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TMC/京尼平/pDNA納米載體及其制備方法和應(yīng)用與流程

文檔序號:11116868閱讀:1512來源:國知局
TMC/京尼平/pDNA納米載體及其制備方法和應(yīng)用與制造工藝

本發(fā)明涉及基因治療和抗體生產(chǎn)領(lǐng)域,尤其涉及TMC/京尼平/pDNA納米載體及其制備方法和應(yīng)用。



背景技術(shù):

隨著社會經(jīng)濟(jì)的繁榮與進(jìn)步,健康問題越來越受到人們的重視。在致命的10大疾病中,排名前幾的心臟病、惡性腫瘤、腦血管病變、糖尿病嚴(yán)重影響人們的生活,而且這些疾病還呈增長趨勢,死亡率也越來越高,趨向于年輕化,這些疾病常常會引起很多并發(fā)癥?;蛑委熃o人們帶來了曙光,從1990年至今,實(shí)現(xiàn)了在生物醫(yī)藥領(lǐng)域和臨床上基因治療對人類疾病進(jìn)行基因干預(yù)治療,在治療疾病的潛力得到了認(rèn)可,比傳統(tǒng)治療疾病的方法有很多不可比擬的優(yōu)點(diǎn)?;蛑委熞呀?jīng)成為當(dāng)代生命科學(xué)領(lǐng)域最具前景性的研究方向。2003年基因組計(jì)劃的成功,推動了基因治療的進(jìn)步。基因治療旨在改變基因水平,有DNA和mRNA兩個水平。2009年美國就有354項(xiàng)關(guān)于基因治療的計(jì)劃在試行,遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了2008年的全球的116項(xiàng)。英國在2014年推出了“十萬基因組計(jì)劃”擬通過對基因組進(jìn)行測序,有效確定引發(fā)癌癥及其他疾病的基因。

抗體也是生物科學(xué)領(lǐng)域的主力軍,最普遍的用法是通過Western blot去揭示細(xì)胞中特定蛋白的表達(dá)量的多少,抗體另一方面還被用于熒光染色和免疫組化。根據(jù)2015年Biocompare發(fā)表的一份報告,在科研上用于抗體的生產(chǎn)的市場規(guī)模很龐大,并且仍在增長,抗體的種類也越來越多,但是抗體的質(zhì)量得不到保證,在抗體的購買方面損失了很多的資金,只科研用于抗體市場規(guī)模就達(dá)到25億美金,每年因購買質(zhì)量差的抗體導(dǎo)致的損失達(dá)到8億美金。2015年9月Uhlén和美國實(shí)驗(yàn)生物學(xué)學(xué)會聯(lián)合會分別舉辦了關(guān)于抗體迫在眉睫的問題的解決的會議,解決方案之一就是抗體的效果的評價。同一種抗體在幾次試驗(yàn)下表現(xiàn)出的性質(zhì)不同,會產(chǎn)生不可預(yù)料的結(jié)果。斯坦福大學(xué)反向DNA疫苗開創(chuàng)一型糖尿病新療法,這種疫苗是以基因工程技術(shù)為基礎(chǔ)的反向DNA疫苗,通過靶向抑制異常表達(dá)的T細(xì)胞保護(hù)胰島B細(xì)胞不受傷害,來治療糖尿病。2015年4月,科學(xué)家證明了納米涂層細(xì)菌能有效轉(zhuǎn)運(yùn)口服DNA疫苗,這種疫苗可以刺激人體的免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用治療疾病,主要目的是有效增加口服疫苗生物利用度,尋找一個有效的載體物質(zhì)。一些常見的方法如基因槍法、電穿孔法、顯微注射等方法,但這些方法目前的缺點(diǎn)是無法確?;蜻M(jìn)入體內(nèi)不被降解、無靶向性、會產(chǎn)生機(jī)體的免疫反應(yīng),目前陽離子聚合物載體作為非病毒型載體已經(jīng)受到了人們的重視,將潛在的病毒型載體的安全性隱患排除。這種陽離子載體既可應(yīng)用于基因治療又可簡化疫苗的生產(chǎn)以及DNA疫苗的不成熟性,可保護(hù)DNA進(jìn)入體內(nèi)不被DNA水解酶水解。常見的陽離子聚合物基因載體毒性低、轉(zhuǎn)染效率高、具有靶向性且在細(xì)胞內(nèi)無明顯免疫反應(yīng)。因此合成以陽離子聚合物為基礎(chǔ)的DNA納米載體載體很有意義和應(yīng)用前景。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足,本發(fā)明提供一種TMC/京尼平/pDNA納米載體及其制備方法。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下:

一種TMC/京尼平/pDNA納米載體,包括包裹pDNA的TMC/京尼平納米球;所述的TMC/京尼平/pDNA納米載體粒徑在100nm-500nm。

本發(fā)明還提供一種制備上述的TMC/京尼平/pDNA納米載體的方法,通過單體殼聚糖合成三甲基殼聚糖,通過交聯(lián)劑京尼平,先形成納米球,再將DNA載入納米球中。

步驟如下:

(一)制備碘化三甲基殼聚糖

(1)分別稱取研碎的脫乙酰度DD=80%-95%的殼聚糖、2.3倍殼聚糖摩爾量的NaI、 2.3倍殼聚糖摩爾量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%NaOH溶液、10倍殼聚糖摩爾量的CH3I溶解在1-甲基-2-吡咯烷酮中,得到混合溶液;將混合溶液在40-60℃條件下水浴1h,然后將混合溶液離心進(jìn)行分離,通過乙醚對沉淀洗滌2次、過濾除去乙醚后再將沉淀溶解在1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中后在40-60℃條件下水浴1h;

(2)再次稱取與上步等量的NaI、NaOH溶液、CH3I依次加入上步1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中,在40-60℃條件下水浴0.5h后再加入與NaI等摩爾量的CH3I和0.5倍NaI摩爾量的NaOH繼續(xù)攪拌1h,得到碘化三甲基殼聚糖產(chǎn)品;

(二)制備去碘化的三甲基殼聚糖

將上步所得碘化三甲基殼聚糖產(chǎn)品溶解在10%的NaCl溶液中,進(jìn)行脫碘化,然后用乙醇沉淀,收集沉淀,對沉淀用乙醚與乙醇交替洗滌后離心,真空干燥得到白色粉末,即去碘化的三甲基殼聚糖產(chǎn)品;

(三)TMC/京尼平納米球的制備

稱取上述制備的三甲基殼聚糖溶解在體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸溶液中,室溫下逐滴加入與三甲基殼聚糖摩爾比1:1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的京尼平溶液,邊滴邊攪拌,反應(yīng)中顏色變化后再持續(xù)攪拌進(jìn)行6h,即制得TMC/京尼平納米球;

(四)TMC/京尼平/pDNA納米載體納米球的制備

(1)將上步所得TMC/京尼平納米球通過0.22μm濾膜進(jìn)行滅菌操作,放入無菌操作臺備用。

(2)將(1)中的TMC/京尼平溶液取1mL加入離心管1中,另取藥用量的pDNA加入離心管2中,加入無菌水稀釋至2μg/mL;向離心管1中分批加入稀釋后的pDNA后渦旋30s,再將離心管1放入孵育器中,37℃孵育1h,即得到TMC/京尼平/pDNA納米載體納米球。

作為優(yōu)選項(xiàng):所述步驟(二)中水浴過程中通過使用醇沉法加入5倍體積的乙醇溶液進(jìn)行沉淀,除去溶解在乙醇中多余的 CH3I,離心得到去碘化三甲基殼聚糖。

本發(fā)明中TMC/京尼平納米球作為陽離子聚合物納米粒,可以通過靜電作用與pDNA結(jié)合,起到保護(hù)pDNA的作用,可以與不同濃度的pDNA結(jié)合,形成的納米球粒徑和電位均有所不同;粒徑和帶電荷的不同使納米粒子進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)進(jìn)行基因治療和對抗體生產(chǎn)的影響不同;陽離子聚合物載體的分散性好,尺寸可控,穩(wěn)定性好,與pDNA凝集很穩(wěn)定,整體帶正電荷,第三種電荷反轉(zhuǎn)復(fù)合物可以在不同pH條件下進(jìn)行電荷反轉(zhuǎn),更加有利于載體進(jìn)入細(xì)胞。

本發(fā)明還提供TMC/京尼平/pDNA納米載體在基因治療和抗體生產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用。

本發(fā)明的DNA納米載體,可以與不同濃度的可以表達(dá)綠色熒光蛋白的pDNA進(jìn)行結(jié)合,從而可以對各個環(huán)節(jié)進(jìn)行綜合評價,更好的用于生物檢測。

殼聚糖衍生物分別是天然的非病毒型載體和合成型的非病毒型載體,主要表現(xiàn)在其安全性可降解性、生物相容性、釋藥可控性、轉(zhuǎn)染效率高。在一定程度上保證DNA納米載體整體帶正電荷,采用復(fù)凝集法制備陽離子聚合物的DNA納米載體。在特定pH條件下,在水中分散性很好,粒徑分布均勻。

TMC(三甲基殼聚糖)/京尼平/pDNA納米載體分別以天然陽離子聚合物和合成陽離子聚合物對于DNA的結(jié)合程度,毒性大小以及粒徑分布產(chǎn)生影響。

綜上所述,本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果為:

1、本發(fā)明制備方法工藝簡單,成本低;

2、本發(fā)明制備的納米顆粒穩(wěn)定性好,并且在水中分散性好,粒徑可控;

3、本發(fā)明制備的pDNA納米載體比在PBS和油相中尺寸和帶電荷量影響更小;

4、本發(fā)明制備的納米顆粒比兩單體的物質(zhì)穩(wěn)定性更好,更能改變整個物質(zhì)的電荷分布,更加適合基因治療和抗體生產(chǎn)的應(yīng)用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明中三甲基殼聚糖的制備過程示意圖;

圖2為本發(fā)明制備的載體進(jìn)入細(xì)胞示意圖。

具體實(shí)施方式

制備TMC(三甲基殼聚糖)/京尼平/pDNA納米載體,包括如下實(shí)驗(yàn)步驟:

(1)制備TMC(三甲基殼聚糖)

①稱取一定量研碎的殼聚糖(DD=80%-95%),NaI固體, NaOH溶液、CH3I溶液加入含有1-甲基-2-吡咯烷酮的燒瓶中40-60℃水浴1h.通過乙醇溶液將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行沉淀,通過離心進(jìn)行分離。上述所得產(chǎn)品通過乙醚洗滌2次過濾除去乙醇。

②將①中的產(chǎn)物溶解在1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中40-60℃水浴,量取一定量的NaI固體, NaOH溶液、CH3I加入含有1-甲基-2-吡咯烷酮溶液的燒瓶中,40-60℃水浴0.5h.再加入CH3I和NaOH固體繼續(xù)攪拌1h.

③碘化三甲基殼聚糖去碘化 將上述制備的產(chǎn)品溶解在10%的NaCl溶液中,代替鹽酸,進(jìn)行脫碘化。用乙醇沉淀此聚合物,用乙醚與乙醇交替洗滌并離心,通過真空干燥得到白色粉末。

(2)制備TMC(三甲基殼聚糖)/京尼平納米球

稱取一定量上述制備的三甲基殼聚糖溶解在體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸溶液中,室溫下按照一定配比混合逐滴加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的京尼平溶液,邊滴邊攪拌,反應(yīng)進(jìn)行15min后顏色變化,反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行6h.制得TMC(三甲基殼聚糖)/京尼平納米球。

(3)制備TMC(三甲基殼聚糖)/京尼平/pDNA納米載體

將制得的TMC(三甲基殼聚糖)/京尼平納米球使用0.45μm的濾膜進(jìn)行處理,pDNA(0.1mg/mL)分批加入到殼聚糖納米球溶液中,分別渦旋30s后,將離心管放入孵育器中37℃進(jìn)行培養(yǎng)1h.既可制得TMC(三甲基殼聚糖)/京尼平/pDNA納米載體。

以下實(shí)施例描述了本發(fā)明的特殊實(shí)施例子,以便對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明,這些實(shí)施例只是說明而不表示本發(fā)明所有的可能性,本發(fā)明并不僅僅局限于這些實(shí)施例中提到的材料、反應(yīng)條件或參數(shù),任何在相關(guān)領(lǐng)域具備經(jīng)驗(yàn)的人,都可以按照本專利的原理,利用其他類似材料或反應(yīng)條件實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所描述的DNA納米載體的制備,這些不脫離本發(fā)明描述的基本概念。因此,這些修改或不同的應(yīng)都在本發(fā)明的覆蓋范圍內(nèi)。

實(shí)施例1

1、制備碘化三甲基殼聚糖

稱取2g研碎的殼聚糖(DD=80%-95%),4.8gNaI,11ml15%NaOH溶液、11.5mlCH3I溶解在80ml1-甲基-2-吡咯烷酮中60℃水浴1h.反應(yīng)過程中需要冷凝CH3I通過乙醇溶液將進(jìn)行沉淀,通過離心進(jìn)行分離。上述所得產(chǎn)品通過乙醚洗滌2次過濾除去乙醇。

2、將1中的產(chǎn)品溶解在80ml1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中60℃水浴,移除吸附在碘化三甲基殼聚糖多余的乙醚。量取4.8gNaI,11ml15%NaOH溶液、7mlCH3I依次加入80ml1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中,60℃水浴0.5h.再加入2mlCH3I和0.6gNaOH繼續(xù)攪拌1h.

3、 制備去碘化的三甲基殼聚糖

將2中制備的將上步所得碘化三甲基殼聚糖產(chǎn)品溶解在10%的NaCl溶液中,進(jìn)行脫碘化,然后用乙醇沉淀,收集沉淀,對沉淀用乙醚與乙醇交替洗滌后離心,真空干燥得到白色粉末,即去碘化的三甲基殼聚糖產(chǎn)品;

所述乙醇沉淀的具體操作為使用醇沉法加入5倍體積的乙醇溶液進(jìn)行沉淀,除去溶解在乙醇中多余的 CH3I,離心得到去碘化三甲基殼聚糖。

4 、TMC/京尼平納米球的制備

稱取10mg上述制備的三甲基殼聚糖溶解在10ml體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸溶液中,室溫下逐滴加入2ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的京尼平溶液,邊滴邊攪拌,反應(yīng)進(jìn)行15min后顏色變化,反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行6h.制得TMC(三甲基殼聚糖)/京尼平納米球。

5、 TMC(三甲基殼聚糖)/京尼平/pDNA納米載體納米球的制備

(1)、將4中的TMC/京尼平納米球通過0.22μm濾膜進(jìn)行滅菌操作,放入無菌操作臺備用。

(2)、將(1)中的TMC/京尼平溶液取1ml加入離心管1中,取10μlpDNA(3kb)加入2ml離心管2中,加入無菌水稀釋至100μl,分批加入稀釋后的pDNA,渦旋30s混合溶液,將離心管1放入孵育器中,37℃孵育1h,即得。

實(shí)施例2

1、制備碘化三甲基殼聚糖

稱取2g研碎的殼聚糖(DD=80%-95%),4.8gNaI,11ml15%NaOH溶液、11.5mlCH3I溶解在80ml1-甲基-2-吡咯烷酮中40℃水浴1h.反應(yīng)過程中需要冷凝CH3I通過乙醇溶液將進(jìn)行沉淀,通過離心進(jìn)行分離。上述所得產(chǎn)品通過乙醚洗滌2次過濾除去乙醇。

2、將1中的產(chǎn)品溶解在80ml1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中40℃水浴,移除吸附在碘化三甲基殼聚糖多余的乙醚。量取4.8gNaI,11ml15%NaOH溶液、7mlCH3I依次加入80ml1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中,40℃水浴0.5h.再加入2mlCH3I和0.6gNaOH繼續(xù)攪拌1h。

3 、制備去碘化的三甲基殼聚糖

將2中制備的將上步所得碘化三甲基殼聚糖產(chǎn)品溶解在10%的NaCl溶液中,進(jìn)行脫碘化,然后用乙醇沉淀,收集沉淀,對沉淀用乙醚與乙醇交替洗滌后離心,真空干燥得到白色粉末,即去碘化的三甲基殼聚糖產(chǎn)品;

所述乙醇沉淀的具體操作為使用醇沉法加入5倍體積的乙醇溶液進(jìn)行沉淀,除去溶解在乙醇中多余的 CH3I,離心得到去碘化三甲基殼聚糖。

4、 TMC/京尼平納米球的制備

稱取10mg上述制備的三甲基殼聚糖溶解在10ml體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸溶液中,室溫下逐滴加入2ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的京尼平溶液,邊滴邊攪拌,反應(yīng)進(jìn)行15min后顏色變化,反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行1h,制得TMC(三甲基殼聚糖)/京尼平納米球。

5、TMC(三甲基殼聚糖)/京尼平/pDNA納米載體納米球的制備

(1)、 將4中的TMC/京尼平納米球通過0.22μm濾膜進(jìn)行滅菌操作,放入無菌操作臺備用;

(2)、 將(1)中的TMC/京尼平溶液取1ml加入離心管1中,取10μlpDNA(5kb)加入2ml離心管2中,加入無菌水稀釋至2ug/ml,分批加入稀釋后的pDNA,渦旋30s混合溶液,將離心管1放入孵育器中,37℃孵育1h,即得。

實(shí)施例3

1、制備碘化三甲基殼聚糖

稱取1g研碎的殼聚糖(DD=80%-95%),2.4gNaI,5.5ml15%NaOH溶液、5.75mlCH3I溶解在40ml1-甲基-2-吡咯烷酮中60℃水浴1h.反應(yīng)過程中需要冷凝CH3I通過乙醇溶液將進(jìn)行沉淀,通過離心進(jìn)行分離。上述所得產(chǎn)品通過乙醚洗滌2次過濾除去乙醇。

2、將1中的產(chǎn)品溶解在80ml1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中60℃水浴,移除吸附在碘化三甲基殼聚糖多余的乙醚。量取2.4gNaI,5.5ml15%NaOH溶液、3.5mlCH3I依次加入40ml1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中,60℃水浴0.5h.再加入1mlCH3I和0.3gNaOH繼續(xù)攪拌1h;

3、 制備去碘化的三甲基殼聚糖

將2中制備的將上步所得碘化三甲基殼聚糖產(chǎn)品溶解在10%的NaCl溶液中,進(jìn)行脫碘化,然后用乙醇沉淀,收集沉淀,對沉淀用乙醚與乙醇交替洗滌后離心,真空干燥得到白色粉末,即去碘化的三甲基殼聚糖產(chǎn)品;

所述乙醇沉淀的具體操作為使用醇沉法加入5倍體積的乙醇溶液進(jìn)行沉淀,除去溶解在乙醇中多余的 CH3I,離心得到去碘化三甲基殼聚糖。

4 、TMC/京尼平納米球的制備

稱取5mg上述制備的三甲基殼聚糖溶解在5ml體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸溶液中,室溫下逐滴加入1ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的京尼平溶液,邊滴邊攪拌,反應(yīng)進(jìn)行15min后顏色變化,反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行6h,制得TMC(三甲基殼聚糖)/京尼平納米球。

5、 TMC(三甲基殼聚糖)/京尼平/pDNA納米載體納米球的制備

(1)、 將4中的TMC/京尼平納米球通過0.22μm濾膜過濾后進(jìn)行滅菌操作,放入無菌操作臺備用。

(2)、將(1)中的TMC/京尼平溶液取1ml加入離心管1中,取8μlpDNA(3kb)加入2ml離心管2中,加入無菌水稀釋至100μl,分批加入稀釋后的pDNA,渦旋30s混合溶液,將離心管1放入孵育器中,37℃孵育1h,即得。

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