本發(fā)明涉及瑞香烷型二萜藥物，特別涉及瑞香烷型二萜化合物pimelotide C的新用途，具體是瑞香烷型二萜化合物pimelotide C在制備抗乙型病毒性肝炎藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
據(jù)有關(guān)統(tǒng)計(jì)顯示，全世界大約有3億多人為慢性乙肝病毒(HBV)攜帶者，我國(guó)約占半數(shù)。乙肝病毒感染已成為全球性的影響人類健康的主要疾病之一，由于HBV感染可以導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化和原發(fā)性肝癌，因此成為影響人類壽命的九大疾病之一。由于慢性HBV感染者較非攜帶者發(fā)生肝癌的相對(duì)危險(xiǎn)率為217，因此在全世界每年大約有200萬(wàn)人死于乙肝引起的肝硬化和肝癌，而我國(guó)是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，每年約有25萬(wàn)人死于與乙肝相關(guān)的慢性肝病(肝硬化與肝癌)。上述疾病給人民健康和國(guó)民經(jīng)濟(jì)帶來(lái)巨大損失。因此，尋求高效低毒的抗HBV藥物已成為刻不容緩的問(wèn)題。
天然產(chǎn)物由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，從中尋找高效低毒、作用靶點(diǎn)新穎的先導(dǎo)化合物已經(jīng)成為新型抗HBV藥物研發(fā)的重要組成部分。據(jù)統(tǒng)計(jì)，通過(guò)體內(nèi)和體外活性篩選被證實(shí)具有潛在抗HBV活性的天然產(chǎn)物類型包括木脂素、萜類、生物堿、黃酮、香豆素、環(huán)肽等。黃芫花為瑞香科蕘花屬植物河朔蕘花(Wikstroemia chamaedaphne Meissn)的花蕾，花小，黃色，數(shù)朵排成頂生傘形聚傘花序，帶數(shù)個(gè)再集合成圓錐花序，花蕾粉末為黃綠色，主產(chǎn)于山西新絳。黃芫花性溫味辛，有小毒，在山西、甘肅等省用黃芫花入藥主治瀉下逐水，通便，用于水腫脹滿，痰飲積聚，咳逆喘滿，精神分裂癥，癲癇等。臨床研究表明，黃芫花葉子水提物有明顯鎮(zhèn)靜作用，河朔蕘花能使興奮性病人安靜，抑郁性病人情緒活躍，憂慮性病人有所緩解。我國(guó)傳統(tǒng)用藥中，河朔蕘花作為抗早孕藥物使用可使孕酮水平、血清絨毛膜促性腺激素水平降低，效果與前列腺素、米非司酮相當(dāng)。
瑞香烷型二萜主要存在于瑞香科和大戟科植物中，先前的研究表明該類化合物對(duì)HIV以病毒具有一定的抑制作用【瑞香烷型二萜原酸酯類化合物，其藥物組合物及其制備方法和應(yīng)用,專利號(hào)：CN201110234308.9；1-烷基化瑞香烷型二萜及其在制備抗艾滋病毒藥物中的用途，專利號(hào)：CN201410308774.0】；此外，這類化合物還顯示很好抑制腫瘤作用【芫花中新的瑞香烷型二萜類化合物及其制備方法和用途，專利號(hào)：CN200910010388.2】。
目前關(guān)于瑞香烷型二萜pimelotide C(見(jiàn)結(jié)構(gòu)式Ⅰ)的報(bào)道僅限2篇文獻(xiàn)，其中最開(kāi)始發(fā)現(xiàn)該化合物是2010年澳大利亞學(xué)者從瑞香科植物Pimelea elongata所獲得，且最初獲得為兩個(gè)化合物的混合物，其總收率0.34mg/100g，含量非常低，且分離程序復(fù)雜，也未報(bào)道任何藥理活性(Daphnane-and Tigliane-Type diterpenoid esters and orthoesters from Pimelea elongate,Journal of Natural Products,2010,73,1907-1913)。另外一篇文獻(xiàn)為我國(guó)沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)者也是從瑞香科植物Daphne genkwa分離得到，其收率為2.4mg/100g，含量一般，且分離程序也是非常復(fù)雜，他們對(duì)該化合物進(jìn)行腫瘤細(xì)胞HeLa、MCF-7、HepG2、HCT116、A549、A375-S2、HT1080、HL60、U937、K562活性篩選，該化合物顯示了一定的抑制腫瘤活性(Daphnane-type diterpenes with inhibitory activities against human cancer cell lines from Daphne genkwa，Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters，2013，23，2500–2504)。
但是迄今，現(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有關(guān)于瑞香烷型二萜化合物pimelotide C抗乙型肝炎活性的報(bào)道，也沒(méi)有它們及其藥物組合物在制備或治療乙型病毒性肝炎的藥物中的應(yīng)用的報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供瑞香烷型二萜化合物pimelotide C的新用途，即pimelotide C在制備抗乙型病毒性肝炎藥物中的應(yīng)用；提供瑞香烷型二萜pimelotide C藥物組合物；提供瑞香烷型二萜化合物pimelotide C的制備方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
瑞香烷型二萜化合物pimelotide C在制備抗乙型病毒性肝炎藥物中的應(yīng)用，所述瑞香烷型二萜化合物pimelotide C的結(jié)構(gòu)式為：
一種抗乙型肝炎病毒的藥物組合物，含有瑞香烷型二萜化合物pimelotide C。也可以將瑞香烷型二萜化合物pimelotide C本身作為抗乙型肝炎病毒的藥物直接使用。
一種抗乙型肝炎病毒的藥物組合物，含有0.1-99％，優(yōu)選為0.5-90％的瑞香烷型二萜化合物pimelotide C，其余為藥物學(xué)上可接受的、對(duì)人和動(dòng)物無(wú)毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
所述的藥用載體或賦形劑是一種或多種固體、半固體和液體稀釋劑、填料以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明的藥物可經(jīng)注射(靜注、肌注)和口服兩種形式給藥。
本發(fā)明提供的一種瑞香烷型二萜化合物pimelotide C的制備方法，取黃芫花，用95％乙醇回流提取兩次，每次3小時(shí)，合并乙醇提液，減壓回收至無(wú)醇，用加入相同體積的蒸餾水溶解，然后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取液濃縮干燥成浸膏，浸膏用80％乙醇溶解吸附于硅膠上，室溫放置揮干溶劑，研碎過(guò)篩后經(jīng)硅膠柱層析，用體積比7:3、5:5、3:7的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，得到3個(gè)組分A-C，組分C經(jīng)過(guò)ODS C-18gel柱中壓制備，用體積比5:95至95:5的甲醇-水梯度洗脫，得到5個(gè)流份C1～C5；C4經(jīng)Sephadex凝膠柱層析，用體積比1:1氯仿-甲醇洗脫，得到6個(gè)流分C4-1～C4-6；流分C4-3經(jīng)HPLC制備，用體積比75:25乙腈-水洗脫，純化得到化合物pimelotide C。
與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的有益效果：經(jīng)過(guò)化合物pimelotide C在HepG2.2.15細(xì)胞對(duì)HBV抑制活性和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)證明：化合物pimelotide C能有效抑制HBsAg的產(chǎn)生，IC50為0.016μg/mL，TI值為355.63,顯著高于陽(yáng)性對(duì)照拉米呋啶。瑞香烷型二萜pimelotide C化合物可在制備抗乙型病毒性肝炎藥物中的應(yīng)用。
具體實(shí)施方式
為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面將用實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但不以此實(shí)施例來(lái)限定本發(fā)明。
實(shí)施例1
瑞香烷型二萜化合物pimelotide C對(duì)HBsAg，HBeAg分泌和對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的藥物毒性實(shí)驗(yàn)。
化合物pimelotide C的細(xì)胞毒性測(cè)定：
HepG2.2.15細(xì)胞經(jīng)消化，制備成2×105/mL的細(xì)胞懸液，以100μL/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，經(jīng)48小時(shí)培養(yǎng)后，加入倍比稀釋的不同濃度樣品液，繼續(xù)培養(yǎng)9天(每3天換液一次)，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，確定樣品對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，計(jì)算TC50，并確定細(xì)胞活性≥90％的樣品濃度用于進(jìn)一步檢測(cè)抗HBV活性。
MTT法檢測(cè)步驟:細(xì)胞經(jīng)實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)后，棄去培養(yǎng)板中培養(yǎng)液，在每孔培養(yǎng)孔中加入新培養(yǎng)液95μL和5mg/mL的MTT溶液5μL，搖勻，置37℃培養(yǎng)3-4小時(shí)，可見(jiàn)孔內(nèi)有藍(lán)紫色結(jié)晶形成，小心吸去板內(nèi)的溶液，加入DMSO 100μL/孔，震蕩，使結(jié)晶充分溶解，在酶標(biāo)儀上測(cè)定光吸收值，測(cè)定波長(zhǎng)為490nm。
化合物pimelotide C抑制HBsAg和HBeAg分泌活性的測(cè)定：
HepG2.2.15細(xì)胞經(jīng)消化，制備成2×105/mL的細(xì)胞懸液，以100μL/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)48小時(shí)后，加入系列濃度的樣品液(細(xì)胞活性≥90％時(shí)的樣品濃度)，同時(shí)設(shè)不加樣品的空白對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)9天(每3天換液一次)，收集上清液，采用上海實(shí)業(yè)科華生物技術(shù)公司的HBsAg和HBeAg ELISA診斷試劑盒，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)HepG2.2.15細(xì)胞上清中的HBsAg和HBeAg水平，計(jì)算樣品對(duì)HBV抗原的抑制率并對(duì)抑制率≥50％的樣品計(jì)算IC50和治療指數(shù)(TI＝TC50/IC50)。陽(yáng)性對(duì)照為拉米呋啶(3TC)。
結(jié)果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1
表1，化合物pimelotide C在HepG2.2.15細(xì)胞對(duì)HBV抑制活性和細(xì)胞毒性
結(jié)論：化合物pimelotide C能有效抑制HBsAg的產(chǎn)生，IC50為0.016μg/mL，TI值為355.63,顯著高于陽(yáng)性對(duì)照拉米呋啶。
實(shí)施例2
化合物pimelotide C的制備及表征：取黃芫花500g，用95％乙醇(5L*2)回流提取兩次，每次3小時(shí)，合并乙醇提液，減壓回收至無(wú)醇，用加入相同體積的蒸餾水(400mL)溶解，然后用乙酸乙酯(1L)進(jìn)行萃取3次，萃取液濃縮干燥成浸膏(100g)，浸膏用80％乙醇溶解吸附于硅膠上，室溫放置揮干溶劑，研碎過(guò)篩后經(jīng)硅膠柱層析，用7:3、5:5、3:7的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，得到3個(gè)組分A-C，組分C經(jīng)過(guò)ODS C-18gel柱中壓制備，5:95至95:5的甲醇-水梯度洗脫，得到5個(gè)流份C-1～C-5。C-4經(jīng)硅Sephadex凝膠柱層析，以氯仿-甲醇(1:1)洗脫，得到6個(gè)流分；流分C-4-3經(jīng)HPLC制備，乙腈-水75:25洗脫，純化得到化合物pimelotide C(35mg)。該化合物的結(jié)構(gòu)鑒定通過(guò)與文獻(xiàn)【Hayes，P；Journal of Natural Products,2010,73(11),1907-1913】的碳譜數(shù)據(jù)對(duì)比得以確定。
化合物pimelotide C的波譜數(shù)據(jù)為：1H-NMR(600MHz,CDCl3),δH:2.35(1H,dd,J＝8.8,3.5Hz,H-1),4.87(1H,s,H-5),3.55(1H,s,H-7),3.70(1H,d,J＝2.2Hz,H-8),3.08(1H,d,J＝8.0Hz,H-10),2.48(1H,m,H-11),2.12(1H,m,H-12a),1.66(1H,m,H-12b),4.24(1H,d,J＝2.8Hz,H-14),4.90(1H,s,H-16a),4.86(1H,s,H-16b),1.75(3H,s,H-17),1.30(3H,s,H-18),1.79(3H,s,H-19),3.94(1H,d,J＝12.0Hz,H-20a),3.75(1H,d,J＝12.0Hz,H-20a),1.81(2H,m,H-2′),1.56(2H,m,H-3′),1.29(1H,m,H-4′a),1.72(1H,m,H-4′b),1.17(1H,m,H-5′a),1.56(1H,m,H-5′b),1.10(1H,m,H-6′a),1.56(1H,m,H-6′b),1.25(1H,m,H-7′a),1.46(1H,m,H-7′b),2.32(1H,m,H-8′a),1.10(1H,m,H-8′b),2.09(1H,m,H-9′),1.04(3H,d,J＝7.1Hz,H-10′)。13C-NMR(150MHz,CDCl3),δC:54.1(C-1),112.9(C-2),173.3(C-3),86.6(C-4),67.7(C-5),60.0(C-6),59.4(C-7),35.9(C-8),81.1(C-9),48.9(C-10),37.4(C-11),37.0(C-12),84.0(C-13),81.3(C-14),146.3(C-15),111.4(C-16),18.7(C-17),21.3(C-18),20.1(C-19),63.9(C-20),119.5(C-1′),33.8(C-2′),20.4(C-3′),28.9(C-4′),26.0(C-5′),24.4(C-6′),24.6(C-7′),25.5(C-8′),29.5(C-9′),18.9(C-10′).
實(shí)施例3
按實(shí)施例1的方法先制得化合物pimelotide C，用少量的DMSO溶解后，按常規(guī)加注射用水，精濾，灌封滅菌制成注射液。
實(shí)施例4
按實(shí)施例1的方法先制得化合物pimelotide C，用少量的DMSO溶解后，將其溶于無(wú)菌注射用水中，攪拌使溶解，用無(wú)菌抽濾漏斗過(guò)濾，再無(wú)菌精濾，分裝于安瓿中，低溫冷凍干燥后無(wú)菌熔封得粉針劑。
實(shí)施例5
將實(shí)施例1所分離得到的化合物pimelotide C，分別按其與賦形劑重量比為9:1的比例加入賦形劑，制成粉劑。
實(shí)施例6
按實(shí)施例1的方法先制得化合物pimelotide C，分別按其與賦形劑重量比為5:1的比例加入賦形劑，制粒壓片。
實(shí)施例7
按實(shí)施例1的方法先制得化合物pimelotide C，分別按常規(guī)口服液制法制成口服液。
實(shí)施例8
按實(shí)施例1的方法先制得化合物pimelotide C，按其與賦形劑重量比為5:1的比例加入賦形劑，制成膠囊。
實(shí)施例9
按實(shí)施例1的方法先制得化合物pimelotide C，按其與賦形劑重量比為3:1的比例加入賦形劑，制成膠囊。
實(shí)施例10
按實(shí)施例1的方法先制得化合物pimelotide C，分別按其與賦形劑重量比為5:1的比例加入賦形劑，制成顆粒劑。