一種娃兒藤生物堿類(lèi)提取物的制備方法及其檢測(cè)方法與流程

本發(fā)明涉及一種生物堿類(lèi)化合物的提純領(lǐng)域，尤其涉及醫(yī)藥生產(chǎn)中的一種娃兒藤生物堿類(lèi)提取物的制備方法及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：生物堿類(lèi)化合物是一類(lèi)廣泛分布于生物堿（主要是植物界）中，具有明顯的生物活性，例如抗癌、抗炎消炎、抗菌、抗腫瘤、抗病毒等作用，因此生物堿類(lèi)化合物重要的天然藥物活性成分之一。娃兒藤為蘿摩科(Asclepiadaceac)娃兒藤屬(Tylophora)多年生葡萄性藤狀草本，主要以根及全草入藥，主要分別于我國(guó)云南、廣西、廣東、湖南、江西、浙江、中國(guó)臺(tái)灣等地，以及越南、老撾、緬甸、印度等地。娃兒藤入藥在我國(guó)有悠久的歷史,《江西草藥》記載其具有祛風(fēng)化痰、通經(jīng)散癖的功效?！赌蠈幨兴幬镏尽酚涊d其有行氣、散癖、止痛、化痰、止咳、治跌打、刀傷、咳嗽、風(fēng)濕痛的功效。江西《草藥手冊(cè)》記載其能散癖、催吐治哮喘痰咳、咽喉腫痛、跌打損傷、風(fēng)濕痛、胃痛、腹痛等?，F(xiàn)代藥理研究表明，娃兒藤主要生物活性成分是生物堿類(lèi)化合物，含量可達(dá)0.3%。自從娃兒藤堿分離到現(xiàn)在，人們已經(jīng)通過(guò)化學(xué)合成方法合成包括娃兒藤堿在內(nèi)的一系列娃兒藤堿衍生物，而且這些娃兒藤堿的衍生物具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗癌等等明顯的藥理活性。從植物提取分離方法得到的娃兒藤堿或者通過(guò)化學(xué)半合成的方法得到的娃兒藤堿衍生物，一般都含有比較多的雜質(zhì)。另外由于娃兒藤類(lèi)生物堿性質(zhì)不太穩(wěn)定、見(jiàn)光、受熱或者長(zhǎng)時(shí)間暴露在空氣中都容易被氧化變質(zhì)。因此，通過(guò)各種溶劑萃取、各種柱色譜法反復(fù)層析及重結(jié)晶等傳統(tǒng)分離純化方法難以得到純度較高娃兒藤生物堿，而且存在過(guò)程繁瑣、浪費(fèi)時(shí)間、溶劑消耗大、死吸附嚴(yán)重，生物堿樣品損失嚴(yán)重等缺點(diǎn)，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。聚酰胺樹(shù)脂是一種常用的分離純化材料，具有設(shè)備簡(jiǎn)單，能耗低，適用范圍廣，能重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛用于中藥等領(lǐng)域，特別是對(duì)黃酮類(lèi)、酚類(lèi)等化合物的分離純化，而其在分離純娃兒藤生物堿類(lèi)化合物方面的使用尚未見(jiàn)報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明公開(kāi)一種操作簡(jiǎn)單、快速、低成本、高效率、適用于工業(yè)生產(chǎn)的從娃兒藤中純化分離生物堿化合物的制備方法。本發(fā)明一種娃兒藤生物堿類(lèi)提取物的制備方法，包括以下步驟：S1、用乙醇溶液對(duì)娃兒藤藥材粉末進(jìn)行提取，所述提取液經(jīng)濃縮回收乙醇得到粗提物浸膏；S2、所述浸膏用稀鹽酸溶劑，并過(guò)濾得濾液，以除去色素等脂溶性物質(zhì)；S3、所述濾液經(jīng)聚酰胺樹(shù)脂吸附；S4、用水溶液對(duì)聚酰胺樹(shù)脂進(jìn)行洗脫除去大部分雜質(zhì)，直到洗脫液檢測(cè)出生物堿成分為止；S5、用有機(jī)溶劑洗脫液對(duì)聚酰胺樹(shù)脂進(jìn)行洗脫，直到洗脫液檢測(cè)生物堿成分為止，收集洗脫流出液，濃縮回收有機(jī)溶劑得浸膏即為娃兒藤生物堿類(lèi)提取物。進(jìn)一步地，提取所用的乙醇的體積分?jǐn)?shù)為80-100%；所述提取方式為回流提取、超聲波提取、微波提取、索氏提取或者冷浸提取的任一種；所述提取的次數(shù)為1-3次，每次所述提取的時(shí)間為0.5-3個(gè)小時(shí)，所述提取溫度為70-90℃，每次提取所用的乙醇溶液于娃兒藤藥材粉末的固液之比為1:7-1:12。進(jìn)一步地，S2中所用的稀鹽酸為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1-1%的鹽酸,粗浸膏重量(g)與稀鹽酸體積(mL)之比為1:15-1:25。進(jìn)一步地，所述聚酰胺樹(shù)脂的粒徑為80-400目。進(jìn)一步地，S3中上樣體積為0.5-2BV（柱體積），上樣流速為0.5-4BV/h；靜止吸附時(shí)間為0.2-1h。進(jìn)一步地，S4中所用除去雜質(zhì)的水溶液的體積為0.5-1.5BV。進(jìn)一步地，S5中，所用的有機(jī)溶劑洗脫液為體積分?jǐn)?shù)10-95%乙醇水溶液；洗脫體積為1-5BV；洗脫流速為0.5-4BV/h。進(jìn)一步地，所述洗脫流出液為濃度為10-30%的乙醇洗脫液，收集的總體積為1-3BV。娃兒藤生物堿類(lèi)提取物的檢測(cè)方法，采用HPLC色譜分析，HPLC色譜條件：流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸；色譜柱：十八烷基鍵合硅膠(DiamonsilC18)為填充劑，（4.6mm×250mm，5μm）；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；梯度洗脫條件見(jiàn)表1：表1梯度洗脫表時(shí)間（min）乙腈（%）0.2%磷酸（%）02080102080253465307030357080402020本發(fā)明的有益效果是：所采用的聚酰胺樹(shù)脂分離純化娃兒藤生物堿的方法尚屬首次研究。由于聚酰胺樹(shù)脂價(jià)格低廉，而且能夠重復(fù)使用多次，所用洗脫劑濃度較低，具有安全低毒，對(duì)環(huán)境污染少，而且本工藝操作簡(jiǎn)便、能耗低、選擇性好、樣品損失少、產(chǎn)品純度高，可以降低生產(chǎn)成本和提高經(jīng)濟(jì)效益，可以實(shí)現(xiàn)工藝化生產(chǎn)要求。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明的工藝流程圖；圖2為上聚酰胺柱前溶液的指紋圖譜；圖3為本發(fā)明實(shí)施例1建立的水作為洗脫劑的指紋圖譜，主要為雜質(zhì)；圖4為本發(fā)明實(shí)施例1建立的30%乙醇作為洗脫劑的指紋圖譜，主要為生物堿類(lèi)化合物；圖5為本發(fā)明實(shí)施例1建立的收集50-90%乙醇為洗脫劑的指紋圖譜，主要為非生物堿類(lèi)化合物；圖6為本發(fā)明實(shí)施例2建立的水作為洗脫劑的指紋圖譜，主要為雜質(zhì)；圖7為本發(fā)明實(shí)施例2建立的30%乙醇作為洗脫劑的指紋圖譜，主要為生物堿類(lèi)化合物；圖8為本發(fā)明實(shí)施例2建立的收集50-90%乙醇為洗脫劑的指紋圖譜，主要為非生物堿類(lèi)化合物；圖9為本發(fā)明實(shí)施例3建立的水作為洗脫劑的指紋圖譜，主要為雜質(zhì)；圖10為本發(fā)明實(shí)施例3建立的30%乙醇作為洗脫劑的指紋圖譜，主要為生物堿類(lèi)化合物；圖11為本發(fā)明實(shí)施例3建立的收集50-90%乙醇為洗脫劑的指紋圖譜，主要為非生物堿類(lèi)化合物；圖12為本發(fā)明實(shí)施例4建立的水作為洗脫劑的指紋圖譜，主要為雜質(zhì)；圖13為本發(fā)明實(shí)施例4建立的30%乙醇作為洗脫劑的指紋圖譜，主要為生物堿類(lèi)化合物；圖14為本發(fā)明實(shí)施例4建立的收集50-90%乙醇為洗脫劑的指紋圖譜，主要為非生物堿類(lèi)化合物。具體實(shí)施方式以下結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。以下實(shí)施例中娃兒藤生物堿類(lèi)提取物采用HPLC色譜分析的方法，HPLC色譜條件：流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸；色譜柱：十八烷基鍵合硅膠(DiamonsilC18)為填充劑，（4.6mm×250mm，5μm）；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；梯度洗脫條件見(jiàn)表1：表1梯度洗脫表時(shí)間（min）乙腈（%）0.2%磷酸（%）02080102080253465307030357080402020實(shí)施例1參照?qǐng)D1，取娃兒藤粉末250g，加入重量體積比為8倍量80%乙醇，在90℃回流提取2次，每次2小時(shí)，合并提取液，過(guò)濾，濾液濃縮回收乙醇得粗浸膏30g。用18倍量0.4%鹽酸溶解粗浸膏、過(guò)濾除去酸不溶物，得濾液。取體積100-200目聚酰胺樹(shù)脂700mL，乙醇濕法裝于直徑5cm柱子，得到柱高28cm的柱層，取400ml娃兒藤濾液上樣加入到聚酰胺樹(shù)脂中，以2bv/h流速上樣，靜置吸附1h讓聚酰胺樹(shù)脂充分吸附,先用1倍樹(shù)脂床體積水沖洗，洗脫雜質(zhì)，分別用1.2倍樹(shù)脂床體積30%、50%、70%、90%乙醇作為洗脫劑進(jìn)行洗脫，洗脫流速為1.5bv/h，每0.3倍樹(shù)脂床體積收集一次，并用HPLC指紋圖譜分析，合并收集含有生物堿的洗脫液，得到總生物堿洗脫液，將最后經(jīng)濃縮，干燥，得到得高純化生物堿類(lèi)提取物樣品0.69g,經(jīng)HPLC指紋圖譜比較生物堿總峰面積，生物堿轉(zhuǎn)移率為72%，純度未62%。結(jié)果見(jiàn)圖2-5，特征峰見(jiàn)表2。實(shí)施例2取娃兒藤粉末250g，加入重量體積比為10倍量95%乙醇，在80℃回流提取3次，每次1小時(shí)，合并提取液，過(guò)濾，濾液濃縮回收乙醇得粗浸膏28g。用15倍量0.8%鹽酸溶解粗浸膏、過(guò)濾除去酸不溶物，得濾液。取體積100-200目聚酰胺樹(shù)脂400mL，乙醇濕法裝于直徑5cm柱子，得到柱高20cm的柱層，取400ml娃兒藤濾液上樣加入到聚酰胺樹(shù)脂中，以2bv/h流速上樣，靜置吸附1h讓聚酰胺樹(shù)脂重復(fù)吸附,先用1倍樹(shù)脂床體積水沖洗，洗脫雜質(zhì)，分別用1倍樹(shù)脂床體積30%、50%、70%、90%乙醇作為洗脫劑進(jìn)行洗脫，洗脫流速為1bv/h，每0.25倍樹(shù)脂床體積收集一次，并用HPLC指紋圖譜分析，合并收集含有生物堿的洗脫液，得到總生物堿洗脫液，將最后經(jīng)濃縮，干燥，得到得高純化生物堿類(lèi)提取物樣品0.84g,經(jīng)HPLC指紋圖譜比較生物堿總峰面積，生物堿轉(zhuǎn)移率為91%，純度為80%。結(jié)果見(jiàn)圖6-8，特征峰見(jiàn)表2。實(shí)施例3取娃兒藤粉末1000g，加入重量體積比為8倍量95%乙醇，在80℃回流提取3次，每次2小時(shí)，合并提取液，過(guò)濾，濾液濃縮回收乙醇得粗浸膏102g。用20倍量0.5%鹽酸溶解粗浸膏、過(guò)濾除去酸不溶物，得濾液。取體積100-200目聚酰胺樹(shù)脂2000mL，乙醇濕法裝于直徑10cm柱子，得到柱高25cm的柱層，取2000ml娃兒藤濾液上樣加入到聚酰胺樹(shù)脂中，以1.5bv/h流速上樣，靜置吸附0.5h讓聚酰胺樹(shù)脂充分吸附,先用1倍樹(shù)脂床體積水沖洗，洗脫雜質(zhì)，分別用1.2倍樹(shù)脂床體積30%、50%、70%、90%乙醇作為洗脫劑進(jìn)行洗脫，洗脫流速為1bv/h，每0.2倍樹(shù)脂床體積收集一次，并用HPLC指紋圖譜分析，合并收集含有生物堿的洗脫液，得到總生物堿洗脫液，將最后經(jīng)濃縮，干燥，得到得高純化生物堿類(lèi)提取物樣品3.4g,經(jīng)HPLC指紋圖譜比較生物堿總峰面積，生物堿轉(zhuǎn)移率為73%，純度為64%。結(jié)果見(jiàn)圖9-11，特征峰見(jiàn)表2。實(shí)施例4取娃兒藤粉末1000g，加入重量體積比為10倍量95%乙醇，在80℃回流提取3次，每次2小時(shí)，合并提取液，過(guò)濾，濾液濃縮回收乙醇得粗浸膏110g。用20倍量0.5%鹽酸溶解粗浸膏、過(guò)濾除去酸不溶物，得濾液。取體積100-200目聚酰胺樹(shù)脂2000mL，乙醇濕法裝于直徑10cm柱子，得到柱高25cm的柱層，取2000ml娃兒藤濾液上樣加入到聚酰胺樹(shù)脂中，以2bv/h流速上樣，靜置吸附1h讓聚酰胺樹(shù)脂充分吸附,先用1倍樹(shù)脂床體積水沖洗，洗脫雜質(zhì)，分別用1.5倍樹(shù)脂床體積30%、50%、70%、90%乙醇作為洗脫劑進(jìn)行洗脫，洗脫流速為1.5bv/h，每0.2倍樹(shù)脂床體積收集一次，并用HPLC指紋圖譜分析，合并收集含有生物堿的洗脫液，得到總生物堿洗脫液，將最后經(jīng)濃縮，干燥，得到得高純化生物堿類(lèi)提取物樣品3.6g,經(jīng)HPLC指紋圖譜比較生物堿總峰面積，生物堿轉(zhuǎn)移率為75%，純度為62%。結(jié)果見(jiàn)圖12-14，特征峰見(jiàn)表2。表2HPLC-ESI-MS分析結(jié)果特征峰分子量分子式對(duì)應(yīng)的化合物1610C27H30O16蘆丁2594C27H30O15山奈酚-3-O-?-D-蕓香糖苷3365C22H23O4N降甲基娃兒藤寧堿4365C22H23O4N娃兒藤定堿5363C23H25O3N7-脫甲氧基娃兒藤堿6331生物堿類(lèi)化合物7381C22H23O5N14-羥基-3,6-二去甲基異密花娃兒藤堿8379C23H25O4N娃兒藤寧堿9379C23H25O4N(13aR,14R）-14-羥基-7-脫甲氧基娃兒藤堿10409生物堿類(lèi)化合物11379C23H25O4NN-氧代-7-脫甲氧基娃兒藤堿12393C24H27O4N娃兒藤堿13391生物堿類(lèi)化合物14363C23H25O3N去羥基娃兒藤寧堿15359生物堿類(lèi)化合物16386C15H11O6木犀草素或者山奈酚或者3,3',4',7-四羥基黃酮以上所述的實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通工程技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案所作的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明權(quán)利要求書(shū)確定的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3