒子的制備方法,包括如下步驟:

(1)將6-醛基化β-環(huán)糊精、聚-L-賴氨酸氫溴酸鹽溶于pH=4.4的醋酸鹽緩沖溶液中,室溫攪拌1.5h,加入氰基硼氫化鈉,室溫繼續(xù)攪拌60h;加氫氧化鈉水溶液使體系呈中性,在半透膜截留分子量為7000Da的條件下超純水透析2d、透析液冷凍干燥獲得聚賴氨酸接枝β-環(huán)糊精衍生物;所述聚賴氨酸接枝β-環(huán)糊精衍生物簡稱PLCD;

所述聚-L-賴氨酸氫溴酸鹽粘均分子量為15000~30000Da;

以賴氨酸結(jié)構(gòu)單元計的聚-L-賴氨酸氫溴酸鹽、6-醛基化β-環(huán)糊精和氰基硼氫化鈉的摩爾比為1:2:4;

(2)按質(zhì)量比為1:0.5的比例,將PLCD與紫杉醇溶解于二甲基亞砜中,室溫攪拌12h,在半透膜截留分子量為8000~14000Da的條件下純水透析24h、冷凍干燥,得到載紫杉醇的納米粒子;

(3)將載紫杉醇的納米粒子與c-myc siRNA分別溶于DEPC水中,調(diào)節(jié)兩種溶液的濃度使載紫杉醇的納米粒子與c-myc siRNA的N/P摩爾比為50:1,將二者等體積混合,渦旋震蕩30s,經(jīng)室溫靜置孵育30min,得共載紫杉醇和c-myc siRNA的納米粒子;

(4)將共載紫杉醇和c-myc siRNA的納米粒子滴加于質(zhì)量濃度為0.75mg/mL的透明質(zhì)酸水溶液中,在400rpm的條件下,攪拌8min,得共載紫杉醇和c-myc siRNA的納米粒子的腫瘤靶向納米粒子;透明質(zhì)酸與共載紫杉醇和c-myc siRNA的納米粒子的質(zhì)量比為4:6。

用miR-122或異硫氰酸熒光素標記的RNA替代本實施例的c-myc siRNA,其它同本實施例,制備出相應(yīng)的HPDR。

實驗證明,實施例6和實施例7制備的HPDR分別采用TEM觀察形態(tài)呈規(guī)則球形,并具有典型的“核-殼”結(jié)構(gòu);粒徑分布與實施例1的HPDR相似。

體外藥物釋放實驗證明,實施例6和實施例7制備的HPDR呈現(xiàn)緩慢釋藥的特性,并具有顯著的pH敏感性。

細胞攝取實驗證明,實施例6和實施例7HPDRFAM具有明顯的腫瘤靶向性。

細胞毒性實驗證明,實施例6和實施例7HPDR具有強的細胞殺傷作用。

SEQ ID NO.1(5’-AACGUUAGCUUCACCAACAUU-3’)

SEQ ID NO.2(5'-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3')

SEQ ID NO.3(5’-AATTCTCCGAACGTGTCACGT-3’)

SEQ ID NO.4(5’-FAM-AATTCTCCGAACGTGTCACGT-3’)。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津市腫瘤醫(yī)院

<120> 共載化療藥物和核酸的腫瘤靶向納米粒子及制備方法

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工合成

<400> 1

aacguuagcu ucaccaacau u 21

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工合成

<400> 2

uggaguguga caaugguguu ug 22

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

aattctccga acgtgtcacg t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

aattctccga acgtgtcacg t 21

當前第1頁1 2 3 
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
1
成年人午夜在线观看视频| 久热这里只有精品99| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲专区字幕在线| 亚洲第一青青草原| 色在线成人网| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲国产中文字幕在线视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产高清激情床上av| 国产精品 欧美亚洲| 少妇精品久久久久久久| 精品国产乱码久久久久久小说| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 精品高清国产在线一区| 日韩欧美三级三区| 亚洲成国产人片在线观看| av欧美777| 考比视频在线观看| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲情色 制服丝袜| 日韩大码丰满熟妇| 久久久精品区二区三区| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲一码二码三码区别大吗| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 男女下面插进去视频免费观看| 在线 av 中文字幕| 久久久久久久精品吃奶| 水蜜桃什么品种好| 亚洲九九香蕉| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 一区二区三区乱码不卡18| 国产在线免费精品| 男男h啪啪无遮挡| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 又紧又爽又黄一区二区| 一级片免费观看大全| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 久久久久国内视频| 日韩中文字幕欧美一区二区| 大香蕉久久成人网| 亚洲精品国产区一区二| 成人手机av| 纯流量卡能插随身wifi吗| 99久久国产精品久久久| 亚洲全国av大片| 精品国产乱码久久久久久小说| 韩国精品一区二区三区| 极品人妻少妇av视频| 久久久国产欧美日韩av| 最新在线观看一区二区三区| 十八禁高潮呻吟视频| 欧美一级毛片孕妇| 午夜福利,免费看| 国产成人精品久久二区二区免费| 性色av乱码一区二区三区2| 国产精品99久久99久久久不卡| 视频在线观看一区二区三区| 色视频在线一区二区三区| 十八禁网站免费在线| av电影中文网址| cao死你这个sao货| 欧美亚洲日本最大视频资源| 一区二区av电影网| 精品视频人人做人人爽| 国产精品一区二区免费欧美| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产精品久久久久成人av| 中亚洲国语对白在线视频| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲精华国产精华精| 一区在线观看完整版| 欧美精品亚洲一区二区| 两个人免费观看高清视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 12—13女人毛片做爰片一| 人成视频在线观看免费观看| 国产亚洲精品一区二区www | 欧美黄色淫秽网站| 国产高清视频在线播放一区| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产91精品成人一区二区三区 | 久久av网站| 亚洲avbb在线观看| 日本五十路高清| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 欧美变态另类bdsm刘玥| 69精品国产乱码久久久| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 又紧又爽又黄一区二区| 午夜免费鲁丝| 欧美在线黄色| 99国产精品一区二区蜜桃av | 精品第一国产精品| 日韩欧美免费精品| 国产精品国产av在线观看| 嫩草影视91久久| 婷婷成人精品国产| 久久九九热精品免费| 国产精品亚洲一级av第二区| 电影成人av| 另类亚洲欧美激情| 欧美亚洲日本最大视频资源| 欧美久久黑人一区二区| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲,欧美精品.| 十八禁高潮呻吟视频| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 热re99久久精品国产66热6| 国产色视频综合| 国产高清视频在线播放一区| 欧美成狂野欧美在线观看| 少妇粗大呻吟视频| 日韩人妻精品一区2区三区| 日韩一区二区三区影片| 国产av又大| 韩国精品一区二区三区| 精品国产乱码久久久久久小说| 免费在线观看影片大全网站| 免费观看a级毛片全部| 欧美国产精品一级二级三级| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 91麻豆av在线| 国产日韩欧美亚洲二区| 精品国产乱码久久久久久小说| 黄色视频在线播放观看不卡| 久久亚洲真实| 一本大道久久a久久精品| 在线看a的网站| 国产精品久久久久成人av| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 久久久久网色| 日韩大码丰满熟妇| 另类精品久久| 99香蕉大伊视频| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产成人精品无人区| 黄色成人免费大全| 最新的欧美精品一区二区| 另类精品久久| aaaaa片日本免费| 精品一品国产午夜福利视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 欧美中文综合在线视频| 人妻 亚洲 视频| 国产精品一区二区免费欧美| 国产精品.久久久| 国产在视频线精品| 国产成人精品无人区| 欧美成人午夜精品| 精品国产乱码久久久久久小说| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲精品乱久久久久久| 国产一卡二卡三卡精品| 久久人妻av系列| 精品一区二区三卡| 欧美一级毛片孕妇| 国产欧美日韩一区二区三| 精品国内亚洲2022精品成人 | tube8黄色片| 久久精品成人免费网站| 丁香六月欧美| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 色婷婷久久久亚洲欧美| 18禁美女被吸乳视频| 97人妻天天添夜夜摸| tocl精华| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 老司机福利观看| 国产精品二区激情视频| 久久 成人 亚洲| 亚洲av日韩在线播放| 九色亚洲精品在线播放| 精品国产乱码久久久久久小说| 视频在线观看一区二区三区| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲五月色婷婷综合| 精品国产乱子伦一区二区三区| 母亲3免费完整高清在线观看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 精品久久久久久电影网| 欧美黑人精品巨大| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 99国产精品一区二区蜜桃av | 国产97色在线日韩免费| 精品视频人人做人人爽| 成年人午夜在线观看视频| 麻豆成人av在线观看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 男人操女人黄网站| 久久亚洲精品不卡| 日本黄色视频三级网站网址 | 9191精品国产免费久久| 国产色视频综合| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产精品一区二区在线不卡| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 久久久久视频综合| 黄片小视频在线播放| 免费日韩欧美在线观看| 久久精品亚洲av国产电影网| 91字幕亚洲| 人妻久久中文字幕网| 国产三级黄色录像| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 制服诱惑二区| 日韩欧美国产一区二区入口| 最新美女视频免费是黄的| 叶爱在线成人免费视频播放| 美女视频免费永久观看网站| 中文字幕色久视频| 色94色欧美一区二区| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 欧美成人免费av一区二区三区 | 亚洲欧美一区二区三区黑人| 婷婷成人精品国产| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 激情在线观看视频在线高清 | 国产伦理片在线播放av一区| 大片免费播放器 马上看| 黑丝袜美女国产一区| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 欧美中文综合在线视频| 日韩视频一区二区在线观看| 亚洲熟女毛片儿| 久久久久国产一级毛片高清牌| 岛国毛片在线播放| 无限看片的www在线观看| 中文字幕人妻熟女乱码| 宅男免费午夜| 9热在线视频观看99| 操出白浆在线播放| 1024香蕉在线观看| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲成a人片在线一区二区| 久久久国产欧美日韩av| 脱女人内裤的视频| 亚洲国产看品久久| 久久99热这里只频精品6学生| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 欧美日韩精品网址| 国产成人影院久久av| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲欧美一区二区三区久久| 亚洲精品自拍成人| 成年动漫av网址| www日本在线高清视频| 热99re8久久精品国产| 蜜桃在线观看..| 欧美性长视频在线观看| 欧美日韩成人在线一区二区| 麻豆乱淫一区二区| √禁漫天堂资源中文www| 大陆偷拍与自拍| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲美女黄片视频| 大片免费播放器 马上看| 国产亚洲欧美精品永久| 最近最新中文字幕大全电影3 | 精品久久久精品久久久| 久久久久网色| 搡老熟女国产l中国老女人| 久久久久久久久免费视频了| 国产成人啪精品午夜网站| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产欧美日韩一区二区三| 999久久久精品免费观看国产| 我的亚洲天堂| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲中文av在线| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产人伦9x9x在线观看| 久久精品91无色码中文字幕| 热99久久久久精品小说推荐| 亚洲五月色婷婷综合| 中文字幕制服av| 亚洲全国av大片| 999久久久国产精品视频| 日韩中文字幕欧美一区二区| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产精品偷伦视频观看了| 蜜桃在线观看..| 12—13女人毛片做爰片一| 婷婷成人精品国产| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲成人免费电影在线观看| 黄色视频在线播放观看不卡| 五月天丁香电影| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲国产欧美在线一区| 99精品欧美一区二区三区四区| 午夜精品国产一区二区电影| 中文字幕精品免费在线观看视频| 老司机福利观看| 久久精品亚洲av国产电影网| 久久中文看片网| 97在线人人人人妻| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 黄色丝袜av网址大全| 国产av又大| 亚洲人成77777在线视频| 国产精品久久久av美女十八| 欧美性长视频在线观看| 欧美国产精品va在线观看不卡| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 成年版毛片免费区| 国产一区二区 视频在线| 一区在线观看完整版| 国产精品.久久久| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 97人妻天天添夜夜摸| 免费av中文字幕在线| bbb黄色大片| 国产av精品麻豆| av视频免费观看在线观看| 欧美日韩黄片免| 99国产精品99久久久久| 少妇被粗大的猛进出69影院| 悠悠久久av| 欧美人与性动交α欧美软件| 亚洲avbb在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 大香蕉久久网| 久久精品国产a三级三级三级| av免费在线观看网站| 一区二区三区国产精品乱码| 国产成人啪精品午夜网站| 免费人妻精品一区二区三区视频| 午夜福利免费观看在线| 动漫黄色视频在线观看| 欧美中文综合在线视频| 桃红色精品国产亚洲av| 国产精品.久久久| 国产主播在线观看一区二区| 999久久久精品免费观看国产| 一区二区三区国产精品乱码| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲一区二区三区欧美精品| 露出奶头的视频| av线在线观看网站| 人人澡人人妻人| 国产激情久久老熟女| 99久久国产精品久久久| 免费高清在线观看日韩| 久久精品国产a三级三级三级| 久久久久网色| 美女福利国产在线| av又黄又爽大尺度在线免费看| 欧美精品一区二区免费开放| 欧美激情高清一区二区三区| 国产精品国产av在线观看| 精品亚洲成国产av| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产精品电影一区二区三区 | 人人澡人人妻人| 午夜成年电影在线免费观看| 日韩有码中文字幕| 国产欧美亚洲国产| 久久久久精品人妻al黑| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 国产成人一区二区三区免费视频网站| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久中文看片网| 青草久久国产| 日本av手机在线免费观看| 丰满饥渴人妻一区二区三| 久久av网站| 波多野结衣一区麻豆| 亚洲成人手机| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲性夜色夜夜综合| 黄片播放在线免费| 国产又爽黄色视频| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲五月色婷婷综合| 男女午夜视频在线观看| kizo精华| 黑丝袜美女国产一区| 超色免费av| 首页视频小说图片口味搜索| 精品一区二区三区av网在线观看 | 亚洲五月色婷婷综合| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 精品国产国语对白av| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲精品在线观看二区| av网站免费在线观看视频| 99国产精品99久久久久| videos熟女内射| 满18在线观看网站| 高清在线国产一区| 精品国产亚洲在线| 国产精品九九99| 免费不卡黄色视频| 色老头精品视频在线观看| 99国产精品免费福利视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲专区字幕在线| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产不卡一卡二| 国产男女超爽视频在线观看| 久久性视频一级片| 91麻豆av在线| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产精品 欧美亚洲| 一区二区三区国产精品乱码| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 少妇精品久久久久久久| 大香蕉久久网| 国产黄频视频在线观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 人人澡人人妻人| 午夜激情av网站| 亚洲少妇的诱惑av| 十八禁网站免费在线| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲天堂av无毛| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产精品熟女久久久久浪| 国产深夜福利视频在线观看| 欧美黑人欧美精品刺激| av网站免费在线观看视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 99国产精品99久久久久| 999精品在线视频| 国产不卡av网站在线观看| 黄频高清免费视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产色视频综合| 三级毛片av免费| 日日夜夜操网爽| 久久婷婷成人综合色麻豆| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲国产欧美一区二区综合| 91麻豆av在线| 超碰成人久久| 午夜免费成人在线视频| 国产欧美亚洲国产| 久9热在线精品视频| 人人澡人人妻人| 在线观看免费视频日本深夜| 精品国产一区二区三区四区第35| 成在线人永久免费视频| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 欧美中文综合在线视频| 不卡av一区二区三区| 免费黄频网站在线观看国产| 老司机影院毛片| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 国产成人啪精品午夜网站| 成人永久免费在线观看视频 | 老鸭窝网址在线观看| 2018国产大陆天天弄谢| 久久久久网色| 午夜福利欧美成人| 男女免费视频国产| 亚洲综合色网址| 亚洲一区中文字幕在线| 国产又色又爽无遮挡免费看| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 成人永久免费在线观看视频 | 制服诱惑二区| av国产精品久久久久影院| 老司机靠b影院| av有码第一页| 亚洲国产av新网站| 国产亚洲精品一区二区www | 亚洲专区国产一区二区| 国产欧美日韩一区二区三| 欧美日韩成人在线一区二区| 青青草视频在线视频观看| 999久久久精品免费观看国产| 99国产精品免费福利视频| 最黄视频免费看| 色播在线永久视频| av天堂在线播放| 欧美激情高清一区二区三区| 欧美一级毛片孕妇| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 在线永久观看黄色视频| 久久性视频一级片| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产深夜福利视频在线观看| 久久中文字幕一级| 久久久国产一区二区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 久久av网站| 视频区图区小说| 亚洲专区字幕在线| 久久久精品免费免费高清| 亚洲五月婷婷丁香| 国精品久久久久久国模美| 午夜免费成人在线视频| 满18在线观看网站| 国产高清国产精品国产三级| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 99精品欧美一区二区三区四区| 女警被强在线播放| av不卡在线播放| kizo精华| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 男女免费视频国产| 精品久久久精品久久久| 国产精品九九99| 久久热在线av| 亚洲 国产 在线| 国产成人影院久久av| 我要看黄色一级片免费的| 国产午夜精品久久久久久| 成人影院久久| 国产在线观看jvid| 制服诱惑二区| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 考比视频在线观看| 99久久国产精品久久久| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 一进一出好大好爽视频| 女警被强在线播放| 亚洲一区中文字幕在线| www.999成人在线观看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 五月开心婷婷网| www.精华液| 亚洲国产成人一精品久久久| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲情色 制服丝袜| 在线观看人妻少妇| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲午夜理论影院| 1024香蕉在线观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 这个男人来自地球电影免费观看| 一二三四在线观看免费中文在| 久久九九热精品免费| 男人舔女人的私密视频| 一本色道久久久久久精品综合| 久久亚洲精品不卡| 黄色怎么调成土黄色| 成在线人永久免费视频| 国产精品国产高清国产av | 国产成人av教育| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 最新在线观看一区二区三区| 精品人妻在线不人妻| 精品第一国产精品| videosex国产| 欧美性长视频在线观看| 久久精品91无色码中文字幕| 欧美日韩黄片免| 久久这里只有精品19| 国产不卡一卡二| 青青草视频在线视频观看| 午夜福利在线免费观看网站| 国产精品国产高清国产av | 久久这里只有精品19| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 老司机福利观看| 亚洲第一青青草原| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产伦人伦偷精品视频| 国产亚洲av高清不卡| 欧美日韩福利视频一区二区| 色在线成人网| www.熟女人妻精品国产| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲中文日韩欧美视频| 天堂中文最新版在线下载| 国产精品99久久99久久久不卡| 超色免费av| 纯流量卡能插随身wifi吗| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲成人国产一区在线观看| 热re99久久国产66热| 欧美精品一区二区大全| 亚洲精品国产区一区二| 成人国产av品久久久| 中文欧美无线码| 国产深夜福利视频在线观看| 一级片'在线观看视频| 国产不卡av网站在线观看| 亚洲精品久久午夜乱码| 男女床上黄色一级片免费看| 9191精品国产免费久久| 久久久久久久精品吃奶| 一区二区三区激情视频| 亚洲国产av影院在线观看| avwww免费| 啦啦啦在线免费观看视频4| 18禁美女被吸乳视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 免费不卡黄色视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 极品教师在线免费播放| 久久国产精品影院|