闊葉豐花草三萜化合物的制備方法及其在制備糖苷酶抑制劑藥物中的應(yīng)用與流程

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于天然藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及六種三萜類化合物即mesembryanthemoidigenic acid(1)、29-hydroxyhederagenin(2)、3β,6β-dihydroxy-olean-12-ene-28-oic acid(3)、scutellaric acid(4)、arjunic acid(5)、3β,6β,23-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid(6)或其可藥用的鹽在制備糖苷酶抑制劑或藥物中的應(yīng)用，以及它們的制備方法。

發(fā)明背景

糖尿病為臨床上常見(jiàn)的內(nèi)分泌代謝失調(diào)性疾病，其與心血管疾病和癌癥等逐年高發(fā)具有重要的相關(guān)性，是人類健康重要的殺手。目前，在全球范圍內(nèi)糖尿病的發(fā)病率正在提高，在我國(guó)更是有超過(guò)1億人的患病率，并呈現(xiàn)逐年增加的趨勢(shì)。糖尿病正給我國(guó)人民健康和國(guó)民經(jīng)濟(jì)造成越來(lái)越重大的損失。

糖尿病西醫(yī)分為Ⅰ型糖尿病(或稱胰島素依賴性，DM1)和Ⅱ型糖尿病(或稱非胰島素依賴性，DM2)，其中Ⅱ型糖尿病發(fā)病與患病率均遠(yuǎn)高于Ⅰ型糖尿病，因而危害更大。競(jìng)爭(zhēng)性α-糖苷酶抑制劑具有推遲糖類物質(zhì)消化吸收、控制飯后血糖急劇升高、進(jìn)而使血糖濃度在一天內(nèi)變化波動(dòng)幅度減小等功能，是可開(kāi)發(fā)用于治療Ⅱ型糖尿病的潛在藥物。目前已開(kāi)發(fā)上市正臨床試用作治療Ⅱ型糖尿病的重要α-糖苷酶抑制劑包括一線用藥acarbose(阿卡波糖)、voglibose、miglitol和emigliate等。

六種三萜化合物mesembryanthemoidigenic acid(1)、29-hydroxyhederagenin(2)、3β,6β-dihydroxy-olean-12-ene-28-oic acid(3)、scutellaric acid(4)、arjunic acid(5)、3β,6β,23-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid(6)分別曾自其他植物中分離獲得(具體見(jiàn)文獻(xiàn)：Magina et al.,Quim Nova,2012,35:1184-1188；Huu et al.,J Chem,2007,45:363-367；Kuo et al.,Chem Pharm Bull,1988,36:3619-3622；Ponouet al.,Chem Biodivers,2011,8:1301-1309；Lavaud et al.,Phytochemistry,2001,57:469-478；Khan et al.,J Nat Prod,1993,56:2163-2165)，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下式(Ⅰ)所示，到目前還未見(jiàn)這些化合物具有糖苷酶抑制劑活性的報(bào)道，以及未見(jiàn)其自闊葉豐花草(Spermacoce latifolia)植物中分離獲得的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供化合物mesembryanthemoidigenic acid(1)、29-hydroxyhedera genin(2)、3β,6β-dihydroxy-olean-12-ene-28-oic acid(3)、scutellaric acid(4)、arjunic acid(5)、3β,6β,23-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid(6)或它們的可藥用鹽，在制備α-糖苷酶抑制劑藥物中的應(yīng)用。

經(jīng)體外藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明提供的化合物mesembryanthemoidigenic acid(1)、29-hydroxyhederagenin(2)、3β,6β-dihydroxy-olean-12-ene-28-oic acid(3)、scutellaric acid(4)、arjunic acid(5)或3β,6β,23-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid(6)均具有強(qiáng)效抑制α-葡萄糖苷酶的活性，它們抑制α-葡萄糖苷酶的活性均顯著強(qiáng)于糖尿病一線用藥阿卡波糖，因此可發(fā)展制備用于預(yù)防和治療α-糖苷酶引起或有關(guān)的生理改變或疾病的潛在藥物候選分子。其中，與α-糖苷酶引起或有關(guān)的生理改變或疾病包括但不限于Ⅱ型糖尿病。

本發(fā)明所述的六種化合物的可藥用的鹽，其在人消化道中于胃酸等生理?xiàng)l件下可轉(zhuǎn)化為以上式(Ⅰ)所示的對(duì)應(yīng)三萜化合物分子，其實(shí)質(zhì)性抑制α-葡萄糖苷酶的活性成分與以上所示的六種三萜化合物分子相同，因而屬于本發(fā)明的嚴(yán)格保護(hù)范圍。

本發(fā)明的以上所述的六種三萜化合物分子或其可藥用的鹽可與藥學(xué)上常用輔料或載體結(jié)合，制備得到具有以上所述六種化合物分子之任意一種或多種抑制α-糖苷酶活性的可用于預(yù)防和治療Ⅱ型糖尿病的藥物或藥物組合物。該藥物或藥物組合物可采用可濕性粉劑、片劑、顆粒劑、膠囊、口服液、滴丸等劑型，還可采用制藥界公知的控釋或緩釋劑型或納米制劑。

以本發(fā)明所述的以上六種三萜化合物分子中的一種或多種為有效成分的包括闊葉豐花草等植物的提取物在制備α-糖苷酶抑制劑藥物中的應(yīng)用，因其是以本發(fā)明所述的六種化合物分子中的一種或多種為實(shí)質(zhì)性有效成分，因而屬于本發(fā)明的嚴(yán)格保護(hù)范圍范疇。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供化合物mesembryanthemoidigenic acid(1)、29-hydroxyhederagenin(2)、3β,6β-dihydroxy-olean-12-ene-28-oic acid(3)、scutellaric acid(4)、arjunic acid(5)、3β,6β,23-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid(6)的制備方法，其特征在于，所述的化合物mesembryanthemoidigenic acid(1)、29-hydroxyhederagenin(2)、3β,6β-dihydroxy-olean-12-ene-28-oic acid(3)、scutellaric acid(4)、arjunic acid(5)、3β,6β,23-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid(6)是從闊葉豐花草(Spermacoce latifolia Aubl.K.Schum.)植株中分離得到的。

優(yōu)選，具體步驟為：

將干燥的闊葉豐花草全株粉碎后用乙醇或乙醇水溶液提取，提取液經(jīng)濃縮后得到浸膏，浸膏加水混懸，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，濃縮后分別得到石油醚萃取部分和乙酸乙酯萃取部分；石油醚萃取部分經(jīng)正相硅膠柱層析，以石油醚/丙酮從體積比100：0-0-100梯度洗脫，收集石油醚-丙酮體積比10：1洗脫的餾分E6，餾分E6經(jīng)MCI柱除去色素，用甲醇洗脫得到甲醇洗脫部分E6-1，E6-1依次通過(guò)反相中壓柱層析，甲醇/水體積比從30:70-100:0梯度洗脫、Sephadex LH-20凝膠柱，以甲醇洗脫，和正相硅膠層析，以氯仿/甲醇體積比100:1洗脫，得到化合物1；

乙酸乙酯萃取部分經(jīng)正相硅膠柱層析，以氯仿/甲醇從體積比100:1-0:100梯度洗脫，收集氯仿/甲醇體積比25:1洗脫的餾分F₅，F(xiàn)₅經(jīng)反相中壓柱層析，甲醇/水從體積比30:70-100:0,梯度洗脫，收集甲醇/水體積比80:20洗脫的餾分F_5-4和甲醇/水體積比90:10洗脫的餾分F_5-5；餾分F_5-4經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱以甲醇洗脫，再經(jīng)正相硅膠層析柱分離純化，以氯仿/甲醇體積比50:1洗脫，得到化合物3，4，5和6；餾分F_5-5經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱以甲醇洗脫，得到化合物2。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供闊葉豐花草在制備化合物mesembryanthemoidigenic acid(1)、29-hydroxyhederagenin(2)、3β,6β-dihydroxy-olean-12-ene-28-oic acid(3)、scutellaric acid(4)、arjunic acid(5)或3β,6β,23-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid(6)中的應(yīng)用。

本發(fā)明的六種具強(qiáng)效抑制α-糖苷酶活性的化合物為安全性高并在環(huán)境中能快速自然降解無(wú)殘留的天然化合物，它們可自闊葉豐花草等植物材料中分離獲得，植物材料來(lái)源豐富，制備過(guò)程易于操作。所述的六種化合物的單體均較穩(wěn)定、易存放，它們的α-糖苷酶抑制活性顯著強(qiáng)于或相當(dāng)于臨床用藥阿卡波糖，極可能進(jìn)一步發(fā)展為有效、安全的預(yù)防和治療Ⅱ型糖尿病的α-糖苷酶抑制劑類藥物，具有較好前景。

附圖說(shuō)明：

圖1是化合物mesembryanthemoidigenic acid(1)的¹³C NMR圖譜。

圖2是化合物29-hydroxyhederagenin(2)的¹³C NMR圖譜。

圖3是化合物3β,6β-dihydroxy-olean-12-ene-28-oic acid(3)的¹³C NMR圖譜。

圖4是化合物scutellaric acid(4)的¹³C NMR圖譜。

圖5是化合物arjunic acid(5)的¹H NMR圖譜。

圖6是化合物3β,6β,23-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid(6)的¹³C NMR圖譜。

具體實(shí)施方式：

以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡(jiǎn)單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1：闊葉豐花草植物中六種三萜化合物的制備

1.1植物來(lái)源與鑒定

闊葉豐花草(Spermacoce latifolia Aubl.K.Schum.)植物全株于2012年09月采自廣東省廣州市華南植物園，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院華南植物園邢福武研究員鑒定。

1.2提取與分離

干燥的闊葉豐花草全株(5.0Kg)粉碎后于室溫用體積分?jǐn)?shù)95％的乙醇水溶液提取，提取液合并后減壓濃縮得無(wú)醇浸膏。浸膏加水混懸，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取各4次；減壓濃縮后得到石油醚萃取部分(330g)和乙酸乙酯萃取部分(202g)。所獲石油醚萃取部分(330g)經(jīng)正相硅膠柱層析(200-300目，1000×105mm i.d.)，以石油醚-丙酮(100:0-0:100,v/v,each 3.0L)梯度洗脫，經(jīng)TLC薄層層析檢測(cè)合并主點(diǎn)相同的流分，共得到9個(gè)組分(E₁-E₉)。E₆(5.0g)【石油醚-丙酮(10:1,v/v)洗脫的餾分】經(jīng)MCI柱【200×40mm i.d.】除去色素，用甲醇洗脫得到甲醇洗脫部分E_6-1。E_6-1(3.0g)依次通過(guò)反相中壓柱層析分離純化，甲醇/水(30:70-100:0,v/v,each 1.0L)為流動(dòng)相梯度洗脫、Sephadex LH-20凝膠柱(1550×13.4mm i.d.)以甲醇洗脫和正相硅膠層析柱(200-300目，400×30mm i.d)分離純化，以氯仿-甲醇(100:1，v/v)恒定梯度洗脫，得到化合物1(3.4mg)。乙酸乙酯萃取部分(202g)經(jīng)正相硅膠柱層析(200-300目，1000×105mm i.d.)，以氯仿-甲醇(100:1-0:100,v/v,each 3.0L)梯度洗脫，經(jīng)TLC薄層層析檢測(cè)合并主點(diǎn)相同的流分，得到F₁-F₉共9個(gè)組分。F₅(3.3g)【氯仿-甲醇(25:1,v/v)洗脫的餾分】繼續(xù)經(jīng)反相中壓柱層析分離純化，甲醇/水(30:70-100:0,v/v,each 1.0L)為流動(dòng)相梯度洗脫，TLC薄層檢測(cè)合并主點(diǎn)相同的流分，得到6個(gè)亞組分(F_5-1-F_5-6)。F_5-4(2.5g)【甲醇/水(80:20,v/v)洗脫的餾分】經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱以甲醇洗脫，再經(jīng)正相硅膠層析柱(200-300目，400×30mm i.d.)分離純化，以氯仿-甲醇(50:1，v/v)恒定梯度洗脫，得到化合物3(5.6mg)，4(3.6mg)，5(5.0mg)和6(4.0mg)。F_5-5(1.0g)【甲醇/水(90:10,v/v)洗脫的餾分】經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱以甲醇洗脫，得到化合物2(4.2mg)。

1.3化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

所獲化合物1為白色粉末，ESI-MS m/z 495[M+Na]⁺,471[M-H]^–對(duì)應(yīng)該化合物的分子式C₃₀H₄₈O₄；其¹³C NMR圖譜如圖1所示，¹H-NMR(500MHz,CD₃OD):δ5.25(1H,t,J＝3.5Hz,H-12),3.19(2H,s,H-29),3.15(1H,dd,J＝11.4,4.7Hz,H-3),2.88(1H,dd,J＝13.0,4.7Hz,H-18),1.17(3H,s),0.97(3H,s),0.94(3H,s),0.93(3H,s),0.82(3H,s),0.78(3H,s)；¹³C-NMR(125MHz,CD₃OD):δ38.5(CH₂,C-1),27.6(CH₂,C-2),79.7(CH,C-3),38.9(C,C-4),56.7(CH,C-5),18.3(CH₂,C-6),32.9(CH₂,C-7),39.8(C,C-8),46.5(CH,C-9),36.8(C,C-10),23.2(CH₂,C-11),123.7(CH,C-12),145.2(C,C-13),42.7(C,C-14),28.7(CH₂,C-15),24.0(CH₂,C-16),47.6(C,C-17),40.6(CH,C-18),40.3(CH₂,C-19),35.5(C,C-20),29.6(CH₂,C-21),38.0(CH₂,C-22),28.3(CH₃,C-23),16.3(CH₃,C-24),15.9(CH₃,C-25),17.7(CH₃,C-26),25.4(CH₃,C-27),181.9(C,C-28),74.4(CH₂,C-29),19.5(CH₃,C-30)。根據(jù)以上波譜數(shù)據(jù)綜合分析，解析出該化合物1的化學(xué)結(jié)構(gòu)為mesembryanthemoidigenic acid，其結(jié)構(gòu)式如式(Ⅰ)中的1所示。

所獲化合物2為白色粉末，ESI-MS m/z 511[M+Na]⁺,487[M-H]^–，對(duì)應(yīng)該化合物分子式C₃₀H₄₈O₅；其¹³C NMR圖譜如圖2所示，¹H-NMR(500MHz,CD₃OD):δ5.26(1H,t,J＝3.5Hz,H-12),3.60(1H,dd,J＝11.9,4.2Hz,H-3),3.53,3.33,(each 1H,d,J＝11.0Hz,H-23),3.19(2H,s,H-29),2.88(1H,dd,J＝13.9,4.3Hz,H-18),1.19(3H,s),0.98(3H,s),0.93(3H,s),0.82(3H,s),0.70(3H,s)；¹³C-NMR(125MHz,CD₃OD):δ38.2(CH₂,C-1),26.1(CH₂,C-2),75.3(CH,C-3),40.6(C,C-4),49.5(CH,C-5),18.7(CH₂,C-6),32.6(CH₂,C-7),39.7(C,C-8),47.4(CH,C-9),36.7(C,C-10),22.8(CH₂,C-11),122.8(CH,C-12),144.5(C,C-13),41.4(C,C-14),27.7(CH₂,C-15),23.2(CH₂,C-16),47.7(C,C-17),40.7(CH,C-18),40.7(CH₂,C-19),35.6(C,C-20),28.8(CH₂,C-21),32.1(CH₂,C-22),68.3(CH₂,C-23),11.6(CH₃,C-24),15.3(CH₃,C-25),16.8(CH₃,C-26),25.4(CH₃,C-27),182.7(C,C-28),73.4(CH₂,C-29),18.8(CH₃,C-30)。根據(jù)以上波譜數(shù)據(jù)綜合分析，解析出該化合物2的化學(xué)結(jié)構(gòu)為29-hydroxyhederagenin，其結(jié)構(gòu)式如式(Ⅰ)中的2所示。

所獲化合物3為白色粉末，ESI-MS m/z 495[M+Na]⁺,471[M-H]^–，對(duì)應(yīng)該化合物分子式C₃₀H₄₈O₄；其¹³C NMR圖譜如圖3所示，¹H-NMR(500MHz,CD₃OD):δ5.30(1H,t,J＝3.6Hz,H-12),4.51(1H,br s,H-6),3.10(1H,dd,J＝11.6,4.1Hz,H-3),2.89(1H,dd,J＝13.7,4.2Hz,H-18),1.32(3H,s),1.18(3H,s),1.15(3H,s),1.11(3H,s),1.06(3H,s),0.96(3H,s),0.93(3H,s)；¹³C-NMR(125MHz,CD₃OD):δ42.0(CH₂,C-1),28.1(CH₂,C-2),80.1(CH,C-3),40.1(C,C-4),57.1(CH,C-5),68.7(CH,C-6),41.6(CH₂,C-7),40.7(C,C-8),49.4(CH,C-9),37.7(C,C-10),24.5(CH₂,C-11),123.9(CH,C-12),144.5(C,C-13),43.4(C,C-14),28.7(CH₂,C-15),24.0(CH₂,C-16),47.7(C,C-17),40.6(CH,C-18),47.3(CH₂,C-19),30.5(C,C-20),33.6(CH₂,C-21),32.0(CH₂,C-22),28.3(CH₃,C-23),17.6(CH₃,C-24),17.3(CH₃,C-25),18.8(CH₃,C-26),26.4(CH₃,C-27),181.9(C,C-28),23.9(CH₃,C-29),31.8(CH₃,C-30)。根據(jù)以上波譜數(shù)據(jù)綜合分析，解析出該化合物3的化學(xué)結(jié)構(gòu)為3β,6β-dihydroxy-olean-12-ene-28-oic acid，其結(jié)構(gòu)式如式(Ⅰ)中的3所示。

所獲化合物4為白色粉末，ESI-MS m/z 495[M+Na]⁺,471[M-H]^–，對(duì)應(yīng)該化合物分子式C₃₀H₄₈O₄；其¹³C NMR圖譜如圖4所示，¹H-NMR(500MHz,CD₃OD):δ5.26(1H,t,J＝3.6Hz,H-12),3.63(1H,m,H-3),3.70,3.44,(each 1H,d,J＝11.0Hz,H-23),2.87(1H,dd,J＝13.8,4.2Hz,H-18),1.15(3H,s),1.10(3H,s),1.06(3H,s),0.93(3H,s),0.87(3H,s),0.72(3H,s)；¹³C-NMR(125MHz,CD₃OD):δ33.2(CH₂,C-1),26.1(CH₂,C-2),73.9(CH,C-3),40.6(C,C-4),43.5(CH,C-5),18.7(CH₂,C-6),33.6(CH₂,C-7),39.7(C,C-8),49.4(CH,C-9),37.7(C,C-10),23.5(CH₂,C-11),122.8(CH,C-12),144.5(C,C-13),42.4(C,C-14),28.7(CH₂,C-15),24.0(CH₂,C-16),47.7(C,C-17),42.1(CH,C-18),46.3(CH₂,C-19),31.5(C,C-20),34.2(CH₂,C-21),33.1(CH₂,C-22),68.3(CH₂,C-23),18.6(CH₃,C-24),15.3(CH₃,C-25),17.8(CH₃,C-26),26.4(CH₃,C-27),181.7(C,C-28),23.9(CH₃,C-29),33.8(CH₃,C-30)。根據(jù)以上波譜數(shù)據(jù)綜合分析，解析出該化合物4的化學(xué)結(jié)構(gòu)為scutellaric acid，其結(jié)構(gòu)式如式(Ⅰ)中的4所示。

所獲化合物5為白色粉末，ESI-MS m/z 511[M+Na]⁺,487[M-H]^–，對(duì)應(yīng)該化合物分子式C₃₀H₄₈O₅；其¹H NMR圖譜如圖5所示，¹H-NMR(500MHz,CD₃OD):δ5.31(1H,t,J＝3.6Hz,H-12),3.62(1H,m,H-2),3.24(1H,d,J＝3.7Hz,H-19),3.05(1H,d,J＝3.7Hz,H-18),2.90(1H,d,J＝9.6Hz,H-3),1.31(3H,s),1.03(3H,s),1.00(3H,s),0.96(3H,s),0.93(3H,s),0.84(3H,s),0.76(3H,s)；¹³C-NMR(125MHz,CD₃OD):δ48.2(CH₂,C-1),69.6(CH,C-2),84.9(CH,C-3),40.6(C,C-4),57.0(CH,C-5),19.7(CH₂,C-6),34.0(CH₂,C-7),40.9(C,C-8),49.4(CH,C-9),39.7(C,C-10),25.1(CH₂,C-11),124.8(CH,C-12),144.9(C,C-13),42.7(C,C-14),29.7(CH₂,C-15),28.6(CH₂,C-16),46.7(C,C-17),45.1(CH,C-18),82.3(CH,C-19),36.2(C,C-20),29.5(CH₂,C-21),34.1(CH₂,C-22),29.3(CH₃,C-23),17.5(CH₃,C-24),17.1(CH₃,C-25),17.8(CH₃,C-26),25.4(CH₃,C-27),181.7(C,C-28),25.2(CH₃,C-29),28.8(CH₃,C-30)。根據(jù)以上波譜數(shù)據(jù)綜合分析，解析出該化合物5的化學(xué)結(jié)構(gòu)為arjunic acid，其結(jié)構(gòu)式如式(Ⅰ)中的5所示。

所獲化合物6為白色粉末，ESI-MS m/z 511[M+Na]⁺,487[M-H]^–，對(duì)應(yīng)該化合物分子式C₃₀H₄₈O₅；其¹³C NMR圖譜如圖6所示，¹H-NMR(500MHz,CD₃OD):δ5.29(1H,t,J＝3.6Hz,H-12),4.39(1H,br s,H-6),3.56(1H,m,H-3),3.60,3.47,(each 1H,d,J＝11.0Hz,H-23),2.87(1H,dd,J＝13.7,3.9Hz,H-18),1.33(3H,s),1.14(3H,s),1.10(3H,s),1.06(3H,s),0.96(3H,s),0.91(3H,s)；¹³C-NMR(125MHz,CD₃OD):δ41.2(CH₂,C-1),28.1(CH₂,C-2),73.5(CH,C-3),44.0(C,C-4),49.5(CH,C-5),68.6(CH,C-6),41.0(CH₂,C-7),39.3(C,C-8),48.7(CH,C-9),36.9(C,C-10),23.7(CH₂,C-11),122.8(CH,C-12),144.5(C,C-13),42.4(C,C-14),28.7(CH₂,C-15),24.0(CH₂,C-16),46.7(C,C-17),42.1(CH,C-18),46.3(CH₂,C-19),31.0(C,C-20),34.2(CH₂,C-21),33.1(CH₂,C-22),66.7(CH₂,C-23),14.6(CH₃,C-24),17.5(CH₃,C-25),18.8(CH₃,C-26),26.4(CH₃,C-27),181.9(C,C-28),23.7(CH₃,C-29),33.2(CH₃,C-30)。根據(jù)以上波譜數(shù)據(jù)綜合分析，解析出該化合物6的化學(xué)結(jié)構(gòu)為3β,6β,23-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid，其結(jié)構(gòu)式如式(Ⅰ)中的6所示。

實(shí)施例2：所述六種三萜化合物的α-糖苷酶抑制活性檢測(cè)

2.1儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)儀器：酶標(biāo)儀Genois microplate reader(Tecan GENios,Swizerland)。

試劑樣品：α-葡萄糖苷酶購(gòu)自Sigma Chemical Co.(Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)；阿卡波糖(Acarbose)購(gòu)自Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.(Japan)；4-硝基酚-α-D-葡萄糖吡喃苷(PNPG)購(gòu)自Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.(Japan)；六種三萜化合物mesembryanth emoidigenic acid(化合物1)、29-hydroxyhederagenin(化合物2)、3β,6β-dihydroxy-olean-12-en e-28-oic acid(化合物3)、scutellaric acid(化合物4)、arjunic acid(化合物5)、3β,6β,23-tr ihydroxy-olean-12-en-28-oic acid(化合物6)由以上實(shí)驗(yàn)例1的方法制備，也可以按照文獻(xiàn)Ma gina et al.,Quim Nova,2012,35:1184-1188；Huu et al.,J Chem,2007,45:363-367；Ku o et al.,Chem Pharm Bull,1988,36:3619-3622；Ponouet al.,Chem Biodivers,2011,8:1301-1309；Lavaud et al.,Phytochemistry,2001,57:469-478；Khan et al.,J Nat Prod,1993,56:2163-2165中的方法制備得到。

2.2測(cè)試方法：

a)配制藥物溶液：將待測(cè)化合物和阿卡波糖分別由二甲基亞砜(DMSO)配制10mg/ml的溶液，并配制67mmol/L的磷酸緩沖液(超純水配制)，PNPG底物溶液(5mM，磷酸緩沖液配制)和0.2M的NaCO₃溶液(磷酸緩沖液配制)。

b)采用比色法，通過(guò)96孔板就待測(cè)化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶的半數(shù)抑制濃度進(jìn)行測(cè)定。首先將20μl的α-葡萄糖苷酶(0.8U)加入樣品孔，然后將樣品溶液用磷酸緩沖液按比例稀釋，每孔加入樣品溶液120μl，使測(cè)試樣品(包含待測(cè)化合物和阿卡波糖)的最終濃度為：500μg/mL，250μg/mL，125μg/mL，62.5μg/mL，31.25μg/mL，15.625μg/mL，最后再加入反應(yīng)底物4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷20μl(5mM)。37℃水浴反應(yīng)15min后，每個(gè)樣品孔中加入80μl的Na₂CO₃(0.2M)終止反應(yīng)，在405nm波長(zhǎng)處比色測(cè)定。相同體積的磷酸緩沖液代替酶溶液?；衔镆种坡视蓸悠稯D值對(duì)于空白和對(duì)照OD值計(jì)算，計(jì)算公式如下：抑制率(％)＝(OD_control–OD_neg)-(OD_test–OD_{test control})/(OD_control–OD_neg)×100％。其中所測(cè)試六種化合物分別對(duì)α-葡萄糖苷酶的半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)由劑量效應(yīng)曲線得到。

2.3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)參見(jiàn)表1：

表1.六種三萜化合物的a-葡萄糖苷酶抑制活性

2.4實(shí)驗(yàn)結(jié)論：

a-葡萄糖苷酶是a-糖苷酶抑制劑類Ⅱ型糖尿病治療藥物篩選的指標(biāo)性測(cè)試酶。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的化合物mesembryanthemoidigenic acid(化合物1)、29-hydroxyhederagenin(化合物2)、3β,6β-dihydroxy-olean-12-ene-28-oic acid(化合物3)、scutellaric acid(化合物4)、arjunic acid(化合物5)和3β,6β,23-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid(化合物6)均具有顯著強(qiáng)于糖尿病一線用藥阿卡波糖抑制α-葡萄糖苷酶的活性，因此可發(fā)展制備用于預(yù)防和治療α-糖苷酶引起或有關(guān)的生理改變或疾病的潛在藥物候選分子，具有較強(qiáng)的應(yīng)用開(kāi)發(fā)潛質(zhì)，可望能進(jìn)一步發(fā)展成為新的預(yù)防和治療Ⅱ型糖尿病的用藥，應(yīng)用潛質(zhì)廣泛。