一種金釵石斛生物總堿的應用的制作方法

本發(fā)明涉及一種金釵石斛生物總堿的應用，具體屬于醫(yī)藥技術領域。

背景技術：

肝臟疾病是一類嚴重危害人類健康的疾病，發(fā)病率高，包括病毒性肝炎、肝硬化、脂肪肝、酒精肝、藥物性肝病、遺傳性肝病等，這些肝病在急性起病、慢性急性發(fā)作病程中易出現(xiàn)肝損傷，尤其是急性肝損傷。目前尚無急性肝損傷的統(tǒng)一定義，廣義而言，任何原因導致肝功能指標異常，均提示肝損傷(美國國家臨床學會推薦，ALT、AST高于正常限值，可考慮急性肝損傷)。引起急性肝損傷的常見原因有：1、感染：以各型肝炎病毒常見，其次非肝炎病毒；2、藥物中毒：對乙酰氨基酚、四氯化碳、酒精等；3、缺血或充血性循環(huán)障礙：心包積液、心衰、休克等；4、免疫功能失調：多見自身免疫性肝炎；5、代謝性疾病：妊娠急性脂肪肝、肝豆狀核變核、遺傳性高酪氨酸血癥等；其它如肝臟腫瘤、肝硬化等。我國是一個肝病大國，肝病的發(fā)病率居世界第3位。

急性肝損傷是臨床常見的肝病，病情進一步進展可出現(xiàn)肝功能障礙、肝性腦病，嚴重者可出現(xiàn)死亡。因此，急性肝損傷早期診斷、早期治療是成功的關鍵。目前針對肝病損傷的治療主要是藥物治療，臨床上保肝藥物有門冬氨酸鉀鎂、還原性谷胱甘肽、硫普羅寧、甘草酸二胺等，保肝作用機制與抗炎、保護肝細胞膜及代謝有關，上述藥物使用中，存在個體差異大，使用后部分病人會出現(xiàn)血壓改變、腹脹、皮疹、發(fā)熱、惡心、嘔吐等胃腸不良反應。隨著一些新型抗病毒、免疫調控劑、細胞因子的使用，肝病的治療近年得到一定的發(fā)展，但仍存在著價格昂貴、個體差異大等問題，限制了其在臨床肝病治療中的應用。我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥在治療肝臟疾病方面有著豐富的經(jīng)驗積累。大量的研究證明中草藥在抗肝細胞損傷治療中具有良好的效果和獨特的優(yōu)勢。

我國中草藥資源豐富，不良反應少等優(yōu)點，而且有多環(huán)節(jié)、多層次、多靶點綜合作用的特點，在治療肝病方面具備獨特的優(yōu)勢。因此從傳統(tǒng)的中草藥中尋找高效、低毒治療肝臟疾病的新型藥物已成為研究的熱點。

金釵石斛(Deudrobium nobile Lindl)為蘭科石斛屬植物，是一味我國多部醫(yī)書上均有記載的名貴中藥材，享有“仙草”的美譽。其化學成分主要有生物堿類、酚類、多糖、菲類等，生物堿和多糖是主要的藥理活性成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，石斛具有降脂，降低血壓，調節(jié)免疫等作用?，F(xiàn)有技術中，未見金釵石斛生物總堿用于制備治療預防或治療急、慢性肝損傷疾病藥物的相關報道。

技術實現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種金釵石斛生物總堿的應用，即將金釵石斛生物總堿應用于制備預防或治療急、慢性肝損傷疾病藥物中。

為了實現(xiàn)上述目標，本發(fā)明采用如下的技術方案：

金釵石斛生物總堿在制備預防或治療急、慢性肝損傷疾病藥物中的應用。

前述金釵石斛生物總堿的應用中，金釵石斛生物總堿制備方法之一，是通過以下步驟制備：取金釵石斛藥材粉碎至粗粉，用乙醇常溫浸提，得浸提液后過濾，減壓回收乙醇，揮干至浸膏無醇味，隨后加入鹽酸充分溶解，用石油醚萃取后，調節(jié)pH，再用二氯甲烷萃取，合并萃取液，減壓回收溶劑，即得。

具體地，前述金釵石斛生物總堿的應用中，金釵石斛生物總堿是通過以下步驟制備：取金釵石斛藥材粉碎至粗粉，用質量為粗粉質量10～12倍量的95％乙醇常溫浸提3～4次，每次15～20天，合并浸提液后過濾，減壓回收乙醇，揮干至浸膏無醇味，隨后加入體積為浸膏體積3～5倍量的質量濃度為5％的鹽酸充分溶解，用石油醚萃取后，調節(jié)pH至9～11，再用二氯甲烷萃取，合并萃取液，減壓回收溶劑，即得。

優(yōu)選地，前述金釵石斛生物總堿的應用中，金釵石斛生物總堿是通過以下步驟制備：取金釵石斛藥材粉碎至粗粉，用用質量為粗粉質量10倍量的95％乙醇常溫浸提四次，每次20天，合并浸提液后過濾，減壓回收乙醇，揮干至浸膏無醇味，隨后加入體積為浸膏體積3倍量的質量濃度為5％的鹽酸充分溶解，用石油醚萃取后，調節(jié)pH至10，再用二氯甲烷萃取，合并萃取液，減壓回收溶劑，即得。

前述金釵石斛生物總堿的應用中，金釵石斛生物總堿制備方法之二，是通過以下步驟制備：取金釵石斛莖粗粉，加乙醇浸泡后，煮沸提取，過濾，將濾液濃縮成浸膏，用鹽酸水溶液溶解，過濾，濾液過陽離子交換樹脂(732，氫型，徑高比1:8)，用去離子水洗脫雜質，再用酸性乙醇洗脫，洗脫液濃縮至無醇味，加堿中和，經(jīng)脫鹽處理，冷凍干燥，即得純度較高的金釵石斛生物總堿提取物。

具體地，前述金釵石斛生物總堿的應用中，金釵石斛生物總堿是通過以下步驟制備：取金釵石斛莖粗粉，加質量為粗粉質量10～12倍量的90％乙醇浸泡12～16小時，煮沸提取2～4次，每次2～3小時，過濾，將濾液合并濃縮成浸膏，合并的濾液體積是浸膏體積的120倍；隨后用pH為3.5鹽酸水溶液溶解，過濾，濾液過陽離子交換樹脂，用去離子水洗脫雜質，再用酸性乙醇洗脫，洗脫液濃縮至無醇味，加堿中和，經(jīng)脫鹽處理，冷凍干燥，即得純度較高的金釵石斛生物總堿提取物。

優(yōu)選地，前述金釵石斛生物總堿的應用中，金釵石斛生物總堿是通過以下步驟制備：取金釵石斛莖粗粉，加質量為粗粉質量10倍量的90％乙醇浸泡12小時，煮沸提取3次，每次2小時，過濾，將濾液濃縮成浸膏，用pH為3.5鹽酸水溶液溶解，過濾，濾液過陽離子交換樹脂，用去離子水洗脫雜質，再用酸性乙醇洗脫，洗脫液濃縮至無醇味，加堿中和，經(jīng)脫鹽處理，冷凍干燥，即得純度較高的金釵石斛生物總堿提取物。

采用本發(fā)明的兩種金釵石斛生物總堿制備方法，與ZL200910301762.4中方法相比，所得金釵石斛生物總堿量提升15-20％。

前述金釵石斛生物總堿的應用中，藥物是以金釵石斛生物總堿作為活性成分，加入藥用載體或賦形劑制成的片劑、膠囊劑、顆粒劑、軟膠囊、滴丸劑、糖漿劑、舌下含片或注射劑。

前述金釵石斛生物總堿的應用中，片劑通過以下步驟制備：采用濕法制粒壓片，按照重量份數(shù)計，將金釵石斛生物總堿干燥粉1份與淀粉3份混勻，加入質量分數(shù)為10％的淀粉漿制軟材，淀粉漿中含有質量分數(shù)為1％的枸櫞酸，使之輕握成團、輕壓即散，過16目篩制粒，將濕粒于40℃～60℃干燥，用16目篩整粒，并加入質量為制得顆粒質量5％的滑石粉混勻后，直接壓片即得。

前述金釵石斛生物總堿的應用中，膠囊劑通過以下步驟制備：將金釵石斛生物總堿干燥粉末和質量為干粉質量5倍的可溶性淀粉混勻，過100目篩后，手工填充至5號膠囊內即得。

前述金釵石斛生物總堿的應用中，顆粒劑通過以下步驟制備：按照重量份數(shù)計，取金釵石斛生物總堿干燥粉1份、蔗糖粉3份和糊精1.25份混勻，加入60％乙醇制軟材，使之輕握成團、輕壓即散，過16目篩制粒，60℃-80℃干燥，用16目篩整粒，密封即得。

為了確保本發(fā)明技術方案的科學、有效，發(fā)明人進行了一系列的實驗。

一、金釵石斛生物總堿的制備方法

1、實驗材料和儀器

1.1、藥材與試劑

藥材購自赤水金釵石斛，經(jīng)鑒定為金釵石斛Dendrobium nobile Lindl.的干燥莖。冰醋酸(分析純，上海申博化工有限公司，批號1202101)，甲基紅(C₁₅H₁₅N₃O₂:上海三愛思試劑有限公司)，溴甲酚綠(C₂₁H₁₄Br₄O₅S：上海三愛思試劑有限公司)，二氯甲烷(重慶川江化學試劑廠，批號:20030106)，其他生物堿通用顯色劑(碘化鉍鉀、稀碘化鉍鉀、改良碘化鉍鉀)均為分析純，石油醚(30-60℃)等。

1.2、主要儀器

Q-Exactive高性能臺式四級桿-軌道阱UPLC-MS/MS(HESI離子源)系統(tǒng)(美國Thermo公司)；Genius 1022液氮發(fā)生器(英國PEAK公司)；MILLI-Q超純水純化系統(tǒng)(美國Millipore公司)；循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)；旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠)；天平(萬分之一，上海良平儀表有限公司)等。

2方法與結果

2.1金釵石斛生物總堿的提取

稱取干燥金釵石斛藥材粉碎至粗粉，用質量為粗粉質量10倍量的95％乙醇溶劑常溫浸提四次，每次20d，合并浸提液，過濾，旋轉蒸發(fā)儀減壓回收乙醇，揮干至浸膏無乙醇味。所得浸膏加入體積為浸膏體積3倍量體積的5％鹽酸充分溶解，用石油醚萃取后，酸液加碳酸鈉堿化至pH 10，再用二氯甲烷萃取，合并萃取液，減壓回收溶劑，得總生物堿供試品。同時稱重，并計算得率。第一批藥材10Kg，得總生物堿提取物干膏50g；第二批藥材10Kg，得金釵石斛生物總堿提取物干膏49.4g。

取金釵石斛莖粗粉，加質量為粗粉質量10倍量的90％乙醇浸泡12小時，煮沸提取3次，每次2小時，過濾，將濾液合并濃縮成浸膏，合并的濾液體積是浸膏體積的120倍；隨后用pH為3.5鹽酸水溶液溶解，過濾。濾液過陽離子交換樹脂(732，氫型，徑高比1:8)，用去離子水洗脫雜質，再用酸性乙醇洗脫，洗脫液濃縮至無醇味。加堿中和，經(jīng)脫鹽處理，冷凍干燥，得純度較高的金釵石斛生物總堿提取物。

二、DNLA對CCl₄誘導的急性肝損傷小鼠模型的影響

1、實驗材料

1.1、主要儀器

721型紫外-可見分光光度計(上海申化儀表自控公司)，-80℃低溫冰柜(日本三洋公司)，Milli QA純水處理器(Millipore公司)，3K30型高速冷凍離心機(德國Sigma公司)，BSS－110電子分析天平(北京賽多利斯電子天平有限公司)，SHHW電熱恒溫三用水浴鍋(北京永光明醫(yī)療儀器廠)，Leica細胞圖像儀(德國Leica Microsystems Ltd)等。

1.2藥品與試劑

金釵石斛總生物堿(DNLA)由遵義醫(yī)學院藥理重點省部共建教育部實驗室提供(含量為89.5％)，臨用前用1％吐溫-80助溶后配成所需濃度。CCL₄分析醇(重慶市九龍化學試劑廠)，花生油，考馬斯亮蘭、牛血清白蛋白(Solarbio公司)，TNF-a(ELISA)試劑盒(Biotechnology systems)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3、實驗動物

C57小鼠，6～8周齡，SPF級，雄性，體重18±4g，由第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心提供(許可證：2012-0011)。飼養(yǎng)環(huán)境安靜，室溫22-23℃，光照/暗時間為12/12h循環(huán)，各組實驗小鼠自由進食、飲水。

2、實驗方法

2.1、動物分組、給藥和制模

C57小鼠40只，隨機分為4組，每組10只，即空白組(雙蒸水+1％吐溫-80)，模型組(雙蒸水+1％吐溫-80)，DNLA低劑量(10mg/kg)、DNLA高劑量組(20mg/kg)。采用灌胃給藥(0.1mL/10g，每10g小鼠體重給藥0.1mL)，每天1次，連續(xù)給藥7天后，除空白組外，均腹腔注射CCl₄制小鼠急性肝損傷模型。實驗前小鼠禁食12小時，自由飲水。除空白組以溶媒(玉米油)注射，其余各組0.1mL/10g劑量腹腔注射0.2％CCl₄溶液建立急性肝損傷模型。于制模24小時后稱小鼠體重，取血，切取肝組織用于相關指標檢測。

2.2、小鼠肝臟濕重指數(shù)的測定

小鼠處死前稱重，處死后取出肝臟，稱重，肝臟指數(shù)＝肝臟重(g)/小鼠體重(g)×100％2.3、小鼠血清中ALT及AST活性檢測

小鼠眼眶取血，分離血清，采用全自動生化儀測定血清中ALT(丙氨酸氨基轉移酶)、AST(天門冬氨酸氨基轉移酶)活性。

2.4、小鼠肝臟組織形態(tài)學觀察

取各小鼠相同部位肝組織固定于4％甲醛溶液中，常規(guī)石蠟包埋切片、蘇木精-伊紅染色(Hemaltoxylin and eosin，HE)，光鏡下觀察并拍照。

2.5、肝臟組織中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定

稱取肝組織塊0.3～0.5g放入10mL的小燒杯里加入預冷的生理鹽水，研磨制成10％的肝組織勻漿。低溫高速離心機3000r/min離心10min，吸取上清液，待檢。

2.6、肝組織蛋白含量的測定

10％肝組織勻漿液用生理鹽水稀釋成1％，用移液槍吸取此稀釋液200μL于5mL具塞試管中，加入0.1mg/mLBrandford顯色劑4.0mL，用漩渦混勻器混勻，以蒸餾水同法為空白，在室溫放置5min后在595nm處測定吸收度值，代入回歸方程計算蛋白含量。

2.7、肝組織中丙二醛含量的測定

原理：MDA可與硫代巴比妥酸結合，形成紅色產(chǎn)物。此紅色產(chǎn)物在532nm處有最大吸收峰。實驗取10％的肝組織勻漿，按下列表1中步驟加樣：

表1肝組織蛋白含量的測定

旋渦混勻器充分混勻，95℃水浴40min，取出后流水冷卻，然后3500r/min，離心10min，取上清液，532nm處，1cm光徑比色杯，蒸餾水調零，測各管OD值。根據(jù)下列公式(1)計算MDA值。

MDA(nmol/mgprot)＝(測定管OD值－標準空白管OD值)/(標準管OD值－標準空白管OD值)×標準管溶度(nmol/mL)/樣品蛋白含量(mg/mL)式(1)

2.8、肝組織總超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定

原理：超氧化物歧化酶對超氧陰離子自由基具有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，而亞硝酸鹽在顯色劑作用下呈現(xiàn)紫紅色，可測定吸光度求出其活力。按試說劑盒操作方法進行。并根據(jù)下列公式(2)計算SOD值。

SOD(U/mgprot)＝(對照管OD值－測定管OD值)/對照管OD值/50％×反應液總體積/取液量(mL)/樣品蛋白含量(mg/mL)式(2)

2.9、Real-time PCR檢測肝組織中Nrf2，Nqo1，Ho-1基因表達

取相同部位肝臟組織50-100mg置于1mL Trizol中，提取總RNA，測定其濃度，按照試劑盒說明書提取并純化RNA，并分別在260-280nm處測其吸光度，A260/A280比值在1.8-2.0范圍內表示純度較理想。逆轉錄為cDNA后采用熒光定量PCR法檢測Nrf2，Nqo1，Ho-1基因的表達，引物序列見表2。

表2實時熒光定量PCR引物序列

3、結果

3.1、DNLA對CCl₄誘導的急性肝損傷小鼠模型肝指數(shù)影響

實驗結果表明：與空白組比較，CCl₄模型組小鼠的肝臟濕重指數(shù)明顯增高(P<0.05)。與模型組比較，DNLA低、高劑量組肝臟系數(shù)明顯減少(P<0.05)；DNLA低劑量組肝臟系數(shù)與模型組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結果見表3。

表3對CCl₄誘導的急性肝損傷小鼠肝臟指數(shù)的影響(Mean±SE)

注：與空白組比較，#P＜0.05；與模型組比較：*P＜0.05，

3.2、DNLA對CCl₄誘導的急性肝損傷小鼠血清ALT、AST的影響

結果顯示，模型組與空白組比較，小鼠血清中ALT、AST活性均明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，DNLA各給藥組均明顯降低CCl₄所致肝損傷小鼠血清中ALT、AST活性(P<0.05)，結果見表4。

表4 DNLA對CCl₄所致肝損傷小鼠血清中ALT、AST活性的影響(n＝10)

注：與空白組比較，^#P＜0.05；與模型組比較：*P＜0.05

3.3、DNLA對急性肝臟損傷小鼠肝組織病理學的影響

肝臟組織切片，HE染色，光鏡下觀察，空白組可見小鼠的肝臟結構正常，細胞膜完整，肝索排列規(guī)則。模型組見中央靜脈向四周呈片狀病灶性壞死，中央靜脈和匯管區(qū)出現(xiàn)彌漫性炎細胞浸潤，肝小葉結構被破壞。DNLA給藥組的肝組織病灶性壞死消失，肝小葉結構基本完整，炎癥細胞浸潤明顯減輕，僅見中央靜脈周圍細胞輕微水腫(見圖1)。

3.4、DNLA對CCL4誘導的急性肝損傷小鼠肝組織中MDA含量、SOD活性的影響

與空白對照組比較，肝損傷模型組MDA含量明顯升高(P<0.01)，SOD活性明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，DNLA高、低劑量組均能顯著降低肝勻漿MDA含量(P<0.01)；SOD活性均明顯升高(P<0.01)，結果見表5。

表5 DNLA對CCl₄誘導的急性肝損傷小鼠肝組織中MDA含量和SOD活性的影響(Mean±SE)

注：與空白組比較，#P＜0.05；與模型組比較：*P＜0.05，**P<0.01

3.5、DNLA對急性肝損傷小鼠肝組織中Nrf2，Nqo1，Ho-1mRNA表達的影響

結果顯示，模型組Nrf2，Nqo1，Ho-1mRNA的表達明顯低于空白組(P<0.05)，DNLA給藥組Nrf2，Nqo1，Ho-1mRNA表達顯著高于模型組(P<0.05)，結果見圖2-4。

三、DNLA對D-半乳糖胺誘導的急性肝損傷小鼠模型影響

1、材料和方法

實驗材料、分組及給藥方法同第二項。造模的方法為腹腔注射6.5％D-半乳糖胺溶液10mL/kg，造模24h后眼眶取血，分離血清，測定ALT、AST測定，計算肝臟系數(shù)。

2、實驗結果

結果顯示，與空白組比較，模型組血清中ALT、AST顯著高于空白組(P<0.01)；與模型組比較，DNLA低、高劑量組ALT、AST值明顯低于肝損傷模型組(P<0.05，(P<0.01)。提示DNLA對D-半乳糖胺肝損傷引起的小鼠血清ALT、AST升高具有明顯的抑制作用。肝臟系數(shù)各組間無明顯差異(P>0.05)。結果見表6。

表6 DNLA對D-半乳糖胺肝損傷小鼠血清ALT、AST和肝臟系數(shù)的影響(n＝10，χ±s)

注：與空白組比較:**P<0.01；與模型組比較:^#P<0.01。

四、對酒精誘導的急性肝損傷小鼠模型的影響

1、材料和方法

分組與給藥方法同第二項，造模的方法是每天下午灌胃給予56度的北京二鍋頭0.1mL/10g，連續(xù)7d。造模24h后眼眶取血，分離血清，測定ALT、AST和計算肝臟系數(shù)。

2、實驗結果

結果顯示，與正常對照組比較，模型組小鼠血清ALT、AST顯著高于空白組(P<0.05)；與模型組比較，DNLA給藥組小鼠血清ALT、AST值均明顯低于肝損傷模型組(P<0.05)。提示DNLA對酒精所致肝損傷小鼠血清轉氨酶升高具有明顯的抑制作用，但肝臟系數(shù)各組間無明顯差異(P>0.05)，結果見表7。

表7 DNLA對酒精肝損傷小鼠血清ALT、AST活性和肝臟系數(shù)的影響(n＝10，χ±s)

注：與空白組比較：*P<0.05；與模型組比較#P<0.05

五、DNLA對CCl₄所致的慢性肝損傷大鼠模型的影響

1、實驗材料

1.1、實驗動物：雄性SD(Spragye-Dawley)大鼠，清潔級，月齡3-4月，體重約160-180g，由第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心提供(許可證：SCXK-軍2007-017)。

1.2、藥品和試劑及設備同第二項。

2、實驗方法

2.1、實驗分組和給藥：

健康SD大鼠80只，雌雄兼用，體重180±10g，飼養(yǎng)溫度18～25℃，在實驗環(huán)境下喂養(yǎng)一周后，將大鼠隨機分為6組，每組10只，即空白對照組，模型組，金釵石斛生物總堿低、中、高劑量組，陽性對照組。每天上午分別灌胃濃度為10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg，空白對照組及模型組每天均灌胃蒸餾水，陽性對照組每天灌胃聯(lián)苯雙酯100mg/kg。

2.2、模型制作：

實驗第1天，除空白對照組外其余各組均皮下注射40％CCl₄植物油溶液5ml/kg，以后每隔3－4天皮下注射3mL/kg。各組均在造模同時開始，連續(xù)45天。于第45天用2％戊巴比妥鈉(45mg/kg)腹腔注射麻醉后處死動物，檢測指標。

2.3、生化指標測定

在全自動生化分析儀上測定血清AST，ALT活性；用黃嘌呤氧化酶法測定組織SOD活性，用硫代巴比妥酸法測定肝組織中MDA含量，肝組織中蛋白含量以考馬斯亮藍法測定，所有的測定方法按試劑盒操作說明進行。

2.4、病理組織切片觀察

取大鼠相同部位肝組織，用10％的福爾馬林溶液固定，石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察肝組織病理學變化。

2.5、數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件統(tǒng)計，所有數(shù)據(jù)以(Mean±SE)表示，多組間比較采用ONE-WAY ANOVA處理，方差齊使用LSD法，方差不齊Games-Howell法，P<0.05有統(tǒng)計學意義。

3、實驗結果

3.1、DNLA對CCl4致慢性肝損傷大鼠血清ALT、AST活性的影響

結果表明，與模型組大鼠血清中ALT、AST活性明顯高于正常組(P<0.05)，與模型組比較，DNLA各劑量組(10、20、40mg/kg)均能明顯降低大鼠血清ALT、AST活性(P<0.05)，結果見表8。

表8 DNLA對CCl₄所致慢性肝損傷大鼠血清AST和ALT活性的影響(n＝8，x±s)

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較#P<0.05。

3.2、DNLA對CCl₄致大鼠慢性肝損傷肝組織病理學的影響

HE染色，光鏡下觀察可見，正常對照組小鼠肝組織結構正常，無變性、壞死等病理改變，而CCl₄組大鼠肝組織結構在光鏡下可見不同程度的變性與壞死，纖維組織明顯增生，其中肝細胞脂肪變性，部分肝細胞有氣泡樣變，部分肝細胞核大，深染，核分裂像易見等炎性細胞浸潤，而DNLA各劑量組的肝細胞壞死，變性及炎性細胞浸潤程度均明顯減輕。

本發(fā)明的有益之處在于：本發(fā)明提供的一種金釵石斛生物總堿的應用，即金釵石斛生物總堿在制備預防或治療急、慢性肝損傷疾病藥物中的應用。金釵石斛生物總堿對CCL₄，酒精或D-半乳糖所誘導的急性肝損傷，CCL₄所致的慢性肝損傷均具有防治作用。

(1)對于CCl₄誘導的急性肝損傷，金釵石斛生物總堿使用后能夠使得肝臟系數(shù)明顯減少，明顯降低了血清中ALT、AST活性，顯著降低肝組織中MDA含量，SOD活性均明顯升高，并能明顯提高肝組織中Nrf2，Nqo1，Ho-1mRNA表達。通過肝臟組織切片觀察，使用金釵石斛生物總堿后，肝組織病灶性壞死消失，肝小葉結構基本完整，炎癥細胞浸潤明顯減輕。

(2)對于酒精誘導的急性肝損傷，金釵石斛生物總堿使用后，降低了血清中ALT、AST值，對酒精所致急性肝損傷血清轉氨酶升高具有明顯的抑制作用。

(3)對于D-半乳糖胺誘導的急性肝損傷，金釵石斛生物總堿使用后，降低了血清中ALT、AST值，對D-半乳糖胺肝損傷引起的血清ALT、AST升高具有明顯的抑制作用。

(4)對于CCl₄所致的慢性肝損傷，金釵石斛生物總堿施用后，降低了血清中ALT、AST活性，對肝細胞壞死，變性及炎性細胞浸潤程度均有明顯的減輕作用。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的DNLA對小鼠肝組織形態(tài)學變化的影響圖(HE 200×)；

圖2是DNLA對小鼠肝組織中Nrf2表達的影響圖()；

圖3是DNLA對小鼠肝組織中Nqo1表達的影響圖()；

圖4是DNLA對小鼠肝組織中Ho-1mRNA表達的影響圖()；

圖中附圖標記的含義：圖1：A-空白組，B-模型組，C-DNLA低劑量組(DNLA-L)，D-DNLA高劑量組(DNLA-H)；圖2～圖4：與空白組比較，#P＜0.05；與模型組比較：*P＜0.05。

具體實施方式

以下結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的介紹。

實施例1

金釵石斛生物總堿在制備預防或治療急、慢性肝損傷疾病藥物中的應用。藥物是以金釵石斛生物總堿作為活性成分，加入藥用載體或賦形劑制成的片劑。片劑通過以下步驟制備：采用濕法制粒壓片，按照重量份數(shù)計，將金釵石斛生物總堿干燥粉1份與淀粉3份混勻，加入質量分數(shù)為10％的淀粉漿制軟材，淀粉漿中含有質量分數(shù)為1％的枸櫞酸，使之輕握成團、輕壓即散，過16目篩制粒，將濕粒于40℃～60℃干燥，用16目篩整粒，并加入質量為制得顆粒質量5％的滑石粉混勻后，直接壓片即得。金釵石斛生物總堿是通過以下步驟制備：取金釵石斛藥材粉碎至粗粉，用質量為粗粉質量11倍量的95％乙醇常溫浸提3次，每次18天，合并浸提液后過濾，減壓回收乙醇，揮干至浸膏無醇味，隨后加入體積為浸膏體積4倍量的質量濃度為5％的鹽酸充分溶解，用石油醚萃取后，調節(jié)pH至10，再用二氯甲烷萃取，合并萃取液，減壓回收溶劑，即得。片劑的用法和用量為：灌胃給藥，以金釵石斛生物總堿計，低劑量10mg/kg，高劑量20mg/kg。

實施例2

金釵石斛生物總堿在制備預防或治療急、慢性肝損傷疾病藥物中的應用。藥物是以金釵石斛生物總堿作為活性成分，加入藥用載體或賦形劑制成的膠囊劑。膠囊劑通過以下步驟制備：將金釵石斛生物總堿干燥粉末和質量為干粉質量5倍的可溶性淀粉混勻，過100目篩后，手工填充至5號膠囊內即得。金釵石斛生物總堿是通過以下步驟制備：取金釵石斛藥材粉碎至粗粉，用質量為粗粉質量12倍量的95％乙醇常溫浸提3次，每次15天，合并浸提液后過濾，減壓回收乙醇，揮干至浸膏無醇味，隨后加入體積為浸膏體積5倍量的質量濃度為5％的鹽酸充分溶解，用石油醚萃取后，調節(jié)pH至9，再用二氯甲烷萃取，合并萃取液，減壓回收溶劑，即得。膠囊劑的用法和用量為：灌胃給藥，以金釵石斛生物總堿計，低劑量10mg/kg，高劑量20mg/kg。

實施例3

金釵石斛生物總堿在制備預防或治療急、慢性肝損傷疾病藥物中的應用。藥物是以金釵石斛生物總堿作為活性成分，加入藥用載體或賦形劑制成的顆粒劑。顆粒劑通過以下步驟制備：按照重量份數(shù)計，取金釵石斛生物總堿干燥粉1份、蔗糖粉3份和糊精1.25份混勻，加入60％乙醇制軟材，使之輕握成團、輕壓即散，過16目篩制粒，60℃-80℃干燥，用16目篩整粒，密封即得。其中，金釵石斛生物總堿是通過以下步驟制備：取金釵石斛藥材粉碎至粗粉，用用質量為粗粉質量10倍量的95％乙醇常溫浸提四次，每次20天，合并浸提液后過濾，減壓回收乙醇，揮干至浸膏無醇味，隨后加入體積為浸膏體積3倍量的質量濃度為5％的鹽酸充分溶解，用石油醚萃取后，調節(jié)pH至10，再用二氯甲烷萃取，合并萃取液，減壓回收溶劑，即得。顆粒劑的用法和用量為：灌胃給藥，以金釵石斛生物總堿計，低劑量10mg/kg，高劑量20mg/kg。

實施例4

金釵石斛生物總堿在制備預防或治療急、慢性肝損傷疾病藥物中的應用。藥物是以金釵石斛生物總堿作為活性成分，加入藥用載體或賦形劑制成的軟膠囊。其中，金釵石斛生物總堿是通過以下步驟制備：取金釵石斛莖粗粉，加質量為粗粉質量11倍量的90％乙醇浸泡16小時，煮沸提取2次，每次2.5小時，過濾，將濾液合并濃縮成浸膏，合并的濾液體積是浸膏體積的120倍；隨后用pH為3.5鹽酸水溶液溶解，過濾，濾液過陽離子交換樹脂，用去離子水洗脫雜質，再用酸性乙醇洗脫，洗脫液濃縮至無醇味，加堿中和，經(jīng)脫鹽處理，冷凍干燥，即得純度較高的金釵石斛生物總堿提取物。軟膠囊的用法和用量為：灌胃給藥，以金釵石斛生物總堿計，低劑量10mg/kg，高劑量20mg/kg。

實施例5

金釵石斛生物總堿在制備預防或治療急、慢性肝損傷疾病藥物中的應用。藥物是以金釵石斛生物總堿作為活性成分，加入藥用載體或賦形劑制成的滴丸劑。其中金釵石斛生物總堿是通過以下步驟制備：取金釵石斛莖粗粉，加質量為粗粉質量12倍量的90％乙醇浸泡13小時，煮沸提取4次，每次3小時，過濾，將濾液合并濃縮成浸膏，合并的濾液體積是浸膏體積的120倍；隨后用pH為3.5鹽酸水溶液溶解，過濾，濾液過陽離子交換樹脂，用去離子水洗脫雜質，再用酸性乙醇洗脫，洗脫液濃縮至無醇味，加堿中和，經(jīng)脫鹽處理，冷凍干燥，即得純度較高的金釵石斛生物總堿提取物。滴丸劑的用法和用量為：灌胃給藥，以金釵石斛生物總堿計，用量為10mg/kg～20mg/kg。

實施例6

金釵石斛生物總堿在制備預防或治療急、慢性肝損傷疾病藥物中的應用。藥物是以金釵石斛生物總堿作為活性成分，加入藥用載體或賦形劑制成的糖漿劑。其中，金釵石斛生物總堿是通過以下步驟制備：取金釵石斛莖粗粉，加質量為粗粉質量10倍量的90％乙醇浸泡12小時，煮沸提取3次，每次2小時，過濾，將濾液合并濃縮成浸膏，合并的濾液體積是浸膏體積的120倍；隨后用pH為3.5鹽酸水溶液溶解，過濾，濾液過陽離子交換樹脂，用去離子水洗脫雜質，再用酸性乙醇洗脫，洗脫液濃縮至無醇味，加堿中和，經(jīng)脫鹽處理，冷凍干燥，即得純度較高的金釵石斛生物總堿提取物。糖漿劑的用法和用量為：灌胃給藥，以金釵石斛生物總堿計，用量為10mg/kg～20mg/kg。

實施例1～6中藥物還可以為以金釵石斛生物總堿作為活性成分，加入藥用載體或賦形劑制成的舌下含片或注射劑。