藍光?全反式維甲酸?納米金剛石協(xié)同治療白血病的裝置的制作方法

本發(fā)明屬于醫(yī)療器械的技術領域，特別涉及一種全反式維甲酸藥物和納米金剛石的復合并聯(lián)合藍光LED照射治療白血病的裝置。

背景技術：

白血病是危害人類健康和生命的重大疾病，尚沒有完全治愈的藥物和技術。急性早幼粒細胞白血病(APL)屬于急性髓系白血病(AML)的一種，目前全反式維甲酸(ATRA)作為靶向治療APL的藥物并且獲得了較好的療效。但是ATRA長時間單一使用會產(chǎn)生維甲酸毒副作用以及復發(fā)性。將ATRA聯(lián)合砷化合物(ATO)治療APL是一種新的治療技術，可在較短時間獲得完全緩解率同時保證了較長的無病生存率，但是ATO的長期使用會對人體產(chǎn)生不良反應或毒副作用。光動力學治療近年來也用于APL的治療的作用，如紅光作用光敏劑Purpurin-18可促進腫瘤細胞HL60的凋亡，但是光敏劑的使用存在細胞毒性以及細胞攝入量低的問題。還有用UV紫外燈光照核黃素抑制HL60細胞的生長，而紫外光照對人會產(chǎn)生皮膚致癌的作用，不宜于臨床應用。利用光(特別是藍光)直接照射HL60細胞，可明顯地提高其抑制率，但沒有藥物的配合，該方法不具備靶向治療的特點，無法獲得更好的臨床治療效果。

和本發(fā)明接近的現(xiàn)有技術是申請?zhí)枮?3142238.1名稱為“一種可治愈急性早幼粒白血病的組合藥物”的發(fā)明專利，通過ATRA誘導未正常分化的細胞分化同時聯(lián)合砷劑As₂O₃共同誘導細胞凋亡，利用這兩種藥物聯(lián)合治療APL，雖然提高APL治愈率。但是，化療藥物的長時間使用會對人體產(chǎn)生毒性，研究表明As₂O₃對細胞毒性存在短期的副作用及長期的細胞毒性。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術問題是，設計了一種ATRA/ND納米金剛石載藥復合物協(xié)同藍光治療裝置，利用無毒納米金剛石(ND)提高ATRA藥物作用效果的同時減少藥物的使用劑量，再協(xié)同溫和藍光作用，增強對人早幼粒白血病細胞的殺傷作用，從而達到更好的臨床治療效果。通過體外細胞增殖抑制、凋亡實驗及體內(nèi)動物抑瘤實驗，證明了三者協(xié)同增強抑制作用，可比單獨使用ATRA的效果大幅提高，同時可以減少藥物毒副作用。

將ATRA和ND按照摩爾質(zhì)量比5～10:1配制成納米金剛石載藥復合物藥物。

體內(nèi)動物實驗每天按照5mg/kg/d的接種量，腹腔注射，治療7天，同時給予0.25mW/cm²藍光體外照射8h/d，達到90％以上的抑瘤率。同時研究證明細胞凋亡主要是通過線粒體凋亡途徑實現(xiàn)的，其中ATRA是誘導分化促進細胞凋亡，納米金剛石作為一種載體具有富集、緩釋藥物的作用。藍光作為綠色光源替代As₂O₃促進細胞凋亡?；谝陨系难芯?，本發(fā)明公開一種新型的高效率、低毒副作用的APL聯(lián)合治療的裝置。

本發(fā)明設計的一種藍光照裝置，波長為400～500nm的商用藍光LED包覆于透明的血流管上，當含有HL60細胞的血液流經(jīng)加藥口時，給予一定劑量的ATRA和ND(5～10:1的摩爾質(zhì)量比)制成的納米金剛石載藥復合物ATRA/ND，之后將含有藥物的血液流經(jīng)藍光照射裝置，最終獲得最大的抑制效果。具體的技術方案如下。

一種藍光-全反式維甲酸-納米金剛石協(xié)同治療白血病的裝置，其中的藥物成分有全反式維甲酸(ATRA)，其特征在于，在一條兩端分別是血液入口7和血液出口6的血循環(huán)管路8中間串接透明的血流管5，血流管5外部被藍光LED陣列1包覆；血循環(huán)管路8中間不同位置分別接裝有蠕動泵3、肝素囊4、藥物盒2；藥物盒2內(nèi)裝有以全反式維甲酸和納米金剛石粉為成分的納米金剛石載藥復合物。

其中，全反式維甲酸和納米金剛石粉按摩爾質(zhì)量比5～10:1。

其中，所述的納米金剛石粉，平均粒徑為3～15nm；所述的金剛石粉，是經(jīng)過酸化回流處理的。

其中，藍光可以使用發(fā)光二極管LED光源，白光加藍光濾光片等，波長范圍為400～500nm。

本發(fā)明的ARTA/ND納米金剛石載藥復合物的用量按全反式維甲酸的量計，等于或低于現(xiàn)有的單獨使用全反式維甲酸的量。

本發(fā)明的納米金剛石載藥復合物是以納米金剛石粉作為載體，負載ATRA，納米金剛石粉在藥物中主要起富集和緩釋ATRA的作用，利用無毒、生物兼容性好的納米金剛石粉(ND)負載ATRA藥物，制成ATRA納米金剛石載藥復合物(ATRA/ND)，證明可以降低藥物給藥量；藍光-ATRA-ND的協(xié)同抑制細胞增殖效果分別高于任何單獨的組合，同時證明通過線粒體凋亡途徑實現(xiàn)細胞凋亡，可以大幅提高對HL60細胞的增殖抑制，體內(nèi)實驗證明能夠明顯抑制腫瘤的生長，獲得更好的臨床治療效果。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的藍光-全反式維甲酸-納米金剛石協(xié)同治療白血病裝置示意圖。

圖2是實施例2的CCK8實驗檢測藍光-ATRA-ND協(xié)同增強細胞增殖抑制與對照組、ATRA-ND、藍光照組的對比圖。

圖3實施例2流式細胞儀檢測藍光-ATRA-ND協(xié)同誘導HL60細胞凋亡與對照組及分別使用藍光、ATRA-ND作用的對比圖。

圖4實施例3各種方式對小鼠的HL60腫瘤抑瘤曲線圖。

具體實施方式

以下結合具體實施例，對本發(fā)明做進一步說明。以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。

實施例1、本發(fā)明的藍光-全反式維甲酸-納米金剛石協(xié)同治療白血病裝置的整體結構。

如圖1所示，1為藍光LED陣列，2為藥物盒，3為蠕動泵，4為肝素囊，5為血流管，6為血液出口，7為血液入口，8為血循環(huán)管路。其中，血循環(huán)管路8兩端開有血液入口7和血液出口6，中間串通血流管5和接通蠕動泵3，血液入口7、蠕動泵3、血循環(huán)管路8、血流管5和血液出口6構成血液的循環(huán)系統(tǒng)；血流管5外部放置藍光LED陣列1；血循環(huán)管路8中間分別接通藥物盒2和肝素囊4；藥物盒2內(nèi)裝有以全反式維甲酸和納米金剛石粉為成分的納米金剛石載藥復合物。

其中的納米金剛石粉，最好是經(jīng)過酸化回流處理，形成ND表面羥基化，有利于分散以及與全反式維甲酸藥物偶聯(lián)，形成納米金剛石載藥復合物。

將波長為400～500nm的商用藍光LED陣列1環(huán)置于透明的血流管5周圍，距離和光劑量可以優(yōu)化，使血流管5處于藍光照射下。血液經(jīng)過血液入口7進入血循環(huán)管路8，當含有HL60細胞的血液流經(jīng)過肝素囊4與血循環(huán)管路8的通口處時，給予一定的肝素防止血液發(fā)生凝集，血液經(jīng)過蠕動泵3繼續(xù)循環(huán)，在藥物盒2內(nèi)的藥物輸入到血流管5，給予一定劑量的ATRA和ND(5～10:1的摩爾質(zhì)量比)制成的ATRA/ND納米金剛石載藥復合物，血液繼續(xù)流經(jīng)透明的血流管5，此時含有ATRA/ND納米金剛石載藥復合物的血液經(jīng)外層管壁上的藍光LED進行照射后，血液通過血循環(huán)管路8流至血液出口6重新回至人體。

所述的ATRA/ND納米金剛石載藥復合物，ATRA與ND的摩爾質(zhì)量比在5～10:1的范圍內(nèi)，對腫瘤細胞HL60的增殖抑制和凋亡效果基本相同。

實施例2、藍光照ATRA和ND協(xié)同促進細胞增殖抑制以及凋亡實驗。

1)細胞增殖抑制實驗

取對數(shù)期的HL60細胞計數(shù)，控制細胞密度10⁵個/ml。接種于96孔板中(10⁴個/孔)，實驗組1：50uM ATRA和50ug/LND形成的納米金剛石載藥復合物藥物；實驗組2：藍光照組；實驗組3：藍光照50uM ATRA和50ug/LND形成的納米金剛石載藥復合物；對照組:RPMI-1640培養(yǎng)基(含0.1％二甲基亞砜)，培養(yǎng)24h后，測試藍光照ATRA和ND對HL60細胞增殖抑制影響。加入10ul CCK8孵育4h，酶標儀450nm檢測吸光度。

2)細胞凋亡實驗

取對數(shù)期HL60細胞接種于100mm培養(yǎng)皿中，細胞密度為1.2×10⁶個，設置實驗組1：50uM ATRA和50ug/LND形成的納米金剛石載藥復合物藥物；實驗組2：藍光照組；實驗組3：藍光照50uM ATRA和50ug/LND形成的納米金剛石載藥復合物；對照組:RPMI-1640培養(yǎng)基(含0.1％二甲基亞砜)，每天光照12h，連續(xù)實驗3天，每天測試細胞凋亡情況。1000rpm 5min收集細胞，PBS清洗細胞一遍，將細胞重懸于50ul結合緩沖液中，分別加入2ul Annexin-V-FITC和2ul PI染料，4℃染色，過300目濾網(wǎng)，流式細胞儀1h小時內(nèi)完成測試。

實驗結果細胞增殖抑制如圖2(*P<0.05相對對照組具有顯著統(tǒng)計學差異,#P<0.05相對ATRA/ND納米金剛石載藥復合物組具有顯著統(tǒng)計學差異)，細胞凋亡如圖3。

圖2結果表明藍光照ATRA/ND納米金剛石載藥復合物，細胞增殖抑制率相比較空白組抑制率增加75％，比藍光或不加藍光ATRA/ND的抑制率都高。圖3結果表明，藍光照ATRA/ND的情況下，在24h的凋亡率54％，48h時凋亡率78％，72h的細胞凋亡率98％，隨著光劑量的增加細胞的凋亡率逐漸增加，都高于藍光、ATRA和ND單獨作用的凋亡率。

實施例3、體內(nèi)動物抑瘤實驗。

為了測試藍光治療APL的效果，建立HL-60細胞裸鼠皮下腫瘤模型。選擇BALB/c裸鼠(體重20-24g約5周齡)，小鼠皮下注射1×10⁷個細胞，觀察10天左右，出現(xiàn)明顯瘤體后。按照腫瘤大小隨機分組。分別設置空白組，ATRA組、ATRA和ND組、藍光照組：光照8小時/天，實驗7天。藍光ATRA組和藍光照ATRA和ND組：每天腹腔注射5mg/kg ATRA(含1％羥甲基纖維素鈉)，共作用7天。實驗過程中每天測量瘤體積和小鼠體重。瘤體積用數(shù)顯卡尺測量計算公式：瘤體積(mm³)V＝長*寬*寬/2，長：瘤長徑寬：瘤短徑。實驗結束后，處死小鼠取腫瘤，根據(jù)腫瘤抑制率％＝1－((給藥組平均瘤重(T)/對照組平均瘤重(C))×100％，計算抑瘤率。如圖4?？梢钥闯瞿[瘤生長受到抑制。藍光照ATRA和ND組相對空白組抑瘤率依次為95％。藍光照ATRA和ND可以最大程度地抑制腫瘤的生長。

實施例4、藍光/ATRA/ND協(xié)同機制。

通過線粒體凋亡通路的標志分子ROS，線粒體膜上的凋亡抑制蛋白Bcl-2mRNA的表達情況，以及凋亡效應蛋白Caspase3蛋白活性進行細胞凋亡的機制的研究。實驗結果表明，藍光照ATRA和ND，活性氧增加，相應的Bcl-2mRNA的表達量降低，Caspase3蛋白活性升高?？梢酝茢嗉毎ㄟ^線粒體通路走向凋亡。

綜上所述，本發(fā)明研制的一種安全、方便易制作的可見光-藍光協(xié)同最有效的治療藥物ATRA以及生物相容性較好的納米金剛石材料，制作一種新的裝置，通過協(xié)同作用用于白血病的臨床治療，提高治療效果，預期可取得重要的臨床應用。