含至少一種流感病毒的中和性結(jié)合分子的佐劑組合物及含該佐劑組合物的疫苗組合物的制作方法

本發(fā)明涉及一種佐劑組合物，該佐劑組合物包括用于中和流感病毒的至少一種結(jié)合分子，且涉及一種含該佐劑組合物的疫苗組合物；更具體地，本發(fā)明涉及一種佐劑組合物，該佐劑組合物包括對(duì)流感病毒具有中和活性的至少一種人單克隆抗體，該佐劑組合物起到增強(qiáng)由疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答從而增加疫苗功效的佐劑作用，且涉及一種含該佐劑組合物的疫苗組合物。
背景技術(shù)：
：流感是一種流感病毒感染呼吸道所引起的疾病，其常見于冬季、傳染性高、易在所有年齡段傳播，還已知尤其困擾老年人(treanorj,2004,nengl.jmed.350(3):218-20)。流感病毒分為甲型(a)、乙型(b)和丙型(c)流感病毒，甲型流感病毒按照作為主要表面蛋白的ha(血凝素)和na(神經(jīng)氨酸酶)，進(jìn)一步分為許多亞型，其中流感病毒是屬于正粘病毒科(orthomyxoviridae)的包膜病毒，它的基因組由八條負(fù)義單鏈rna(核糖核酸)片段組成。迄今已知存在17種類型的ha和10種類型的na(cheungtkandpoonll2007,annnyacad.sci.1102:1-25；tongs,etal.2012,proc.natl.acad.sci.u.s.a.109:4269-4274)。流感病毒持續(xù)產(chǎn)生變種病毒，這些變種病毒由于其特征可以根據(jù)其類型而感染鳥、豬和人，并且由于包含rna片段的基因組而產(chǎn)生多種基因組合和突變(treanorj,2004.nengl.jmed.350(3):218-20)。因?yàn)檫@種持續(xù)性突變，所以難以獲得永久免疫力，目前最有效的預(yù)防方法是通過接種抗每年預(yù)期流行的流感病毒的疫苗，而每年形成適合于特定類型的免疫力。目前每年接種的流感病毒疫苗是三價(jià)或四價(jià)疫苗，其由甲型流感病毒的h1和h3亞型的ha，及乙型流感病毒的一種或兩種類型的ha構(gòu)成?？垢鞣N感染性疾病的疫苗，包括流感病毒疫苗，可以添加用于增加免疫原性的物質(zhì)，這種物質(zhì)被稱作佐劑。經(jīng)批準(zhǔn)用于人類的佐劑的例子可包括由氫氧化鋁和磷酸鋁組成的鋁佐劑(alum)，水包油乳劑mf59、as03以及由tlr4激動(dòng)劑mpl和氫氧化鋁組成as04(rappuolir,2011.naturereviewsimmunology11,11(12):865-72)。除此之外，還有許多關(guān)于通過一起施用抗體和抗原來增強(qiáng)免疫應(yīng)答的報(bào)道，且進(jìn)行了許多將抗體用作佐劑的嘗試。由本申請(qǐng)人提交的抗甲型流感病毒的抗體顯示出抗各種流感亞型的中和活性，尤其是韓國專利申請(qǐng)第10-2011-0020061號(hào)中公開的抗體主要表現(xiàn)出抗系統(tǒng)發(fā)育組1(h1、h2、h5、h9等)的中和活性，以及韓國專利申請(qǐng)第10-2012-0107512號(hào)中公開的抗體主要表現(xiàn)出抗系統(tǒng)發(fā)育組2(h3、h7等)的中和活性。因此，如在韓國專利申請(qǐng)第10-2014-0036601號(hào)中所公開的，已開發(fā)了一種雞尾酒制劑，其經(jīng)配置以便混合并共同施用兩種或更多種抗體，從而顯示出抗可能流行的組1和組2病毒的預(yù)防和治療作用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：技術(shù)問題本發(fā)明人已經(jīng)確定，可以通過將疫苗與本發(fā)明人已開發(fā)的用于中和流感病毒的抗體一起施用來增加疫苗的效果，并已發(fā)現(xiàn)了已開發(fā)的抗體作為佐劑的新用途，從而實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，本發(fā)明旨在提供一種佐劑組合物，所述佐劑組合物包括用于中和流感病毒的至少一種結(jié)合分子。此外，本發(fā)明旨在提供一種包括所述佐劑組合物和靶抗原的疫苗組合物。此外，本發(fā)明旨在提供一種制備疫苗組合物的方法，所述疫苗組合物包括所述佐劑組合物和靶抗原。此外，本發(fā)明旨在提供一種通過向宿主施用所述佐劑組合物，來增加對(duì)靶抗原的免疫應(yīng)答的方法。此外，本發(fā)明旨在提供一種通過向宿主施用所述疫苗組合物，對(duì)宿主進(jìn)行免疫的方法。此外，本發(fā)明旨在提供一種通過向宿主施用所述疫苗組合物，從經(jīng)免疫的宿主制備免疫產(chǎn)物的方法。技術(shù)方案因此，本發(fā)明提供了一種佐劑組合物，所述佐劑組合物包括用于中和流感病毒的至少一種結(jié)合分子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述結(jié)合分子可以與甲型流感病毒的血凝素(ha)蛋白的頸部區(qū)域中的表位結(jié)合。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述結(jié)合分子的表位可以是選自由以下表位所組成的組中的至少一種：i)包括選自由ha1多肽的第18、25、27、32、33、38、40、54、55、278、291、292、310、311、312和318位的氨基酸所組成的組中任何一個(gè)氨基酸殘基的表位；和，ii)包括選自由ha2多肽的第18、19、20、21、38、39、41、42、45、46、48、49、52、53、56、57、58、60和99位的氨基酸所組成的組中的任何一個(gè)氨基酸殘基的表位。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述結(jié)合分子的表位可以包括ha1多肽的第18、38、40、291、292和318位的氨基酸殘基。此外，所述結(jié)合分子的表位可以包括ha2多肽的第18、19、20、21、41、42、45、48、49、52和53位的氨基酸殘基。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述結(jié)合分子的表位可以包括ha1多肽的第18、38、40、291、292和318位的氨基酸殘基，且可以包括ha2多肽的第18、19、20、21、41、42、45、48、49、52和53位的氨基酸殘基。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述結(jié)合分子的表位可以包括ha1多肽的第278和318位的氨基酸殘基。另外，所述結(jié)合分子的表位可以包括ha2多肽的第38、39、41、42、45、48、49、52和53位的氨基酸殘基。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述結(jié)合分子的表位可以包括在ha第一單體的ha1多肽和/或ha2多肽的上述位置處的氨基酸殘基，并且可以進(jìn)一步包括與第一單體相鄰的第二單體的ha1多肽的第25、32和33位的氨基酸殘基。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述結(jié)合分子的表位可以包括ha1多肽的第278和318位的氨基酸殘基，以及ha2多肽的第38、39、41、42、45、48、49、52和53位的氨基酸殘基。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述結(jié)合分子的表位可以包括在ha第一單體的ha1多肽和ha2多肽的上述位置處的氨基酸殘基，并且可以進(jìn)一步包括與第一單體相鄰的第二單體的ha1多肽的第25、32和33位的氨基酸殘基。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述結(jié)合分子的表位可以包括ha1多肽的第278和318位的氨基酸殘基，以及ha2多肽的第38、39、41、42、45、48、49、52、53、58和99位的氨基酸殘基。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述結(jié)合分子的表位可以包括在ha第一單體的ha1多肽和ha2多肽的上述位置處的氨基酸殘基，并且可以進(jìn)一步包括與第一單體相鄰的第二單體的ha1多肽的第25、27、32和33位的氨基酸殘基。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述結(jié)合分子的表位可以包括ha1多肽的第54、55、278、291和318位的氨基酸殘基，以及ha2多肽的第19、20、21、38、39、41、42、45、46、48、49、52、53、56、57和60位的氨基酸殘基。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述結(jié)合分子的表位可以包括在ha第一單體的ha1多肽和ha2多肽的上述位置處的氨基酸殘基，并且可以進(jìn)一步包括與ha第一單體相鄰的ha第二單體的ha1多肽的第25、32、33、310、311和312位的氨基酸殘基。上述表位的氨基酸位置的編號(hào)基于h3ha的編號(hào)系統(tǒng)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述結(jié)合分子可以包括選自由以下結(jié)合分子所組成的組中的至少一種：i)結(jié)合分子，該結(jié)合分子包括根據(jù)kabat法測(cè)定的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中，該輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包括seqidno：1的cdr1區(qū)、seqidno：2的cdr2區(qū)和seqidno：3的cdr3區(qū)，該重鏈可變結(jié)構(gòu)域包括seqidno：4的cdr1區(qū)、seqidno：5的cdr2區(qū)和seqidno：6的cdr3區(qū)；和，ii)結(jié)合分子，該結(jié)合分子包括根據(jù)kabat法測(cè)定的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中，該輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包括seqidno：7的cdr1區(qū)、seqidno：8的cdr2區(qū)和seqidno：9的cdr3區(qū)，該重鏈可變結(jié)構(gòu)域包括seqidno：10的cdr1區(qū)、seqidno：11的cdr2區(qū)和seqidno：12的cdr3區(qū)。在本發(fā)明中，按照由kabat等人設(shè)計(jì)的系統(tǒng)，使用典型方法測(cè)定可變結(jié)構(gòu)域的cdr(參見[kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(5th),nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991)])。使用kabat法進(jìn)行本發(fā)明中使用的cdr編號(hào)，但本發(fā)明還涵括包括通過其他方法，包括imgt法、chothia法和abm法等，所測(cè)定的cdr的結(jié)合分子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述結(jié)合分子可以包括選自由以下結(jié)合分子所組成的組中的至少一種：i)結(jié)合分子，該結(jié)合分子包括輕鏈和重鏈，其中，該輕鏈包括seqidno：13的多肽序列，該重鏈包括seqidno：14的多肽序列；和ii)結(jié)合分子，該結(jié)合分子包括輕鏈和重鏈，其中，該輕鏈包括seqidno：15的多肽序列，該重鏈包括seqidno：16的多肽序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述結(jié)合分子包括與細(xì)胞表面的fc受體結(jié)合的結(jié)合分子。此外，本發(fā)明提供一種包括所述佐劑組合物和靶抗原的疫苗組合物。所述靶抗原可以是病毒抗原，但不限于此。優(yōu)選地，所述病毒抗原是流感病毒抗原。所述流感病毒抗原包括甲型流感病毒抗原或乙型流感病毒抗原。所述流感病毒抗原可以是血凝素(ha)或神經(jīng)氨酸酶(na)，但不限于此。另外，在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，所述疫苗組合物可以以1:0.02至1:200，優(yōu)選1:0.2至1:20的重量比包括所述抗原和所述佐劑組合物，但不限于此?？梢越档突蛱岣咚隹乖退鲎魟┙M合物的重量比，來調(diào)節(jié)免疫原性活性。另外，在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了除上述佐劑組合物外，還加入額外的佐劑組合物的疫苗組合物。所述額外的佐劑組合物可以包括但不限于：鋁佐劑、可代謝的油(如角鯊烯)、母育酚(如α-生育酚)、甾醇(如膽固醇)、皂苷(如qs21)、toll樣受體配體(如poly(i:c))、具有cpg基序的寡核苷酸和/或lps衍生物(如3d-mpl)。此外，本發(fā)明提供了一種制備疫苗組合物的方法，所述疫苗組合物包括上述佐劑組合物和靶抗原。所述疫苗組合物可以是流感病毒疫苗組合物，但不限于此。此外，本發(fā)明提供了一種通過向宿主施用上述佐劑組合物，來增加對(duì)靶抗原的免疫應(yīng)答的方法。所述疫苗組合物可以是流感病毒疫苗組合物，但不限于此。另外，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述免疫應(yīng)答可以由在其表面上具有fc受體的細(xì)胞來誘導(dǎo)，但本發(fā)明不限于此。此外，本發(fā)明提供了一種預(yù)防由病毒引起的疾病的方法，所述方法包括向受試者施用有效量的含上述佐劑組合物的疫苗組合物。例如，所述由病毒引起的疾病可以是由流感病毒引起的疾病。此外，本發(fā)明提供了一種通過向宿主施用疫苗組合物，對(duì)宿主進(jìn)行免疫的方法。此外，本發(fā)明提供了一種制備免疫產(chǎn)物的方法，所述方法包括：a)通過向宿主施用上述疫苗組合物來免疫宿主，以及b)從經(jīng)免疫的宿主獲得免疫產(chǎn)物。另外，在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，所述免疫產(chǎn)物可以是t細(xì)胞、b細(xì)胞或抗體。所述免疫產(chǎn)物可以是在其細(xì)胞表面上具有fc受體的其他類型的細(xì)胞，如b細(xì)胞，例如嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞。下文中，本發(fā)明中所使用的術(shù)語定義如下。如本文所使用的，術(shù)語“流感病毒”是指屬于正粘病毒(orthomyxoviridae)科，并具有由8個(gè)負(fù)義單鏈rna(核糖核酸)片段組成的基因組的包膜病毒。流感病毒分為甲型(a)、乙型(b)和丙型(c)，并根據(jù)作為主要表面蛋白的ha(血凝素)和na(神經(jīng)氨酸酶)進(jìn)一步分為多種亞型。迄今已報(bào)告了17種類型的ha和10種類型的na。如本文所使用的，“h1亞型”包括h1n1、h1n2、h1n3、h1n4、h1n5、h1n6、h1n7、h1n8、h1n9和h1n10。如本文所使用的，“h2亞型”包括h2n1、h2n2、h2n3、h2n4、h2n5、h2n6、h2n7、h2n8、h2n9和h2n10。如本文所使用的，“h5亞型”包括h5n1、h5n2、h5n3、h5n4、h5n5、h5n6、h5n7、h5n8、h5n9和h5n10。如本文所使用的，“h9亞型”包括h9n1、h9n2、h9n3、h9n4、h9n5、h9n6、h9n7、h9n8、h9n9和h9n10。如本文所使用的，“h3亞型”包括h3n1、h3n2、h3n3、h3n4、h3n5、h3n6、h3n7、h3n8、h3n9和h3n10。如本文所使用的，“h7亞型”包括h7n1、h7n2、h7n3、h7n4、h7n5、h7n6、h7n7、h7n8、h7n9和h7n10。如本文所述，術(shù)語“血凝素”(以下稱為“ha”)是指流感病毒的包膜糖蛋白。ha介導(dǎo)流感病毒吸附并滲透至宿主細(xì)胞中。迄今已報(bào)告了17種ha亞型。如本文所述，術(shù)語“神經(jīng)氨酸酶”(以下稱為“na”)是指流感病毒的包膜糖蛋白。na在流感病毒在增殖后傳播時(shí)起重要的作用。迄今已報(bào)告了10種na亞型。如本文所述的，流感疫苗被認(rèn)為是預(yù)防季節(jié)性流感或流行性流感的最有效方法，主要包括活疫苗和滅活疫苗。作為活疫苗，開發(fā)并使用活的減毒疫苗。滅活疫苗可以包括：使用完整病毒的全病毒疫苗，其中從雞胚培養(yǎng)或通過細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)的病毒經(jīng)純化，并用福爾馬林等滅活；裂解疫苗，其中病毒的包膜被乙醚等破壞；和，亞單位疫苗，其中ha和na組分被純化。包括甲型流感病毒h1亞型和h3亞型及乙型流感病毒一種類型的疫苗是三價(jià)疫苗，包括甲型流感病毒h1亞型和h3亞型及乙型流感病毒兩種類型的疫苗是四價(jià)疫苗。如本文所述的，“流感疫苗”包括所有三價(jià)、四價(jià)、季節(jié)性和流行性的活疫苗和滅活疫苗。如本文所述的，術(shù)語“結(jié)合分子”是指：完整的免疫球蛋白，包括單克隆抗體，如嵌合單克隆抗體、人源化單克隆抗體或人單克隆抗體；融合蛋白，包括免疫球蛋白的fc或免疫球蛋白的與抗原結(jié)合的部分，例如包括與完整免疫球蛋白競(jìng)爭(zhēng)以結(jié)合甲型流感病毒的單體ha或三聚體ha的免疫球蛋白片段的可變結(jié)構(gòu)域，與底物結(jié)合的酶、受體或蛋白質(zhì)。無論結(jié)構(gòu)如何，抗原結(jié)合片段與完整免疫球蛋白所識(shí)別的同一抗原結(jié)合?？乖Y(jié)合片段可以包括肽或多肽，其包括由所述結(jié)合分子的氨基酸序列的至少2個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少20個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少25個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，至少30個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少35個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少40個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少50個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少60個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少70個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少80個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少90個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少100個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少125個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少150個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少175個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少200個(gè)連續(xù)氨基酸殘基或至少250個(gè)連續(xù)氨基酸殘基所組成的氨基酸序列。如本文所述的，術(shù)語“抗原結(jié)合片段”尤其包括fab、f(ab')、f(ab')2、fv、dab、fd、互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)片段、單鏈抗體(scfv)、二價(jià)單鏈抗體、單鏈?zhǔn)删w抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、多肽等，其中該多肽包括免疫球蛋白的足以賦予該多肽抗原特異性結(jié)合的至少一個(gè)片段。上述片段可以通過合成或通過對(duì)完整的免疫球蛋白進(jìn)行酶促或化學(xué)切割來產(chǎn)生，或者可以通過重組dna技術(shù)進(jìn)行遺傳工程處理。這些生產(chǎn)方法是本領(lǐng)域所熟知的。如本文所使用的，術(shù)語“佐劑”是指加入疫苗或藥物活性成分中以增加和/或影響免疫應(yīng)答的物質(zhì)或組合物。佐劑的實(shí)例包括免疫原性載劑或輔助材料，和/或其它藥物活性材料或組合物。通常，術(shù)語“佐劑”應(yīng)廣義地解釋，且是指可以并入佐劑中的，或可增強(qiáng)與佐劑一起施用的抗原的免疫原性的廣泛范圍的物質(zhì)或策略。此外，佐劑可以包括但不限于免疫增強(qiáng)劑、抗原遞送系統(tǒng)或其組合。如本文所使用的，術(shù)語“免疫產(chǎn)物”是指由通過施用佐劑組合物和/或抗原而被免疫的宿主產(chǎn)生的保護(hù)性免疫介質(zhì)或細(xì)胞，其實(shí)例可包括但不限于活化的t細(xì)胞、b細(xì)胞或抗體。如本文所使用的，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的賦形劑”是指與活性分子，如藥物、試劑或結(jié)合分子組合以制備可接受或方便劑型的任何惰性物質(zhì)。藥學(xué)上可接受的賦形劑是如下的賦形劑，該賦形劑在所用劑量和濃度下對(duì)接受者無毒或至少毒性較小，并且與含藥物、試劑或結(jié)合分子的制劑的其它成分相容。如本文所使用的，術(shù)語“有效量”是指在與抗甲型流感病毒的疫苗一起施用時(shí)，有效增加該疫苗效力的本發(fā)明結(jié)合分子的量。在本發(fā)明中，通過小鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)了，已提交的抗體(韓國專利申請(qǐng)第10-2011-0020061號(hào)、第10-2012-0107512號(hào)和第10-2014-0036601號(hào))在與流感疫苗一起接種時(shí)增加了免疫應(yīng)答的效果，從而發(fā)現(xiàn)了其作為佐劑的新用途。在此，本申請(qǐng)人提交的韓國專利申請(qǐng)第10-2011-0020061號(hào)、第10-2012-0107512號(hào)和第10-2014-0036601號(hào)以引用的方式并入到本申請(qǐng)中。有益效果根據(jù)本發(fā)明，包括用于中和流感病毒的至少一種結(jié)合分子的組合物可以增強(qiáng)疫苗的效果，從而可以在施用疫苗時(shí)用作增強(qiáng)免疫應(yīng)答的佐劑，并且對(duì)于預(yù)防由病毒引起的疾病非常有效。附圖說明圖1示出了在每只小鼠以兩周的間隔肌內(nèi)注射兩次h1n1疫苗組合物的條件下，在第一次肌內(nèi)注射后13天、17天和27天取樣的血清中，抗h1n1流感病毒的特異性抗體效價(jià)的elisa結(jié)果(表1)。圖2示出了在每只小鼠以兩周的間隔肌內(nèi)注射兩次h1n1疫苗組合物的條件下，在第一次肌肉注射后28天取樣的血清中，抗h1n1ha蛋白和h1n1流感病毒的特異性抗體效價(jià)的elisa結(jié)果(表3)。圖3示出了在用10mld50的h1n1流感病毒接種經(jīng)免疫的小鼠后，經(jīng)免疫的小鼠的存活率和體重變化。圖4示出了在每只小鼠以兩周的間隔肌內(nèi)注射兩次h1n1疫苗組合物的條件下，在第一次肌內(nèi)注射后13天、20天和27天取樣的血清中，抗h1n1流感病毒的特異性抗體效價(jià)的elisa結(jié)果(表5)。圖5示出了在用10mld50的h1n1流感病毒接種經(jīng)免疫的小鼠后，經(jīng)免疫的小鼠的存活率和體重變化。圖6示出了在每只小鼠以兩周的間隔肌內(nèi)注射兩次h1n1疫苗組合物的條件下，在第一次肌內(nèi)注射后13天、20天和27天取樣的血清中，抗h1n1流感病毒的特異性抗體效價(jià)的elisa結(jié)果(表7)。圖7示出了在用10mld50的h1n1流感病毒接種經(jīng)免疫的小鼠后，經(jīng)免疫的小鼠的存活率和體重變化。圖8示出了在每只小鼠以兩周的間隔肌內(nèi)注射兩次h3n2疫苗組合物的條件下，在第一次肌內(nèi)注射后13天和27天取樣的血清中，抗h3n2流感病毒的特異性抗體效價(jià)的elisa結(jié)果(表9)。圖9示出了在用10mld50的h3n2流感病毒接種經(jīng)免疫的小鼠后，經(jīng)免疫的小鼠的存活率和體重變化。圖10示出了在每只小鼠以兩周的間隔肌內(nèi)注射兩次h1n1疫苗組合物的條件下，在第一次肌內(nèi)注射后13天、20天和27天取樣的血清中，抗h1n1流感病毒的特異性抗體效價(jià)的elisa結(jié)果(表11)。圖11示出了在每只小鼠以兩周的間隔肌內(nèi)注射兩次h1n1疫苗組合物的情況下，在第二次肌內(nèi)注射后1天、3天和7天的脾臟中，免疫細(xì)胞中的b細(xì)胞群體比例的測(cè)量結(jié)果(表14)。圖12示出了在每只小鼠以兩周的間隔肌內(nèi)注射兩次h1n1疫苗組合物的條件下，在第二次肌內(nèi)注射后1天、3天和7天的腹股溝淋巴結(jié)中，免疫細(xì)胞的b細(xì)胞群體比例的測(cè)量結(jié)果(表14)。圖13示出了在每只小鼠以兩周的間隔肌內(nèi)注射兩次h1n1疫苗組合物的條件下，在第二次肌內(nèi)注射后四周，接種h1n1病毒后1天和3天的脾臟和淋巴結(jié)中，b細(xì)胞群體比例的測(cè)量結(jié)果(表15)。圖14示出了在每只小鼠以兩周的間隔肌內(nèi)注射兩次h1n1疫苗組合物的條件下，在第一次肌內(nèi)注射后13天、20天和27天取樣的血清中，抗h1n1流感病毒的特異性抗體效價(jià)的elisa結(jié)果(表16)。具體實(shí)施方式在下文中，將參照以下實(shí)施例來更詳細(xì)地解釋本發(fā)明。然而，提供以下實(shí)施例和試驗(yàn)例僅用于說明本發(fā)明，但不應(yīng)解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。本發(fā)明中引用的文獻(xiàn)通過引用的方式并入到本發(fā)明的說明書中。實(shí)施例實(shí)施例1：對(duì)流感病毒中和抗體的疫苗佐劑效果的評(píng)價(jià)1-1.elisa為了評(píng)價(jià)治療性ct120和ct149抗體作為流感病毒疫苗佐劑的效果，如下表1所示進(jìn)行了動(dòng)物試驗(yàn)。如下表1所示，將0.2μgh1n1裂解疫苗單獨(dú)施用，或與通常用作佐劑的鋁佐劑(1mg)或與作為佐劑的ct120抗體(0.5μg、1μg、5μg、10μg)或ct149抗體(0.5μg、1μg、5μg、10μg)組合施用，之后測(cè)量每只小鼠中抗流感病毒的抗體效價(jià)。[表1]組抗原佐劑途徑小鼠#組1pbs-i.m.4組2pbsct12010μgi.m.4組3pbsct14910μgi.m.4組4h1n1裂解疫苗0.2μg-i.m.4組5h1n1裂解疫苗0.2μgct12010μgi.m.4組6h1n1裂解疫苗0.2μgct1205μgi.m.4組7h1n1裂解疫苗0.2μgct1201μgi.m.4組8h1n1裂解疫苗0.2μgct1200.5μgi.m.4組9h1n1裂解疫苗0.2μgct14910μgi.m.4組10h1n1裂解疫苗0.2μgct1495μgi.m.4組11h1n1裂解疫苗0.2μgct1491μgi.m.4組12h1n1裂解疫苗0.2μgct1490.5μgi.m.4組13h1n1裂解疫苗0.2μg鋁佐劑i.m.4如表1所示，將h1n1疫苗組合物以兩周的間隔肌內(nèi)注射小鼠兩次，隨后觀察每個(gè)試驗(yàn)組誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。在第一次肌內(nèi)注射后13天、17天和27天，從每個(gè)試驗(yàn)組取樣血清，并且通過elisa測(cè)量其抗體效價(jià)。如圖1的結(jié)果所示，相較于僅施用疫苗的組，疫苗與ct120、ct149或鋁佐劑聯(lián)合施用的組中產(chǎn)生更大量的抗體，該抗體能檢測(cè)到對(duì)應(yīng)于作為整體施用的疫苗的病毒。在比較疫苗和佐劑施用后27天的抗體的量時(shí)，在施用5μgct120或10μgct149的組中和在施用鋁佐劑的組中所產(chǎn)生的抗體的量相似，而在施用1μg或0.5μgct149的組中所產(chǎn)生的抗體的量大于施用鋁佐劑的組。1-2.血凝抑制試驗(yàn)(hi試驗(yàn)，血凝素抑制試驗(yàn))如下表2所示，為了驗(yàn)證治療性抗體ct120和ct149作為流感病毒疫苗佐劑是否有效，通過血凝抑制試驗(yàn)(hi試驗(yàn)，血凝素抑制試驗(yàn))評(píng)價(jià)疫苗的效力。在施用疫苗和佐劑后13天、17天和27天，從每只小鼠獲得血清，并測(cè)量能夠抑制流感病毒和雞紅細(xì)胞血凝反應(yīng)的抗體效價(jià)。[表2]如圖1的結(jié)果，在比較疫苗和佐劑施用后27天的抗體的量時(shí)，施用5μgct120和10μgct149的組(組6和組9)顯示出與施用鋁佐劑的組(組13)相似的hi效價(jià)，而施用1μg和0.5μgct149的組(組11和組12)顯示出高于施用鋁佐劑的組的hi效價(jià)。當(dāng)ct120或ct149與流感病毒疫苗的注射劑一起施用時(shí)，表現(xiàn)出相似或優(yōu)于鋁佐劑的免疫原性增強(qiáng)效果。因此，證明了ct120和ct149作為流感病毒疫苗佐劑是有效的。實(shí)施例2：確定抗原濃度以驗(yàn)證使用h1n1疫苗作為抗原時(shí)ct120和ct149的佐劑效果2-1.抗體生產(chǎn)結(jié)果如下表3所示，在驗(yàn)證治療性抗體的佐劑效果之前，進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)以確定合適的抗原濃度。h1n1疫苗(基于細(xì)胞的)以0.01μg至1μg的量單獨(dú)施用或與鋁佐劑組合施用，隨后通過elisa測(cè)量抗體效價(jià)，并通過hi測(cè)量中和抗體效價(jià)?！皹?biāo)準(zhǔn)品”表示市售的三價(jià)疫苗，用于試驗(yàn)結(jié)果的對(duì)比。[表3]組抗原佐劑途徑小鼠#組1pbs-i.m.5組2h1n1疫苗1μg-i.m.5組3h1n1疫苗1μg鋁佐劑i.m.5組4標(biāo)準(zhǔn)品3μg-i.m.5組5h1n1疫苗0.5μg-i.m.5組6h1n1疫苗0.5μg鋁佐劑i.m.5組7h1n1疫苗0.2μg-i.m.5組8h1n1疫苗0.2μg鋁佐劑i.m.5組9h1n1疫苗0.1μg-i.m.5組10h1n1疫苗0.1μg鋁佐劑i.m.5組11標(biāo)準(zhǔn)品0.3μg-i.m.5組12h1n1疫苗0.05μg-i.m.5組13h1n1疫苗0.05μg鋁佐劑i.m.5組14h1n1疫苗0.01μg-i.m.5組15h1n1疫苗0.01μg鋁佐劑i.m.5組16標(biāo)準(zhǔn)品0.03μg-i.m.5如表3所示，將h1n1疫苗組合物以兩周的間隔肌內(nèi)注射小鼠兩次，隨后觀察每個(gè)試驗(yàn)組誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。在第一次肌內(nèi)注射后28天，從每個(gè)試驗(yàn)組取樣血清，通過elisa測(cè)量血清中抗ha蛋白和病毒的抗體效價(jià)，并通過hi試驗(yàn)測(cè)量中和抗體的效價(jià)。如圖2的結(jié)果所示，抗體效價(jià)的增加大致與所添加的抗原量成比例，當(dāng)隨之添加鋁佐劑時(shí)，抗體效價(jià)更高。此外，抗ha蛋白的抗體效價(jià)與抗h1n1病毒的抗體效價(jià)差異不大。[表4]從表4的結(jié)果可以明顯看出，與僅施用抗原的試驗(yàn)組相比，施用抗原和鋁佐劑的試驗(yàn)組的hi效價(jià)增加。此外，在抗原濃度為0.1μg的試驗(yàn)組(組9和組10)和抗原濃度為0.05μg的試驗(yàn)組(組12和組13)中，與僅添加抗原時(shí)相比，額外添加了鋁佐劑時(shí)hi效價(jià)分別增加8倍和4倍，從而明確證實(shí)了在含有或不含有佐劑的疫苗效力之間存在差異。2-2.保護(hù)性免疫力的結(jié)果為了評(píng)價(jià)第二次免疫后4周抗流感病毒的保護(hù)性免疫力，將10mld50的ca/04/09h1n1病毒接種到經(jīng)免疫的小鼠鼻腔中使其感染，隨后持續(xù)15天測(cè)量每只小鼠的存活率和體重的變化。如圖3的結(jié)果所示，與僅施用抗原的試驗(yàn)組相比，在施用抗原和鋁佐劑的試驗(yàn)組中，所有濃度下抗流感病毒的保護(hù)性免疫力效果都較高。此外，對(duì)于兩種抗原濃度(0.1μg和0.05μg)的試驗(yàn)組，通過hi效價(jià)測(cè)量，在這兩種抗原濃度下存在或不存在佐劑的疫苗效果顯著不同，在0.1μg試驗(yàn)組中，僅施用抗原的試驗(yàn)組顯示出80％的存活率，而施用抗原和佐劑的試驗(yàn)組的存活率為100％。另一方面，在0.05μg試驗(yàn)組中，僅施用抗原的試驗(yàn)組顯示出60％的存活率，而施用抗原和佐劑的試驗(yàn)組的存活率為100％。2-3.結(jié)論基于抗流感病毒的hi效價(jià)結(jié)果和保護(hù)性免疫效果，對(duì)于0.1μg試驗(yàn)組，hi效價(jià)結(jié)果是不同的，但依賴于是否存在佐劑的保護(hù)性免疫效果的差異較小，而0.05μg試驗(yàn)組顯示出hi效價(jià)結(jié)果和保護(hù)性免疫效果依賴于是否存在佐劑而顯著不同，因此將0.05μg確定為最終抗原濃度。下面，使用該條件進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)以評(píng)價(jià)佐劑效果。實(shí)施例3：使用h1n1疫苗作為抗原評(píng)價(jià)ct120和ct149的佐劑效果3-1.使用h1n1疫苗作為抗原評(píng)價(jià)ct120的佐劑效果3-1-1.抗體生產(chǎn)結(jié)果使用基于動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果(實(shí)施例2)確定的0.05μg的抗原濃度，進(jìn)行用于驗(yàn)證治療性抗體ct120和ct149的佐劑效果的動(dòng)物試驗(yàn)。此處，在小鼠試驗(yàn)中，預(yù)期對(duì)應(yīng)于ct120和ct149抗體的小鼠形式ct120(migg2a)和ct149(migg2a)的佐劑效果與ct120或ct149同樣有效，因此，將ct120和ct149及其小鼠形式用于動(dòng)物試驗(yàn)。通過將人igg1形式的ct120或ct149中fc區(qū)的恒定區(qū)替換為小鼠的igg1或igg2a區(qū)，來制備小鼠形式的抗體。通過預(yù)試驗(yàn)(本文未描述)，選擇作為佐劑有效的濃度，來確定ct120和ct120(migg2a)的量。如下表5所示，將h1n1疫苗(基于細(xì)胞的)與不同濃度的治療性抗體混合，在37℃下反應(yīng)1小時(shí)，并以2周的間隔肌內(nèi)注射兩次。第一次肌內(nèi)注射后13天、20天和27天，在每個(gè)試驗(yàn)組中取樣血清，并分別通過elisa和hi試驗(yàn)測(cè)量血清中抗h1n1病毒的抗體效價(jià)和中和抗體效價(jià)。[表5]組抗原佐劑途徑小鼠#組1pbs-i.m.10組2pbsct1200.5μgi.m.10組3pbsct120(migg2a)0.5μgi.m.10組4h1n1疫苗0.05μg-i.m.10組5h1n1疫苗0.05μgct1200.05μgi.m.10組6h1n1疫苗0.05μgct1200.1μgi.m.10組7h1n1疫苗0.05μgct1200.5μgi.m.10組8h1n1疫苗0.05μgct120(migg2a)0.05μgi.m.10組9h1n1疫苗0.05μgct120(migg2a)0.1μgi.m.10組10h1n1疫苗0.05μgct120(migg2a)0.5μgi.m.10組11h1n1疫苗0.05μg鋁佐劑i.m.10組12標(biāo)準(zhǔn)品0.15μg-i.m.10如圖4的結(jié)果所示，與使用ct120作為佐劑的試驗(yàn)組相比，使用小鼠形式的ct120(migg2a)作為佐劑的試驗(yàn)組中的抗h1n1病毒的抗體效價(jià)更高。此外，在使用ct120(migg2a)的試驗(yàn)組的情況下，抗體效價(jià)高于使用鋁佐劑作為佐劑的試驗(yàn)組，并且第一次免疫后3周取樣的血清中(圖5中的d20)抗體效價(jià)急劇增加。[表6]從表6的結(jié)果可以明顯看出，與使用ct120作為佐劑的試驗(yàn)組相比，使用ct120(migg2a)作為佐劑的試驗(yàn)組中，hi效價(jià)通常增加，取決于所使用的濃度最多增加4倍。在所有試驗(yàn)組中，使用0.5μgct120(migg2a)的、具有最高的抗體效價(jià)的試驗(yàn)組(組10)，顯示出最高的hi效價(jià)，具體為160。3-1-2.保護(hù)性免疫力結(jié)果為了評(píng)價(jià)第二次免疫后4周抗流感病毒的保護(hù)性免疫力，將10mld50的ca/04/09h1n1病毒接種到經(jīng)免疫的小鼠鼻腔中使其感染，隨后持續(xù)15天測(cè)量每只小鼠的存活率和體重的變化。如圖5的結(jié)果所示，使用ct120(migg2a)作為佐劑時(shí)，其存活率高于使用ct120作為佐劑的試驗(yàn)組或僅使用抗原的試驗(yàn)組，且其體重變化最低。具體地，使用0.5μgct120(migg2a)作為佐劑的、具有最高抗體效價(jià)和hi效價(jià)結(jié)果的試驗(yàn)組，顯示出100％的存活率，比使用鋁佐劑作為佐劑的試驗(yàn)組高30％。因此，證明了與ct120相比，ct120(migg2a)作為佐劑更有效，且以0.5μg的濃度施用時(shí)顯示出最佳效果。3-2.使用h1n1疫苗作為抗原評(píng)價(jià)ct149的佐劑效果3-2-1.抗體生產(chǎn)結(jié)果如下表7所示，確定ct149在預(yù)試驗(yàn)(本文未描述)中顯示出佐劑效果的濃度，并進(jìn)行與實(shí)施例3-1-1相同的試驗(yàn)。[表7]組抗原佐劑途徑小鼠#組1pbs-i.m.10組2pbsct1490.5μgi.m.10組3pbsct149(migg2a)0.5μgi.m.10組4h1n1疫苗0.05μg-i.m.10組5h1n1疫苗0.05μgct1490.01μgi.m.10組6h1n1疫苗0.05μgct1490.05μgi.m.10組7h1n1疫苗0.05μgct1490.5μgi.m.10組8h1n1疫苗0.05μgct149(migg2a)0.01μgi.m.10組9h1n1疫苗0.05μgct149(migg2a)0.05μgi.m.10組10h1n1疫苗0.05μgct149(migg2a)0.5μgi.m.10組11h1n1疫苗0.05μg鋁佐劑i.m.10組12標(biāo)準(zhǔn)品0.15μg-i.m.10如圖6的結(jié)果所示，與ct120不同，ct149的佐劑效果通常較弱，并且在使用0.5μgct149(migg2a)的試驗(yàn)組中，表現(xiàn)出與使用鋁佐劑的試驗(yàn)組相似的抗體效價(jià)。[表8]抗原佐劑hi效價(jià)g1pbs-n.d.g2pbsct1490.5μgn.d.g3pbsct149(migg2a)0.5μgn.d.g4h1n1疫苗0.05μg-20g5h1n1疫苗0.05μgct1490.01μg20g6h1n1疫苗0.05μgct1490.05μg40g7h1n1疫苗0.05μgct1490.5μg20g8h1n1疫苗0.05μgct149(migg2a)0.01μg20g9h1n1疫苗0.05μgct149(migg2a)0.05μg40g10h1n1疫苗0.05μgct149(migg2a)0.5μg80g11h1n1疫苗0.05μg鋁佐劑80g12標(biāo)準(zhǔn)品0.15μg-n.d.從表8的結(jié)果可以明顯看出，在使用ct149或ct149(migg2a)作為佐劑的試驗(yàn)組中，hi效價(jià)沒有顯著增加，并且如通過elisa測(cè)定的抗體效價(jià)的結(jié)果所示，使用0.5μgct149(migg2a)的試驗(yàn)組(組10)中的hi效價(jià)與使用鋁佐劑的試驗(yàn)組(組11)相同。3-2-2.保護(hù)性免疫力結(jié)果為了評(píng)價(jià)第二次免疫后4周抗流感病毒的保護(hù)性免疫力，將10mld50的ca/04/09h1n1病毒接種到經(jīng)免疫的小鼠鼻腔中使其感染，隨后持續(xù)15天測(cè)量每只小鼠的存活率和體重的變化。如圖7的結(jié)果所示，使用0.5μgct149(migg2a)作為佐劑的試驗(yàn)組顯示出80％存活率，比使用鋁佐劑的試驗(yàn)組高10％。與使用鋁佐劑的試驗(yàn)組相比，體重變化的程度沒有明顯改善。3-3.結(jié)論基于上述結(jié)果，ct120(migg2a)對(duì)于h1n1疫苗顯示出優(yōu)異的佐劑效果，特別是以0.5μg濃度使用時(shí)效果最佳。當(dāng)使用0.5μgct149(migg2a)時(shí)，顯示出佐劑效果，但低于ct120(migg2a)的佐劑效果。實(shí)施例4：使用h3n2疫苗作為抗原評(píng)價(jià)ct120和ct149的佐劑效果實(shí)施例1～3證實(shí)了ct120和ct149作為h1n1疫苗佐劑的效果，使用另一種流感病毒株，菲律賓/2/82(h3n2)，生產(chǎn)h3n2疫苗(基于細(xì)胞的)，并進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)以評(píng)價(jià)ct120和ct149作為h3n2疫苗佐劑的效果。4-1.抗體生產(chǎn)結(jié)果如下表9所示，在驗(yàn)證治療性抗體的佐劑效果之前，進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)以確定合適的抗原濃度。h3n2疫苗以0.01μg至1μg的量單獨(dú)施用或與鋁佐劑組合施用，隨后通過elisa測(cè)量抗體效價(jià)并通過hi測(cè)量中和抗體效價(jià)。此外，為了評(píng)價(jià)保護(hù)性免疫力效果，用適于小鼠的菲律賓/2/82(h3n2)病毒感染每只小鼠，并測(cè)量其存活率和體重的變化。[表9]組抗原佐劑途徑小鼠#組1pbs-i.m.5組2h3n2疫苗1μg-i.m.5組3h3n2疫苗1μg鋁佐劑i.m.5組4h3n2疫苗0.5μg-i.m.5組5h3n2疫苗0.5μg鋁佐劑i.m.5組6h3n2疫苗0.2μg-i.m.5組7h3n2疫苗0.2μg鋁佐劑i.m.5組8h3n2疫苗0.1μg-i.m.5組9h3n2疫苗0.1μg鋁佐劑i.m.5組10h3n2疫苗0.05μg-i.m.5組11h3n2疫苗0.05μg鋁佐劑i.m.5組12h3n2疫苗0.01μg-i.m.5組13h3n2疫苗0.01μg鋁佐劑i.m.5如表9所示，將h3n2疫苗組合物以兩周的間隔肌內(nèi)注射小鼠兩次，隨后觀察每個(gè)試驗(yàn)組誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。在每次肌內(nèi)注射后2周，從每個(gè)試驗(yàn)組取樣血清，通過elisa測(cè)量血清中抗h3n2病毒的抗體效價(jià)，并通過hi試驗(yàn)測(cè)量中和抗體效價(jià)。如圖8的結(jié)果所示，抗體效價(jià)的增加與添加的抗原量成比例，當(dāng)與鋁佐劑一起使用時(shí)，抗體效價(jià)更高。[表10]從表10的結(jié)果可以看出，使用抗原和鋁佐劑的試驗(yàn)組中的hi效價(jià)高于僅使用抗原的試驗(yàn)組。在使用0.01μg和0.05μg抗原的試驗(yàn)組中(組12和組10)，沒有測(cè)量出hi效價(jià)，但是在額外添加鋁佐劑作為佐劑的試驗(yàn)組(組13和組11)中，hi效價(jià)分別增加至160和640。4-2.保護(hù)性免疫力結(jié)果為了評(píng)價(jià)第二次免疫后4周抗流感病毒的保護(hù)性免疫力，將10mld50的a/菲律賓/2/82h3n2病毒接種到經(jīng)免疫的小鼠鼻腔中使其感染，隨后持續(xù)15天測(cè)量每只小鼠的存活率和體重的變化。如圖9的結(jié)果所示，除僅使用低劑量抗原(即0.01μg抗原和0.05μg抗原)的試驗(yàn)組外，其他試驗(yàn)組的免疫應(yīng)答效果都較高。4-3.結(jié)論在實(shí)施例3的h1n1試驗(yàn)中所使用的抗原濃度(0.05μg)下，h3n2疫苗組合物顯示出依賴于是否存在佐劑的可變的hi效價(jià)和存活率。因此，以與實(shí)施例3相同的方式，使用確定的0.05μgh3n2抗原濃度進(jìn)行用于評(píng)價(jià)治療性抗體ct120和ct149的佐劑效果的動(dòng)物試驗(yàn)，由此證實(shí)了ct120和ct149作為h3n2疫苗佐劑的效果，其中h3n2疫苗用作抗原。實(shí)施例5：流感疫苗佐劑的功能機(jī)制基于實(shí)施例1～4的試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)論是治療性流感抗體起到增強(qiáng)流感疫苗效力的佐劑作用。因此，進(jìn)行了動(dòng)物試驗(yàn)，以測(cè)試產(chǎn)生佐劑效果的機(jī)制。關(guān)于治療性抗體顯示出作為流感疫苗佐劑效果的機(jī)制的假說是，抗體的fc區(qū)可能結(jié)合存在于免疫細(xì)胞中的fc受體，由此可以更有效地發(fā)生對(duì)流感疫苗的免疫應(yīng)答。為了證明這一假說，選擇在實(shí)施例3中被證明有明顯佐劑效果的、0.1μg和0.5μg的ct120(migg2a)抗體濃度，并且如下表11所示，將完整的ct120(migg2a)和不含fc的ct120(migg2a)f(ab')2以不同的量與0.05μgh1n1疫苗反應(yīng)，然后肌內(nèi)注射到小鼠中，之后觀察誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。5-1.抗體生產(chǎn)結(jié)果如下表11所示，測(cè)試以0.1μg和0.5μg的濃度施用ct120(migg2a)的組，在實(shí)施例3中顯示在該濃度下具有作為h1n1疫苗佐劑的最佳效果。對(duì)于施用ct120(migg2a)f(ab')2的組，在下組中進(jìn)行試驗(yàn)：一個(gè)組中，施用與ct120(migg2a)相同的量；以及，一個(gè)組中，ct120(migg2a)f(ab')2的量經(jīng)計(jì)算，以與0.5μg和0.1μgct120(migg2a)的疫苗相同的摩爾比來施用。[表11]組抗原佐劑途徑小鼠#組1pbs-i.m.10組2h1n1疫苗0.05μg-i.m.10組3pbsct120(migg2a)f(ab')20.5μgi.m.10組4pbsct120(migg2a)0.5μgi.m.10組5h1n1疫苗0.05μg鋁佐劑i.m.10組6h1n1疫苗0.05μgct120(migg2a)0.5μgi.m.10組7h1n1疫苗0.05μgct120(migg2a)0.1μgi.m.10組8h1n1疫苗0.05μgct120(migg2a)f(ab')20.5μgi.m.10組9h1n1疫苗0.05μgct120(migg2a)f(ab')20.3μgi.m.10組10h1n1疫苗0.05μgct120(migg2a)f(ab')20.1μgi.m.10組11h1n1疫苗0.05μgct120(migg2a)f(ab')20.06μgi.m.10如表11所示，將h1n1疫苗與各種濃度的ct120(migg2a)或ct120(migg2a)f(ab')2混合，在37℃反應(yīng)1小時(shí)，以2周的間隔肌內(nèi)注射小鼠兩次，之后觀察每個(gè)試驗(yàn)組誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。第一次肌內(nèi)注射后13天、20天和27天，在每個(gè)試驗(yàn)組中取樣血清，并分別通過elisa和hi測(cè)量血清中抗h1n1病毒的抗體效價(jià)和抗h1n1病毒的中和抗體效價(jià)。如圖10的結(jié)果所示，使用ct120(migg2a)f(ab')2時(shí)，抗體效價(jià)相對(duì)較低，抗體效價(jià)的不同在各試驗(yàn)組間無顯著性差異。[表12]組抗原佐劑途徑hi效價(jià)組1pbs-i.m.n.d.組2h1n1疫苗0.05μg-i.m.20組3pbsct120(migg2a)f(ab')20.5μgi.m.n.d.組4pbsct120(migg2a)0.5μgi.m.n.d.組5h1n1疫苗0.05μg鋁佐劑i.m.160組6h1n1疫苗0.05μgct120(migg2a)0.5μgi.m.160組7h1n1疫苗0.05μgct120(migg2a)0.1μgi.m.80組8h1n1疫苗0.05μgct120(migg2a)f(ab')20.5μgi.m.40組9h1n1疫苗0.05μgct120(migg2a)f(ab')20.3μgi.m.20組10h1n1疫苗0.05μgct120(migg2a)f(ab')20.1μgi.m.20組11h1n1疫苗0.05μgct120(migg2a)f(ab')20.06μgi.m.40從表12的結(jié)果可以明顯看出，使用ct120(migg2a)f(ab')2作為佐劑的所有試驗(yàn)組中(組8～組11)的hi效價(jià)，與單獨(dú)施用h1n1疫苗而不含佐劑的試驗(yàn)組(組2)相似。相比之下，使用完整ct120(migg2a)作為佐劑的試驗(yàn)組(組6和組7)分別顯示出160和80的hi效價(jià)，與單獨(dú)施用h1n1疫苗的試驗(yàn)組(組2)相比增加了8倍和4倍。5-2.保護(hù)性免疫力結(jié)果為了評(píng)價(jià)第二次免疫后4周抗流感病毒的保護(hù)性免疫力，將10mld50的ca/04/09h1n1病毒接種到經(jīng)免疫的小鼠鼻腔中使其感染，隨后持續(xù)15天測(cè)量每只小鼠的存活率。[表13]從表13的結(jié)果可以明顯看出，如實(shí)施例3一樣，使用完整ct120(migg2a)作為佐劑的試驗(yàn)組(組6和組7)顯示出高存活率，而使用ct120(migg2a)f(ab')2作為佐劑的試驗(yàn)組(組8～組11)表現(xiàn)出與僅使用抗原的試驗(yàn)組(組2)相似的存活率。5-3.結(jié)論基于上述結(jié)果，證明了抗體的fc區(qū)在作為流感疫苗佐劑中起重要作用。實(shí)施例6：流感疫苗佐劑的靶免疫細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)6-1.靶免疫細(xì)胞的驗(yàn)證實(shí)施例5中確認(rèn)了流感抗體的fc區(qū)作為佐劑起重要作用。相應(yīng)地，進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，以從表達(dá)fc受體的免疫細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)具有依賴于與fc區(qū)結(jié)合而變化的免疫應(yīng)答的細(xì)胞。用作抗體的量為0.5μg小鼠形式的ct120(migg2a)，在實(shí)施例3中顯示出該量作為h1n1疫苗佐劑具有最佳效果。[表14]組抗原佐劑途徑小鼠#組1pbs-i.m3組2h1n1疫苗0.05μg-i.m3組3-ct120(migg2a)0.5μgi.m3組4h1n1疫苗0.05μg鋁佐劑i.m3組5h1n1疫苗0.05μgct120(migg2a)0.5μgi.m3組6h1n1疫苗0.05μgct120(migg2a)f(ab')20.5μgi.m3如表14所示，將h1n1疫苗與佐劑混合，在37℃下反應(yīng)1小時(shí)，并以2周的間隔肌內(nèi)注射小鼠兩次。在1天、3天和7天后，分離每只小鼠的脾和腹股溝淋巴結(jié)，從而測(cè)量各種免疫細(xì)胞的數(shù)量和相應(yīng)的細(xì)胞比例。如圖11和圖12的結(jié)果所示，與其他施用組相比，當(dāng)加入h1n1疫苗和ct120(migg2a)時(shí)，在兩次肌內(nèi)注射后1天，脾臟和腹股溝淋巴結(jié)中的b細(xì)胞的量大約增加了一倍。在第3天和第7天，得到相對(duì)類似的細(xì)胞比例。因此，證實(shí)了ct120佐劑通過fc區(qū)提高b細(xì)胞的免疫應(yīng)答。在施用ct120f(ab')2的組中，其與施用pbs對(duì)照的小鼠沒有差異，從而再次證實(shí)fc區(qū)的重要性。相應(yīng)地，可證明ct120佐劑通過與市售佐劑鋁佐劑不同的機(jī)制來增加h1n1疫苗的免疫原性。6-2.b細(xì)胞的保護(hù)性免疫力結(jié)果在實(shí)施例6-1中，證實(shí)了ct120佐劑增強(qiáng)b細(xì)胞的免疫力?；诖?，進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)來評(píng)價(jià)ct120佐劑是否即使在病毒接種的狀態(tài)下，也能與b細(xì)胞的保護(hù)性免疫力相關(guān)。[表15]組抗原佐劑途徑小鼠#組1pbs-i.m3組2h1n1疫苗0.05μg-i.m3組3h1n1疫苗0.05μgct120(migg2a)0.5μgi.m3組4h1n1疫苗0.05μg鋁佐劑i.m3如表15所示，將h1n1疫苗組合物以2周的間隔肌內(nèi)注射小鼠兩次。4周后，將10mld50的ca/04/09h1n1病毒接種到經(jīng)免疫的小鼠鼻腔中。病毒感染后1天和3天，分離每只小鼠的脾臟和內(nèi)部淋巴結(jié)，并使用流式細(xì)胞儀測(cè)量所有細(xì)胞中的b細(xì)胞比例。如圖13的結(jié)果所示，當(dāng)病毒感染后1天對(duì)脾臟進(jìn)行分析時(shí)，與pbs對(duì)照相比，在使用h1n1疫苗和ct120兩者的試驗(yàn)組中，b細(xì)胞群體增加了約10％。在使用疫苗和鋁佐劑兩者的試驗(yàn)組中，b細(xì)胞群體與pbs對(duì)照相比顯著增加，但與使用ct120的試驗(yàn)組相比未顯著增加。此外，在其他組中存在未成熟的b細(xì)胞，即b-1細(xì)胞(cd19+b220-)，但在使用h1n1疫苗和ct120的試驗(yàn)組中僅存在由b-1細(xì)胞發(fā)育來的b-2細(xì)胞(cd19+b220+)。對(duì)于淋巴結(jié)，與脾臟中相同，b細(xì)胞比例未急劇增加，但在三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中顯著增加。6-3結(jié)論因此，當(dāng)使用ct120作為佐劑時(shí)，迅速形成更多的成熟b細(xì)胞。實(shí)施例7：市售佐劑與ct120的效果比較通過上述實(shí)施例，證實(shí)了ct120作為流感疫苗佐劑是有效的，并且將該效果與目前有用的流感疫苗佐劑的效果進(jìn)行比較。目前市售的季節(jié)性流感疫苗佐劑是novartis的mf59、fluad。在以下比較試驗(yàn)中，使用具有與mf59相同組成的addavaxtm(invivogen，貨號(hào)#vac-adx-10)。7-1抗體生產(chǎn)結(jié)果使用0.5μg和0.1μg小鼠形式的ct120(migg2a)進(jìn)行試驗(yàn)，其在實(shí)施例3中顯示出作為h1n1疫苗佐劑具有最佳效果。在下表16中，100％addvax表示在45μg季節(jié)性流感疫苗ha中所含佐劑的量。[表16]組抗原佐劑途徑小鼠#組1pbs-i.m.10組2h1n1疫苗0.05μg-i.m.10組3pbsct120(migg2a)0.5μgi.m.10組4pbsaddvax100％i.m.10組5h1n1疫苗0.05μg鋁佐劑i.m.10組6h1n1疫苗0.05μgct120(migg2a)0.5μgi.m.10組7h1n1疫苗0.05μgct120(migg2a)0.1μgi.m.10組8h1n1疫苗0.05μgaddvax100％i.m.10組9h1n1疫苗0.05μgaddvax10％i.m.10組10h1n1疫苗0.05μgaddvax1％i.m.10如表16所示，將h1n1疫苗與ct120(migg2a)或具有與市售佐劑相同組成的addvax混合，在37℃下反應(yīng)1小時(shí)，以2周的間隔肌內(nèi)注射小鼠兩次，隨后觀察每個(gè)試驗(yàn)組誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。第一次肌內(nèi)注射后13天、20天和27天，在每個(gè)試驗(yàn)組中取樣血清，并分別通過elisa和hi測(cè)量血清中抗h1n1病毒的抗體效價(jià)和抗h1n1病毒的中和抗體效價(jià)。如圖14的結(jié)果所示，僅施用100％addavax的試驗(yàn)組顯示出與施用0.5μg和0.1μgct120(migg2a)的試驗(yàn)組相似的抗體效價(jià)。當(dāng)施用10％和1％的addavax時(shí)，所得抗體效價(jià)較低。[表17]組抗原佐劑hi效價(jià)組1pbs-n.d.組2h1n1疫苗0.05μg-20組3pbsct120(migg2a)0.5μgn.d.組4pbsaddvax100％n.d.組5h1n1疫苗0.05μg鋁佐劑160組6h1n1疫苗0.05μgct120(migg2a)0.5μg160組7h1n1疫苗0.05μgct120(migg2a)0.1μg80組8h1n1疫苗0.05μgaddvax100％160組9h1n1疫苗0.05μgaddvax10％20組10h1n1疫苗0.05μgaddvax1％n.d.從表17的結(jié)果可以看出，施用100％addvax的試驗(yàn)組(組8)顯示出與施用0.5μg和0.1μgct120(migg2a)的試驗(yàn)組(組6和組7)相似的hi效價(jià)，而施用1％和10％addvax的試驗(yàn)組(組10和組9)的hi效價(jià)未測(cè)量到，或表現(xiàn)出與僅施用h1n1疫苗的試驗(yàn)組(組2)相似的hi效價(jià)。7-2.保護(hù)性免疫力結(jié)果為了評(píng)價(jià)第二次免疫后4周抗流感病毒的保護(hù)性免疫力，將10mld50的ca/04/09h1n1病毒接種到經(jīng)免疫的小鼠鼻腔中使其感染，之后持續(xù)15天測(cè)量小鼠的存活率。[表18]從表18的結(jié)果可以看出，施用100％addavax的試驗(yàn)組(組8)顯示出與施用0.5μg和0.1μgct120(migg2a)的試驗(yàn)組(組6和組7)相似的存活率，而在施用1％和10％addvax的試驗(yàn)組(組10和組9)中存活率降低。7-3.結(jié)論因此，在h1n1疫苗添加了0.5μg和0.1μgct120(migg2a)時(shí)的佐劑效果，與在45μg市售流感疫苗ha中添加一定量的佐劑(100％addavax)時(shí)的效果相似。在實(shí)施例4中，當(dāng)使用0.5μgct149(migg2a)作為佐劑時(shí)，結(jié)果與施用0.1μg和0.5μgct120(migg2a)時(shí)類似，由此可以預(yù)期ct149(migg2a)顯示出的效果與ct120(migg2a)相似。<110>賽特瑞恩股份有限公司<120>含至少一種流感病毒的中和性結(jié)合分子的佐劑組合物及含該佐劑組合物的疫苗組合物<130>cpd2015043kr<160>16<170>kopatentin2.0<210>1<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223>ct120輕鏈cdr1<400>1argalasergluasniletrpasnasnleuala1510<210>2<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>ct120輕鏈cdr2<400>2glyalaserthrglyalathr15<210>3<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>ct120輕鏈cdr3<400>3glnglntyrasnsertrpproargthr15<210>4<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>ct120重鏈cdr1<400>4serhisalaileser15<210>5<211>17<212>prt<213>人工序列<220><223>ct120重鏈cdr2<400>5glyileserprometpheglythrthrhistyralaglnlysphegln151015gly<210>6<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>ct120重鏈cdr3<400>6aspglyalaglysertyrtyrproleuasntrppheasppro1510<210>7<211>12<212>prt<213>人工序列<220><223>ct149輕鏈cdr1<400>7argalaserhisargvalglyserthrtyrileala1510<210>8<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>ct149輕鏈cdr2<400>8glyalaserasnargalathr15<210>9<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>ct149輕鏈cdr3<400>9glnglnpheservalserprotrpthr15<210>10<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>ct149重鏈cdr1<400>10thrtyrglyvalser15<210>11<211>17<212>prt<213>人工序列<220><223>ct149重鏈cdr2<400>11trpileseralatyrthrglyilethrasptyralaglnlysphegln151015gly<210>12<211>17<212>prt<213>人工序列<220><223>ct149重鏈cdr3<400>12asplysvalglnglyargvalgluvalglyserglyglyarghisasp151015tyr<210>13<211>234<212>prt<213>人工序列<220><223>ct120輕鏈<400>13metglualaproalaglnleuleupheleuleuleuleutrpleupro151015aspthrthrglygluilevalleuthrglnserproalathrleuser202530leuserproglygluargalathrleusercysargalasergluasn354045iletrpasnasnleualatrptyrglnglnlysproglyglnalapro505560argleuleuileserglyalaserthrglyalathrglyvalproser65707580argpheargglyserglyserargthrgluphethrleuthrileser859095serleuglnsergluaspphealailetyrphecysglnglntyrasn100105110sertrpproargthrpheglyproglythrlysvalgluilelysarg115120125thrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglugln130135140leulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphetyr145150155160proargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleuglnser165170175glyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspserthr180185190tyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglulys195200205hislysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuserserpro210215220valthrlysserpheasnargglyglucys225230<210>14<211>472<212>prt<213>人工序列<220><223>ct120重鏈<400>14metasptrpthrtrpargpheleuphevalvalalaalaalathrgly151015valglncysglnvalglnleuvalglnserglyalagluvallysmet202530proglyserservallysvalsercyslysthrserglyvalphephe354045serserhisalailesertrpvalargglnalaproglyglnglyleu505560glutrpmetglyglyileserprometpheglythrthrhistyrala65707580glnlyspheglnglyargvalthrilethralaaspglnserthrthr859095thralatyrmetgluleuthrserleuthrsergluaspthralaval100105110tyrtyrcysalaargaspglyalaglysertyrtyrproleuasntrp115120125pheaspprotrpglyglnglythrleuvalthrvalserseralaser130135140thrlysglyproservalpheproleualaproserserlysserthr145150155160serglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyrphepro165170175gluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrserglyval180185190histhrpheproalavalleuglnserserglyleutyrserleuser195200205servalvalthrvalproserserserleuglythrglnthrtyrile210215220cysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplysargval225230235240gluprolyssercysasplysthrhisthrcysproprocysproala245250255progluleuleuglyglyproservalpheleupheproprolyspro260265270lysaspthrleumetileserargthrarggluvalthrcysvalval275280285valaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrval290295300aspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarggluglugln305310315320tyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisgln325330335asptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysala340345350leuproalaproileglulysthrileserlysalalysglyglnpro355360365arggluproglnvaltyrthrleuproproserargaspgluleuthr370375380lysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrproser385390395400aspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyr405410415lysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleutyr420425430serlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphe435440445sercysservalmethisgluglyleuhisasnhistyrthrglnlys450455460serleuserleupheproglylys465470<210>15<211>215<212>prt<213>人工序列<220><223>ct149輕鏈<400>15gluvalvalleuthrglnserproglythrleualaleuproprogly151015gluargalathrleusercysargalaserhisargvalglyserthr202530tyrilealatrptyrglnglnlysserglyglnalaproargargleu354045iletyrglyalaserasnargalathraspileproaspargpheser505560glyserglyserglythraspphethrleuthrileargargleuglu65707580progluaspseralavaltyrtyrcysglnglnpheservalserpro859095trpthrpheglyglnglythrargvalgluilelysargthrvalala100105110alaproservalpheilepheproproseraspgluglnleulysser115120125glythralaservalvalcysleuleuasnasnphetyrproargglu130135140alalysvalglntrplysvalaspasnalaleuglnserglyasnser145150155160glngluservalthrgluglnaspserlysaspserthrtyrserleu165170175serserthrleuthrleuserlysalaasptyrglulyshislysval180185190tyralacysgluvalthrhisglnglyleuserserprovalthrlys195200205serpheasnargglyglucys210215<210>16<211>456<212>prt<213>人工序列<220><223>ct149重鏈<400>16glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala151015servallysvalsercyslysthrserglytyrserpheserthrtyr202530glyvalsertrpvalargglnalaproglyglnglyproglutrpval354045glytrpileseralatyrthrglyilethrasptyralaglnlysphe505560glnglyargvalthrleuthrthraspalathrthralathralaphe65707580leuaspleuargserleuargproaspaspthralathrtyrphecys859095alaargasplysvalglnglyargvalgluvalglyserglyglyarg100105110hisasptyrtrpglyglnglythrleuvalilevalserseralaser115120125thrlysglyproservalpheproleualaproserserlysserthr130135140sergly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