本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?01280034022.9、申請(qǐng)日為2012年5月3日、發(fā)明名稱為“由人巨細(xì)胞病毒感染的細(xì)胞制造致密體(db)”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
本發(fā)明涉及致密體(db)的制造和含有db的藥學(xué)組合物。
背景技術(shù)：
還被稱為人類皰疹病毒5的人巨細(xì)胞病毒(hcmv)為一種覆膜的雙股dna病毒，其屬于皰疹病毒。hcmv對(duì)于健康的成人是通常無害的。然而在妊娠中該病毒是特別危險(xiǎn)的，并且可以對(duì)未出生的胎兒甚至是危及生命的。對(duì)于具有虛弱的免疫系統(tǒng)的人，也可能由被hcmv感染發(fā)展成嚴(yán)重的疾病。因此，特別有危險(xiǎn)的是艾滋病患者、移植受者、干細(xì)胞移植后的白血病患者、以細(xì)胞抑制劑治療的患者等等。
對(duì)于具有虛弱的免疫系統(tǒng)的患者，在hcmv感染時(shí)使用病毒抑制劑，例如更昔洛韋、膦甲酸、西多福韋、并且也可能是阿昔洛韋。
此外，從多年前起已經(jīng)致力于抗hcmv的痘苗或疫苗的發(fā)展。因此例如嘗試了，以削弱的或減毒的活痘苗引發(fā)所期望的免疫力。然而由此僅僅可以獲得有限的保護(hù)。
另外的方式在于，借助于所謂的致密體(db)實(shí)現(xiàn)接種疫苗。在這種情況下涉及由hcmv派生出的、在電子顯微鏡中可見的結(jié)構(gòu)。db為在其被膜中膜圍繞的亞病毒顆粒，被膜由細(xì)胞脂質(zhì)膜派生而出、嵌入病毒糖蛋白。這些病毒蛋白很有可能以天然的構(gòu)象存在于病毒脂質(zhì)膜中。類似于病毒顆粒，db在被感染的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中形成并且最終由細(xì)胞排出。db的90％db蛋白質(zhì)量由病毒編碼為所謂的pp65(ul83)蛋白組成。此外在db中，還可以探測到病毒蛋白pp150(ul32)、gh(ul75)、gm(ul100)以及gb(ul55)。因?yàn)閐b不含有病毒dna和病毒殼體，所以其是非感染性的。
在現(xiàn)有技術(shù)中描述了，db由于其高度近似于hcmv抗原特性的抗原特性，適合作為抗hcmv感染或在hcmv感染時(shí)作用的痘苗。這種痘苗被證明是特別有效的。因?yàn)閐b是非感染性的，所以風(fēng)險(xiǎn)方面和副作用與活痘苗的情況相比明顯較少受批評(píng)的。因此，含有db的、名稱為“vmp2001”的痘苗已經(jīng)存在于臨床試驗(yàn)中。以db接種疫苗的原則和優(yōu)點(diǎn)例如在wo00/5372中進(jìn)行了描述。
由于db在hcmv的正常侵染循環(huán)中：i)僅以微小的量形成并且因此僅以有限的量提供；并且ii)db制劑可能在一定情況下被感染性的hcmv污染，存在對(duì)以下方法的需求，即，通過該方法db的形成可以有針對(duì)性地提高并且防止通過感染性的hcmv而污染。
reefschlaeger等(2001,journalofantimicrobialchemotherapy(抗菌化學(xué)療法雜志)48,757-767)和buerger等(2001,journalofvirology(病毒學(xué)雜志)75,9077-9086)描述了一種名稱為bay38-4766的物質(zhì)，其應(yīng)當(dāng)提升所形成的db的量。
hwang等(2007,journalofvirology81,11604-11611)和hwang等(2009,antimicrobialagentsandchemotherapy(抗微生物制劑與化學(xué)療法)53,5095-5101)描述了苯并咪唑基-d核糖核苷，其同樣能夠適用于所形成的db的量的提升。
然而，迄今所描述的用于db形成優(yōu)化的所謂適用的物質(zhì)都沒有在實(shí)踐中得以證明。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
在這個(gè)背景下，本發(fā)明的任務(wù)在于：提供另外的物質(zhì)，該物質(zhì)作為在生產(chǎn)db時(shí)的添加物i)防止db制劑被感染性的hcmv污染；ii)在db生產(chǎn)的范疇下提升db的產(chǎn)率。
這個(gè)任務(wù)通過如下物質(zhì)的用途解決，該物質(zhì)選自以下物質(zhì)：
本發(fā)明的另外的任務(wù)在于，提供一種用于制造db的新穎的方法。
這個(gè)另外的任務(wù)通過具有以下步驟的方法解決(1)提供在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中的被人巨細(xì)胞病毒(hcmv)感染的生物細(xì)胞，以及(2)以選自以上所列出的物質(zhì)(a)到(d)的物質(zhì)培養(yǎng)受感染的生物細(xì)胞。
發(fā)明人認(rèn)識(shí)到，以上的鑒定證明的物質(zhì)極其良好地適應(yīng)于制造db?？梢蕴貏e地注意到的是：被hcmv感染的生物細(xì)胞，例如原代成纖維細(xì)胞，在存在這些化合物的情況下在細(xì)胞質(zhì)中富集高濃度的db并且釋放到介質(zhì)中。在此，作為特別的優(yōu)點(diǎn)表明的是，物質(zhì)(a)到(d)防止完好的病毒顆粒在細(xì)胞核中組合，并且因此導(dǎo)致，沒有感染性的hcmv由已感染的細(xì)胞中排出。因此可以容易地由介質(zhì)或已感染的細(xì)胞的裂解液分離db，而無需擔(dān)心被感染性的病毒顆粒污染。
根據(jù)本發(fā)明，這些允許hcmv的生物細(xì)胞是適用于使用在該方法中的。
根據(jù)本發(fā)明對(duì)于“適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)”理解為常見的細(xì)胞培養(yǎng)基。在此優(yōu)選涉及根據(jù)各個(gè)使用的細(xì)胞種類所用的介質(zhì)。適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)例如為：伊格爾(氏)最低限度必需介質(zhì)(emem)+10％胎牛血清(fcs)+2mml-谷氨酰胺+1％青霉素/鏈霉素(pen/strep；青霉素g鈉10000μg/ml；0.85％硫酸鏈霉素)；emem+10％fcs+2mml-谷氨酰胺+1mm丙酮酸鈉(nap)+1％非必需氨基酸+1％pen/strep或者帶有100μg/ml慶大霉素的rpmi1640；5u/ml肝素；50μg/ml血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子；15％人血清(對(duì)于hcmv呈血清陰性)和12μg/ml西普樂(cibrobay)，等等。
在此，根據(jù)本發(fā)明當(dāng)生物細(xì)胞為原代細(xì)胞時(shí)是優(yōu)選的，其優(yōu)選地選自由以下所構(gòu)成的組：人內(nèi)皮細(xì)胞、人成纖維細(xì)胞、人樹突狀細(xì)胞、人上皮細(xì)胞和人巨噬細(xì)胞。
這種措施具有以下優(yōu)點(diǎn)，即，使用這些允許hcmv并且因此特別適用于制造db的細(xì)胞。
此外，當(dāng)利用物質(zhì)在濃度約1nmol/l到約100μmol/l的介質(zhì)中進(jìn)行培養(yǎng)生物細(xì)胞時(shí)，是優(yōu)選的。
這種措施具有以下優(yōu)點(diǎn)，即，選擇這些根據(jù)發(fā)明人的認(rèn)識(shí)導(dǎo)致特別良好的結(jié)果的濃度范圍。確切的濃度依賴于所使用的生物細(xì)胞以及感染用的hcmv株(stamm)。濃度可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過簡單的滴定列沒有困難地在單個(gè)情況下測定。因此，發(fā)明人可以通過物質(zhì)(a)和以hcmv株ad169感染的人包皮成纖維細(xì)胞(hff)在濃度為50nmol/l的情況下獲得最優(yōu)的結(jié)果。在同樣的方式下對(duì)于物質(zhì)(b)、(c)和(d)，5nmol/l、500nmol/l以及500nmol/l的濃度導(dǎo)致最優(yōu)的結(jié)果。在通過出自人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)(以hcmv株tb40/e感染)培養(yǎng)的情況下，對(duì)于物質(zhì)(a)、(b)、(c)和(d)，300nmol/l、300nmol/l、3μmol/l以及30μmol/l的濃度導(dǎo)致最優(yōu)的結(jié)果。在使用被hcmv的臨床分離物感染的hff的情況下(在共培養(yǎng)中帶有未感染的hff)，300nmol/l、300nmol/l、3μmol/l以及30μmol/l的濃度同樣導(dǎo)致良好的結(jié)果。
此外，當(dāng)培養(yǎng)進(jìn)行1天到14天的持續(xù)時(shí)間時(shí)是優(yōu)選的，優(yōu)選為3至10天，最優(yōu)選的為5天。
這種措施具有以下優(yōu)點(diǎn)，即，在培養(yǎng)時(shí)在所給出的時(shí)間范圍內(nèi)得到足夠高的db量。
此外根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)在以所述物質(zhì)培養(yǎng)生物細(xì)胞之后進(jìn)行db的分離時(shí)，是優(yōu)選的。
這種措施具有以下優(yōu)點(diǎn)，即，db可以以能夠直接再處理的形式(例如疫苗配方)提供。db的分離根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行。例如離心無細(xì)胞的介質(zhì)并在此沉淀db。然后db可以容易地由上清液分出。
在這種背景下，本發(fā)明還涉及一種用來制造優(yōu)選為疫苗的藥學(xué)組合物的方法，其具有以下步驟：(1)制造致密體(db)；(2)提供(bereitstellen)在步驟(1)中制造的db；以及(3)把在步驟(2)中提供的db配制到藥學(xué)上可接受的載體中，其中，在步驟(1)中的制造以根據(jù)之前所描述的、根據(jù)本發(fā)明的方法實(shí)現(xiàn)。
藥學(xué)上可接受的載體在現(xiàn)有技術(shù)中一般公知，這些載體例如包括：結(jié)合劑、崩解劑、填充劑、潤滑劑以及粉末、鹽和其他適用于藥品配方的物質(zhì)；可參見rowee.等的handbookofpharmaceuticalexcipients,5thedition,pharmaceuticalpress(藥用輔料手冊(cè)，第5版，醫(yī)藥出版社)，2006；或者bauer等的lehrbuchderpharmazeutischentechnology,6.auflage,wissenschaftlicheverlagsgesellschaftstuttgartmbh(制藥技術(shù)教科書，第6版，斯圖加特科學(xué)出版有限責(zé)任公司),1999。以上公開出版物的內(nèi)容引用成為本申請(qǐng)的組成部分。
此外在制造疫苗時(shí)，可以設(shè)置引起免疫反應(yīng)增強(qiáng)的佐劑。佐劑可以為油-水混合物、脂多糖、氫氧化鋁等等。在現(xiàn)有技術(shù)中全面的描述了佐劑。
在這種背景下，本發(fā)明還涉及一種優(yōu)選為疫苗的藥學(xué)組合物，其根據(jù)以上所描述的方法制造。
關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的用來制造db的用途和根據(jù)本發(fā)明的用來制造db的方法所描述的特征、性質(zhì)和優(yōu)點(diǎn)，同樣適用于根據(jù)本發(fā)明的制造藥學(xué)組合物的方法以及適用于根據(jù)本發(fā)明的藥學(xué)組合物。
附圖說明
接著描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，優(yōu)選實(shí)施例是純?yōu)榻忉屝缘牟⑶也粚?duì)本發(fā)明的范圍產(chǎn)生限制。在此，參照附圖：
圖1示出了以物質(zhì)(a)、(b)、(c)和(d)培養(yǎng)的、并且在之前以hcmv感染的細(xì)胞的電子顯微鏡拍照，該細(xì)胞與未經(jīng)處理的細(xì)胞(e)相比較在其細(xì)胞質(zhì)中富集較大量的db(箭頭)。
具體實(shí)施方式
1.根據(jù)本發(fā)明的物質(zhì)(a)到(d)
在wo2004/096778的72頁和73頁上的實(shí)施例14和15中詳盡描述了物質(zhì)a的合成，物質(zhì)a為(4s)-{8-氟-2-[4-(3-甲氧基苯基)-1-哌嗪基]-3-[2-甲氧基-5-(三氟甲基)苯基]-3,4-二氫-4-喹唑啉基}乙酸。
在wo2006/089664的39頁和40頁上的實(shí)施例2中詳盡描述了物質(zhì)b的合成，物質(zhì)b為n-{1-甲基-2-[(4-(5-甲基-吡啶-2-基)-哌嗪-1-基)羰基]-1h-咪唑-4-基}-n'-[4-(三氟甲氧基)苯基]脲。
在wo2007/090579的96頁和97頁上的實(shí)施例47中詳盡描述了物質(zhì)c的合成，物質(zhì)c為1-[6-氟-8-甲氧基-3-({[2-甲基-4-(三氟甲氧基)芐基]氨基}羰基)-4-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,4-二氫喹啉-7-基]哌啶-4-羧酸。
在wo2007/101573的49頁上的實(shí)施例1中詳盡描述了物質(zhì)d的合成，物質(zhì)d為n-{3-[({4-[5-(6-氨基吡啶-2-基)-1,2,4-惡二唑-3-基]苯基}磺?；?氨基]-5-氟苯基}-1-氰基環(huán)丙烷甲酰胺。
上述文獻(xiàn)wo2004/096778、wo2006/089664、wo2007/090579和wo2007/101573的內(nèi)容，特別是涉及到的鑒定證明性的合成描述，引用成為本公開的組成部分。
2.制造致密體(db)
2.1在以hcmv株ad169感染的成纖維細(xì)胞中的制造
人包皮成纖維細(xì)胞(“humanforeskinfibroblasts；hff”)在感染前一天以1×106細(xì)胞每瓶的量加入到5個(gè)t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。提供hcmv株ad169作為冷凍的、不含細(xì)胞的病毒制劑，其從在晚期感染階段的細(xì)胞提取。根據(jù)本發(fā)明的物質(zhì)(a)、(b)、(c)和(d)作為各50mmol/l的在dmso中的原液提供。
原液以1:1000稀釋到50μmol/l的最終濃度。溶液如下地進(jìn)一步稀釋：a:1:1000(50nmol/l)在12mlmem中為12μml；
b:1:10000(5nmol/l)在12mlmem中為1.2μml；
c:1:100(500nmol/l)在12mlmem中為120μml；
d:1:100(500nmol/l)在12mlmem中為120μml。
hff細(xì)胞通過病毒制劑在m.o.i.(multiplicityofinfection；感染復(fù)數(shù))為：≥≥1個(gè)tcid50(50％組織培養(yǎng)感染劑量)/細(xì)胞的(1:20稀釋)的條件下感染一個(gè)小時(shí)。接著病毒拋棄病毒上清液并且以在以下濃度下的根據(jù)本發(fā)明的物質(zhì)培養(yǎng)受感染的細(xì)胞：
a:50nmol/l；
b:5nmol/l；
c:500nmol/l；
d:500nmol/l。
細(xì)胞被培養(yǎng)5天，其中，在第一天和第四天之后更新含有該物質(zhì)的介質(zhì)。在培養(yǎng)后，用電子顯微方法對(duì)受感染的細(xì)胞進(jìn)行db形成的檢測。
結(jié)果在附圖1中示出。在此表明的是，所有以根據(jù)本發(fā)明的物質(zhì)(a)、(b)、(c)和(d)處理的細(xì)胞都富集了高濃度的db(箭頭)，而未處理的細(xì)胞(e)在其細(xì)胞質(zhì)中幾乎沒有富集db。db以箭頭標(biāo)識(shí)。此外，在處理過的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中沒有發(fā)現(xiàn)任何感染性病毒顆粒，而在未處理的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中檢測到了相當(dāng)大數(shù)量的相應(yīng)顆粒。
2.2在以hcmv株tb40/e感染的內(nèi)皮細(xì)胞中的制造
在另外的試驗(yàn)中出自人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)以由在晚期感染階段的細(xì)胞分離出hcmv株tb40/e感染。試驗(yàn)設(shè)計(jì)與在2.1下所示出的相應(yīng)，其中，以在以下濃度下的根據(jù)本發(fā)明的物質(zhì)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)：
a:300nmol/l；
b:300nmol/l；
c:3μmol/l；
d:30000μmol/l。
在電子顯微方法檢測中，在受感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中同樣表現(xiàn)出了強(qiáng)烈的db富集，該受感染的細(xì)胞以根據(jù)本發(fā)明的物質(zhì)(a)、(b)、(c)和(d)培養(yǎng)。在對(duì)照組(e)中僅可以確定少量的db。與在2.1中所描述的發(fā)現(xiàn)相似地，在經(jīng)處理的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中同樣沒有檢測到病毒。
2.3在以臨床hcmv分離物感染的人成纖維細(xì)胞中的制造，其中，感染的人成纖維細(xì)胞與沒有感染的人成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)
如以上在2.1所描述的那樣，hff以臨床hcmv分離物(其由晚期感染階段的細(xì)胞分離)感染。感染的hff與未感染的hff在迷你托盤(minitrays)中(2000細(xì)胞/凹槽)共培養(yǎng)。制造三種不同的感染細(xì)胞/未感染細(xì)胞的比例：未稀釋；1:2稀釋；1:4稀釋。根據(jù)本發(fā)明的物質(zhì)以以下濃度與細(xì)胞一起培養(yǎng)：
a:300nmol/l；
b:300nmol/l；
c:3μmol/l；
d:30μmol/l。
在37℃下培養(yǎng)5天之后，進(jìn)行電子顯微檢測。在此表明的是，在存在最高份額的感染細(xì)胞的組中，確切地說“未稀釋”的組中，在以根據(jù)本發(fā)明的物質(zhì)培養(yǎng)后的細(xì)胞在其細(xì)胞質(zhì)中積累非常大量的db。以未感染的細(xì)胞稀釋得越嚴(yán)重，那么在細(xì)胞質(zhì)中積累的db就越少。在沒有根據(jù)本發(fā)明的物質(zhì)的對(duì)照組中，僅能夠確定非常少的db。此外，通過加入根據(jù)本發(fā)明的物質(zhì)，還避免了感染性顆粒由細(xì)胞核中排出。
3.分離致密體
在現(xiàn)有技術(shù)中，例如pepperl等在(2000)journalofvirology(病毒學(xué)雜志)74,6132-6146中和irmiere,a.與w.gibson在(1993)virology(病毒學(xué))130,118-133中，詳盡地描述了分離。以上所述的公開出版物的內(nèi)容引用成為本申請(qǐng)的組成部分。
相應(yīng)地，顆粒按照以下描述從受感染細(xì)胞的培養(yǎng)基純化：受感染的細(xì)胞在感染后6天由細(xì)胞培養(yǎng)容器底部刮去并且再次懸浮到介質(zhì)中。懸浮液以低速離心，例如在1500g時(shí)在4°進(jìn)行10分鐘。所獲得的無細(xì)胞的介質(zhì)加入到酒石酸鉀-甘油梯度(在0.05ml三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(trishcl)、ph7.4、0.1mnacl(tn緩沖液中；talbot與almeda，1997))上，并且在40000rpm的情況下，在使用beckman轉(zhuǎn)子sw41和sorvall超速離心機(jī)otd-50下，在低加速度和在“raking(粗篩)”模式下在4°進(jìn)行15分鐘離心。含有db的帶在梯度中通過特有的散射光的特性而確定。該帶通過在使用32號(hào)規(guī)格針頭通過離心管壁的抽取而取出。在必要時(shí)，db可以通過再次的相應(yīng)的沉淀或者更長的、直至平衡的離心過程(確切的說為18小時(shí))，在使用相同的梯度/和離心條件的情況下進(jìn)一步純化。
4.結(jié)論
發(fā)明者可以證明，通過物質(zhì)(a)、(b)、(c)和(d)可以極其有效地制造高的db量，其例如在進(jìn)行分離和純化之后可以作為疫苗使用。特別有利的是，借助于以上所列出的物質(zhì)可以以高純度分離db。