發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明大體上涉及用于誘導(dǎo)對(duì)單純皰疹病毒2型(hsv-2)的免疫應(yīng)答的治療組合物和方法的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及通過引入和表達(dá)編碼hsvgd2的dna疫苗來誘導(dǎo)受試者中的免疫應(yīng)答的方法。發(fā)明背景單純皰疹病毒2型(hsv-2)是皰疹病毒科(herpesviridae)的成員，并且是生殖器潰瘍病的主要原因。該病毒感染了全世界5億多人(looker等人，2008)。hsv-2在感覺神經(jīng)根神經(jīng)節(jié)中達(dá)到潛伏狀態(tài)，并且當(dāng)身體的免疫功能下降時(shí)再激活，引起反復(fù)發(fā)作(gupta等人，2007)。然而，控制病毒潛伏期的機(jī)制仍然難以捉摸。雖然生殖器皰疹是世界范圍高度流行的疾病，但目前沒有可用的針對(duì)hsv-2感染的療法。1.1hsv-2發(fā)病機(jī)理hsv-2進(jìn)入需要病毒糖蛋白d(gd2)與其受體的復(fù)合(complexation)。gd2受體包括皰疹病毒進(jìn)入介質(zhì)(hvem)、連接蛋白-1(nectin-1)和-2以及硫酸肝素中的特異性位點(diǎn)(spear等人，2000)。在急性hsv感染期間，gd2與hvem相互作用，導(dǎo)致生殖器粘膜處隨后的cd8+回憶應(yīng)答降低(kopp等人，2012)。hsv-2還通過降低i型干擾素(即，ifn-α和ifn-β)的水平和增加ii型干擾素(即，ifn-γ)的水平改變先天免疫應(yīng)答(peng等人，2009)。提出，hsv-2還阻斷樹突狀細(xì)胞(dc)成熟和誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞(dc)細(xì)胞凋亡并觸發(fā)促炎細(xì)胞因子的釋放(stefanidou等人，2013；和peretti等人，2005)。hsv-2重新激活導(dǎo)致反復(fù)發(fā)作，范圍從輕度到重度病例。hsv感染的癥狀包括生殖器皮膚或粘膜中的水樣水皰。病變愈合伴隨著皰疹疾病典型的結(jié)痂。1.2對(duì)hsv-2的先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答對(duì)hsv-2的強(qiáng)大和穩(wěn)健的免疫應(yīng)答需要先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答兩者。適應(yīng)性免疫應(yīng)答的主要功能在于病毒清除和長期記憶的產(chǎn)生，這是重要研究關(guān)注的中心。病毒與先天性免疫細(xì)胞(例如，單核吞噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(dc)和nkt細(xì)胞)之間的相互作用通過模式識(shí)別受體(prr)引發(fā)免疫應(yīng)答。prr識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(pamp)，例如病毒dna和rna。toll樣受體(tlr)是prr的主要類別并由先天性免疫細(xì)胞表達(dá)，起到引發(fā)免疫應(yīng)答的作用。適應(yīng)性免疫應(yīng)答由細(xì)胞和體液免疫兩者組成。適應(yīng)性免疫應(yīng)答的主要功能是消除病原體(例如病毒)并誘導(dǎo)針對(duì)病原性抗原的長期記憶。通常，適應(yīng)性免疫應(yīng)答是由先天性免疫應(yīng)答觸發(fā)的。需要cd4+t細(xì)胞和cd8+t細(xì)胞二者以引發(fā)有效的hsv-2特異性免疫應(yīng)答(參見tilton等人，2008)。細(xì)胞毒性免疫通過消除感染病原體(例如，hsv-2病毒)的細(xì)胞和除去細(xì)胞內(nèi)病原體例如病毒來補(bǔ)償體液系統(tǒng)。已經(jīng)證明呈現(xiàn)足夠濃度的外源性施用的抗原聯(lián)合i類主要組織相容性復(fù)合物(mhc)分子以引發(fā)足夠的免疫應(yīng)答是有挑戰(zhàn)性的。這嚴(yán)重阻礙了針對(duì)弱免疫原性病毒蛋白(例如，hsv-2)的疫苗的開發(fā)。在針對(duì)已經(jīng)顯示抗體增強(qiáng)感染性的劑(例如病毒)的免疫中，期望提供單獨(dú)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。具體地，公認(rèn)，對(duì)hsv-2的細(xì)胞免疫應(yīng)答對(duì)于預(yù)防疾病和控制復(fù)發(fā)性疾病將都是重要的(美國專利號(hào)8,828,408)。提供針對(duì)慢性和潛伏性病毒感染的這類應(yīng)答也將是有用的。1.3當(dāng)前的針對(duì)hsv-2的疫苗制劑已經(jīng)考慮了用于針對(duì)hsv感染的免疫的幾種不同的疫苗制劑策略，包括滅活疫苗、減活疫苗、復(fù)制缺陷型疫苗、亞單位疫苗、肽疫苗、活載體疫苗和dna疫苗。然而，沒有單一的策略已經(jīng)證明是成功的。合成肽疫苗的使用具有嚴(yán)重的失敗，至少因?yàn)橥ǔｋ牟蝗菀着cmhc分子相關(guān)聯(lián)、具有短的血清半衰期、快速地被蛋白水解并且不特異地定位于呈遞抗原的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。滅活病毒疫苗通常免疫原性差并且具有低功效。此外，據(jù)報(bào)道，這類疫苗展示出增加癌癥易感性的潛力，并且因此目前沒有被繼續(xù)進(jìn)行。盡管減活病毒具有針對(duì)hsv-2發(fā)揮有效保護(hù)的能力，臨床試驗(yàn)揭示，病毒的復(fù)發(fā)在除了37.5％以外的所有患者中發(fā)生。據(jù)報(bào)道，hsv-2icpo-突變型病毒誘導(dǎo)出比gd2亞單位疫苗大10至100倍的針對(duì)生殖器皰疹的保護(hù)(halford等人，2011)，并且因此針對(duì)該疾病表現(xiàn)出很大的希望。另一種有希望的減活hsv-2疫苗是hsv-2gd27，在氨基酸215、222和223處具有點(diǎn)突變。變體多核苷酸以其與連接蛋白-1受體相互作用的能力的功能喪失為特征。然而，減活病毒的一個(gè)顯著缺點(diǎn)是病毒恢復(fù)到野生型表型的能力。因此，對(duì)引發(fā)對(duì)hsv-2病毒抗原的安全和有效的免疫應(yīng)答的方法存在需要。此外，對(duì)將使這些抗原與apc的細(xì)胞表面上的1類mhc分子相關(guān)聯(lián)以引發(fā)細(xì)胞毒性t細(xì)胞應(yīng)答、避免血清中材料的過敏反應(yīng)和蛋白水解并促進(jìn)材料定位至單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的方法存在明顯需要(如美國專利號(hào)8,828,408中所討論的)。1.4基于免疫應(yīng)答偏好的密碼子優(yōu)化本發(fā)明人先前在wo2004/042059中公開了用于增強(qiáng)或降低由感興趣的生物體顯示或建議顯示的選定表型的質(zhì)量的策略。該策略包括編碼表型相關(guān)多肽的多核苷酸的密碼子修飾，該多核苷酸本身或與感興趣的生物體中的其他分子相關(guān)聯(lián)而給予或賦予生物體選定表型。然而，與以前的方法不同，該策略不依賴于根據(jù)其在生物體或一類生物中的使用偏好提供同義密碼子的排名的數(shù)據(jù)。其也不依賴于根據(jù)其在生物體或一類生物體的一種或更多種細(xì)胞中的翻譯效率提供同義密碼子的排名的數(shù)據(jù)。相反，其依賴于用于產(chǎn)生選定表型的根據(jù)生物體或一類生物體或其中部分對(duì)其的使用偏好在表型相關(guān)的多肽中編碼氨基酸的個(gè)體同義密碼子的排名。本發(fā)明人然后能夠確定哺乳動(dòng)物中單個(gè)同義密碼子的免疫應(yīng)答偏好排名，如wo2009/049350中詳細(xì)描述的。wo2009/049350中描述的免疫應(yīng)答偏好與如由seed(參見美國專利序列號(hào)5,786,464和5,795,737)確定的來源于通常哺乳動(dòng)物細(xì)胞的密碼子使用頻率值的翻譯效率的比較揭示了密碼子的排名的幾個(gè)差異。發(fā)明概述本發(fā)明部分地基于以下驚人的發(fā)現(xiàn)，即具有hsvgd2的定性不同形式(qualitativelydifferentforms)的增強(qiáng)生產(chǎn)的二元核酸構(gòu)建體系統(tǒng)的皮膚施用以劑量依賴性方式引發(fā)顯著的遲發(fā)型超敏反應(yīng)(dth)應(yīng)答?；谟稍摌?gòu)建體系統(tǒng)引發(fā)的出乎意料地強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，提出其特別適用于對(duì)抗hsv-2感染的治療應(yīng)用，如下所述。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于在受試者中治療單純皰疹病毒-2(hsv-2)感染的方法。這些方法通常包括同時(shí)向受試者施用有效量的包含第一構(gòu)建體和第二構(gòu)建體的構(gòu)建體系統(tǒng)，其中第一構(gòu)建體包含通過用具有比選定密碼子更高的免疫應(yīng)答偏好的同義密碼子替換野生型hsvgd2編碼序列中的選定密碼子而區(qū)別于野生型hsvgd2編碼序列的第一合成編碼序列，其中密碼子替換選自表1，并且其中第一合成編碼序列的密碼子的至少70％是根據(jù)表1的同義密碼子，并且其中第一合成編碼序列可操作地連接到調(diào)控核酸序列，并且其中第二構(gòu)建體包含通過用具有比選定密碼子更高的免疫應(yīng)答偏好的同義密碼子替換野生型hsvgd2編碼序列中的選定密碼子而區(qū)別于野生型hsvgd2編碼序列的第二合成編碼序列，并且其中密碼子替換選自表1，并且其中第二合成編碼序列的密碼子的至少70％是根據(jù)表1的同義密碼子，并且其中第二合成編碼序列可操作地連接到調(diào)控核酸序列和編碼通過i類主要組織相容性(mhc)途徑增加多肽的加工和呈遞的蛋白質(zhì)去穩(wěn)定元件的核酸序列，其中表1如下：表1在一些實(shí)施方案中，該方法還包括在同時(shí)施用第一和第二構(gòu)建體之前鑒定受試者具有hsv-2感染。在一些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)去穩(wěn)定元件選自由在多肽的氨基末端的去穩(wěn)定氨基酸、pest序列和泛素分子組成的組。適當(dāng)?shù)?，蛋白質(zhì)去穩(wěn)定元件是泛素分子。因此，通過用表1中鑒定的那些密碼子替換野生型hsvgd2編碼序列的密碼子，在相同條件下產(chǎn)生比野生型編碼序列產(chǎn)生的免疫應(yīng)答更強(qiáng)或增強(qiáng)至少約110％、150％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％和其間所有整數(shù)百分比的免疫應(yīng)答(適當(dāng)?shù)丶?xì)胞免疫應(yīng)答，其包括dth應(yīng)答)是可實(shí)現(xiàn)的。優(yōu)選但不是必須，用選自表1的同義密碼子替換野生型hsvgd2編碼序列的所有密碼子。在一些實(shí)施方案中，第一合成編碼序列和第二合成編碼序列各自通過用具有比選定密碼子更高的免疫應(yīng)答偏好的同義密碼子替換許多選定密碼子而區(qū)別于野生型hsvgd2編碼序列，使得第一合成編碼序列和第二合成編碼序列中至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％和其間所有整數(shù)百分比的密碼子是選自表1的同義密碼子。在一些實(shí)施方案中，第一和第二合成編碼序列包含相同核苷酸序列或由相同核酸序列組成。在其他實(shí)施方案中，第一和第二合成編碼序列包含不同核苷酸序列或由不同核酸序列組成。在這種類型的說明性實(shí)例中，第一合成編碼序列包含相對(duì)于第二合成編碼序列不同的密碼子替換。在說明性實(shí)例中，第一合成編碼序列包含相對(duì)于第二合成編碼序列不同數(shù)量的密碼子替換。在一些實(shí)施方案中，第一和第二合成編碼序列相應(yīng)于全長hsvgd2編碼序列。在其他實(shí)施方案中，第一合成編碼序列相應(yīng)于全長hsvgd2編碼序列，并且第二合成編碼序列相應(yīng)于hsvgd2編碼序列的一部分。在還其他實(shí)施方案中，第一合成編碼序列相應(yīng)于hsvgd2編碼序列的一部分，并且第二合成編碼序列相應(yīng)于全長hsvgd2編碼序列。又在其他實(shí)施方案中，第一和第二合成編碼序列各自相應(yīng)于hsvgd2編碼序列的至少一部分。適當(dāng)?shù)?，hsvgd2編碼序列的部分編碼全長hsvgd2多肽的氨基酸殘基25-331。在具體實(shí)施方案中，第一合成編碼序列相應(yīng)于全長hsvgd2編碼序列，并且第二合成編碼序列相應(yīng)于編碼全長hsvgd2多肽的氨基酸殘基25-331的hsvgd2編碼序列部分。在具體實(shí)例中，第一合成編碼序列包含seqidno：3列出的序列，并且第二合成編碼序列包含seqidno：4列出的序列。第一構(gòu)建體和第二構(gòu)建體可被包含在相同的載體中或單獨(dú)的載體中。在一些實(shí)施方案中，載體不含任何非必需序列(例如，信號(hào)或靶向序列)。在一些實(shí)施方案中，第一構(gòu)建體和第二構(gòu)建體被包含在任選地包含藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或載體的藥物組合物中。因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供對(duì)治療hsv-2感染有用的免疫原性藥物組合物。在這個(gè)方面的一些實(shí)施方案中，組合物被配制成用于皮膚或皮膚下施用(例如，皮內(nèi)施用、透皮施用或皮下施用)。在具體實(shí)施方案中，組合物被配制成用于皮內(nèi)施用。在一些實(shí)施方案中，施用于受試者的構(gòu)建體系統(tǒng)的劑量為每次注射至少約30μg。在具體實(shí)施方案中，每次注射30μg、50μg、100μg、150μg、200μg、250μg、300μg、500μg、750μg、1000μg或更多的劑量是適合的。適當(dāng)?shù)?，受試者?jīng)受多輪治療。以舉例的方式，受試者可以每兩周的間隔接受3次單獨(dú)的劑量。然而，其他治療方案是合適的，并且可由受試者的需要而定制。在一些實(shí)施方案中，組合物與佐劑一起被配制。在其他實(shí)施方案中，組合物不添加任何佐劑而被配制。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，受試者是人。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供如上文和本文別處廣泛定義的構(gòu)建體系統(tǒng)用于治療hsv-2感染的用途。在一些實(shí)施方案中，構(gòu)建體系統(tǒng)被制備或制造為用于該目的的藥物。附圖簡述圖1顯示ntc8485-o2-gd2和ntc8485-o2-ubi-gd2tr的示意圖譜。ntc8485載體圖譜顯示第一合成編碼序列(a)o2-gd2和(b)o2-ubi-gd2tr的位置。圖2顯示在施用500μg劑量的cor-1疫苗后受試者的注射部位的照片。(a)立即；(b)注射后45分鐘；(c)注射后24小時(shí)；和(d)注射后48小時(shí)拍攝右臂注射部位的照片。圖3顯示在施用500μg劑量的cor-1疫苗后受試者的注射部位的照片。(a)立即；(b)注射后45分鐘；(c)注射后24小時(shí)；和(d)注射后48小時(shí)拍攝左臂注射部位的照片。圖4顯示在施用30μg劑量的cor-1疫苗后受試者的注射部位的照片。(a)立即；(b)注射后45分鐘；(c)注射后24小時(shí)；和(d)注射后48小時(shí)拍攝照片。圖5顯示在施用100μg劑量的cor-1疫苗后受試者的注射部位的照片。(a)立即；(b)注射后45分鐘；(c)注射后24小時(shí)；和(d)注射后48小時(shí)拍攝照片。圖6顯示在施用300μg劑量的cor-1疫苗后受試者的注射部位的照片。(a)立即；(b)注射后45分鐘；(c)注射后24小時(shí)；和(d)注射后48小時(shí)拍攝照片。表a序列簡述發(fā)明詳述1.定義除非另有說明，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。盡管與本文描述的那些相似或等效的任何方法和材料都可用于實(shí)踐或測試本發(fā)明，但描述了優(yōu)選的方法和材料。為了本發(fā)明的目的，下文中定義了以下術(shù)語。本文使用的冠詞“一(a)”和“一(an)”是指一個(gè)或多于一個(gè)(即至少一個(gè))該冠詞的語法客體。以舉例的方式，“元素(anelement)”意味著一個(gè)元素或多于一個(gè)元素?！凹s(about)”意指對(duì)于參照數(shù)目、水平、值、頻率、百分比、維度、大小或量，變化不超過15％，并且優(yōu)選不超過10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的數(shù)目、水平、值、頻率、百分比、維度、大小或量。術(shù)語“同時(shí)施用(administrationconcurrently)”或“同時(shí)施用(administeringconcurrently)”或“共同施用(co-administering)”等是指含有兩種或更多種活性物質(zhì)的單一組合物的施用，或各活性物質(zhì)同期地(contemporaneously)或同時(shí)地(simultaneously)或在足夠短的時(shí)間段內(nèi)順序地作為單獨(dú)組合物和/或通過各自的途徑遞送而施用，有效結(jié)果等同于當(dāng)所有這些活性物質(zhì)作為單一組合物施用時(shí)獲得的結(jié)果。“同時(shí)地(simultaneously)”意指，活性劑基本上同時(shí)被施用，并且合意地在同一制劑中一起被施用?！巴诘?contemporaneously)”意指，活性劑在時(shí)間上緊密地被施用，例如，一種劑在另一種之前或之后約1分鐘內(nèi)至約1天內(nèi)被施用。任何同時(shí)期的時(shí)間都是有用的。然而，通常情況是，當(dāng)不同時(shí)被施用時(shí)，劑將在約1分鐘內(nèi)至約8小時(shí)內(nèi)，并且優(yōu)選在小于約1至約4小時(shí)內(nèi)被施用。當(dāng)被同期(comtemporaneously)施用時(shí)，劑適當(dāng)?shù)乇皇┯迷谑茉囌叩南嗤课?。術(shù)語“相同部位(samesite)”包括精確的位置，但可在約0.5至約15厘米內(nèi)，優(yōu)選在約0.5至約5厘米內(nèi)。本文使用的術(shù)語“分別地(separately)”意味著，劑以間隔被施用，例如以約一天至幾周或數(shù)月的間隔被施用?；钚詣┛梢匀我豁樞虮皇┯谩１疚氖褂玫男g(shù)語“順序地(sequentially)”意味著，劑按順序被施用，例如以數(shù)分鐘、數(shù)小時(shí)、數(shù)天或數(shù)周的一個(gè)或更多個(gè)間隔被施用。如果合適，活性劑可以有規(guī)律的重復(fù)周期被施用。如本文使用的，“和/或(and/or)”是指和涵蓋一個(gè)或更多個(gè)相關(guān)列出的項(xiàng)目的任何和所有可能的組合，以及當(dāng)在替換(或)中解釋時(shí)缺少組合。術(shù)語“抗原(antigen)”和“表位(epitope)”在本領(lǐng)域中是熟知的，并且是指被免疫系統(tǒng)的組分(例如，抗體或t細(xì)胞抗原受體)特異性識(shí)別的大分子的部分。表位被溶液中的抗體識(shí)別以例如擺脫其他分子(freefromothermolecules)。當(dāng)表位與i類或ii類主要組織相容性復(fù)合物分子相關(guān)聯(lián)時(shí)，表位被t細(xì)胞抗原受體識(shí)別?！癱tl表位(ctlepitope)”是當(dāng)表位被呈遞在與mhci類分子相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞表面時(shí)被細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(cytotoxictlymphocyte)(通常為cd8+細(xì)胞)識(shí)別的表位。應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)關(guān)于數(shù)值的范圍使用時(shí)，術(shù)語“其間(between)”涵蓋該范圍的每個(gè)端點(diǎn)處的數(shù)值。例如，包含30μg和約1000μg之間的合成構(gòu)建體的組合物包括包含30μg的合成構(gòu)建體的組合物和包含1000μg的合成構(gòu)建體的組合物。如本文使用的，術(shù)語“順式作用序列(cis-actingsequence)”或“順式調(diào)控區(qū)(cis-regulatoryregion)”或類似術(shù)語應(yīng)被理解為意指源自可表達(dá)遺傳序列的任何核苷酸序列，其中遺傳序列的表達(dá)(至少部分地)被該核苷酸序列調(diào)控。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到，順式調(diào)控區(qū)可能能夠激活、沉默、增強(qiáng)、抑制或以其他方式改變?nèi)魏谓Y(jié)構(gòu)基因序列的表達(dá)水平和/或細(xì)胞類型特異性和/或發(fā)育特異性。遍及本說明書，除非上下文另有要求，否則詞語“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”將被理解為暗示包含陳述的步驟或要素或步驟或要素的組，但不排除任何其他步驟或要素或步驟或要素的組?！熬幋a序列(codingsequence)”意指有助于基因多肽產(chǎn)物的編碼的任何核酸序列。相比之下，術(shù)語“非編碼序列(non-codingsequence)”意指對(duì)基因多肽產(chǎn)物的編碼無貢獻(xiàn)的任何核酸序列。本文使用的術(shù)語“遲發(fā)型超敏反應(yīng)(delayedtypehypersensitivity)”(也稱為iv型超敏反應(yīng))是指包含cd4+和/或cd8+t細(xì)胞的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。cd4+輔助t細(xì)胞識(shí)別被抗原呈遞細(xì)胞(apc)上ii類mhc分子呈遞的抗原。在這種情況下，apc通常是分泌il-12的巨噬細(xì)胞，其刺激進(jìn)一步的cd4+th1細(xì)胞的增殖。這些cd4+t細(xì)胞反過來分泌il-2和ifn-γ，進(jìn)一步誘導(dǎo)其他th1細(xì)胞因子的釋放，并且從而介導(dǎo)實(shí)質(zhì)性細(xì)胞免疫應(yīng)答。cd8+t細(xì)胞起在接觸后破壞靶細(xì)胞的作用，而激活的巨噬細(xì)胞在暴露于細(xì)胞內(nèi)病原體時(shí)產(chǎn)生水解酶。皮膚中的dth應(yīng)答通常用于評(píng)估體內(nèi)的細(xì)胞免疫(參見pichler等人，2011)。具體地說，在皮膚或皮膚下(適當(dāng)?shù)仄?nèi))施用抗原后，在注射后約48小時(shí)硬結(jié)和紅斑的出現(xiàn)強(qiáng)烈指示陽性的dth反應(yīng)和實(shí)質(zhì)性細(xì)胞免疫應(yīng)答。在調(diào)控免疫應(yīng)答或治療或預(yù)防疾病或狀況的上下文中，“有效量(effectiveamount)”意指將該量的組合物以單劑量或作為系列的一部分施用于需要其的個(gè)體，對(duì)于達(dá)到該調(diào)控、治療或預(yù)防是有效的。有效量將根據(jù)待治療個(gè)體的健康和身體狀況、待治療個(gè)體的分類群體、組合物的制劑、醫(yī)療情況的評(píng)估和其他相關(guān)因素而變化。據(jù)預(yù)計(jì)，該量將落入可通過常規(guī)試驗(yàn)確定的相對(duì)較寬的范圍內(nèi)。應(yīng)當(dāng)理解，本文預(yù)期的“引發(fā)(eliciting)”或“誘導(dǎo)(inducing)”免疫應(yīng)答包括刺激新的免疫應(yīng)答和/或增強(qiáng)先前存在的免疫應(yīng)答。如本文使用的，術(shù)語“編碼(encode)”、“編碼(encoding)”等是指核酸提供另一種核酸或多肽的能力。例如，如果核酸序列可被轉(zhuǎn)錄和/或翻譯以產(chǎn)生多肽，或者如果其可被加工成可被轉(zhuǎn)錄和/或翻譯以產(chǎn)生多肽的形式，那么該核酸序列被稱為“編碼”多肽。這類核酸序列可包括編碼序列或編碼序列和非編碼序列兩者。因此，術(shù)語“編碼(encode)”、“編碼(encoding)”等包括因dna分子的轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生的rna產(chǎn)物、因rna分子的翻譯而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)、因dna分子的轉(zhuǎn)錄以形成rna產(chǎn)物和隨后rna產(chǎn)物的翻譯而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)、或因dna分子的轉(zhuǎn)錄以提供rna產(chǎn)物、rna產(chǎn)物的加工以提供加工的rna產(chǎn)物(例如，mrna)和隨后加工的rna產(chǎn)物的翻譯而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。術(shù)語“增強(qiáng)免疫應(yīng)答(enhancinganimmuneresponse)”、“產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答(producingastrongerimmuneresponse)”等是指增加動(dòng)物對(duì)hsvgd2多肽的應(yīng)答能力，其可例如通過檢測被引發(fā)以攻擊這類抗原的動(dòng)物細(xì)胞的數(shù)目、活性和能力的增加和/或動(dòng)物中與hsvgd2多肽免疫相互作用的抗體的滴度或活性的增加來確定。免疫應(yīng)答的強(qiáng)度可通過標(biāo)準(zhǔn)免疫測定來測量，標(biāo)準(zhǔn)免疫測定包括：抗體滴度或外周血淋巴細(xì)胞的直接測量；溶細(xì)胞的t淋巴細(xì)胞測定；自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性測定；包括淋巴細(xì)胞增殖(淋巴細(xì)胞激活)測定的細(xì)胞增殖測定；免疫細(xì)胞亞群的免疫測定；敏化受試者中抗原特異性t淋巴細(xì)胞的測定；細(xì)胞介導(dǎo)免疫的皮膚測試；等等。這些測定是本領(lǐng)域公知的。參見例如erickson等人,1993,j.immunol.151:4189-4199；doe等人,1994,eur.j.immunol.24:2369-2376。最近測量細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法包括測量細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子或t細(xì)胞群體的細(xì)胞因子分泌，或通過測量表位特異性t細(xì)胞(例如，通過四聚體技術(shù))(由mcmichael，a.j.和o'callaghan，c.a.，1998，j.exp.med.187(9)1367-1371；mcheyzer-williams,m.g.等人,1996,immunol.rev.150:5-21；lalvani,a.等人,1997,j.exp.med.186:859-865綜述)。例如通過免疫測定測量的免疫應(yīng)答的強(qiáng)度的任何統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的增加都被認(rèn)為是本文使用的“增強(qiáng)的免疫應(yīng)答(enhancedimmuneresponse)”或“免疫增強(qiáng)(immunoenhancement)”。增強(qiáng)的免疫應(yīng)答也由物理表現(xiàn)例如炎癥，以及全身和局部感染的愈合和疾病中癥狀即皰疹和疣的減少來表示。這類物理表現(xiàn)也涵蓋本文使用的“增強(qiáng)的免疫應(yīng)答”或“免疫增強(qiáng)”。關(guān)于基因序列的術(shù)語“表達(dá)(expression)”是指基因的轉(zhuǎn)錄，并且適當(dāng)?shù)兀胢rna轉(zhuǎn)錄物向蛋白質(zhì)的翻譯。因此，如從上下文將清楚的，編碼序列的表達(dá)起因于編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯。反之，非編碼序列的表達(dá)起因于非編碼序列的轉(zhuǎn)錄?！氨磉_(dá)載體(expressionvector)”意指能夠指導(dǎo)由載體編碼的蛋白質(zhì)的合成的任何自主遺傳元件。這類表達(dá)載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。本文使用的術(shù)語“基因(gene)”是指基因組的任何和所有離散編碼區(qū)以及相關(guān)的非編碼和調(diào)控區(qū)。基因還意圖意指編碼一種或更多種特定多肽的開放閱讀框，并且任選地包含一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)含子和參與表達(dá)調(diào)控的相鄰的5'和3'非編碼核苷酸序列。在這方面，基因可還包含調(diào)控性核酸例如與給定基因自然相關(guān)的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止和/或聚腺苷酸化信號(hào)，或異源控制信號(hào)?；蚩赡芑蚩赡懿荒苡糜诋a(chǎn)生功能性蛋白質(zhì)?；蚩砂ň幋a區(qū)和非編碼區(qū)兩者。如本文使用的，在核酸或氨基酸序列的上下文中的術(shù)語“hsvgd2”(或“單純皰疹病毒2型糖蛋白d(herpessimplexvirustype-2glycoproteind)”)是指全長或部分長度的hsvgd2編碼序列或全長或部分長度的hsvgd2氨基酸序列(例如，全長或部分長度的hsv株hg52(基因組菌株nc_001798)的gd2基因、其蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物)。在一些實(shí)施方案中，合成編碼序列編碼至少約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、200、250、300或350個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，或幾乎高達(dá)存在于全長hsvgd2氨基酸序列的氨基酸總數(shù)(393個(gè)氨基酸殘基)。在一些實(shí)施方案中，合成編碼序列編碼hsvgd2多肽的多個(gè)部分，其中各部分相同或不同。在這種類型的說明性實(shí)例中，合成編碼序列編碼多表位融合蛋白。許多因素能夠影響部分大小的選擇。例如，可選擇由合成編碼序列編碼的單個(gè)部分的大小，使得其包括t細(xì)胞表位和/或b細(xì)胞表位(或?qū)?yīng)于其大小)和其加工要求。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，i類限制性t細(xì)胞表位的長度通常在8和10個(gè)氨基酸殘基之間，并且如果被放置在非自然側(cè)翼殘基旁邊，這類表位可通常需要2至3個(gè)自然側(cè)翼氨基酸殘基，以確保其被有效地加工和呈遞。ii類限制性t細(xì)胞表位的長度范圍通常在12至25個(gè)氨基酸殘基之間，并且可不需要自然側(cè)翼殘基用于高效的蛋白水解加工，盡管認(rèn)為自然側(cè)翼殘基可能發(fā)揮作用。ii類限制性表位的另一個(gè)重要特征是，它們通常在中間含有9-10個(gè)氨基酸殘基的核心，其與ii類mhc分子特異性結(jié)合，伴隨著該核心任意一側(cè)的側(cè)翼序列通過以序列獨(dú)立的方式與ii類mhc抗原任意一側(cè)的保守結(jié)構(gòu)相關(guān)聯(lián)而使結(jié)合穩(wěn)定。因此ii類限制性表位的功能區(qū)通常小于約15個(gè)氨基酸殘基長。線性b細(xì)胞表位的大小和影響其加工的因素，如ii類限制性表位是高度可變的，盡管這類表位的大小經(jīng)常小于15個(gè)氨基酸殘基。從上述，hsvgd2多肽的單個(gè)部分的大小為至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30個(gè)氨基酸殘基是有利的但不是必要的。適當(dāng)?shù)兀瑔蝹€(gè)部分的大小不超過約500、200、100、80、60、50、40個(gè)氨基酸殘基。在某些有利的實(shí)施方案中，單個(gè)部分的大小足以由抗原呈遞細(xì)胞呈遞被包含在肽內(nèi)的t細(xì)胞和/或b細(xì)胞表位?！懊庖邞?yīng)答(immuneresponse)”或“免疫應(yīng)答(immunologicalresponse)”是指導(dǎo)致對(duì)于侵入病原體的機(jī)體、感染有病原體的細(xì)胞或組織的選擇性損傷、破壞或消除的淋巴細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和由上述細(xì)胞或肝臟產(chǎn)生的可溶性大分子(包括抗體、細(xì)胞因子和補(bǔ)體)中的任一種或更多種的協(xié)同作用。在一些實(shí)施方案中，“免疫應(yīng)答”涵蓋個(gè)體中對(duì)由本發(fā)明的引入的合成編碼序列編碼的多肽的體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答的發(fā)展。如本領(lǐng)域已知的，術(shù)語“體液免疫應(yīng)答(humoralimmuneresponse)”包括并涵蓋由抗體分子介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，而“細(xì)胞免疫應(yīng)答(cellularimmuneresponse)”包括并涵蓋由t淋巴細(xì)胞和/或其他白細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。因此，免疫應(yīng)答可包括一種或更多種以下作用：由b細(xì)胞產(chǎn)生抗體；和/或特異性地針對(duì)存在于感興趣的組合物或疫苗中的一種或更多種抗原的抑制t細(xì)胞和/或記憶/效應(yīng)t細(xì)胞的激活。在一些實(shí)施方案中，這些應(yīng)答可用于中和感染性和/或介導(dǎo)抗體-補(bǔ)體或抗體依賴性細(xì)胞毒性(antibodydependentcellcytotoxicity)(adcc)以向免疫的宿主提供保護(hù)。這類應(yīng)答可使用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)免疫測定和中和測定來確定。(參見例如，montefiori等人，1988，jclinmicrobiol.26:231-235；dreyer等人,1999,aidsreshumretroviruses15(17):1563-1571)。哺乳動(dòng)物的先天免疫系統(tǒng)還通過激活toll樣受體和免疫細(xì)胞上的類似受體分子來識(shí)別和響應(yīng)致病生物體和癌細(xì)胞的分子特征。在激活先天免疫系統(tǒng)后，各種非適應(yīng)性免疫應(yīng)答細(xì)胞被激活以例如產(chǎn)生各種細(xì)胞因子、淋巴因子和趨化因子。由先天免疫應(yīng)答激活的細(xì)胞包括例如單核細(xì)胞和漿細(xì)胞樣譜系(mdc、pdc)以及γ、δ、α和βt細(xì)胞和b細(xì)胞等的未成熟和成熟的樹突狀細(xì)胞。因此，本發(fā)明還預(yù)期免疫應(yīng)答，其中免疫應(yīng)答包括先天和適應(yīng)性應(yīng)答兩者。如果組合物能夠：a)在個(gè)體中產(chǎn)生針對(duì)hsvgd2多肽的免疫應(yīng)答，或b)在個(gè)體中重組、加強(qiáng)或維持超過如果未施用劑或組合物會(huì)發(fā)生的免疫應(yīng)答，則該組合物是“免疫原性的(immunogenic)”。如果以單或多劑量施用時(shí)能夠達(dá)到這些標(biāo)準(zhǔn)中的任一個(gè)，則劑或組合物是免疫原性的。免疫應(yīng)答可包括受試者中的細(xì)胞免疫應(yīng)答和/或體液免疫應(yīng)答。遍及本說明書，除非上下文另有要求，否則詞語“包含(include)”、“包含(includes)”和“包含(including)”將被理解為暗示包含陳述的步驟或要素或步驟或要素的組，但不排除任何其他步驟或要素或步驟或要素的組。如本文使用的，術(shù)語“哺乳動(dòng)物(mammal)”是指任何哺乳動(dòng)物，包括但不限于人和其他靈長類動(dòng)物，包括非人靈長類動(dòng)物例如黑猩猩和其他猿和猴類；農(nóng)場動(dòng)物例如牛、綿羊、豬、山羊、馬；家養(yǎng)哺乳動(dòng)物例如狗和貓；和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，包括嚙齒動(dòng)物例如小鼠、大鼠和豚鼠。該術(shù)語不表示特定年齡。因此，成年和新生個(gè)體都意圖被覆蓋。本文使用的術(shù)語“可操作地連接(operablyconnected)”、“可操作地連接(operablylinked)”等是指元件的布置，其中如此描述的組分被配置以進(jìn)行其通常的功能。因此，當(dāng)存在適當(dāng)?shù)拿笗r(shí)，給定的調(diào)控核酸例如可操作地連接到編碼序列的啟動(dòng)子能夠?qū)崿F(xiàn)編碼序列的表達(dá)。啟動(dòng)子不必與編碼序列連續(xù)，只要其起到指導(dǎo)編碼序列表達(dá)的功能即可。因此，例如，啟動(dòng)子序列和編碼序列之間可存在其間的未翻譯但已轉(zhuǎn)錄的序列，并且啟動(dòng)子序列仍然可被認(rèn)為與編碼序列“可操作地連接”。因此，術(shù)語例如“可操作地連接”包括將結(jié)構(gòu)基因置于啟動(dòng)子的調(diào)控控制下，然后啟動(dòng)子控制基因的轉(zhuǎn)錄和任選地基因的翻譯。在異源啟動(dòng)子/結(jié)構(gòu)基因組合的構(gòu)建中，通常優(yōu)選的是，將遺傳序列或啟動(dòng)子放置在離基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的一定距離處，該距離與該遺傳序列或啟動(dòng)子和在其自然環(huán)境中其控制的基因(即遺傳序列或啟動(dòng)子源自的基因)之間的距離大致相同。如本領(lǐng)域所知，該距離中的一些變化可被調(diào)整而不損失功能。類似地，啟動(dòng)子相對(duì)于將被置于其控制下的異源基因的優(yōu)選放置由啟動(dòng)子在其自然環(huán)境(即其所源自的基因)中的定位來定義?？蛇x地，將gd2編碼序列“可操作地連接”到編碼蛋白質(zhì)去穩(wěn)定化元件(pde)的核酸序列涵蓋gd2編碼序列相對(duì)于pde編碼核酸序列的定位和/或取向，使得(1)該編碼序列和pde編碼核酸序列一起轉(zhuǎn)錄以形成單個(gè)嵌合轉(zhuǎn)錄物和(2)gd2編碼序列與pde編碼核酸序列是“符合讀框的(in-frame)”以產(chǎn)生包含gd2編碼序列和pde編碼核酸序列的嵌合開放閱讀框。術(shù)語“開放閱讀框(openreadingframe)”和“orf”是指在編碼序列的翻譯起始和終止密碼子之間編碼的氨基酸序列。術(shù)語“起始密碼子(initiationcodon)”和“終止密碼子(terminationcodon)”是指編碼序列中分別指定蛋白質(zhì)合成(mrna翻譯)的起始和鏈終止的三個(gè)相鄰核苷酸的單元(“密碼子”)?！八帉W(xué)上可接受的載體(pharmaceutically-acceptablecarrier)”意指可安全地用于局部或全身施用的固體或液體填充劑、稀釋劑或包封物質(zhì)。本文使用的術(shù)語“多核苷酸(polynucleotide)”或“核酸(nucleicacid)”代表mrna、rna、crna、cdna或dna。該術(shù)語通常是指長度大于30個(gè)核苷酸的寡核苷酸。“多肽(polypeptide)”、“肽(peptide)”和“蛋白質(zhì)(protein)”在本文中可互換使用以指氨基酸殘基的聚合物和其變體和合成類似物。如本文使用的，術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”不限于最小長度的產(chǎn)物。因此，肽、寡肽、二聚體、多聚體等包括在該定義內(nèi)。全長蛋白質(zhì)和其片段都涵蓋在該定義中。該術(shù)語還包括多肽的后表達(dá)修飾，例如糖基化、乙?；?、磷酸化等。在一些實(shí)施方案中，“多肽”是指一種蛋白質(zhì)，其包括對(duì)天然序列的修飾，例如缺失、添加和取代(本質(zhì)上通常保守的)，只要蛋白質(zhì)保持所需的活性即可。這些修飾可以是有意的，如通過定點(diǎn)誘變，或者可以是偶然的，例如通過產(chǎn)生蛋白質(zhì)的宿主的突變或由于pcr擴(kuò)增引起的錯(cuò)誤。術(shù)語“多肽變體(polypeptidevariant)”和“變體(variant)”是指通過至少一個(gè)氨基酸殘基的添加、缺失或取代(本質(zhì)上通常保守的)不同于參考多肽的多肽。通常，變體保留參考多肽的所需活性，例如在誘導(dǎo)針對(duì)hsvgd2多肽的免疫應(yīng)答中的抗原活性。通常，當(dāng)兩個(gè)序列比對(duì)時(shí)，變體多肽與參考多肽“基本相似(substantiallysimilar)”或“基本相同(substantiallyidentical)”，例如氨基酸序列同一性或相似性多于50％，通常多于60％-70％，甚至更具體地80％-85％或更多，例如至少90％-95％或更多。通常，變體將包括相同數(shù)量的氨基酸，但將包括如本文解釋的取代。本文對(duì)“啟動(dòng)子”的提及將以其最廣泛的范圍被采用，并且包括經(jīng)典基因組基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，包括準(zhǔn)確轉(zhuǎn)錄起始所需的tata框，具有或不具有ccaat框序列和另外的調(diào)控元件(即上游激活序列、增強(qiáng)子和沉默子)，其響應(yīng)于發(fā)育和/或環(huán)境刺激或以組織特異性或細(xì)胞類型特異性方式改變基因表達(dá)。啟動(dòng)子通常但不必然位于其調(diào)控表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因的上游或5'端。此外，包含啟動(dòng)子的調(diào)控元件通常位于基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的2kb內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選啟動(dòng)子可含有一個(gè)或更多個(gè)特定調(diào)控元件的另外拷貝，以進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞中的表達(dá)，和/或改變其可操作地連接的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)時(shí)機(jī)。本文使用的術(shù)語“序列同一性”是指在比較窗內(nèi)基于一個(gè)核苷酸接著一個(gè)核苷酸或基于一個(gè)氨基酸接著一個(gè)氨基酸的序列相同的程度。因此，“序列同一性百分比(percentageofsequenceidentity)”如下計(jì)算：通過在比較窗內(nèi)比較兩個(gè)最佳比對(duì)的序列，確定兩個(gè)序列中出現(xiàn)相同的核酸堿基(例如，a、t、c、g、i)或相同的氨基酸殘基(例如，ala、pro、ser、thr、gly、val、leu、ile、phe、tyr、trp、lys、arg、his、asp、glu、asn、gln、cys和met)的位置數(shù)目以產(chǎn)生匹配位置的數(shù)目，將匹配位置的數(shù)目除以比較窗中位置的總數(shù)目(即，窗大小)，并將結(jié)果乘以100以得到序列同一性的百分比。為了本發(fā)明的目的，“序列同一性”將被理解為意指使用軟件附帶的參考手冊(cè)中使用的標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)值，由dnasis計(jì)算機(jī)程序(windows版本2.5；可從hitachisoftwareengineeringco.,ltd.,southsanfrancisco,california,usa獲得)計(jì)算的“匹配百分比”?！跋嗨菩?similarity)”是指如表10中定義的相同或構(gòu)成保守取代的氨基酸的百分?jǐn)?shù)?？墒褂眯蛄斜容^程序例如gap(deveraux等人1984,nucleicacidsresearch12,387-395)來確定相似性。以這種方式，可通過將缺口插入到比對(duì)中來比較與本文提及的那些序列長度相似或基本不同的序列，這類間隙例如通過gap使用的比較算法確定。用于描述兩個(gè)或更多個(gè)多核苷酸或多肽之間的序列關(guān)系的術(shù)語包括“參考序列(referencesequence)”、“比較窗口(comparisonwindow)”、“序列同一性(sequenceidentity)”、“序列同一性百分比(percentageofsequenceidentity)”和“實(shí)質(zhì)同一性(substantialidentity)”?！皡⒖夹蛄小钡拈L度為至少12個(gè)但經(jīng)常為15至18個(gè)并且通常至少25個(gè)單體單元，所述單體單元包括核苷酸和氨基酸殘基。因?yàn)閮蓚€(gè)多核苷酸可各自包含(1)在兩個(gè)多核苷酸之間相似的序列(即，僅完整多核苷酸序列的部分)，和(2)在兩個(gè)多核苷酸之間不同的序列，兩個(gè)(或更多個(gè))多核苷酸之間的序列比較通常通過在“比較窗口”上比較兩個(gè)多核苷酸的序列來進(jìn)行，以鑒定和比較序列相似性的局部區(qū)域?！氨容^窗口”是指至少6個(gè)連續(xù)位置，通常約50至約100個(gè)，更通常約100至約150個(gè)的概念區(qū)段，其中在兩個(gè)序列被最佳比對(duì)后，序列被與具有相同數(shù)量的連續(xù)位置的參考序列比較。為了兩個(gè)序列的最佳比對(duì)，與參考序列(其不包含添加或缺失)相比，比較窗口可包含約20％或更少的添加或缺失(即，缺口)。用于對(duì)齊比較窗口的序列的最佳比對(duì)可通過算法的計(jì)算機(jī)化工具(wisconsingeneticssoftwarepackage發(fā)布7.0中的gap、bestfit、fasta和tfasta，geneticscomputergroup,575sciencedrivemadison,wi,usa)或通過檢查來進(jìn)行并選擇各種方法的任一種產(chǎn)生的最佳比對(duì)(即，導(dǎo)致比較窗口的最高同源性百分比)。還可參考如例如由altschul等，1997,nucl.acidsres.25:3389公開的blast程序家族。序列分析的詳細(xì)討論可在ausubel等，“currentprotocolsinmolecularbiology”,johnwiley&sonsinc,1994-1998,chapter15的unit19.3中找到。本文使用的術(shù)語“合成編碼序列(syntheticcodingsequence)”是指由重組或合成技術(shù)形成的多核苷酸，并且通常包括在自然界中通常未發(fā)現(xiàn)的多核苷酸。本文使用的術(shù)語“同義密碼子(synonymouscodon)”是指具有與另一個(gè)密碼子不同的核苷酸序列但編碼與其他密碼子相同的氨基酸的密碼子?！爸委?treatment)”、“治療(treat)”、“治療(treated)”等意在包括治療的和預(yù)防性的治療兩者?！拜d體(vector)”意指源自例如核酸序列可被插入或克隆進(jìn)的質(zhì)粒、噬菌體或植物病毒的核酸分子，優(yōu)選地dna分子。載體優(yōu)選地含有一個(gè)或更多個(gè)獨(dú)特的限制性位點(diǎn)，并且可能夠在包括靶細(xì)胞或組織或其祖細(xì)胞或組織的定義的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制，或是與定義的宿主的基因組可整合的，使得克隆的序列可繁殖。因此，載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實(shí)體存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制，例如，線性質(zhì)?；蜷]合環(huán)狀質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。載體可包含用于確保自我復(fù)制的任何工具(means)?？蛇x地，載體可以是當(dāng)被引入進(jìn)宿主細(xì)胞時(shí)其被整合進(jìn)基因組中并連同它已被整合進(jìn)的染色體一起復(fù)制的載體。載體系統(tǒng)可包含單個(gè)載體或質(zhì)粒、共同包含待引入進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組的總dna或轉(zhuǎn)座子的兩個(gè)或更多個(gè)載體或質(zhì)粒。載體的選擇通常將取決于載體與該載體待引入進(jìn)的宿主細(xì)胞的相容性。載體還可包括選擇標(biāo)記物，例如可用于選擇合適的轉(zhuǎn)化體的抗生素抗性基因。這類抗性基因的實(shí)例是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。關(guān)于生物體、多肽或核酸序列的術(shù)語“野生型(wild-type)”、“自然的(natural)”、“天然的(native)”等是指自然存在或在至少一個(gè)不被人改變、突變或以其他方式操縱的自然存在的生物體中可得的生物體、多肽或核酸序列。2.縮寫在整個(gè)申請(qǐng)中使用以下縮寫：nt＝核苷酸nts＝核苷酸bp＝堿基對(duì)aa＝氨基酸3.hsvgd2編碼序列預(yù)期用于本發(fā)明的第一和第二合成編碼序列編碼蛋白質(zhì)性分子，其代表性實(shí)例包括多肽和肽。野生型hsvgd2多肽適用于本發(fā)明，盡管也預(yù)期了變體hsvgd2多肽。根據(jù)本發(fā)明，由本發(fā)明的核酸構(gòu)建體產(chǎn)生的hsvgd2多肽由密碼子優(yōu)化的hsvgd2編碼序列編碼。在一些實(shí)施方案中，基于對(duì)野生型hsvgd2編碼序列的至少一部分的密碼子優(yōu)化產(chǎn)生合成編碼序列，所述野生型hsvgd2編碼序列的說明性實(shí)例包括菌株hg52(基因組菌株nc_001798)的hsvgd2編碼序列，其具有以下核苷酸序列：atggggcgtttgacctccggcgtcgggacggcggccctgctagttgtcgcggtgggactccgcgtcgtctgcgccaaatacgccttagcagacccctcgcttaagatggccgatcccaatcgatttcgcgggaagaaccttccggttttggaccagctgaccgacccccccggggtgaagcgtgtttaccacattcagccgagcctggaggacccgttccagccccccagcatcccgatcactgtgtactacgcagtgctggaacgtgcctgccgcagcgtgctcctacatgccccatcggaggccccccagatcgtgcgcggggcttcggacgaggcccgaaagcacacgtacaacctgaccatcgcctggtatcgcatgggagacaattgcgctatccccatcacggttatggaatacaccgagtgcccctacaacaagtcgttgggggtctgccccatccgaacgcagccccgctggagctactatgacagctttagcgccgtcagcgaggataacctgggattcctgatgcacgcccccgccttcgagaccgcgggtacgtacctgcggctagtgaagataaacgactggacggagatcacacaatttatcctggagcaccgggcccgcgcctcctgcaagtacgctctccccctgcgcatccccccggcagcgtgcctcacctcgaaggcctaccaacagggcgtgacggtcgacagcatcgggatgctaccccgctttatccccgaaaaccagcgcaccgtcgccctatacagcttaaaaatcgccgggtggcacggccccaagcccccgtacaccagcaccctgctgccgccggagctgtccgacaccaccaacgccacgcaacccgaactcgttccggaagaccccgaggactcggccctcttagaggatcccgccgggacggtgtcttcgcagatccccccaaactggcacatcccgtcgatccaggacgtcgcgccgcaccacgcccccgccgcccccagcaacccgggcctgatcatcggcgcgctggccggcagtaccctggcggtgctggtcatcggcggtattgcgttttgggtacgccgccgcgctcagatggcccccaagcgcctacgtctcccccacatccgggatgacgacgcgcccccctcgcaccagccattgttttactag[seqidno：1].seqidno：1列出的該多核苷酸序列編碼以下氨基酸序列(uniprot登錄號(hào)np044536)：mgrltsgvgtaallvvavglrvvcakyaladpslkmadpnrfrgknlpvldqltdppgvkrvyhiqpsledpfqppsipitvyyavleracrsvllhapseapqivrgasdearkhtynltiawyrmgdncaipitvmeytecpynkslgvcpirtqprwsyydsfsavsednlgflmhapafetagtylrlvkindwteitqfilehrarasckyalplrippaacltskayqqgvtvdsigmlprfipenqrtvalyslkiagwhgpkppytstllppelsdttnatqpelvpedpedsalledpagtvssqippnwhipsiqdvaphhapaapsnpgliigalagstlavlviggiafwvrrraqmapkrlrlphirdddappshqplfy[seqidno：2].3.1密碼子優(yōu)化在一些實(shí)施方案中，使用wo2009/049350中描述的方法突變親本(例如，野生型)hsvgd2編碼序列內(nèi)的多個(gè)密碼子。簡而言之，野生型編碼序列的密碼子被相應(yīng)的同義密碼子替換，已知其具有比其替換的密碼子更高的免疫應(yīng)答偏好，如下表1列出的：在具體實(shí)例中，本發(fā)明預(yù)期了密碼子優(yōu)化的編碼對(duì)應(yīng)于野生型hsvgd2多肽的至少一部分的氨基酸序列的編碼序列，其包括將所有ala變?yōu)間ct；arg的cgg和agg分別變?yōu)閏ga和aga；glu變?yōu)間aa；gly變?yōu)間ga；ile變?yōu)閍tc；所有l(wèi)eu變?yōu)閏tg；phe變?yōu)閠tt，pro變?yōu)閏ct或ccc，ser變?yōu)閠cg，thr變?yōu)閍cg；和所有除了gtg以外的val變?yōu)間tc。除了leu和ile之外，這些修飾避免將密碼子變?yōu)椴溉閯?dòng)物的共有優(yōu)選密碼子。由于編碼leu和ile氨基酸的具有最高免疫應(yīng)答偏好的密碼子顯著高于替代的同義密碼子，并且鑒于hsvgd2多肽序列中l(wèi)eu和ile殘基的頻率(39個(gè)亮氨酸氨基酸和23個(gè)異亮氨酸氨基酸)，哺乳動(dòng)物的共有優(yōu)選密碼子未被避免，以確保構(gòu)建體的實(shí)質(zhì)表達(dá)。符合這類實(shí)施方案的多核苷酸的說明性實(shí)例如下：aagcttgccgccaccatgggacgtctgacgtcgggagtcggaacggctgctctgctggtcgtcgctgtgggactgcgcgtcgtctgcgctaaatacgctctggctgacccctcgctgaagatggctgatcccaatcgatttcgcggaaagaacctgcccgtcctggaccagctgacggacccccccggagtgaagcgtgtctaccacatccagccctcgctggaagacccctttcagcccccctcgatccccatcacggtgtactacgctgtgctggaacgtgcttgccgctcggtgctgctgcatgctccctcggaagctccccagatcgtgcgcggagcttcggacgaagctcgaaagcacacgtacaacctgacgatcgcttggtatcgcatgggagacaattgcgctatccccatcacggtcatggaatacacggaatgcccctacaacaagtcgctgggagtctgccccatccgaacgcagccccgctggtcgtactatgactcgttttcggctgtctcggaagataacctgggatttctgatgcacgctcccgcttttgaaacggctggaacgtacctgcgactggtgaagatcaacgactggacggaaatcacgcaatttatcctggaacaccgagctcgcgcttcgtgcaagtacgctctgcccctgcgcatcccccccgctgcttgcctgacgtcgaaggcttaccaacagggagtgacggtcgactcgatcggaatgctgccccgctttatccccgaaaaccagcgcacggtcgctctgtactcgctgaaaatcgctggatggcacggacccaagcccccctacacgtcgacgctgctgccccccgaactgtcggacacgacgaacgctacgcaacccgaactggtccccgaagaccccgaagactcggctctgctggaagatcccgctggaacggtgtcgtcgcagatcccccccaactggcacatcccctcgatccaggacgtcgctccccaccacgctcccgctgctccctcgaaccccggactgatcatcggagctctggctggatcgacgctggctgtgctggtcatcggaggaatcgctttttgggtccgccgccgcgctcagatggctcccaagcgcctgcgtctgccccacatccgagatgacgacgctcccccctcgcaccagcccctgttttactagctcgag[seqidno：3].在一些實(shí)施方案中，第二合成編碼序列編碼對(duì)應(yīng)于野生型hsvgd2多肽的至少一部分的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，第二合成編碼序列編碼對(duì)應(yīng)于缺少gd2信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域區(qū)域的野生型hsvgd2多肽的一部分的氨基酸序列。雖然不是必需的，但是去除這些區(qū)域確保，hsvgd2多肽不從細(xì)胞分泌，因此改善多肽被降解并引起細(xì)胞免疫應(yīng)答的可能性。例如，合成編碼序列可編碼野生型hsvgd2氨基酸序列的氨基酸25-331。在這種類型的說明性實(shí)例中，第二合成編碼序列包括以下序列：aagcttgccgccaccatgcagatctttgtgaagacgctgacgggaaagacgatcacgctggaagtggaaccctcggacacgatcgaaaacgtgaaggctaagatccaggacaaggaaggaatcccccccgaccagcagagactgatctttgctggaaagcagctggaagacggacgcacgctgtcggactacaacatccagaaggaatcgacgctgcacctggtgctgagactgcgcggagctgctaaatacgctctggctgacccctcgcttaagatggctgatcccaatcgatttcgcggaaagaacctgcccgtcctggaccagctgacggacccccccggagtgaagcgtgtctaccacatccagccctcgctggaagacccctttcagcccccctcgatccccatcacggtgtactacgctgtgctggaacgtgcttgccgctcggtgctgctgcatgctccctcggaagctccccagatcgtgcgcggagcttcggacgaagctcgaaagcacacgtacaacctgacgatcgcttggtatcgcatgggagacaattgcgctatccccatcacggtcatggaatacacggaatgcccctacaacaagtcgctgggagtctgccccatccgaacgcagccccgctggtcgtactatgactcgttttcggctgtctcggaagataacctgggatttctgatgcacgctcccgcttttgaaacggctggaacgtacctgcgactggtgaagatcaacgactggacggaaatcacgcaatttatcctggaacaccgagctcgcgcttcgtgcaagtacgctctgcccctgcgcatcccccccgctgcttgcctgacgtcgaaggcttaccaacagggagtgacggtcgactcgatcggaatgctgccccgctttatccccgaaaaccagcgcacggtcgctctgtactcgctgaaaatcgctggatggcacggacccaagcccccctacacgtcgacgctgctgccccccgaactgtcggacacgacgaacgctacgcaacccgaactggtccccgaagaccccgaagactcggctctgctggaagatcccgctggaacggtgtcgtcgcagatcccccccaactggcacatcccctcgatccaggacgtcgctccccaccactagctcgag[seqidno：4].被密碼子優(yōu)化以制備合成編碼序列的親本hsvgd2編碼序列適合地是野生型或自然基因。然而，可能親本hsvgd2編碼序列不是自然存在的，而是使用重組技術(shù)被工程化。野生型多核苷酸可從任何合適的來源獲得，例如來自真核生物或原核生物，包括但不限于哺乳動(dòng)物或其他動(dòng)物，和致病生物體例如酵母、細(xì)菌、原生動(dòng)物和病毒。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，通常不需要用編碼與hsvgd2多肽共有完全相同氨基酸序列的多肽的合成編碼序列進(jìn)行免疫以產(chǎn)生對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答。因此，在一些實(shí)施方案中，由合成編碼序列編碼的多肽是hsvgd2多肽的至少一部分的變體?！白凅w”多肽包括通過以下而從hsvgd2多肽衍生的蛋白質(zhì)：缺失(所謂的截短)或向hsvgd2多肽的n端和/或c端加入一個(gè)或更多個(gè)氨基酸；在hsvgd2多肽的一個(gè)或更多個(gè)位點(diǎn)缺失或添加一個(gè)或更多個(gè)氨基酸；或在hsvgd2多肽的一個(gè)或更多個(gè)位點(diǎn)取代一個(gè)或更多個(gè)氨基酸。本發(fā)明涵蓋的變體多肽將具有與野生型hsvgd2多肽或其部分的氨基酸序列至少40％、50％、60％、70％，通常至少75％、80％、85％，通常至少約90％至95％或更高，和更通常地至少約96％、97％、98％、99％或更高的序列相似性或同一性，如通過本文別處描述的序列比對(duì)程序使用默認(rèn)參數(shù)確定的。hsvgd2多肽的變體可不同于野生型序列，通常多達(dá)200、100、50或20個(gè)氨基酸殘基，或適當(dāng)?shù)厣僦?-15個(gè)氨基酸殘基，少至1-10個(gè)，例如6-10個(gè)，少至5個(gè)，少至4、3、2或甚至1個(gè)氨基酸殘基。與hsvgd2多肽序列相比，對(duì)應(yīng)于hsvgd2多肽的至少一部分的變體多肽可在其序列的不同位置含有保守氨基酸取代?！氨Ｊ匕被崛〈?conservativeaminoacidsubstitution)”是其中氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替換的氨基酸取代。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族已經(jīng)在本領(lǐng)域中被定義，其通?？蓙喎诸惾缦拢核嵝缘模簹埢捎谠谏韕h下h離子的損失而具有負(fù)電荷，并且殘基被水性溶液吸引，以便當(dāng)含有其的肽在生理ph下處于水性介質(zhì)中時(shí)尋求該肽的構(gòu)象中的表面位置。具有酸性側(cè)鏈的氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。堿性的：殘基由于在生理ph或其一或兩個(gè)ph單位內(nèi)與h離子締合而具有正電荷(例如，組氨酸)，并且殘基被水性溶液吸引，以便當(dāng)包含其的肽在生理ph下處于水性介質(zhì)中時(shí)尋求該肽的構(gòu)象中的表面位置。具有堿性側(cè)鏈的氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶電的：殘基在生理ph下帶電，并且因此包括具有酸性或堿性側(cè)鏈的氨基酸(即，谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸和組氨酸)。疏水的：殘基在生理ph下不帶電，并且殘基被水性溶液排斥，以便當(dāng)含有其的肽處于水性介質(zhì)中時(shí)尋求該肽的構(gòu)象中的內(nèi)部位置。具有疏水側(cè)鏈的氨基酸包括酪氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。中性的/極性的：殘基在生理ph下不帶電，但是殘基不被水性溶液充分排斥，使得當(dāng)含有其的肽處于水性介質(zhì)中時(shí)其會(huì)尋求該肽的構(gòu)象中的內(nèi)部位置。具有中性/極性側(cè)鏈的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、組氨酸、絲氨酸和蘇氨酸。此描述也將某些氨基酸表征為“小的(small)”，因?yàn)榧词谷鄙贅O性基團(tuán)，其側(cè)鏈也不夠大到賦予疏水性。除脯氨酸外，“小的”氨基酸是當(dāng)至少一個(gè)極性基團(tuán)在側(cè)鏈上時(shí)具有四個(gè)或更少的碳，以及當(dāng)側(cè)鏈上沒有極性基團(tuán)時(shí)具有三個(gè)或更少的碳的那些氨基酸。具有小側(cè)鏈的氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸。由于其已知的對(duì)肽鏈二級(jí)構(gòu)象的影響，基因編碼的二級(jí)氨基酸脯氨酸是一個(gè)特殊情況。脯氨酸的結(jié)構(gòu)與所有其他自然存在的氨基酸的不同之處在于其側(cè)鏈鍵合至α-氨基基團(tuán)的氮以及α-碳。但是，多個(gè)氨基酸相似性矩陣(例如，由dayhoff等人(1978)amodelofevolutionarychangeinproteins.matricesfordeterminingdistancerelationshipsinm.o.dayhoff,(ed.),atlasofproteinsequenceandstructure,vol.5,pp.345-358,nationalbiomedicalresearchfoundation,washingtondc；和由gonnet等人，1992,science256(5062):144301445公開的pam120矩陣和pam250矩陣)將脯氨酸包括在與甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸同組中。因此，為了本發(fā)明的目的，將脯氨酸分類為“小的”氨基酸。分類為極性或非極性所需的吸引或排斥的程度是任意的，并且因此，本發(fā)明具體預(yù)期的氨基酸已被分類為一種或另一種。大多數(shù)不被具體命名的氨基酸可根據(jù)已知行為進(jìn)行分類。氨基酸殘基可進(jìn)一步被亞分類為環(huán)狀或非環(huán)狀和芳香或非芳香，關(guān)于殘基的側(cè)鏈取代基的不言自明的分類，和小的或大的。倘若存在另外的極性取代基，如果其含有總共四個(gè)碳原子或更少(包括羧基碳)，則殘基被認(rèn)為是小的；如果沒有，則三個(gè)或更少。當(dāng)然，小殘基總是非芳香的。取決于其結(jié)構(gòu)性質(zhì)，氨基酸殘基可能落入兩個(gè)或更多個(gè)類別中。對(duì)于自然存在的蛋白質(zhì)氨基酸，根據(jù)此方案的亞分類被呈現(xiàn)于表3。表3保守氨基酸取代還包括基于側(cè)鏈的分組。例如，一組具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；一組具有脂肪族-羥基側(cè)鏈的氨基酸是絲氨酸和蘇氨酸；一組具有含酰胺側(cè)鏈的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一組具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一組具有堿性側(cè)鏈的氨基酸是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；和一組具有含硫側(cè)鏈的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。例如，可合理地預(yù)期，用異亮氨酸或纈氨酸替換亮氨酸、用谷氨酸替換天冬氨酸、用絲氨酸替換蘇氨酸或用結(jié)構(gòu)相關(guān)的氨基酸類似地替換氨基酸，將不會(huì)對(duì)所得變體多肽的性質(zhì)具有大的影響。保守取代在下表4中在示例性取代的標(biāo)題下顯示。更優(yōu)選的取代在優(yōu)選的取代的標(biāo)題下顯示。落入本發(fā)明范圍內(nèi)的氨基酸取代通常通過選擇在其維持(a)在取代區(qū)域中的肽骨架的結(jié)構(gòu)，(b)在靶位點(diǎn)的分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的體積的作用中沒有顯著差異的取代來實(shí)現(xiàn)。引入取代后，針對(duì)生物活性篩選變體。表4示例性和優(yōu)選氨基酸取代可選地，用于進(jìn)行保守取代的相似氨基酸可基于側(cè)鏈的身份被分為三類。第一組包括谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸、組氨酸，其均具有帶電側(cè)鏈；第二組包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺；和第三組包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸，如zubay,g.,biochemistry,第三版,wm.c.brownpublishers(1993)中描述的。3.2取代密碼子的方法可使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法來實(shí)現(xiàn)將一個(gè)密碼子替換為另一個(gè)。例如，親本多核苷酸的密碼子修飾可使用包括例如寡核苷酸定向誘變、用簡并寡核苷酸的誘變和區(qū)域特異性誘變的多種已知的誘變技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。示例性的體外誘變技術(shù)描述于例如美國專利號(hào)4,184,917、4,321,365和4,351,901中或在ausubel等人(currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,inc.1997)和在sambrook等人,(molecularcloning.alaboratorymanual,coldspringharborpress,1989)的相關(guān)章節(jié)中。代替體外誘變，合成編碼序列可使用例如美國專利號(hào)4,293,652中描述的容易獲得的機(jī)器來從頭合成。然而，應(yīng)當(dāng)注意，本發(fā)明不依賴于和不指向用于構(gòu)建合成編碼序列的任何一種特定技術(shù)。4.合成構(gòu)建體4.1調(diào)控核酸本發(fā)明進(jìn)一步預(yù)期了第一和第二構(gòu)建體，其各自包含可操作地連接到調(diào)控核酸的合成編碼序列。調(diào)控核酸適當(dāng)?shù)匕D(zhuǎn)錄和/或翻譯控制序列，其將對(duì)感興趣的生物體或該生物體的細(xì)胞中的表達(dá)相容。通常，轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控控制序列包括但不限于啟動(dòng)子序列、5'非編碼區(qū)、順式調(diào)控區(qū)例如轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白或翻譯調(diào)控蛋白的功能性結(jié)合位點(diǎn)、上游開放閱讀框、核糖體結(jié)合序列、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、翻譯起始位點(diǎn)和/或編碼前導(dǎo)序列的核苷酸序列、終止密碼子、翻譯終止位點(diǎn)和3'非翻譯區(qū)。本發(fā)明預(yù)期了本領(lǐng)域已知的組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以是自然存在的啟動(dòng)子或者組合多于一個(gè)啟動(dòng)子的元件的雜合啟動(dòng)子。本發(fā)明預(yù)期的啟動(dòng)子序列可對(duì)感興趣的生物體是天然的或者可衍生自替代的來源，其中該區(qū)域在選定的生物體中有功能。啟動(dòng)子的選擇將根據(jù)預(yù)期的宿主或細(xì)胞或組織類型而不同。例如，可用于哺乳動(dòng)物中表達(dá)的啟動(dòng)子包括可響應(yīng)于重金屬例如鎘而被誘發(fā)的金屬硫蛋白啟動(dòng)子、β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子以及病毒啟動(dòng)子例如sv40大t抗原啟動(dòng)子、人類巨細(xì)胞病毒(cmv)立即早期(ie)啟動(dòng)子、勞斯肉瘤病毒ltr啟動(dòng)子、小鼠乳腺腫瘤病毒ltr啟動(dòng)子、腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(admlp)、單純皰疹病毒啟動(dòng)子和hpv啟動(dòng)子特別是hpv上游調(diào)控區(qū)域(urr)、及其他。所有這些啟動(dòng)子都在本領(lǐng)域中被充分地描述并且容易獲得。本文還可使用增強(qiáng)子元件以增加哺乳動(dòng)物構(gòu)建體的表達(dá)水平。示例包括如例如在dijkema等人(1985,emboj.4:761)中描述的sv40早期基因增強(qiáng)子、如例如在gorman等人(1982,proc.natl.acad.sci.usa79:6777)中描述的衍生自勞斯肉瘤病毒的長末端重復(fù)(ltr)的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子和例如在boshart等人(1985,cell41:521)中描述的衍生自人cmv的元件，例如包括在cmv內(nèi)含子a序列中的元件。第一和第二構(gòu)建體還可包含3'非翻譯序列。3'非翻譯序列是指基因包含含有聚腺苷酸化信號(hào)和能夠?qū)崿F(xiàn)mrna加工或基因表達(dá)的任何其他調(diào)控信號(hào)的dna區(qū)段的部分。聚腺苷酸化信號(hào)被表征為實(shí)現(xiàn)添加聚腺苷酸域(polyadenylicacidtracts)至mrna前體的3'末端。聚腺苷酸化信號(hào)通常依據(jù)與典型形式的5'aataaa-3’存在同源性來被識(shí)別，盡管變化并不罕見。3'非翻譯調(diào)控dna序列優(yōu)選地包括從約50至1,000nt，并且除了聚腺苷酸化信號(hào)和能夠?qū)崿F(xiàn)mrna加工或基因表達(dá)的任何其他調(diào)控信號(hào)之外，還可含有轉(zhuǎn)錄和翻譯終止序列。在一些實(shí)施方案中，第一和第二構(gòu)建體還含有選擇性標(biāo)記基因，以允許選擇含有該構(gòu)建體的細(xì)胞。選擇基因是本領(lǐng)域公知的，并且將與在感興趣的細(xì)胞中的表達(dá)相容。然而，應(yīng)當(dāng)理解，異源系統(tǒng)中蛋白質(zhì)編碼多核苷酸的表達(dá)現(xiàn)在是眾所周知的，并且本發(fā)明不一定指向或依賴于用于表達(dá)多核苷酸的任何特定載體、轉(zhuǎn)錄控制序列或技術(shù)。而是，根據(jù)本文列出的方法制備的合成編碼序列可以任何合適的構(gòu)建體或載體的形式以任何合適的方式引入哺乳動(dòng)物，并且合成編碼序列可以任何常規(guī)方式用已知的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件表達(dá)。此外，第一和第二構(gòu)建體可被構(gòu)建為包括編碼例如衍生自單個(gè)或自多于一個(gè)hsvgd2多肽的例如感興趣的多個(gè)抗原/表位的嵌合抗原編碼基因序列。在某些實(shí)施方案中，可構(gòu)建多順反子盒(例如，雙順反子盒)，其允許使用例如emcvires等從單個(gè)mrna表達(dá)多種佐劑和/或抗原性多肽。在其他實(shí)施方案中，佐劑和/或抗原性多肽可在與獨(dú)立轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件可操作地連接的分開的編碼序列上編碼。4.2蛋白質(zhì)佐劑和蛋白質(zhì)去穩(wěn)定元件此外，可構(gòu)建第一和第二構(gòu)建體以包括編碼蛋白質(zhì)佐劑的序列。特別合適的是例如以下的細(xì)菌adp-核糖基化毒素的脫毒突變體(detoxifiedmutant)：白喉毒素、百日咳毒素(pt)、霍亂毒素(ct)、大腸桿菌(escherichiacoli)不耐熱毒素(lt1和lt2)、假單胞菌(pseudomonas)內(nèi)毒素a、肉毒梭菌(clostridiumbotulinum)c2和c3毒素以及來自產(chǎn)氣莢膜梭菌(c.perfringens)、螺狀梭菌(c.spiriforma)和艱難梭菌(c.difficile)的毒素。在一些實(shí)施方案中，第一和第二構(gòu)建體包括大腸桿菌不耐熱毒素的脫毒突變體的編碼序列，所述脫毒突變體例如在美國專利號(hào)6,818,222中描述的lt-k63和lt-r72脫毒突變體。在一些實(shí)施方案中，佐劑是蛋白質(zhì)去穩(wěn)定化元件，其通過i類mhc途徑增加對(duì)應(yīng)于hsvgd2多肽的至少一部分的多肽的加工和呈遞，從而導(dǎo)致增強(qiáng)的針對(duì)多肽的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。示例性蛋白質(zhì)去穩(wěn)定元件包括可選自但不限于以下的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解信號(hào)或降解決定子：在感興趣的多肽的氨基末端的去穩(wěn)定氨基酸、pset區(qū)域或泛素。例如，可修飾多肽的編碼序列以在其氨基末端包括去穩(wěn)定氨基酸，使得如例如在美國專利序列號(hào)5,093,242中由bachmair等人和在美國專利序列號(hào)5,122,463中由varshavsky等人公開的，如此修飾的蛋白質(zhì)經(jīng)受n末端規(guī)則途徑。在一些實(shí)施方案中，去穩(wěn)定氨基酸選自異亮氨酸和谷氨酸，特別是選自組氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺，更特別是選自天冬氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、亮氨酸、色氨酸和賴氨酸。在某些實(shí)施方案中，去穩(wěn)定氨基酸是精氨酸。在一些蛋白質(zhì)中，由于蛋白質(zhì)的構(gòu)象(即，其三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu))，氨基末端被遮蔽。在這些情況下，氨基末端的更廣泛的改變可能是使蛋白質(zhì)經(jīng)受n端規(guī)則途徑所必需的。例如，在由于不可接近的氨基末端而使單個(gè)氨基末端殘基的簡單添加或替換不足的情況，可將多個(gè)氨基酸(包括賴氨酸，泛素結(jié)合于底物蛋白質(zhì)的位點(diǎn))加入到原始氨基末端以增加工程化氨基末端的可接近性和/或分段移動(dòng)性(segmentalmobility)。在一些實(shí)施方案中，可修飾編碼多肽的氨基末端區(qū)域的核酸序列，以在合適的背景中引入賴氨酸殘基。這可通過采用編碼“通用去穩(wěn)定區(qū)段”的dna構(gòu)建體來最方便地實(shí)現(xiàn)。通用去穩(wěn)定區(qū)段包含編碼含有一個(gè)或更多個(gè)賴氨酸殘基的優(yōu)選可分段移動(dòng)的多肽結(jié)構(gòu)的核酸構(gòu)建體，賴氨酸殘基的密碼子位于構(gòu)建體內(nèi)，使得當(dāng)構(gòu)建體被插入編碼蛋白質(zhì)的合成編碼序列的編碼序列時(shí)，賴氨酸殘基空間上足夠靠近編碼的蛋白質(zhì)的氨基末端以作為完整氨基末端降解信號(hào)的第二決定因素。將這類構(gòu)建體插入編碼多肽的合成編碼序列的5'部分將在合適的背景中為編碼的多肽提供一個(gè)或更多個(gè)賴氨酸殘基用于去穩(wěn)定化。在其他實(shí)施方案中，將多肽修飾成含有富含選自脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的氨基酸的pest區(qū)，該區(qū)域任選地兩側(cè)是包含正電側(cè)鏈的氨基酸。在這方面，已知細(xì)胞內(nèi)半衰期小于約2小時(shí)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列含有富含脯氨酸(p)、谷氨酸(e)、絲氨酸(s)和蘇氨酸(t)的一個(gè)或更多個(gè)區(qū)域，如例如由rogers等人(1986,science234(4774):364-368)顯示的。在還其他實(shí)施方案中，多肽與泛素或其生物活性片段綴合，以產(chǎn)生相對(duì)于未修飾的多肽其細(xì)胞內(nèi)蛋白水解降解速率增加、增強(qiáng)或以其他方式升高的修飾多肽。一種或更多種佐劑多肽可與對(duì)應(yīng)于hsvgd2多肽的至少一部分的“抗原性”多肽共表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，佐劑和抗原性多肽可以包含一種或更多種佐劑多肽和一種或更多種抗原性多肽的融合蛋白的形式共表達(dá)?？蛇x擇地，佐劑和抗原性多肽可共表達(dá)為分開的蛋白質(zhì)。4.3載體以上描述的第一和第二構(gòu)建體適合地是適合于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白質(zhì)的載體的形式，并且特別是通過遺傳免疫鑒定為用于誘導(dǎo)中和免疫應(yīng)答的那些。專門用于在dna疫苗中使用而制備的載體通常將指導(dǎo)靶生物體中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的真核區(qū)域與在大腸桿菌(e.coli)宿主中提供選擇和繁殖的細(xì)菌區(qū)域組合。真核區(qū)域在感興趣的基因的上游含有啟動(dòng)子和下游含有聚腺苷酸化信號(hào)(polya)。轉(zhuǎn)染入細(xì)胞核后，啟動(dòng)子指導(dǎo)包括轉(zhuǎn)基因的mrna的轉(zhuǎn)錄。聚腺苷酸化信號(hào)介導(dǎo)mrna裂解和聚腺苷酸化，這導(dǎo)致向細(xì)胞質(zhì)的高效的mrna輸出。經(jīng)常包括kozak序列(gccgccrccatgg共有序列，kozak序列內(nèi)的轉(zhuǎn)基因atg起始密碼子被加下劃線，帽中的關(guān)鍵殘基r＝a或g)。kozak序列在細(xì)胞質(zhì)中被核糖體識(shí)別并指導(dǎo)高效的轉(zhuǎn)基因翻譯。組成型人巨細(xì)胞病毒(cmv)啟動(dòng)子是dna疫苗中最常用的啟動(dòng)子，因?yàn)樗诖蠖鄶?shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高度活躍，比替代病毒或細(xì)胞啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄更高水平的mrna。polya信號(hào)通常用于增加聚腺苷酸化效率，導(dǎo)致增加的mrna水平和改善的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，載體包含第一或第二合成編碼序列，而沒有任何另外的和/或非功能性序列(例如，可能在受試者中表達(dá)的隱蔽orf)。這在轉(zhuǎn)錄的utr中是特別有益的，以預(yù)防在受試者中產(chǎn)生可能誘發(fā)不期望的適應(yīng)性免疫應(yīng)答的載體編碼的隱蔽肽。適用于本發(fā)明的載體的說明性實(shí)例包括ntc8485和nct8685(naturetechnologycorporation,nebraska,usa)。可選擇地，可使用親本載體ntc7485。ntc7485被設(shè)計(jì)為符合美國食品和藥物管理局(fda)關(guān)于dna疫苗載體組合物的管理指南(fda1996,fda2007，并在williams等人,2009中綜述)。具體地，消除了對(duì)靶基因的大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制或哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)不是必需的所有序列。在載體設(shè)計(jì)中利用合成的真核mrna前導(dǎo)序列和終止子序列來限制與人類基因組的dna序列同源性，以減少染色體整合的可能性。在其他實(shí)施方案中，載體可包含編碼輔助功能序列的核酸序列(例如，實(shí)現(xiàn)hsvgd2多肽的轉(zhuǎn)運(yùn)或翻譯后序列修飾的序列，其非限制性示例包括信號(hào)或靶向序列)。例如，ntc8482使用優(yōu)化的組織纖溶酶原激活物(tpa)信號(hào)肽將編碼的蛋白質(zhì)靶向至分泌途徑。在一些實(shí)施方案中，hsvgd2抗原的表達(dá)由優(yōu)化的嵌合啟動(dòng)子-內(nèi)含子(例如，sv40-cmv-htlv-1r合成內(nèi)含子)驅(qū)動(dòng)。在這些實(shí)施方案的一個(gè)方面，載體編碼共有的kozak翻譯起始序列和atg起始密碼子。值得注意的是，嵌合巨細(xì)胞病毒(cmv)啟動(dòng)子達(dá)到比傳統(tǒng)的基于人cmv啟動(dòng)子的載體顯著更高的表達(dá)水平(luke等人，2009)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將dna質(zhì)?？寺〉絥tc8485、ntc8685或ntc9385r載體家族中，其組合最小原核序列并包括無抗生素的蔗糖選擇標(biāo)記物。這些家族還含有指導(dǎo)優(yōu)良的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的新型嵌合啟動(dòng)子(參見luke等人，2009；luke等人，2011；和williams，2013)。4.4使用rna選擇標(biāo)記物的無抗生素選擇如上面描述的，在一些實(shí)施方案中，載體不含用于表達(dá)本發(fā)明的合成構(gòu)建體的任何非必需序列，例如抗生素抗性標(biāo)記物?？敲顾乜剐?kanr)是載體中最常用的抗性基因以允許在細(xì)菌發(fā)酵過程中選擇性保留質(zhì)粒dna。然而，為確保安全，管理機(jī)構(gòu)通常推薦從治療和疫苗質(zhì)粒dna載體中消除抗生素抗性標(biāo)記物。由于抗生素抗性向內(nèi)源性微生物菌群的潛在轉(zhuǎn)移和基因被細(xì)胞摻入基因組后由哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子的潛在的激活和轉(zhuǎn)錄，疫苗載體中抗生素抗性基因的存在因此被管理機(jī)構(gòu)認(rèn)為是不期望的。改進(jìn)以用短rna無抗生素標(biāo)記物替換kanr標(biāo)記物的載體通常具有改善表達(dá)的意想不到的好處。ntc7485載體包含卡那霉素抗性抗生素選擇標(biāo)記物。在一些實(shí)施方案中，使用抗生素抗性以外的選擇技術(shù)。以說明性實(shí)例的方式，ntc8485、ntc8684和ntc9385r載體衍生自ntc7485載體，其中kanr抗生素選擇標(biāo)記物被蔗糖可選擇的rna-out標(biāo)記物替換。因此，在一些實(shí)施方案中，疫苗載體包含無抗生素的選擇系統(tǒng)。雖然已經(jīng)開發(fā)了許多無抗生素的質(zhì)粒保留系統(tǒng)，其中載體編碼的選擇標(biāo)記物不是基于蛋白質(zhì)的，但是已經(jīng)觀察到具有摻入基于rna的無抗生素選擇標(biāo)記物的sna疫苗載體的優(yōu)良的表達(dá)和制備。合適的基于rna的無抗生素選擇系統(tǒng)的說明性實(shí)例是蔗糖選擇載體rna-out，一種小的70bp反義rna系統(tǒng)(naturetechnologycorporation,nebraska,usa)；pfar4和pcor載體編碼無義抑制子trna標(biāo)記物；并且pmini載體利用cole1起點(diǎn)編碼的rnai反義rna。這些質(zhì)粒攜帶的rna中的每一個(gè)調(diào)控宿主染色體編碼的選擇標(biāo)記物的翻譯，允許質(zhì)粒選擇。例如，rna-out抑制反選擇標(biāo)記物(sacb)從宿主染色體(選擇宿主dh5αattλ::p5/66/6-rna-in-sacb,catr)的表達(dá)。sacb編碼一種果聚糖蔗糖酶，其在蔗糖存在下是有毒的。在蔗糖存在下達(dá)到質(zhì)粒選擇。此外，對(duì)于rna-out載體和pmini兩者，已經(jīng)開發(fā)了高產(chǎn)的發(fā)酵方法。在所有這些載體中，以前已經(jīng)證明了kanr抗生素選擇標(biāo)記物替換的結(jié)果可改善靶生物體中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，表明消除抗生素選擇以達(dá)到管理標(biāo)準(zhǔn)可能意外地還改善了載體表現(xiàn)。4.5病毒載體在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的第一和第二構(gòu)建體是表達(dá)載體的形式，其適當(dāng)?shù)剡x自自體復(fù)制的染色體外的載體(例如，質(zhì)粒)和整合到宿主基因組中的載體。在這種類型的說明性實(shí)例中，表達(dá)載體是病毒載體，例如猿猴病毒40(sv40)或牛乳頭瘤病毒(bpv)，其具有作為染色體外元件復(fù)制的能力(eukaryoticviralvectors,coldspringharborlaboratory,gluzmaned.,1982；sarver等人，1981,mol.cell.biol.1:486)。病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒(慢病毒)、腺相關(guān)病毒(參見例如okada,1996,genether.3:957-964；muzyczka,1994,j.clin.invst.94:1351；美國專利號(hào)6,156,303；描述aav載體的6,143,5485,952,221；還參見美國專利號(hào)6,004,799；5,833,993)、腺病毒(參見例如美國專利號(hào)6,140,087；6,136,594；6,133,028；6,120,764)、呼腸孤病毒、皰疹病毒、輪狀病毒基因組等，其被修飾用于引入和指導(dǎo)細(xì)胞中多核苷酸或轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可包括基于鼠白血病病毒的那些(參見例如美國專利號(hào)6,132,731)、長臂猿白血病病毒(參見例如美國專利號(hào)6,033,905)、猿免疫缺陷病毒、人免疫缺陷病毒(參見例如美國專利號(hào)5,985,641)及其組合。載體還包括在體內(nèi)高效地將基因遞送到動(dòng)物細(xì)胞(例如，干細(xì)胞)的那些(參見例如美國專利號(hào)5,821,235和5,786,340；croyle等人，1998,genether.5:645；croyle等人，1998,pharm.res.15:1348；croyle等人，1998,hum.genether.9:561；foreman等人，1998,hum.genether.9:1313；wirtz等人，1999,gut44:800)。適用于體內(nèi)遞送的腺病毒和腺相關(guān)病毒載體描述于例如美國專利號(hào)5,700,470、5,731,172和5,604,090。適用于體內(nèi)遞送的另外的載體包括單純皰疹病毒載體(參見例如美國專利號(hào)5,501,979)、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(參見例如美國專利號(hào)5,624,820、5,693,508和5,674,703；和wo92/05266和wo92/14829)、牛乳頭瘤病毒(bpv)載體(參見例如美國專利號(hào)5,719,054)、基于cmv的載體(參見例如美國專利號(hào)5,561,063)和細(xì)小病毒、輪狀病毒和諾瓦克病毒載體。慢病毒載體對(duì)于感染分裂以及非分裂細(xì)胞是有用的(參見例如美國專利號(hào)6,013,516)。將可用于遞送編碼感興趣抗原的核酸分子的另外的病毒載體包括源自痘病毒家族(包括牛痘病毒和禽痘病毒)的那些。以舉例的方式，可如下構(gòu)建表達(dá)第一和第二構(gòu)建體的牛痘病毒重組體。首先將抗原編碼序列插入到適當(dāng)?shù)妮d體中，使得其與牛痘啟動(dòng)子相鄰并且側(cè)接牛痘dna序列，例如編碼胸苷激酶(tk)的序列。然后將該載體用于轉(zhuǎn)染同時(shí)感染牛痘的細(xì)胞。同源重組用于將牛痘啟動(dòng)子加上編碼感興趣的編碼序列的基因插入到病毒基因組中。可通過在存在5-溴代脫氧尿苷的情況下培養(yǎng)細(xì)胞并挑選對(duì)其耐藥的病毒噬菌斑來選擇所得的tk-重組體?？蛇x擇地，禽痘病毒，例如禽痘和金絲雀痘病毒也可用于遞送基因。已知當(dāng)向非禽類物種施用時(shí)，表達(dá)來自哺乳動(dòng)物病原體的免疫原的重組禽痘病毒賦予保護(hù)性免疫。在人類哺乳動(dòng)物和其他哺乳動(dòng)物物種中尤其期望使用禽痘載體，因?yàn)榍荻粚俚某蓡T只能在易感的禽類物種中有效地復(fù)制，并因此在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不感染。用于產(chǎn)生重組禽痘病毒的方法是本領(lǐng)域已知的，并且如上關(guān)于生產(chǎn)牛痘病毒的描述采用遺傳重組。參見例如wo91/12882；wo89/03429；和wo92/03545。分子結(jié)合載體，例如在michael等人，j.biol.chem.(1993)268:6866-6869和wagner等人,proc.natl.acad.sci.usa(1992)89:6099-6103中描述的腺病毒嵌合載體也可用于基因遞送。甲病毒屬(alphavirus)的成員，例如但不限于衍生自辛德比斯病毒(sin)、塞米利奇森林病毒(sfv)和委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(vee)的載體也將可用作病毒載體用于遞送本發(fā)明的第一和第二構(gòu)建體。對(duì)于對(duì)本方法的實(shí)踐有用的辛德比斯病毒衍生的載體的描述，參見dubensky等人(1996,j.virol.70:508-519；和國際公布號(hào)wo95/07995、wo96/17072)；以及dubensky,jr.,t.w.等人，美國專利號(hào)5,843,723和dubensky,jr.,t.w.,美國專利號(hào)5,789,245。這種類型的示例性載體是包括衍生自辛德比斯病毒和委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒的序列的嵌合甲病毒載體。參見例如perri等人(2003,j.virol.77:10394-10403)和國際公布號(hào)wo02/099035、wo02/080982、wo01/81609和wo00/61772。在其他說明性實(shí)施方案中，采用慢病毒載體以將本發(fā)明的第一和第二構(gòu)建體遞送到選定的細(xì)胞或組織中。通常，這些載體包含5'慢病毒ltr、trna結(jié)合位點(diǎn)、包裝信號(hào)、可操作地連接到一個(gè)或更多個(gè)感興趣基因的啟動(dòng)子、第二鏈dna合成起點(diǎn)和3'慢病毒ltr，其中慢病毒載體含有核運(yùn)輸元件。核運(yùn)輸元件可位于感興趣的編碼序列的上游(5')或下游(3')(例如，本發(fā)明的合成的gag或env表達(dá)盒)。可在本發(fā)明的上下文中利用各種慢病毒，包括例如選自hiv、hiv-1、hiv-2、fiv、biv、eiav、mvv、caev和siv組成的組的慢病毒。pct公布號(hào)wo00/66759、wo00/00600、wo99/24465、wo98/51810、wo99/51754、wo99/31251、wo99/30742和wo99/15641中描述了慢病毒載體的說明性實(shí)例。合意地，使用第三代sin慢病毒。第三代sin(自滅活)慢病毒的商業(yè)供應(yīng)商包括invitrogen(virapowerlentiviralexpressionsystem)。例如在invitrogen技術(shù)手冊(cè)“virapowerlentiviralexpressionsystem版本b05010225-0501”中(可從http://www.invitrogen.com/content/tech-online/molecular_biology/manuals_p-ps/virapower_lentiviral_system_man.pdf獲得)給出了慢病毒載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染、收獲和使用的詳細(xì)方法，慢病毒載體已經(jīng)涌現(xiàn)為基因轉(zhuǎn)移的有效方法。生物安全特性的改善已經(jīng)使得這些載體適合在生物安全等級(jí)2(bl2)下使用。第三代sin(自動(dòng)滅活)載體中并入了許多安全特征。病毒3'ltru3區(qū)域的缺失導(dǎo)致不能轉(zhuǎn)錄全長病毒rna的原病毒(provirus)。此外，許多必需基因以反式提供，產(chǎn)生能夠僅單輪感染和整合的病毒貯存。慢病毒載體有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，包括：1)使用兼性包膜蛋白對(duì)載體的假型包裝允許其感染幾乎任何細(xì)胞類型；2)到靜止、有絲分裂后、分化細(xì)胞(包括神經(jīng)元)的基因遞送已經(jīng)被證明；3)其低細(xì)胞毒性在轉(zhuǎn)基因遞送系統(tǒng)中是獨(dú)特的；4)病毒整合入基因組允許長期轉(zhuǎn)基因表達(dá)；5)其包裝容量(6-14kb)比其他逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺相關(guān)病毒載體大得多。在該系統(tǒng)能力最近的證明中，表達(dá)gfp的慢病毒載體被用于感染鼠干細(xì)胞，導(dǎo)致活后代、種系傳播和報(bào)告基因的啟動(dòng)子特異性和組織特異性表達(dá)(ailles,l.e.和naldini,l.,hiv-1-derivedlentiviralvectors.in:trono,d.(ed.),lentiviralvectors,springer-verlag,berlin,heidelberg,newyork,2002,pp.31-52)。在lois等人(2002,science,295868-872)的綜述的圖2中概述了當(dāng)代載體的實(shí)例。第一和第二構(gòu)建體也可無載體地被遞送。例如，構(gòu)建體可在遞送到受試者或從其衍生的細(xì)胞之前作為dna或rna被包裝在脂質(zhì)體中。脂質(zhì)包封通常使用能夠穩(wěn)定結(jié)合或捕獲和保留核酸的脂質(zhì)體來完成。凝聚的dna與脂質(zhì)制劑的比例可變化，但通常為約1:1(mgdna：微摩爾脂質(zhì))或更多的脂質(zhì)。關(guān)于脂質(zhì)體作為遞送核酸的載體的使用的綜述，參見hug和sleight(1991，biochim.biophys.acta.1097:1-17)；和straubinger等人，在methodsofenzymology(1983),vol.101,pp.512-527中。在其他實(shí)施方案中，第一和第二構(gòu)建體包含包含hsvgd2編碼序列的mrna編碼序列、由包含hsvgd2編碼序列的mrna編碼序列組成或基本上由包含hsvgd2編碼序列的mrna編碼序列組成。如上面描述的，hsvgd2編碼序列可任選地包含kozak序列和/或聚腺苷酸化序列。適當(dāng)?shù)?，第一和第二?gòu)建體還任選地包括本領(lǐng)域已知的rna結(jié)構(gòu)的化學(xué)修飾，例如骨架的硫代磷酸化或核糖基團(tuán)的2'-甲氧基甲基化(2'moe)，以增強(qiáng)mrna編碼序列的攝取、穩(wěn)定性和最終有效性(參見agrawal1999；gearry等人，2001)。4.6微環(huán)載體(minicirclevectors)在一些實(shí)施方案中，第一和/或第二構(gòu)建體是微環(huán)載體的形式。微環(huán)載體是小的、雙鏈的環(huán)狀dna分子，其提供存在于載體上的hsvgd2編碼序列的持續(xù)的、高水平的表達(dá)，該感興趣的序列可編碼多肽(例如，hsvgd2多肽)。hsvgd2編碼序列可操作地連接到存在于微環(huán)載體上的調(diào)控序列，該調(diào)控序列控制其表達(dá)。用于本發(fā)明的合適的微環(huán)載體被描述于，例如在公布的美國專利申請(qǐng)?zhí)?004/0214329中，并且可通過darquet等人，genether.(1997)4:1341-1349中描述的方法制備。簡而言之，hsvgd2編碼序列側(cè)翼為重組酶的附著位點(diǎn)，重組酶在編碼序列之外的部分載體序列中以可誘導(dǎo)的方式表達(dá)。簡而言之，可用類似于pbad..phi.c31.hfix和pbad..phi.c31.rhb的質(zhì)粒制備微環(huán)載體，并用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌。本領(lǐng)域已知的重組體酶，例如λ和cre，適用于并入微環(huán)載體。存在于微環(huán)載體中的表達(dá)盒可含有用于轉(zhuǎn)錄起始和終止的位點(diǎn)，以及轉(zhuǎn)錄區(qū)域中的用于翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。微環(huán)載體可包括至少一種選擇標(biāo)記物，例如二氫葉酸還原酶、g418或用于真核細(xì)胞培養(yǎng)的新霉素抗性的標(biāo)記物；和用于在大腸桿菌和其他原核細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)的四環(huán)素、卡那霉素或氨芐青霉素抗性基因。產(chǎn)生質(zhì)粒的微環(huán)可包括至少一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)以允許載體在合適的真核或原核宿主細(xì)胞中的繁殖。復(fù)制起點(diǎn)是本領(lǐng)域已知的，例如在genesii,lewin,b.,ed.,johnwiley&sons,newyork(1985)中描述的。5.組合物本發(fā)明還提供包含本文描述的第一和第二構(gòu)建體的組合物(特別是免疫原性組合物)，其可例如使用相同或不同的載體或媒介物遞送。第一和第二構(gòu)建體可分別、同時(shí)或順序被施用。免疫原性組合物可被給予不止一次(例如，“初免”施用，隨后是一次或多次“加強(qiáng)”)以達(dá)到所需的效果。相同的組合物可被以一個(gè)或更多個(gè)初免和一個(gè)或更多個(gè)加強(qiáng)步驟施用?？蛇x地，不同的組合物可用于初免和加強(qiáng)。5.1藥學(xué)上可接受的組分本發(fā)明的組合物適合地是藥物組合物。藥物組合物通常包含一種或更多種“藥學(xué)上可接受的載體”。這些包括本身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)接受組合物的個(gè)體有害的抗體的任何載體。合適的載體通常是大的、緩慢代謝的大分子，例如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和脂質(zhì)聚集體(例如油滴或脂質(zhì)體)。這類載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。組合物還可含有稀釋劑，例如水、鹽水、甘油等。此外，可存在輔助物質(zhì)，例如潤濕劑或乳化劑、ph緩沖物質(zhì)等。藥學(xué)上可接受的組分的詳細(xì)討論可在gennaro(2000)remington:thescienceandpracticeofpharmacy.20thed.,isbn:0683306472中獲得。藥物組合物可包括例如2002年2月14日公布的美國專利申請(qǐng)公布號(hào)2002/0019358中公開的各種鹽、賦形劑、遞送媒介物和/或輔助劑(auxiliaryagents)?？蛇x地或另外，本發(fā)明的藥物組合物可包括一種或更多種促進(jìn)將多核苷酸遞送至細(xì)胞內(nèi)部和/或至細(xì)胞內(nèi)的期望位置的轉(zhuǎn)染促進(jìn)化合物。如本文使用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)染促進(jìn)化合物”、“轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑”和“轉(zhuǎn)染促進(jìn)材料”是同義的，并且可互換使用。應(yīng)當(dāng)注意，某些轉(zhuǎn)染促進(jìn)化合物也可以是如下文所述的“佐劑”，即，除促進(jìn)將多核苷酸遞送至細(xì)胞內(nèi)部外，該化合物也用于改變或增加針對(duì)多核苷酸編碼的抗原的免疫應(yīng)答。轉(zhuǎn)染促進(jìn)化合物的實(shí)例包括但不限于無機(jī)材料例如磷酸鈣、明礬(磷酸鋁)和金顆粒(例如，“粉末”型遞送媒介物)；肽，例如，典型的、細(xì)胞間靶向的(用于選擇性遞送至某些細(xì)胞類型)、細(xì)胞內(nèi)靶向的(用于核定位或內(nèi)體逃逸)和兩親的(螺旋形成的或孔形成的)；蛋白質(zhì)，例如，堿性的(例如，帶正電荷的)例如組蛋白、靶向的(例如，脫唾液酸蛋白)、病毒的(例如，仙臺(tái)病毒外殼蛋白)和孔形成的；脂質(zhì)，例如，陽離子的(例如，dmrie、dospa、dc-chol)、堿性的(例如，甾胺)、中性的(例如，膽固醇)、陰離子的(例如，磷脂酰絲氨酸)和兩性離子的(例如，dope、dopc)；和聚合物例如樹枝狀聚合物、星形聚合物、“均質(zhì)的”聚氨基酸(例如，聚賴氨酸、聚精氨酸)、“異質(zhì)的”聚氨基酸(例如，賴氨酸&甘氨酸的混合物)、共聚物、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、泊洛沙姆(例如crl1005)和聚乙二醇(peg)。轉(zhuǎn)染促進(jìn)材料可單獨(dú)使用或與一種或更多種其他轉(zhuǎn)染促進(jìn)材料組合使用。兩種或更多種轉(zhuǎn)染促進(jìn)材料可通過以下反式組合：化學(xué)鍵合(例如，共價(jià)的和離子的，例如在脂質(zhì)化聚賴氨酸、聚乙二醇化聚賴氨酸中)(toncheva等人，biochim.biophys.acta1380(3):354-368(1988))、機(jī)械混合(例如，在液相或固相中的自由移動(dòng)材料例如“聚賴氨酸+陽離子脂質(zhì)”)(gao和huang,biochemistry35:1027-1036(1996)；trubetskoy等人，biochem.biophys.acta1131:311-313(1992))和聚集(例如，共沉淀、凝膠形成例如在陽離子脂質(zhì)+聚丙交酯和聚賴氨酸+明膠中)。轉(zhuǎn)染促進(jìn)材料的一類是陽離子脂質(zhì)。陽離子脂質(zhì)的實(shí)例是5-羧基鯨蠟基甘氨酸二辛基酰胺(5-carboxyspermylglycinedioctadecylamide，dogs)和二棕櫚?；字Ｒ掖及?5-羧基鯨蠟酰胺(dipalmitoyl-phophatidylethanolamine-5-carboxyspermylamide，dppes)。陽離子膽固醇衍生物也是有用的，包括{3β-[n-n',n'-二甲基氨基)乙烷]-氨基甲酰基}-膽固醇(dc-chol)。二甲基雙十八烷基溴化銨(ddab)、n-(3-氨基丙基)-n,n-(雙-(2-十四烷氧基乙基))-n-甲基溴化銨(pa-demo)、n-(3-氨基丙基)n,n-(雙-(2-十二烷基氧基乙基))-n-甲基溴化銨(pa-delo)、n,n,n-三-(2-十二烷基氧基)乙基-n-(3-氨基)溴化銨(pa-telo)和n1-(3-氨基丙基)((2-十二烷基氧基)乙基)-n2-(2-十二烷基氧基)乙基-1-哌嗪胺溴化物(ga-loe-bp)也可用于本發(fā)明。非二醚陽離子脂質(zhì)，例如dl-1,2-二油?；?3-二甲基氨基丙基-β-羥乙基銨(dori二酯)、1-o-油基-2-油?；?3-二甲基氨基丙基對(duì)羥乙基銨(dori酯/醚)和其鹽促進(jìn)體內(nèi)基因遞送。在一些實(shí)施方案中，陽離子脂質(zhì)包含通過附接于頭基中季銨部分的雜原子附接的基團(tuán)。甘氨?；g隔子可將接頭連接到羥基上。用于本發(fā)明的某些實(shí)施方案中的具體但非限制性的陽離子脂質(zhì)包括dmrie((±)-n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基-2,3-雙(十四烷基氧基)-1-丙胺溴化物)、gap-dmorie((±)-n-(3-氨基丙基)-n,n-二甲基-2,3-雙(順式-9-十四碳烯基氧基)-1-丙胺溴化物)和gap-dmrie((±)-n-(3-氨基丙基)-n,n-二甲基-2,3-(雙十二烷基氧基)-1-丙酰胺溴化物)。用于本發(fā)明的某些實(shí)施方案的其他具體但非限制性的陽離子表面活性劑包括bn-dhrie、dhxrie、dhxrie-oac、dhxrie-obz和pr-doctrie-oac。這些脂質(zhì)在共同未決的美國專利申請(qǐng)序列號(hào)10/725,015中公開。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，陽離子表面活性劑是pr-doctrie-oac。其他陽離子脂質(zhì)包括(±)-n,n-二甲基-n-[2-(精胺甲酰氨基)乙基]-2,3-雙(二油烯基氧基)-1-丙酰胺五鹽酸鹽(dospa)、(±)-n-(2-氨基乙基)-n,n-二甲基-2,3-雙(十四烷基氧基)-1-丙酰胺溴化物(β-氨基乙基-dmrie或βae-dmrie)(wheeler等人，biochim.biophys.acta1280：1-11(1996)和(±)-n-(3-氨基丙基)-n,n-二甲基-2,3-雙(十二烷基氧基)-1-丙酰胺溴化物(gap-dlrie)(wheeler等人，proc.natl.acad.sci.usa93:11454-11459(1996))，其從dmrie開發(fā)。對(duì)本發(fā)明有用的dmrie衍生的陽離子脂質(zhì)的其他實(shí)例是(±)-n-(3-氨基丙基)-n,n-二甲基-2,3-(二-癸氧基)-1-丙酰胺溴化物(gap-ddrie)、(±)-n-(3-氨基丙基)-n,n-二甲基-2,3-(雙-十四烷基氧基)-1-丙胺溴化物(gap-dmrie)、(±)-n-((n”-甲基)-n'-次脲)丙基-n,n-二甲基-2,3-雙(十四烷基氧基)-1-丙酰胺溴化物(gmu-dmrie)、(±)-n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基-2,3-雙(十二烷基氧基)-1-丙酰胺溴化物(dlrie)和(±)-n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基-2,3-雙-([z]-9-十八烯基氧基)丙基-1-丙酰胺溴化物(hp-dorie)。在免疫原性組合物包含陽離子脂質(zhì)的實(shí)施方案中，陽離子脂質(zhì)可與一種或更多種共脂質(zhì)混合。為了定義的目的，術(shù)語“共脂質(zhì)(co-lipid)”是指可與陽離子脂質(zhì)組分組合的任何疏水材料并且包括兩親性脂質(zhì)例如磷脂和中性脂質(zhì)例如膽固醇。陽離子脂質(zhì)和共脂質(zhì)可以多種方式混合或組合以產(chǎn)生各種非共價(jià)鍵合的宏觀結(jié)構(gòu)，包括例如脂質(zhì)體、多層囊泡、單層囊泡、膠束和簡單膜。一種非限制類的共脂質(zhì)是兩性離子磷脂，其包括磷脂酰乙醇胺和磷脂酰膽堿。磷脂酰乙醇胺的實(shí)例包括dope、dmpe和dpype。在某些實(shí)施方案中，共脂質(zhì)是dpype，其包含并入二酰基磷脂酰乙醇胺骨架中的兩個(gè)植?；〈?，并且陽離子脂質(zhì)是gap-dmorie(導(dǎo)致vaxfectin佐劑)。在其他實(shí)施方案中，共脂質(zhì)是dope，cas名稱是1,2-二油基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺。當(dāng)本發(fā)明的組合物包含陽離子脂質(zhì)和共脂質(zhì)時(shí)，陽離子脂質(zhì):共脂質(zhì)的摩爾比可為約9:1至約1:9、約4:1至約1:4、約2:1至約1:2或約1:1。為了使均一性最大化，陽離子脂質(zhì)和共脂質(zhì)組分可溶解在溶劑例如氯仿中，隨后在真空下蒸發(fā)陽離子脂質(zhì)/共脂質(zhì)溶液至干燥，作為玻璃容器(例如，rotovap圓底燒瓶)的內(nèi)表面上的膜。在水性溶劑中懸浮后，兩親性脂質(zhì)組分分子自組裝成均勻的脂質(zhì)囊泡。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，可在與例如本發(fā)明的密碼子優(yōu)化的多核苷酸絡(luò)合之前，將這些脂質(zhì)囊泡繼而加工成具有均勻大小的選定的平均直徑。例如，脂質(zhì)溶液的超聲處理在felgner等人，proc.natl.acad.sci.usa,natl.acad.sci.usa8:,7413-7417(1987)和在美國專利號(hào)5,264,618中被描述。在組合物包含陽離子脂質(zhì)的那些實(shí)施方案中，通過混合將本發(fā)明的多核苷酸與脂質(zhì)絡(luò)合，例如水性溶液中的質(zhì)粒和本文制備的陽離子脂質(zhì):共脂質(zhì)的溶液被混合。可在混合之前調(diào)整各組成溶液的濃度，使得在混合兩種溶液后獲得所需的最終質(zhì)粒/陽離子脂質(zhì):共脂質(zhì)比例和所需的質(zhì)粒終濃度。通過在適當(dāng)體積的水性溶劑中通過在室溫下渦旋混合約1分鐘將混合脂質(zhì)材料的薄膜水合而適當(dāng)?shù)刂苽潢栯x子脂質(zhì):共脂質(zhì)混合物。通過混合各組分的氯仿溶液來制備薄膜，以提供所需的摩爾溶質(zhì)比，然后將所需體積的溶液等分到合適的容器中。通過蒸發(fā)除去溶劑，首先用干燥、惰性的氣體(例如氬氣)流，隨后用高真空處理。其他疏水性和兩親性的添加劑，例如甾醇、脂肪酸、神經(jīng)節(jié)苷脂、糖脂、脂肽、脂糖、neobees、類脂質(zhì)體(niosomes)、前列腺素和鞘脂也可被包括在本發(fā)明的組合物中。在這樣的組合物中，這些添加劑可以約0.1mol％至約99.9mol％(相對(duì)于總脂質(zhì))、約1-50mol％或約2-25mol％的量被包括。第一和第二構(gòu)建體也可被包封、吸附于顆粒載體或與之關(guān)聯(lián)。這類載體將選定的構(gòu)建體的多個(gè)拷貝呈遞給免疫系統(tǒng)。顆?？杀粚I(yè)的抗原呈遞細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞吸收，和/或可通過其他機(jī)制例如細(xì)胞因子釋放的刺激增強(qiáng)抗原呈遞。顆粒載體的實(shí)例包括衍生自聚甲基丙烯酸甲酯聚合物的那些以及衍生自聚(丙交酯)和聚(丙交酯-共-乙交酯)(被稱為plg)的微粒。參見例如jeffery等人，1993,pharm.res.10:362-368；mcgeej.p.等人，1997,jmicroencapsul.14(2):197-210；o'hagand.t.,等人,1993,vaccine11(2):149-54。此外，其他顆粒系統(tǒng)和聚合物可用于本文描述的組合物的體內(nèi)遞送。例如，聚合物如聚賴氨酸、聚精氨酸、聚鳥氨酸、精胺、亞精胺以及這些分子的綴合物，對(duì)轉(zhuǎn)移感興趣的核酸是有用的。類似地，deae葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀或使用其他不溶性無機(jī)鹽(例如磷酸鍶、包括膨潤土和高嶺土的硅酸鋁、氧化鉻、硅酸鎂、滑石等)的沉淀將可與本方法一起使用。關(guān)于對(duì)基因轉(zhuǎn)移有用的遞送系統(tǒng)的綜述，參見例如felgner,p.l.,advanceddrugdeliveryreviews(1990)5:163-187。類肽(zuckerman,r.n.等人，美國專利號(hào)5,831,005，發(fā)布于1998年11月3日)也可用于遞送本發(fā)明的構(gòu)建體。本發(fā)明的另外的實(shí)施方案延伸到包含在合成構(gòu)建體施用之前、之后或同時(shí)施用的輔助劑的組合物。如本文使用的，“輔助劑(auxiliaryagent)”是由于其增強(qiáng)(相對(duì)于除了包含該輔助劑外相同的組合物)多核苷酸在體內(nèi)進(jìn)入脊椎動(dòng)物細(xì)胞的能力和/或由這類多核苷酸編碼的多肽的體內(nèi)表達(dá)的能力而被包含在組合物中的物質(zhì)。除了增強(qiáng)多核苷酸進(jìn)入細(xì)胞之外，某些輔助劑可增強(qiáng)針對(duì)由多核苷酸編碼的免疫原的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的輔助劑包括非離子的、陰離子的、典型的或兩性離子的表面活性劑或洗滌劑(優(yōu)選非離子表面活性劑或洗滌劑)、螯合劑、dna酶抑制劑、泊洛沙姆、聚集或凝聚核酸的劑、乳化劑或增溶劑、潤濕劑、凝膠形成劑和緩沖劑。用于本發(fā)明的組合物的輔助劑包括但不限于非離子洗滌劑和表面活性劑igepalca6300辛基苯基-聚乙二醇、nonidetnp-40壬基苯氧基聚乙氧基乙醇、nonidetp-40辛基苯氧基聚乙氧基乙醇、tween-20聚山梨醇酯20、tween-80聚山梨醇酯80、pluronicf68泊洛沙姆(平均mw：8400；疏水物的大約mw，1800；親水物的大約wt.％，80％)、pluronicf77泊洛沙姆(平均mw：6600；疏水物的大約mw，2100；親水物的大約wt.％，70％)、pluronicp65泊洛沙姆(平均mw：3400；疏水物的大約mw，1800；親水物的大約wt.％，50％)、tritonx-1004-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇和tritonx-114(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇；陰離子洗滌劑十二烷基硫酸鈉(sds)；糖水蘇糖；凝聚劑dmso；和螯合劑/dna酶抑制劑edta、crl1005(12kpa，5％poe)和bak(苯扎氯銨50％溶液，得自rugerchemicalco.inc.)。在某些具體實(shí)施方案中，輔助劑為dmso、nonidetp-40辛基苯氧基聚乙氧基乙醇、pluronicf68泊洛沙姆(平均mw：8400；疏水物的大約mw，1800；親水物的大約wt.％，80％)、pluronicf77泊洛沙姆(平均mw：6600；疏水物的大約mw，2100；親水物的大約wt.％，70％)、pluronicp65(平均mw：3400；疏水物的大約mw，1800；親水物的大約wt.％，50％)、pluronicpluronicl64泊洛沙姆(平均mw：2900；疏水物的大約mw，1800；親水物的大約wt.％，40％)、和pluronicf108泊洛沙姆(平均mw：14600；疏水物的大約mw，3000；親水物的大約wt.％，80％)。參見例如公布于2002年2月14日的美國專利申請(qǐng)公布號(hào)2002/0019358。本發(fā)明的某些組合物還可包括在多核苷酸之前、之后或與多核苷酸同時(shí)的一種或更多種佐劑。術(shù)語“佐劑(adjuvant)”是指具有(1)改變或增加針對(duì)特定抗原的免疫應(yīng)答或(2)增加或輔助藥理學(xué)劑的作用的能力的任何材料。應(yīng)當(dāng)注意，關(guān)于多核苷酸疫苗，“佐劑”可以是轉(zhuǎn)染促進(jìn)材料。類似地，上文描述的某些“轉(zhuǎn)染促進(jìn)材料”也可以是“佐劑”。佐劑可與包含本發(fā)明的多核苷酸的組合物一起使用。如本文描述的，在初免-加強(qiáng)方案中，佐劑可與初免、加強(qiáng)免疫二者之一或兩者一起使用。合適的佐劑包括但不限于細(xì)胞因子和生長因子；細(xì)菌組分(例如，內(nèi)毒素(特別是超抗原)、外毒素和細(xì)胞壁組分)；鋁基鹽；鈣基鹽；二氧化硅；多核苷酸；類毒素；血清蛋白、病毒和病毒衍生材料、毒素、毒液、咪唑并喹啉化合物、泊洛沙姆和陽離子脂質(zhì)。已經(jīng)顯示各種各樣的材料通過各種機(jī)制具有佐劑活性。任何可能增加多肽的表達(dá)、抗原性或免疫原性的化合物都是潛在的佐劑。本發(fā)明提供篩選針對(duì)潛在佐劑的改善的免疫應(yīng)答的測定?？珊Y選其增強(qiáng)根據(jù)本發(fā)明的免疫應(yīng)答能力的潛在佐劑，其包括但不限于：惰性載體，例如明礬、膨潤土、膠乳和丙烯酸顆粒；plononic嵌段聚合物，例如titermax(嵌段共聚物crl-8941、角鯊烯(代謝油)和微粒二氧化硅穩(wěn)定劑)；儲(chǔ)庫形成物，例如弗氏佐劑、表面活性材料，例如皂角苷、溶血卵磷脂、視黃醛、quila、脂質(zhì)體和pluronic聚合物制劑；巨噬細(xì)胞刺激劑，例如細(xì)菌脂多糖；替代途徑補(bǔ)體激活劑，例如胰島素、酵母聚糖、內(nèi)毒素和左旋咪唑；和非離子表面活性劑，例如泊洛沙姆、聚(氧乙烯)-聚(氧丙烯)三嵌段共聚物。還作為佐劑被包括的是轉(zhuǎn)染促進(jìn)材料，例如上面描述的那些?？珊Y選其增強(qiáng)根據(jù)本發(fā)明的免疫應(yīng)答能力的泊洛沙姆包括但不限于可商購的泊洛沙姆例如pluronic表面活性劑，其是環(huán)氧丙烷和環(huán)氧乙烷的嵌段共聚物，其中環(huán)氧丙烷嵌段夾在兩個(gè)環(huán)氧乙烷嵌段之間。pluronic表面活性劑的實(shí)例包括pluronicl121泊洛沙姆(平均mw：4400；疏水物的大約mw，3600；親水物的大約wt％，10％)、pluronicl101泊洛沙姆(平均mw：3800；疏水物的大約mw，3000；親水物的大約wt.％，10％)、pluronicl81泊洛沙姆(平均mw：2750；疏水物的大約mw，2400；親水物的大約wt.％，10％)、pluronicl61泊洛沙姆(平均mw：2000；疏水物的大約mw，1800；親水物的大約wt.％，10％)、pluronicl31泊洛沙姆(平均mw：1100；疏水物的大約mw，900；親水物的大約wt.％，10％)、pluronicl122泊洛沙姆(平均mw：5000；疏水物的大約mw，3600；親水物的大約wt.％，20％)、pluronicl92泊洛沙姆(平均mw：3650；疏水物的大約mw，2700；親水物的大約wt.％，20％)、pluronicl72泊洛沙姆(平均mw：2750；疏水物的大約mw，2100；親水物的大約wt.％，20％)、pluronicl62泊洛沙姆(平均mw：2500；疏水物的大約mw，1800；親水物的大約wt.％，20％)、pluronicl42泊洛沙姆(平均mw：1630；疏水物的大約mw，1200；親水物的大約wt.％，20％)、pluronicl63泊洛沙姆(平均mw：2650；疏水物的大約mw，1800；親水物的大約wt.％，30％)、pluronicl43泊洛沙姆(平均mw：1850；疏水物的大約mw，1200；親水物的大約wt.％，30％)、pluronicl64泊洛沙姆(平均mw：2900；疏水物的大約mw，1800；親水物的大約wt.％，40％)、pluronicl44泊洛沙姆(平均mw：2200；疏水物的大約mw，1200；親水物的大約wt.％，40％)、pluronicl35泊洛沙姆(平均mw：1900；疏水物的大約mw，900；親水物的大約wt.％，50％)、pluronicp123泊洛沙姆(平均mw：5750；疏水物的大約mw，3600；親水物的大約wt.％，30％)、pluronicp103泊洛沙姆(平均mw：4950；疏水物的大約mw，3000；親水物的大約wt.％，30％)、pluronicp104泊洛沙姆(平均mw：5900；疏水物的大約mw，3000；親水物的大約wt.％，40％)、pluronicp84泊洛沙姆(平均mw：4200；疏水物的大約mw，2400；親水物的大約wt.％，40％)、pluronicp105泊洛沙姆(平均mw：6500；疏水物的大約mw，3000；親水物的大約wt.％，50％)、pluronicp85泊洛沙姆(平均mw：4600；疏水物的大約mw，2400；親水物的大約wt.％，50％)、pluronicp75泊洛沙姆(平均mw：4150；疏水物的大約mw，2100；親水物的大約wt.％，50％)、pluronicp65泊洛沙姆(平均mw：3400；疏水物的大約mw，1800；親水物的大約wt.％，50％)、pluronicf127泊洛沙姆(平均mw：12600；疏水物的大約mw，3600；親水物的大約wt.％，70％)、pluronicf98泊洛沙姆(平均mw：13000；疏水物的大約mw，2700；親水物的大約wt.％，80％)、pluronicf87泊洛沙姆(平均mw：7700；疏水物的大約mw，2400；親水物的大約wt.％，70％)、pluronicf77泊洛沙姆(平均mw：6600；疏水物的大約mw，2100；親水物的大約wt.％，70％)、pluronicf108泊洛沙姆(平均mw：14600；疏水物的大約mw，3000；親水物的大約wt.％，80％)、pluronicf98泊洛沙姆(平均mw：13000；疏水物的大約mw，2700；親水物的大約wt.％，80％)、pluronicf88泊洛沙姆(平均mw：11400；疏水物的大約mw，2400；親水物的大約wt.％，80％)、pluronicf68泊洛沙姆(平均mw：8400；疏水物的大約mw，1800；親水物的大約wt.％，80％)、pluronicf38泊洛沙姆(平均mw：4700；疏水物的大約mw，900；親水物的大約wt.％，80％)?？珊Y選其增強(qiáng)根據(jù)本發(fā)明的免疫應(yīng)答能力的反向泊洛沙姆(reversepoloxamer)包括但不限于pluronicr31r1反向泊洛沙姆(平均mw：3250；疏水物的大約mw，3100；親水物的大約wt.％，10％)、pluronicr25r1反向泊洛沙姆(平均mw：2700；疏水物的大約mw，2500；親水物的大約wt.％，10％)、pluronicr17r1反向泊洛沙姆(平均mw：1900；疏水物的大約mw，1700；親水物的大約wt.％，10％)、pluronicr31r2反向泊洛沙姆(平均mw：3300；疏水物的大約mw，3100；親水物的大約wt.％，20％)、pluronicr25r2反向泊洛沙姆(平均mw：3100；疏水物的大約mw，2500；親水物的大約wt.％，20％)、pluronicr17r2反向泊洛沙姆(平均mw：2150；疏水物的大約mw，1700；親水物的大約wt.％，20％)、pluronicr12r3反向泊洛沙姆(平均mw：1800；疏水物的大約mw，1200；親水物的大約wt.％，30％)、pluronicr31r4反向泊洛沙姆(平均mw：4150；疏水物的大約mw，3100；親水物的大約wt.％，40％)、pluronicr25r4反向泊洛沙姆(平均mw：3600；疏水物的大約mw，2500；親水物的大約wt.％，40％)、pluronicr22r4反向泊洛沙姆(平均mw：3350；疏水物的大約mw，2200；親水物的大約wt.％，40％)、pluronicr17r4反向泊洛沙姆(平均mw：3650；疏水物的大約mw，1700；親水物的大約wt.％，40％)、pluronicr25r5反向泊洛沙姆(平均mw：4320；疏水物的大約mw，2500；親水物的大約wt.％，50％)、pluronicr10r5反向泊洛沙姆(平均mw：1950；疏水物的大約mw，1000；親水物的大約wt.％，50％)、pluronicr25r8反向泊洛沙姆(平均mw：8550；疏水物的大約mw，2500；親水物的大約wt.％，80％)、pluronicr17r8反向泊洛沙姆(平均mw：7000；疏水物的大約mw，1700；親水物的大約wt.％，80％)、pluronicr10r8反向泊洛沙姆(平均mw：4550；疏水物的大約mw，1000；親水物的大約wt.％，80％)?？珊Y選其增強(qiáng)根據(jù)本發(fā)明的免疫應(yīng)答能力的其他可商購的泊洛沙姆包括是聚乙烯和聚丙二醇的嵌段共聚物的化合物，例如synperonicl121(平均mw：4400)、synperonicl122(平均mw：5000)、synperonicp104(平均mw：5850)、synperonicp105(平均mw：6500)、synperonicp123(平均mw：5750)、synperonicp85(平均mw：4600)和synperonicp94(平均mw：4600)，其中l(wèi)指示表面活性劑是液體，p指示其是糊狀物，第一個(gè)數(shù)字是表面活性劑的聚丙烯部分的分子量的量度，且數(shù)字的最后一位數(shù)乘以10，給出表面活性劑的環(huán)氧乙烷含量百分比；和是壬基苯基聚乙二醇的化合物，例如synperonicnp10(壬基酚乙氧基化表面活性劑-10％溶液)、synperonicnp30(1摩爾壬基酚與30摩爾環(huán)氧乙烷的縮合物)和synperonicnp5(1摩爾壬基酚與5.5摩爾氧化萘的縮合物)。可篩選其增強(qiáng)根據(jù)本發(fā)明的免疫應(yīng)答能力的其他泊洛沙姆包括：(a)包含a型段和b型段的聚醚嵌段共聚物，其中a型段包含相對(duì)親水性的線性聚合物段，其重復(fù)單元貢獻(xiàn)約-0.4或更少的平均hansch-leo片段常數(shù)，并且具有在約30至約500之間的分子量貢獻(xiàn)，其中b型段包含相對(duì)疏水性的線性聚合物段，其重復(fù)單元貢獻(xiàn)約-0.4或更多的平均hansch-leo片段常數(shù)，并且具有在約30至約500之間的分子量貢獻(xiàn)，其中連接每個(gè)聚合物段的重復(fù)單元的鍵的至少約80％包含醚鍵；(b)具有聚醚段和聚陽離子段的嵌段共聚物，其中聚醚段包含至少a型嵌段，并且聚陽離子段包含多個(gè)陽離子重復(fù)單元；和(c)聚醚-聚陽離子共聚物，其包含聚合物、聚醚段和聚陽離子段，聚陽離子段包含多個(gè)式-nh-r0的陽離子重復(fù)單元，其中r0是2至6個(gè)碳原子的直鏈脂族基團(tuán)，其可被取代，其中所述聚醚段包含a型或b型段中的至少一種。參見美國專利號(hào)5,656,611。其他感興趣的泊洛沙姆包括crl1005(12kda，5％poe)、crl8300(11kda，5％poe)、crl2690(12kda，10％poe)、crl4505(15kda，5％poe)和crl1415(9kda，10％poe)?？珊Y選其增強(qiáng)根據(jù)本發(fā)明的免疫應(yīng)答能力的其他輔助劑包括但不限于阿拉伯膠(阿拉伯樹膠)；聚氧乙烯醚r—o—(c2h4o)x—h(brij)，例如，聚乙二醇十二烷基醚(brij35，x＝23)、聚乙二醇十二烷基醚(brij30，x＝4)、聚乙二醇十六烷基醚(brij52，x＝2)、聚乙二醇十六烷基醚(brij56，x＝10)、聚乙二醇十六烷基醚(brij58p，x＝20)、聚乙二醇十八烷基醚(brij72，x＝2)、聚乙二醇十八烷基醚(brij76，x＝10)、聚乙二醇十八烷基醚(78p，x＝20)、聚乙二醇油基醚(brij92v，x＝2)和聚氧基10油基醚(brij97，x＝10)；聚-d-葡糖胺(殼聚糖)；氯丁醇；膽固醇；二乙醇胺；毛地黃皂苷(digitonin)；二甲基亞砜(dmso)、乙二胺四乙酸(edta)；甘油單硬脂酸酯；羊毛脂醇；甘油單酯和甘油二酯；單乙醇胺；壬基酚聚氧乙烯醚(np-40)；辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(來自amresco的nonidetnp-40)；乙基苯酚聚(乙二醇醚)n，n＝11(來自roche的nonidetp40)；具有約9個(gè)環(huán)氧乙烷單元的辛基苯酚環(huán)氧乙烷縮合物(nonidetp40)；igepalca630((辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇；結(jié)構(gòu)上與nonidetnp-40相同)；油酸；油醇；聚乙二醇8000；聚氧乙烯20十六烷基-十八烷基醚；聚氧乙烯35蓖麻油；聚氧乙烯40氫化蓖麻油；聚氧乙烯40硬脂酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯(聚山梨醇酯20或tween-20)；聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯(聚山梨醇酯80或tween-80)；丙二醇二乙酸酯；丙二醇單硬脂酸酯；魚精蛋白硫酸鹽；蛋白水解酶；十二烷基硫酸鈉(sds)；單月桂酸鈉；硬脂酸鈉；山梨醇酐衍生物(span)，例如山梨醇酐單棕櫚酸酯(span40)、山梨醇酐單硬脂酸酯(span60)、山梨醇酐三硬脂酸酯(span65)、山梨醇酐單油酸酯(span80)和山梨醇酐三油酸酯；2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯(角鯊烯)；水蘇糖；硬脂酸；蔗糖；表面活性素(來自枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)的脂肽抗生素)；十二烷基聚(乙二醇醚)9(thesit)mw582.9；具有約9-10個(gè)環(huán)氧乙烷單元的辛基苯酚環(huán)氧乙烷縮合物(tritonx-100)；具有約7-8個(gè)環(huán)氧乙烷單元的辛基酚環(huán)氧乙烷縮合物(tritonx-114)；三(2-羥乙基)胺(三乙醇胺)；和乳化蠟。在某些佐劑組合物中，佐劑是細(xì)胞因子。本發(fā)明的組合物可包含一種或更多種細(xì)胞因子、趨化因子或誘導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子的生成的化合物，或編碼一種或更多種細(xì)胞因子、趨化因子或誘導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子的生成的化合物的多核苷酸。實(shí)例包括但不限于粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)、粒細(xì)胞集落刺激因子(g-csf)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(m-csf)、集落刺激因子(csf)、促紅細(xì)胞生成素(epo)、白介素2(il-2)、白介素3(il-3)、白介素4(il-4)、白介素5(il-5)、白介素6(il-6)、白介素7(il-7)、白介素8(il-8)、白介素10(il-10)、白介素12(il-12)、白介素15(il-15)、白介素18(il-18)、干擾素α(ifnα)、干擾素β(ifnβ)、干擾素γ(ifnγ)、干擾素ω(ifnω)、干擾素τ(ifnτ)、干擾素γ誘導(dǎo)因子i(igif)、轉(zhuǎn)化生長因子β(tgf-β)、rantes(regulateduponactivation,normalt-cellexpressedandpresumablysecreted(調(diào)節(jié)激活正常t細(xì)胞表達(dá)和推測分泌因子))、巨噬細(xì)胞炎性蛋白(例如，mip-1α和m3p-1β)、利什曼蟲延長起始因子(leif)和flt-3配體。在本發(fā)明的某些組合物中，多核苷酸構(gòu)建體可與包含(±)-n-(3-氨基丙基)-n,n-二甲基-2,3-雙(順式-9-十四烯酰氧基)-1-丙酰胺溴化物(gap-dmorie)的佐劑組合物絡(luò)合。組合物還可包含一種或更多種共脂質(zhì)，例如1,2-二油?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(dope)、1,2-植烷?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(dpype)和/或1,2-二肉豆蔻酰基-甘油-3-磷酸乙醇胺(dmpe)。以1:1摩爾比包含gap-dmorie和dpype的佐劑組合物在本文中被稱為vaxfectin佐劑。參見例如pct公布號(hào)wo00/57917。在其他實(shí)施方案中，多核苷酸本身可作為佐劑起作用，如當(dāng)本發(fā)明的多核苷酸全部或部分地衍生自細(xì)菌dna的情況。含有未甲基化的cpg-二核苷酸(cpg-dna)基序的細(xì)菌dna通過模式識(shí)別受體(包括例如tlr9的toll受體)觸發(fā)脊椎動(dòng)物中的先天免疫細(xì)胞，并且因此對(duì)巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和b淋巴細(xì)胞具有有效的免疫刺激作用。參見例如wagner,h.,curr.opin.microbiol.5:62-69(2002)；jung,j.等人，j.immunol.169:2368-73(2002)；還參見klinman,d.m.等人，proc.natlacad.sci.u.s.a.93:2879-83(1996)。使用未甲基化cpg-二核苷酸作為佐劑的方法被描述于例如美國專利號(hào)6,207,646、6,406,705和6,429,199。佐劑增加針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的能力通常表現(xiàn)為免疫介導(dǎo)的保護(hù)的顯著增加。例如，體液免疫的增加通常表現(xiàn)為對(duì)抗原產(chǎn)生的抗體滴度的顯著增加，并且t細(xì)胞活性的增加通常表現(xiàn)為增加的細(xì)胞增殖或細(xì)胞毒性或細(xì)胞因子分泌。佐劑也可例如通過將主要為體液或th2應(yīng)答改變成主要為細(xì)胞或th1應(yīng)答來改變免疫應(yīng)答。本發(fā)明的核酸分子和/或多核苷酸，例如質(zhì)粒dna、mrna、線性dna或寡核苷酸可溶解在各種緩沖液的任一種中。合適的緩沖液包括例如磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)、生理鹽水、tris緩沖液和磷酸鈉(例如，150mm磷酸鈉)。不溶性多核苷酸可溶解在弱酸或弱堿中，并且然后用緩沖液稀釋至所需體積?？蛇m當(dāng)?shù)卣{(diào)整緩沖液的ph。另外，可使用藥學(xué)上可接受的添加劑來提供適當(dāng)?shù)臐B透壓。這類添加劑在本領(lǐng)域技術(shù)人員的范圍之內(nèi)。對(duì)于體內(nèi)使用的水性組合物，可使用無菌無熱原的水。這類制劑將含有有效量的多核苷酸連同適量的水性溶液，以便制備適于向人施用的藥學(xué)上可接受的組合物。本發(fā)明的組合物可根據(jù)已知的方法配制。適用的制備方法被描述于例如remington'spharmaceuticalsciences,第16版,a.osol,ed.,mackpublishingco.,easton,pa.(1980)和remington'spharmaceuticalsciences,第19版,a.r.gennaro,ed.,mackpublishingco.,easton,pa.(1995)。盡管組合物可作為水性溶液施用，但也可配制成乳液、凝膠、溶液、懸浮液、凍干形式或本領(lǐng)域已知的任何其他形式。另外，組合物可含有藥學(xué)上可接受的添加劑，包括例如稀釋劑、粘合劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。僅為了說明的目的包括以下示例，并不意圖限制由所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明的范圍。5.2劑量本發(fā)明通常涉及治療組合物，即，以在感染后治療疾病。組合物將包含本文定義的組合物的“治療有效量”，使得可在體內(nèi)產(chǎn)生抗原的量，使得在其施用的個(gè)體中產(chǎn)生免疫應(yīng)答。必需的確切的量將根據(jù)以下而變化：受治療的受試者；待治療的受試者的年齡和一般狀況；受試者免疫系統(tǒng)合成抗體的能力；所需的保護(hù)程度；所治療狀況的嚴(yán)重程度；選定的具體抗原和其施用模式等因素。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定適當(dāng)?shù)挠行Я?。因此，“治療有效量”將落在可通過常規(guī)試驗(yàn)確定的相對(duì)寬的范圍內(nèi)。例如，在施用本文描述的藥物組合物約24小時(shí)后，劑量依賴性dth反應(yīng)發(fā)生在接受至少約30μg、40μg、50μg、75μg、80μg、85μg、90μg、95μg、100μg、200μg、250μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1000μg、大于1mg或其間的任何整數(shù)的劑量的人類受試者中。合適的劑量可以多于一個(gè)單位被施用(例如，1mg可分為各包含500μg劑量的兩個(gè)單位)。劑量治療可以是單劑量計(jì)劃表或多劑量計(jì)劃表。在一些實(shí)施方案中，在約30μg至約1mg或更高之間的劑量足以誘發(fā)對(duì)組合物的dth反應(yīng)。因此，為了治療hsv-2感染，本發(fā)明的方法包括約30μg、100μg、300μg、1mg或更多的本文定義的組合物的劑量。本發(fā)明的組合物可適當(dāng)被配制成用于注射。組合物可以單位劑型制備于安瓿或多劑量容器中。多核苷酸可以在油性或優(yōu)選水性的媒介物中的懸浮液、溶液或乳液這類形式存在?？蛇x擇地，多核苷酸鹽可以是凍干形式，用于在遞送時(shí)用合適的媒介物例如無菌無熱原水進(jìn)行重構(gòu)。液體以及待重構(gòu)的凍干形式都將包含適當(dāng)調(diào)整注射溶液ph值所需量的劑，優(yōu)選緩沖液。對(duì)于任何腸胃外的使用，特別是如果要靜脈內(nèi)施用制劑，應(yīng)控制溶質(zhì)的總濃度以使制劑等滲、低滲或弱高滲。優(yōu)選非離子性材料，例如糖用于調(diào)整張力，并且蔗糖是特別優(yōu)選的。這些形式中的任一種還可包含合適的配制劑，例如淀粉或糖、甘油或鹽水。每單位劑量的組合物，無論是液體還是固體，可含有0.1％至99％的多核苷酸材料。多核苷酸在使用前被包裝在其中的單位劑量安瓿或多劑量容器，可包含封閉適合其藥學(xué)有效劑量或有效劑量的倍數(shù)的一定量的多核苷酸或含有多核苷酸的溶液的密封的容器。將多核苷酸作為無菌制劑包裝，并將氣密密封的容器設(shè)計(jì)成保持制劑的無菌性直到使用。將其中包裝有多核苷酸的容器標(biāo)記，且標(biāo)記物具有以政府機(jī)構(gòu)(例如美國食品和藥物管理局)規(guī)定的格式的告示，該告示反映了機(jī)構(gòu)根據(jù)聯(lián)邦法律批準(zhǔn)了用于人類施用的其中多核苷酸材料的制造、使用或銷售。在大多數(shù)地區(qū)，聯(lián)邦法律要求在人類的治療中的藥劑的使用被聯(lián)邦政府機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)。強(qiáng)制執(zhí)行的責(zé)任是食品和藥物管理局的責(zé)任，其發(fā)行合適的條例規(guī)定以確保這類批準(zhǔn)，詳述于21u.s.c.§§301-392。包括由動(dòng)物組織制成的產(chǎn)品的生物材料的條例提供于42u.s.c.§262。大多數(shù)外國都需要類似的批準(zhǔn)。條例因國而異，但個(gè)體程序是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。待施用的劑量在很大程度上取決于被治療的受試者的狀況和大小以及治療的頻率和施用途徑。繼續(xù)治療的方案包括劑量和頻率可由初始響應(yīng)和臨床判斷指導(dǎo)。注射到組織的間質(zhì)空間中的腸胃外途徑是優(yōu)選的，盡管在特定施用中，可能需要其他腸胃外途徑例如吸入氣霧劑制劑，例如向鼻、喉、支氣管組織或肺的粘膜的施用。在優(yōu)選的方案中，將包含在水性載體中的裸多核苷酸的制劑以每個(gè)部位10μl至每個(gè)部位約1ml的量注入組織中。制劑中多核苷酸的濃度為約0.1μg/ml至約20mg/ml。5.3施用途徑一旦被配制，本發(fā)明的組合物可直接被施用于受試者(例如，如上面描述的)。通過使用常規(guī)注射器、無針裝置(例如biojecttm)或基因槍，例如accelltm基因遞送系統(tǒng)(powdermedltd，oxford，england)或微針裝置進(jìn)行注射，如上面描述的，通常使用或不使用載體達(dá)到含有第一和第二構(gòu)建體的組合物的體內(nèi)直接遞送。可皮內(nèi)遞送(例如，注射)構(gòu)建體。將核酸遞送到表皮的細(xì)胞中是特別優(yōu)選的，因?yàn)檫@種施用模式提供達(dá)到與皮膚相關(guān)的淋巴樣細(xì)胞的途徑并且為接受者中核酸(例如，dna)的瞬時(shí)存在做準(zhǔn)備。合適地，本文描述的組合物被配制用于nanopass(vaxxas，brisbane，australia)貼劑，用于微針施用。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物通過電穿孔被施用。這類技術(shù)大大增加跨細(xì)胞質(zhì)膜屏障的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移，以將質(zhì)粒直接或間接地轉(zhuǎn)染到細(xì)胞質(zhì)中。此外，采用顆粒載體例如金和鎢的基因槍遞送系統(tǒng)對(duì)于遞送本發(fā)明的組合物特別有用。顆粒涂覆有待遞送的合成表達(dá)盒，并且，通常在還原的氣氛下，使用從“基因槍”放出的槍粉將顆粒加速至高速度。關(guān)于這類技術(shù)和對(duì)此有用的裝置的描述，參見例如美國專利號(hào)4,945,050；5,036,006；5,100,792；5,179,022；5,371,015；和5,478,744。在說明性實(shí)例中，氣體驅(qū)動(dòng)顆粒的加速可用例如由powdermedpharmaceuticalsplc(oxford,uk)和powdermedvaccinesinc.(madison,wis.)制造的那些裝置來實(shí)現(xiàn)，其一些示例被描述于美國專利號(hào)5,846,796；6,010,478；5,865,796；5,584,807；和ep專利號(hào)0500799中。該方法提供了無針遞送方法，其中微型顆粒(例如多核苷酸或多肽顆粒)的干粉制劑在由手持裝置產(chǎn)生的氦氣射流內(nèi)被加速至高速，將顆粒推進(jìn)到感興趣的靶組織中。對(duì)于本發(fā)明的組合物的氣驅(qū)無針注射可以有用的其他裝置和方法包括由bioject,inc.(portland,oreg.)提供的那些，其一些示例被描述于美國專利號(hào)4,790,824；5,064,413；5,312,335；5,383,851；5,399,163；5,520,639和5,993,412中?？蛇x擇地，可使用基于微插管和微針的裝置(例如由bectondickinson開發(fā)的那些等)來施用本發(fā)明的組合物。這種類型的說明性裝置被描述于ep1092444a1和提交于2000年6月29日的美國申請(qǐng)序列號(hào)606,909中。使用如1999年10月14日提交的美國序列號(hào)417,671中描述的裝置和方法，標(biāo)準(zhǔn)鋼插管也可用于皮內(nèi)遞送。這些方法和裝置包括通過具有有限穿透深度的窄口徑(約30g)“微插管”遞送物質(zhì)，所述有限穿透深度如由插管的總長度或在深度限制特征之外暴露的插管的總長度定義的。在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是，包括本文描述的組合物的物質(zhì)的靶向遞送可通過單個(gè)微插管或微插管(或“微針”)陣列來實(shí)現(xiàn)，例如安裝在注射裝置上的3-6個(gè)微針，注射裝置可包括或附接到其中容納待施用物質(zhì)的儲(chǔ)存器。為了本發(fā)明可容易地被理解并付諸實(shí)踐，現(xiàn)在將以以下非限制性實(shí)施例的方式描述特定的優(yōu)選實(shí)施方案。實(shí)施例實(shí)施例1hsv-2dna疫苗組合物的構(gòu)建制備hsvgd2疫苗組合物(cor-1)，其包含等濃度的第一和第二構(gòu)建體。將第一和第二合成編碼序列克隆到ntc8485表達(dá)載體(naturetechnologycorporation(ntc)，nebraska，u.s.a.)中(構(gòu)建體在本文中被稱為“ntc8485-o2-gd2”)。第一合成編碼序列包括密碼子優(yōu)化的全長hsv-2gd2多核苷酸，如在seqidno：3中列出的(參見，圖1a)。第二構(gòu)建體包含編碼在其n-末端綴合至一個(gè)泛素重復(fù)段(ubi-gd2tr)的hsvgd2的截短形式(殘基25-331)的密碼子優(yōu)化的dna序列(構(gòu)建體在本文中被稱為“ntc8485-o2-ubi-gd2tr”)。第二合成編碼序列o2-ubi-gd2tr的核苷酸序列在seqidno：2中被列出。cor-1是用te緩沖液(10mm三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(tris-hcl)，1mm乙二胺四乙酸(edta)ph8)配制的nmp8485-o2-gd2和ntc8485-o2-ubi-gd2tr的gmp級(jí)的1:1匯集混合物。材料和方法5.4構(gòu)建體的制備制備以下hsvgd2構(gòu)建體：gd2全長野生型序列(gd2)和泛素化和截短的gd2序列(o2-ubi-gd2tr)，如在nelson等人，hum.vaccin.immunother,(2013),9:2211-5中描述的。簡而言之，根據(jù)制造商的方案，將o2-gd2和o2-ubi-gd2tr序列克隆到ntc8485載體中。簡而言之，將atg起始密碼子放置在載體中緊接著sal之后。sali位點(diǎn)被證明是用于翻譯起始的高效的共有的kozak序列。通過使用具有sali(5'末端)和bgli(3'末端)位點(diǎn)的引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增來復(fù)制o2-gd2和o2-ubi-gd2tr基因。用sali/bgli切割載體產(chǎn)生與切割的pcr產(chǎn)物相容的粘性末端。因此插入物被定向地和精確地克隆到載體中。大多數(shù)恢復(fù)的菌落是重組的，因?yàn)樵谟H本載體中產(chǎn)生的粘性末端不相容。5.5引物設(shè)計(jì)/合成和序列操作根據(jù)相關(guān)的誘變?cè)噭┖惺謨?cè)(quikchangeiisite-directedmutagenesiskitorquikchangemultisite-directedmutagenesiskit；stratagene,lajollaca)中包含的指南設(shè)計(jì)用于定點(diǎn)誘變的寡核苷酸。這些引物由sigmaproligo合成和page純化。用于全基因合成的寡核苷酸被手動(dòng)設(shè)計(jì)，并由sigmaproligo合成。引物以標(biāo)準(zhǔn)脫鹽寡核苷酸被提供。不進(jìn)行寡核苷酸的額外的純化。序列操作和分析使用以下進(jìn)行：bioedit版本7(hall，1999)和各種基于網(wǎng)絡(luò)的程序，包括biomanager(澳大利亞國家基因組信息服務(wù)(australiannationalgenomeinformationservice))、ncbi的blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi)、來自newenglandbiolabs的nebcutterv2.0(http://tools.neb.com/nebcutter2/index.php)、expasy上的翻譯工具(http://au.expasy.org/tools/dna.html)和signalp3.0服務(wù)器(http://www.cbs.dtu.dk/services/signalp/)。5.6標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)根據(jù)酶制造商的說明書(各種制造商，包括newenglandbiolabs、roche和fermentas)進(jìn)行限制酶消化、堿性磷酸酶處理和連接。使用商品試劑盒(qiagen、bio-rad和macherey-nagel)進(jìn)行從瓊脂糖凝膠的dna純化和少量制備(mini-prep)dna的制備。使用類似于在currentprotocolsinmolecularbiology(可通過wileyinterscience獲得的電子書；由ausubel等人編輯)中描述的那些的標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、dna中污染蛋白質(zhì)的苯酚/氯仿提取、dna的乙醇沉淀和其他基礎(chǔ)的分子生物學(xué)操作。由澳大利亞基因組研究設(shè)備(australiangenomeresearchfacility)(agrf，brisbane)進(jìn)行了測序。5.7全基因合成使用重疊的～35-50mer的寡核苷酸(sigma-proligo)合成長dna序列，并且摻入限制性酶切位點(diǎn)以促進(jìn)克隆。用于合成片段的方法是基于smith等人(2003)提供的那些。首先，將頂部或底部鏈的寡核苷酸混合，然后使用t4多核苷酸激酶(pnk；newenglandbiolabs)磷酸化。通過標(biāo)準(zhǔn)苯酚/氯仿提取和乙酸鈉/乙醇(naac/etoh)沉淀從pnk純化寡核苷酸混合物。然后將等體積的頂部和底部鏈的寡核苷酸混合物混合，并且寡核苷酸通過在95℃下加熱2分鐘變性。通過將樣品緩慢冷卻至55℃而將寡核苷酸退火，并使用taq連接酶(newenglandbiolabs)連接退火的寡核苷酸。所得片段通過苯酚/氯仿提取和乙酸鈉/乙醇沉淀純化。根據(jù)制造商的說明書，使用clontechadvantagehf2pcr試劑盒(clontech)填充片段末端并且然后使用最外側(cè)的正向和反向引物擴(kuò)增片段。為了填補(bǔ)末端，使用以下pcr：35個(gè)循環(huán)的94℃的變性步驟15秒，將溫度在7分鐘內(nèi)緩降至55℃的緩慢退火步驟并且然后在55℃下保持2分鐘和72℃的延伸步驟6分鐘。然后進(jìn)行在72℃下的最終延伸步驟7分鐘。用于擴(kuò)增片段的第二次pcr包括：在94℃下的初始變性步驟30秒，接著是在94℃15秒、在55℃30秒、在68℃1分鐘的25個(gè)循環(huán)和在68℃3分鐘的最終延伸步驟。然后片段通過凝膠電泳被純化、消化并連接到相關(guān)載體中。用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌之后，對(duì)多個(gè)菌落進(jìn)行少量制備并對(duì)插入片段測序。有時(shí)不可能分離具有完全正確的序列的克隆。在這些情況下，通過單次或多次定點(diǎn)誘變來修復(fù)錯(cuò)誤。5.8定點(diǎn)誘變根據(jù)制造商的說明書，使用quikchangeii定點(diǎn)誘變?cè)噭┖谢騫uikchange多位點(diǎn)定向誘變?cè)噭┖?stratagene，lajollaca)，用合適的page(聚丙烯酰胺凝膠電泳)純化的引物進(jìn)行誘變。用于接種疫苗的所有質(zhì)粒在大腸桿菌菌株dh5α中生長，并使用nucleobondmaxikit(machery-nagal)純化。通過分光光度法在260nm處定量dna濃度。實(shí)施例3hsvgd2dna疫苗的毒性進(jìn)行了一項(xiàng)臨床研究，以檢查向健康hsv血清陰性受試者皮內(nèi)注射遞增劑量的hsvdna疫苗(cor-1)的安全性和耐受性。此外，為了確定cor-1是否會(huì)誘導(dǎo)抗gd2特異性抗體，并提供可能引起cor-1誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答以保護(hù)免受將來的hsv感染的優(yōu)化劑量的預(yù)測的信息。最后，下面描述的實(shí)驗(yàn)的目的是確定抗gd2抗體是否是中和性的以及cor-1是否會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫(cmi)反應(yīng)。材料和方法5.9臨床研究方法受試者被分配到以下劑量組之一：接受10μgcor-1的4名受試者-3x10μg注射，總暴露量為30μg；接受30μgcor-1的4名受試者-3x30μg注射，總暴露量為90μg；接受100μgcor-1的4名受試者-3x100μg，總暴露量為300μg；和接受300μgcor-1的4名受試者-3x300μg注射，總暴露量為900μg；接受1mgcor-1的4名受試者-6x500mg注射，總暴露量為3mg。cor-1疫苗(批號(hào)：cor-1.12.no13)在第0天、第21天和第42天通過皮內(nèi)注射被施用于受試者的前臂。所有受試者均為年齡在18至45歲之間并且總體健康的hsv-1和-2血清陰性的男性或非懷孕非哺乳的女性。本研究登記了20名受試者，并且每個(gè)治療組分配4名受試者。第一次注射后兩名受試者退出研究，一名在10μgcor-1組中(撤回同意)并且另一名在1mg組中(由于無法遵守方案而退出)。然后登記了兩名替換受試者并分配到這些組(總共n＝22)?？偣?0名受試者按計(jì)劃完成了研究，即，每個(gè)治療組4名。沒有受試者由于不良反應(yīng)(adverseeffects)(ae)從研究中退出。所有ae和嚴(yán)重ae(seriousae)(sae)均根據(jù)fdaguidanceforindustry(2007):toxicitygradingscaleforhealthyadultsandadolescentvolunteersenrolledinpreventativevaccineclinicaltrials被評(píng)估。實(shí)施例3分析在第0、21和42天的每次接種前的60分鐘內(nèi)和最后一次研究訪視(第63天)時(shí)收集的血清樣品中抗hsvgd2抗體和中和性抗hsvgd2抗體的存在。硬結(jié)經(jīng)常被報(bào)告，在接種階段的某一時(shí)刻發(fā)生在每個(gè)治療組的至少一名受試者中。與較低劑量治療組相比，1mgcor-1治療組中硬結(jié)的發(fā)生率趨于較高。在該組中，在每次接種后45分鐘至兩天觀察到硬結(jié)。其他治療組中硬結(jié)的發(fā)生趨于更散發(fā)，并且沒有在每次接種后的所有時(shí)間點(diǎn)被報(bào)告。在所有治療組中，報(bào)告的任何硬結(jié)在三周后的下次訪視時(shí)已經(jīng)消退。所有注射部位反應(yīng)被分類為輕度強(qiáng)度。實(shí)施例4hsv細(xì)胞介導(dǎo)的免疫使用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(enzymelinkedimmunospot)(elispot)測定，通過測量外周血單核細(xì)胞(pbmc)中的ifn-γ產(chǎn)生來評(píng)估針對(duì)11組重疊hsv特異性肽的t細(xì)胞應(yīng)答。在elispot結(jié)果中沒有觀察到劑量相關(guān)的趨勢。在按計(jì)劃完成研究的20名受試者中的19名的pbmc中誘導(dǎo)了ifn-γ產(chǎn)生。因此，觀察到針對(duì)cor-1疫苗的清晰和實(shí)質(zhì)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。所有治療組的應(yīng)答率相似，10μg、30μg、300μg和1mg組中100％受試者對(duì)cor-1疫苗有反應(yīng)和100μg組中75％有反應(yīng)。對(duì)于意向治療(intenttotreat)(itt)人群，10μg組中的一名受試者和1mg組中的一名受試者對(duì)cor-1疫苗沒有反應(yīng)。這些受試者過早從研究中退出并且僅接受一次接種。在測試非特異性dna反應(yīng)性的陰性對(duì)照(數(shù)據(jù)未提供)中沒有觀察到細(xì)胞反應(yīng)，提供觀察到的細(xì)胞反應(yīng)是對(duì)hsvgd2特異性的支持證據(jù)。材料和方法hsvgd2ifn-γelispot將elispot平板用捕獲抗體包被。這包括在新鮮制備和過濾的0.1mnahco3(ph8.2-8.6)中稀釋捕獲mab(1-dk)至5μg/ml，向每個(gè)孔中加入75μl稀釋的捕獲ab并且然后4°下過夜孵育平板(用箔覆蓋)。用每個(gè)孔200μl完全roswellparkmemorialinstitute培養(yǎng)基(crpml)清洗板。然后加入200μl/孔的crpml中的10％fcs(用0.2μm過濾器過濾)，并將板在室溫下溫育(箔覆蓋)2小時(shí)。當(dāng)板在被封閉時(shí)，制備人pbmc。將pbmc在37°水浴中解凍并轉(zhuǎn)移到50ml管中。將10ml具有10％fcs的預(yù)熱的crpmi加入到解凍的pbmc中，并以1200rpm離心5分鐘。將pbmc在10ml預(yù)熱的crpmi中洗滌，然后以1200rpm旋轉(zhuǎn)5分鐘。棄去上清液，將沉淀重新懸浮于2ml10％fcscrpml中。用臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞樣品并在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)。將細(xì)胞懸浮液調(diào)整為1x106細(xì)胞/毫升的濃度。從板上除去封閉溶液并用crpmi洗滌孔。每毫升pmbc加入20μl的il-12(crpmi中1μg/ml)。每毫升pbmc加入200μg肽。向各孔中加入100μl的pbmc(1x105/100μl)和100μl的肽溶液。使用匯集的重疊gd2肽(由mimotope合成)。用箔覆蓋板，并在37℃下在5％co2培養(yǎng)箱中孵育過夜。到目前為止，實(shí)驗(yàn)在無菌條件下進(jìn)行，這之后無菌條件不再必需。將平板用pbs-t(在pbs中0.02％tween-20)洗滌6次。在含有0.5％fcs的pbs-t中，將生物素化檢測mab(7-b6-1)稀釋至1μg/ml。將75μl加入到每個(gè)孔中，并將板(箔覆蓋)在室溫下孵育2-4小時(shí)。然后將板用pbs-t洗滌6次。在含有0.5％fcs的pbs-t中，將鏈霉親和素-hrp(1mg/ml原液)以1:400稀釋，并每孔加入75μl。將板在室溫下孵育(箔覆蓋)1小時(shí)。將板用pbs-t洗滌三次，然后用僅pbs洗滌三次。根據(jù)制造商的說明書制備dab底物溶液(sigma)。向每個(gè)孔中加入75μl底物。將板在自來水中洗滌六次以停止顯色。移除后蓋以允許沖洗孔的底側(cè)。將板過夜干燥并儲(chǔ)存在黑暗中。實(shí)施例5遲發(fā)型超敏反應(yīng)應(yīng)答對(duì)于每種疫苗劑量，在每次注射后立即、45分鐘、24小時(shí)和48小時(shí)拍攝皮內(nèi)注射部位(參見，圖2-6)。這些照片用于評(píng)估注射部位反應(yīng)。對(duì)從每次接種后一天和兩天拍攝的照片觀察紅斑的大小的分析。應(yīng)該注意的是，雖然照片不是為了這個(gè)特定目的拍攝的，但是除了3張照片之外，所有照片中都包含紙尺。該分析的結(jié)果詳述于表5。事后分析揭示，在較高的疫苗劑量下，與在第一天觀察到的紅斑大小相比，第二天的紅斑大小增加。與較低劑量治療組相比，100μg、300μg和1mgcor-1治療組的紅斑發(fā)生率趨于較大。在這些組中，在每次接種后45分鐘至兩天觀察到紅斑。在10μg和30μgcor-1組中紅斑的發(fā)生趨于更散發(fā)，并且沒有在每次接種后的所有時(shí)間點(diǎn)被報(bào)告。在10μg劑量治療組中無可測量的紅斑。在所有治療組中，報(bào)告的任何紅斑在三周后的下次訪視時(shí)已經(jīng)消退。該結(jié)果指示遲發(fā)型超敏反應(yīng)(dth)反應(yīng)，其是細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答而不是抗體介導(dǎo)的應(yīng)答。因此，這與缺乏抗體應(yīng)答的觀察結(jié)果并非不一致。照片的分析也顯示了劑量反應(yīng)，觀察到的紅斑大小隨著疫苗劑量的增加而增加。本文引用的每個(gè)專利、專利申請(qǐng)和公布的公開內(nèi)容特此通過引用整體并入本文。本文對(duì)任何參考文獻(xiàn)的引用不應(yīng)被解釋為承認(rèn)這類參考文獻(xiàn)作為本申請(qǐng)的“現(xiàn)有技術(shù)”可用。在整個(gè)說明書中，目的是描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，而不將本發(fā)明限制于任何一個(gè)實(shí)施方案或特征的特定集合。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，根據(jù)本公開內(nèi)容，可在所示例的具體實(shí)施方案中做出各種修改和改變，而不脫離本發(fā)明的范圍。所有這類修改和改變都旨在被包括在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。參考書目agrawal，s.，importanceofnucleotidesequenceandchemicalmodificationsofantisenseoligonucleotides，biochimbiophysacta，(1999)，1489：53-68.berge，s.m.，bighleyl.d.，monkhoused.c.，pharmaceuticalsalts，j.pharm.sci.，(1977)，66：1-19.darquet，a.-m.，cameron，b.，wils，p..scherman，d.，crouzet，j.，anewdnavehiclefornonviralgenedelivery：supercoiledminicircle.genether.，(1997)，4：1341-1349.foodanddrugadministration，pointstoconsideronplasmiddnavaccinesforpreventiveinfectiousdiseaseindications.federalregister，(1996)，61fr68269-68270.foodanddrugadministration，guidanceforindustry：considerationsforplasmiddnavaccinesforinfectiousdiseaseindications.federalregister，(2007)，72fr61172.geary，r.s.，watanabe，t.a.，truong，l.，pharmacokineticpropertiesof2′-o-(2-methoxyethyl)-modifiedoligonucleotideanalogsinrats.j.pharmacol.exp.ther.，(2001)，296：890-897.gupta，r.，warren，t.，wald，a.，genitalherpes.lancet，(2007)，370：2127-2137.kopp，s.j.，storti，c.s.，muller，w.j.，herpessimplexvirus-2glycoproteininteractionwithhveminfluencesvirus-specificrecallcellularresponsesatthemucosa，clin.dev.immunol.，(2012)，284104：1-10.looker，k.j.，garnett，g.p.，schmid，g.p.，anestimateoftheglobalprevalenceandincidenceofherpessimplexvirustype2infection.bull.who，(2008)，86，805-812.luke，j.，carnes，a.e.，hodgson，c.p.，williams，j.a.，improvedantibiotic-freednavaccinevectorsutilizinganovelrnabasedplasmidselectionsystem.vaccine，(2009)，27：6454-6459.lukej.，vincent，j.m.，du，s.x.，whalen，b.，leon，a.，hodgson，c.p.，williams，j.a.，improvedantibiotic-freeplasmidvectordesignbyincorporationoftransientexpressionenhances.genether.，(2011)，18：334-343.nelsonj.，rodriguez，s.，finlayson，n.，williams，j.，carnes，a.，antibiotic-freeproductionofaherpessimplexvirus2dnavaccineinahighyieldcgmpprocess.hum.vaccin.immunother.，(2013)，9(10)：2211-5.peng，t.，zhu，j.，klock，a.，phasouk，k.，huang，m.l.，koelle，d.m.，wald，a.，corey，l.，evasionofthemucosalinnateimmunesystembyherpessimplexvirustype2.j.virol.，(2009)，83：12559-12568.perretti，s.，shaw，a.，blanchard，j.，bohm，r.，morrow，g.，lifson，j.d.，gettie，a.，pope，m.，immunomodulatoryeffectsofhsv-2infectiononimmaturemacaquedendriticcellsmodifyinnateandadaptiveresponses.blood，(2005)，106：1305-1313.pichlera.j.，yerlyd.，delayeddrughypersensitivity：modelsoft-cellstimulation.brjclinpharmacol.，(2011)，71：701-707.spear，p.g.，eisenberg，r.j.，cohen，g.h.，threeclassesofcellsurfacereceptorsforalphaherpesvirusentry.virology，(2000)，275：1-8.stefanidou，m.，ramos，i.，casullo，v.m.，trepanier，j.b.，rosenbaum，s.，femandez-sesma，a.，herold，b.c.，herpessimplexvirus2(hsv-2)preventsdendriticcellmaturation，inducesapoptosisandtriggersreleaseofproinflammatorycytokines：potentiallinkstohsv-hivsynergy.j.virol.，(2013)，87：1443-1453.tilton，j.c.，manion，m.m.，luskin，m.r.，johnson，a.j.，patamawenu，a.a.，hallahan，c.w.，cogliano-shutta，n.a.，mican，j.m.，davey，r.t.，kottilil.s.，lifson，j.d.，metcalf，j.a.，lempicki，r.a.，connors，m.，humanimmunodeficiencyvirusviremiainducespasmacytoiddendriticcellactivationinvivoanddiminishedalphainterferonproductioninvitro.am.soc.microbiol.，(2008)，82(8)：3997-4006.williams，j.a.，carnes，a.e.，hodgson，c.p.，plasmiddnavaccinevectordesign：impactonefficacy，safetyandupstreamproduction.biotechnol.adv.，(2009)，27(4)：353-370.williams，j.a.，vectordesignforimproveddnavaccineeffficacy，safetyandproduction.vaccines，(2013)，1：225-249.序列表<110>阿德梅杜斯疫苗有限公司<120>治療方法<130>35240711<160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>1182<212>dna<213>單純皰疹病毒2<400>1atggggcgtttgacctccggcgtcgggacggcggccctgctagttgtcgcggtgggactc60cgcgtcgtctgcgccaaatacgccttagcagacccctcgcttaagatggccgatcccaat120cgatttcgcgggaagaaccttccggttttggaccagctgaccgacccccccggggtgaag180cgtgtttaccacattcagccgagcctggaggacccgttccagccccccagcatcccgatc240actgtgtactacgcagtgctggaacgtgcctgccgcagcgtgctcctacatgccccatcg300gaggccccccagatcgtgcgcggggcttcggacgaggcccgaaagcacacgtacaacctg360accatcgcctggtatcgcatgggagacaattgcgctatccccatcacggttatggaatac420accgagtgcccctacaacaagtcgttgggggtctgccccatccgaacgcagccccgctgg480agctactatgacagctttagcgccgtcagcgaggataacctgggattcctgatgcacgcc540cccgccttcgagaccgcgggtacgtacctgcggctagtgaagataaacgactggacggag600atcacacaatttatcctggagcaccgggcccgcgcctcctgcaagtacgctctccccctg660cgcatccccccggcagcgtgcctcacctcgaaggcctaccaacagggcgtgacggtcgac720agcatcgggatgctaccccgctttatccccgaaaaccagcgcaccgtcgccctatacagc780ttaaaaatcgccgggtggcacggccccaagcccccgtacaccagcaccctgctgccgccg840gagctgtccgacaccaccaacgccacgcaacccgaactcgttccggaagaccccgaggac900tcggccctcttagaggatcccgccgggacggtgtcttcgcagatccccccaaactggcac960atcccgtcgatccaggacgtcgcgccgcaccacgcccccgccgcccccagcaacccgggc1020ctgatcatcggcgcgctggccggcagtaccctggcggtgctggtcatcggcggtattgcg1080ttttgggtacgccgccgcgctcagatggcccccaagcgcctacgtctcccccacatccgg1140gatgacgacgcgcccccctcgcaccagccattgttttactag1182<210>2<211>393<212>prt<213>單純皰疹病毒2<400>2metglyargleuthrserglyvalglythralaalaleuleuvalval151015alavalglyleuargvalvalcysalalystyralaleualaasppro202530serleulysmetalaaspproasnargpheargglylysasnleupro354045valleuaspglnleuthraspproproglyvallysargvaltyrhis505560ileglnproserleugluasppropheglnproproserileproile65707580thrvaltyrtyralavalleugluargalacysargservalleuleu859095hisalaproserglualaproglnilevalargglyalaseraspglu100105110alaarglyshisthrtyrasnleuthrilealatrptyrargmetgly115120125aspasncysalaileproilethrvalmetglutyrthrglucyspro130135140tyrasnlysserleuglyvalcysproileargthrglnproargtrp145150155160sertyrtyraspserpheseralavalsergluaspasnleuglyphe165170175leumethisalaproalaphegluthralaglythrtyrleuargleu180185190vallysileasnasptrpthrgluilethrglnpheileleugluhis195200205argalaargalasercyslystyralaleuproleuargilepropro210215220alaalacysleuthrserlysalatyrglnglnglyvalthrvalasp225230235240serileglymetleuproargpheileprogluasnglnargthrval245250255alaleutyrserleulysilealaglytrphisglyprolyspropro260265270tyrthrserthrleuleuproprogluleuseraspthrthrasnala275280285thrglnprogluleuvalprogluaspprogluaspseralaleuleu290295300gluaspproalaglythrvalserserglnileproproasntrphis305310315320ileproserileglnaspvalalaprohishisalaproalaalapro325330335serasnproglyleuileileglyalaleualaglyserthrleuala340345350valleuvalileglyglyilealaphetrpvalargargargalagln355360365metalaprolysargleuargleuprohisileargaspaspaspala370375380proproserhisglnproleuphetyr385390<210>3<211>1203<212>dna<213>人工序列<220><223>重組體<400>3aagcttgccgccaccatgggacgtctgacgtcgggagtcggaacggctgctctgctggtc60gtcgctgtgggactgcgcgtcgtctgcgctaaatacgctctggctgacccctcgctgaag120atggctgatcccaatcgatttcgcggaaagaacctgcccgtcctggaccagctgacggac180ccccccggagtgaagcgtgtctaccacatccagccctcgctggaagacccctttcagccc240ccctcgatccccatcacggtgtactacgctgtgctggaacgtgcttgccgctcggtgctg300ctgcatgctccctcggaagctccccagatcgtgcgcggagcttcggacgaagctcgaaag360cacacgtacaacctgacgatcgcttggtatcgcatgggagacaattgcgctatccccatc420acggtcatggaatacacggaatgcccctacaacaagtcgctgggagtctgccccatccga480acgcagccccgctggtcgtactatgactcgttttcggctgtctcggaagataacctggga540tttctgatgcacgctcccgcttttgaaacggctggaacgtacctgcgactggtgaagatc600aacgactggacggaaatcacgcaatttatcctggaacaccgagctcgcgcttcgtgcaag660tacgctctgcccctgcgcatcccccccgctgcttgcctgacgtcgaaggcttaccaacag720ggagtgacggtcgactcgatcggaatgctgccccgctttatccccgaaaaccagcgcacg780gtcgctctgtactcgctgaaaatcgctggatggcacggacccaagcccccctacacgtcg840acgctgctgccccccgaactgtcggacacgacgaacgctacgcaacccgaactggtcccc900gaagaccccgaagactcggctctgctggaagatcccgctggaacggtgtcgtcgcagatc960ccccccaactggcacatcccctcgatccaggacgtcgctccccaccacgctcccgctgct1020ccctcgaaccccggactgatcatcggagctctggctggatcgacgctggctgtgctggtc1080atcggaggaatcgctttttgggtccgccgccgcgctcagatggctcccaagcgcctgcgt1140ctgccccacatccgagatgacgacgctcccccctcgcaccagcccctgttttactagctc1200gag1203<210>4<211>1173<212>dna<213>人工序列<220><223>重組體<400>4aagcttgccgccaccatgcagatctttgtgaagacgctgacgggaaagacgatcacgctg60gaagtggaaccctcggacacgatcgaaaacgtgaaggctaagatccaggacaaggaagga120atcccccccgaccagcagagactgatctttgctggaaagcagctggaagacggacgcacg180ctgtcggactacaacatccagaaggaatcgacgctgcacctggtgctgagactgcgcgga240gctgctaaatacgctctggctgacccctcgcttaagatggctgatcccaatcgatttcgc300ggaaagaacctgcccgtcctggaccagctgacggacccccccggagtgaagcgtgtctac360cacatccagccctcgctggaagacccctttcagcccccctcgatccccatcacggtgtac420tacgctgtgctggaacgtgcttgccgctcggtgctgctgcatgctccctcggaagctccc480cagatcgtgcgcggagcttcggacgaagctcgaaagcacacgtacaacctgacgatcgct540tggtatcgcatgggagacaattgcgctatccccatcacggtcatggaatacacggaatgc600ccctacaacaagtcgctgggagtctgccccatccgaacgcagccccgctggtcgtactat660gactcgttttcggctgtctcggaagataacctgggatttctgatgcacgctcccgctttt720gaaacggctggaacgtacctgcgactggtgaagatcaacgactggacggaaatcacgcaa780tttatcctggaacaccgagctcgcgcttcgtgcaagtacgctctgcccctgcgcatcccc840cccgctgcttgcctgacgtcgaaggcttaccaacagggagtgacggtcgactcgatcgga900atgctgccccgctttatccccgaaaaccagcgcacggtcgctctgtactcgctgaaaatc960gctggatggcacggacccaagcccccctacacgtcgacgctgctgccccccgaactgtcg1020gacacgacgaacgctacgcaacccgaactggtccccgaagaccccgaagactcggctctg1080ctggaagatcccgctggaacggtgtcgtcgcagatcccccccaactggcacatcccctcg1140atccaggacgtcgctccccaccactagctcgag1173當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12