誘導(dǎo)針對(duì)人免疫缺陷病毒感染的保護(hù)性免疫性的方法和組合物與流程

相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考本申請(qǐng)根據(jù)35u.s.c.§119(e)有權(quán)要求2014年9月26日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?2/056,059的優(yōu)先權(quán)，所述申請(qǐng)以其全文并入本文作參考。關(guān)于聯(lián)邦資助研究或開(kāi)發(fā)的聲明本發(fā)明受國(guó)立衛(wèi)生研究院(nationalinstitutesofhealth)基金號(hào)ai078526和ai096040的政府支持而完成。政府對(duì)本發(fā)明具有一定權(quán)利。關(guān)于電子形式提交的序列表本申請(qǐng)包含序列表，其電子方式作為ascii格式化序列表通過(guò)efs-web提交，文件名為“688097-53wosequencelisting”，生成日期為2015年9月15日，文件大小為47kb。通過(guò)efs-web提交的序列表是本說(shuō)明書的一部分且以其全文并入本文作參考。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及誘導(dǎo)針對(duì)人免疫缺陷病毒(hiv)感染的保護(hù)性免疫性的組合物、疫苗和方法。特別地，本發(fā)明涉及一或多個(gè)病毒表達(dá)載體與分離的抗原性多肽的異源疫苗組合以誘導(dǎo)針對(duì)一或多個(gè)hiv進(jìn)化枝感染的保護(hù)性免疫性。發(fā)明背景人免疫缺陷病毒(hiv)影響世界上數(shù)百萬(wàn)人，hiv的預(yù)防即使在普遍的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的時(shí)代也是高度優(yōu)選的。在美國(guó)，疾病控制中心(cdc)估計(jì)所有hiv陽(yáng)性美國(guó)人大約1/5未察覺(jué)其狀態(tài)，這小部分人群每年傳播一半新感染病例[2]。在世界范圍內(nèi)，迅速診斷和治療的缺口很大。在2010年末，世界范圍估計(jì)3千4百萬(wàn)人感染hiv，比2001年增加17％。盡管在撒哈拉以南非洲地區(qū)大多數(shù)新hiv感染持續(xù)發(fā)生，但是cdc估計(jì)在美國(guó)在2008-2011年期間hiv感染的年發(fā)生率保持穩(wěn)定在大約15-16/100,000，每年有超40,000個(gè)新感染案例。因此，優(yōu)先考慮的緊迫的全球健康問(wèn)題是發(fā)現(xiàn)一種安全且有效的hiv疫苗，其將在診斷之前預(yù)防hiv感染或者削弱其初始影響，包括破壞腸道cd4集合[3]及傳播的高風(fēng)險(xiǎn)[4]。預(yù)期完全有效的疫苗能激發(fā)有效的細(xì)胞應(yīng)答以及能中和不同進(jìn)化枝的hiv-1變體的廣泛中和抗體。此外，近來(lái)的臨床研究表明非中和env特異性抗體可具有與亞型特異性抗體功能相關(guān)的一些保護(hù)性能力[9]。廣泛中和抗體針對(duì)病毒包膜中的高度保守區(qū)域。直至最近，大多數(shù)抗hiv疫苗均使用純化的hiv抗原性蛋白質(zhì)，如以可溶形式存在的gp160、gp41或gp120。大多數(shù)基于包膜蛋白(env)的免疫原是單體包膜分子，其激發(fā)結(jié)合抗體，而不是有效的中和抗體。這部分是由于中和抗體識(shí)別病毒包膜蛋白的天然三聚體結(jié)構(gòu)上的三級(jí)和四級(jí)表位所致。此外，大多數(shù)基于單體env的免疫原不誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。據(jù)報(bào)導(dǎo)hiv-1env的穩(wěn)定化三聚體在體內(nèi)誘導(dǎo)針對(duì)hiv-1的廣泛中和抗血清。見(jiàn)例如us2012/0045472。已經(jīng)證實(shí)活的減毒疫苗在人體中及在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(nhp)中針對(duì)某些病毒疾病是高效的，例如活的減毒的基于猿猴免疫缺陷病毒(siv)的疫苗預(yù)防siv感染。不幸地，由于與活的減毒hiv相關(guān)的安全性風(fēng)險(xiǎn)，這種策略不適用于hiv人體疫苗。為了激發(fā)有效的細(xì)胞應(yīng)答和廣泛中和抗體，重組載體用于在體內(nèi)表達(dá)hiv抗原性蛋白的基因作為活的減毒病毒疫苗的備選。已經(jīng)探究了無(wú)復(fù)制能力的重組病毒載體作為疫苗及其它類型基因治療的應(yīng)用。特別地，對(duì)無(wú)復(fù)制能力的重組腺病毒載體、特別是腺病毒血清型2和5(ad2和ad5)的基因輸送應(yīng)用包括免疫接種已經(jīng)廣泛進(jìn)行了研究。盡管這種基于無(wú)復(fù)制能力的ad5載體疫苗已經(jīng)示出在多種動(dòng)物模型中激發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答，但是基于重組ad5載體的hiv疫苗及其它病原體的用途在人群中受到ad5特異性中和抗體(nab)的高血清陽(yáng)性率的限制[17]。例如，在世界范圍4,381個(gè)對(duì)象的血清陽(yáng)性率研究中，觀測(cè)到ad5nab滴度幾乎是普遍性的，在撒哈拉以南非洲地區(qū)呈現(xiàn)高滴度，大多數(shù)個(gè)體呈現(xiàn)出ad5nab滴度>200[14]。使用基于重組ad5載體的疫苗已經(jīng)進(jìn)行了一些hiv-1疫苗效力試驗(yàn)。這些研究包括hvtn502/step(merckad5)、hvtn503/phambili(merckad5)和hvtn505(nihvrcdna/ad5)hiv-1疫苗效力試驗(yàn)。然而，利用非復(fù)制性ad5和dna/ad5疫苗的所有這三種hiv-1疫苗效力研究示出無(wú)對(duì)抗hiv-1感染的效力。此外，與使用安慰劑相比，在用來(lái)自step研究的merckad5疫苗接種的對(duì)象中觀測(cè)到hiv-1感染增加的傾向。迄今為止使用無(wú)復(fù)制能力的載體如腺病毒血清型5作為hiv疫苗的嘗試是令人失望的，在一些效力試驗(yàn)中未示出益處[5-8]。關(guān)于ad5載體安全性的關(guān)注，特別是來(lái)自step研究[8，10]，已經(jīng)趨于探究來(lái)自供選血清型的生物學(xué)顯著不同的ad載體作為病毒疫苗載體[11-13]。ad5的一個(gè)供選腺病毒血清型是腺病毒血清型26(ad26)。ad26在人體中是一種相對(duì)不常見(jiàn)的病毒，未知在任何其它物種中復(fù)制。在不同群體中關(guān)于腺病毒的許多調(diào)查已經(jīng)示出其很少被分離，甚至當(dāng)分離時(shí)也很少有相關(guān)癥狀。同樣，實(shí)驗(yàn)性免疫示出極少的嚴(yán)重感染跡象。參見(jiàn)例如[14]及[27]-[43]。因此，從觀察性研究中無(wú)跡象表明ad26在健康成年人中導(dǎo)致臨床癥狀，來(lái)自ad26攻擊研究的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也提示腸道ad26感染不產(chǎn)生癥狀[44]。復(fù)制缺陷的腺病毒載體rad26在適于大規(guī)模及臨床級(jí)別生產(chǎn)這些載體的ad5e1補(bǔ)足細(xì)胞系中可以生長(zhǎng)至高滴度[11]，且這個(gè)載體已經(jīng)示出在引發(fā)-加強(qiáng)疫苗接種策略中誘導(dǎo)體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答[11,21]。另一供選載體是rad35，這是衍生自腺病毒血清型35的復(fù)制缺陷的腺病毒載體。rad35載體在適于產(chǎn)生臨床級(jí)別疫苗的細(xì)胞系上生長(zhǎng)至高滴度[61]，且已經(jīng)配制為注射劑以及穩(wěn)定的可吸入粉末[62]。這些供選腺病毒載體示出人樹(shù)突狀細(xì)胞的有效轉(zhuǎn)導(dǎo)[63，22]，及因此具有介導(dǎo)高水平抗原輸送和呈遞的能力。在獼猴中，在至少受體使用、體內(nèi)向性、與樹(shù)突狀細(xì)胞相互作用、先天免疫模式、獲得性免疫表型及針對(duì)siv的保護(hù)性效力方面，已經(jīng)證實(shí)ad26與ad5在生物學(xué)方面極為不同[11，12，15，19-22]。此外，非復(fù)制性ad26載體的安全性和免疫原性已經(jīng)在人體中證實(shí)(clinicaltrials.govnct01215149)。此外，在ad5與ad26之間的許多有利的生物學(xué)差異如在人體中較低的血清陽(yáng)性率及低中和抗體滴度也存在于ad5與ad35之間。修飾的安卡拉痘苗病毒(mva)是一種復(fù)制缺陷的痘苗病毒毒株，也已經(jīng)用作病毒載體以重組表達(dá)hiv抗原性蛋白。見(jiàn)例如us20110159036、us8197825等。mva與痘苗病毒相關(guān)，是痘病毒科正痘病毒屬的一個(gè)成員。已知痘病毒由于其胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)而是cd8t細(xì)胞應(yīng)答的良好誘導(dǎo)劑。然而，通常認(rèn)為其在產(chǎn)生cd4mhcii類限制的t細(xì)胞方面較差。見(jiàn)例如[64]。無(wú)復(fù)制能力的病毒載體的一個(gè)可能缺點(diǎn)是要輸送至宿主的靶基因從病毒載體的表達(dá)在給予所述載體后可能降低。由于在宿主中不能復(fù)制或增殖，因此病毒載體不能產(chǎn)生隨后可用于增加基因表達(dá)的任何新拷貝，因此需要再給予該病毒載體。如果再次給予宿主相同腺病毒血清型，宿主可以產(chǎn)生針對(duì)該特定腺病毒血清型的中和抗體，導(dǎo)致血清型特異性抗腺病毒應(yīng)答。這種血清型特異性抗腺病毒應(yīng)答可阻止有效再次給予病毒載體，使其作為疫苗或基因輸送載體的效率較低。因此，在本領(lǐng)域需要可用于誘導(dǎo)針對(duì)hiv感染的保護(hù)性免疫性的改良的疫苗。這種疫苗優(yōu)選便于給予、長(zhǎng)效及具有最小的副作用。進(jìn)一步優(yōu)選是有效對(duì)抗眾多流傳類型的hiv傳播，包括世界多發(fā)地區(qū)的最常見(jiàn)類型。發(fā)明概述本發(fā)明部分基于發(fā)現(xiàn)分離的hiv抗原性蛋白與編碼hiv抗原的表達(dá)載體如無(wú)復(fù)制能力的病毒載體的組合誘導(dǎo)針對(duì)一或多個(gè)hiv進(jìn)化枝的增加的保護(hù)性免疫性。因此，本發(fā)明的一方面涉及在需要的對(duì)象中誘導(dǎo)針對(duì)人免疫缺陷病毒(hiv)的免疫應(yīng)答的疫苗組合，其包含：(i)第一組合物，其包含免疫有效量的編碼一或多個(gè)hiv抗原性多肽的一或多個(gè)表達(dá)載體及藥物可接受的運(yùn)載體；(ii)第二組合物，其包含免疫有效量的分離的抗原性多肽及藥物可接受的運(yùn)載體；和(iii)免疫有效量的編碼一或多個(gè)另外的抗原性多肽的一或多個(gè)另外的表達(dá)載體；其中第一和第二組合物的一個(gè)用于引發(fā)免疫且另一組合物用于加強(qiáng)免疫，并且免疫有效量的另外的表達(dá)載體存在于第二組合物中或者在與第二組合物一起給予的第三組合物中以引發(fā)或加強(qiáng)免疫。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述疫苗組合的分離的抗原性多肽包含hiv包膜糖蛋白，及優(yōu)選hivgp140的穩(wěn)定化三聚體。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，分離的抗原性多肽包含seqidno:5或seqidno:6所示氨基酸序列。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述疫苗組合的一或多個(gè)表達(dá)載體及一或多個(gè)另外的表達(dá)載體是腺病毒載體如rad26、rad35、rad48、rad5hvr48載體或者mva載體。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，所述一或多個(gè)另外的表達(dá)載體存在于所述疫苗組合的第三組合物中。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，由所述一或多個(gè)表達(dá)載體和/或所述一或多個(gè)另外的表達(dá)載體編碼的一或多個(gè)抗原性多肽包含一或多個(gè)hiv嵌合抗原，更優(yōu)選一或多個(gè)嵌合hivgag-pol-env抗原，及更優(yōu)選包含選自seqidno:1-4所示氨基酸序列。在本發(fā)明的其它特定實(shí)施方案中，所述一或多個(gè)表達(dá)載體是編碼一或多個(gè)包含選自seqidno:1-4所示氨基酸序列的hiv抗原性多肽的rad26載體，并且所述一或多個(gè)另外的表達(dá)載體是編碼一或多個(gè)包含選自seqidno:1-4所示氨基酸序列的hiv抗原性多肽的mva載體。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，疫苗組合包含第一組合物、第二組合物和第三組合物，所述第一組合物包含免疫有效量的編碼分別具有seqidno:1、seqidno:3和seqidno:4所示氨基酸序列的三種hiv抗原性多肽的rad26載體及藥物可接受的運(yùn)載體；所述第二組合物包含免疫有效量的包含具有seqidno:5所示氨基酸序列的hivgp140的穩(wěn)定化三聚體的分離的抗原性多肽及藥物可接受的運(yùn)載體；所述第三組合物包含免疫有效量的編碼具有seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3和seqidno:4所示氨基酸序列的四種hiv抗原性多肽的mva載體。本發(fā)明另一方面涉及根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的疫苗組合，用于產(chǎn)生針對(duì)人免疫缺陷病毒(hiv)感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答，其中所述第一組合物用于引發(fā)免疫應(yīng)答，所述第二組合物和免疫有效量的一或多個(gè)另外的表達(dá)載體用于加強(qiáng)免疫應(yīng)答。本發(fā)明另一方面涉及包含根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的疫苗組合的試劑盒。本發(fā)明再一方面涉及一種在需要的對(duì)象中誘導(dǎo)針對(duì)人免疫缺陷病毒(hiv)的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括：(i)給予所述對(duì)象第一組合物，其包含免疫有效量的編碼一或多個(gè)hiv抗原性多肽的一或多個(gè)表達(dá)載體及藥物可接受的運(yùn)載體；(ii)給予所述對(duì)象第二組合物，其包含免疫有效量的分離的抗原性多肽及藥物可接受的運(yùn)載體；和(iii)給予所述對(duì)象免疫有效量的編碼一或多個(gè)另外的hiv抗原性多肽的一或多個(gè)另外的表達(dá)載體，其中步驟(i)和(ii)以任一順序進(jìn)行，一個(gè)步驟用于引發(fā)免疫且另一步驟用于加強(qiáng)免疫，并且所述免疫有效量的一或多個(gè)另外的表達(dá)載體存在于第二組合物中或者在與第二組合物一起給予的第三組合物中用于引發(fā)或加強(qiáng)免疫。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述第一組合物用于引發(fā)免疫，并且所述第二組合物和所述免疫有效量的一或多個(gè)另外的表達(dá)載體用于加強(qiáng)免疫。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述一或多個(gè)另外的表達(dá)載體存在于第三組合物中。本發(fā)明另一方面涉及一種在需要的對(duì)象中誘導(dǎo)針對(duì)人免疫缺陷病毒(hiv)的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括：(i)給予所述對(duì)象引發(fā)疫苗，其包含免疫有效量的編碼一或多個(gè)hiv抗原性多肽的一或多個(gè)表達(dá)載體及藥物可接受的運(yùn)載體；和(ii)給予所述對(duì)象加強(qiáng)疫苗，其包含免疫有效量的分離的抗原性多肽、免疫有效量的編碼一或多個(gè)另外的hiv抗原性多肽的一或多個(gè)另外的表達(dá)載體及藥物可接受的運(yùn)載體；其中所述分離的抗原性多肽及所述一或多個(gè)另外的表達(dá)載體存在于同一組合物中或者在分開(kāi)的組合物中；并且其中所述加強(qiáng)疫苗在給予引發(fā)疫苗之后給予。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，引發(fā)疫苗及加強(qiáng)疫苗之一或二者是一次或多次再次給予以進(jìn)一步誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，其中引發(fā)疫苗在初次給予其之后但是在第一次給予加強(qiáng)疫苗之前再次給予。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述分離的抗原性蛋白質(zhì)是hiv包膜糖蛋白，更優(yōu)選是穩(wěn)定化hiv包膜糖蛋白，如穩(wěn)定化hivgp140三聚體蛋白質(zhì)或者穩(wěn)定化嵌合gp140三聚體蛋白質(zhì)，及更優(yōu)選包含seqidno:5或seqidno:6所示氨基酸序列。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述一或多個(gè)表達(dá)載體和/或一或多個(gè)另外的表達(dá)載體編碼一或多個(gè)hiv嵌合抗原，更優(yōu)選一或多個(gè)嵌合hivgag-pol-env抗原，及更優(yōu)選編碼包含選自seqidno:1-4所示氨基酸序列的一或多個(gè)嵌合hivgag-pol-env抗原。在再一個(gè)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述一或多個(gè)表達(dá)載體或者另外的表達(dá)載體是腺病毒載體，如rad26、rad35、rad48、rad5hvr48載體，或者mva載體。更優(yōu)選地，所述用于引發(fā)免疫的一或多個(gè)載體衍生自與用于加強(qiáng)免疫的那些不同類型的病毒。例如，當(dāng)腺病毒載體如rad26或rad35載體用于引發(fā)免疫時(shí)，mva載體與分離的hiv抗原性蛋白質(zhì)一起用于加強(qiáng)免疫。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述一或多個(gè)表達(dá)載體是rad26載體，且所述一或多個(gè)另外的表達(dá)載體是mva載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述一或多個(gè)表達(dá)載體是mva載體且所述一或多個(gè)另外的表達(dá)載體是rad26載體。在另外的實(shí)施方案中，所述一或多個(gè)表達(dá)載體是rad26載體且所述一或多個(gè)另外的表達(dá)載體也是rad26載體。在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，用于引發(fā)免疫的組合物包含分別編碼包含seqidno:1、3和4所示氨基酸序列的一或多個(gè)抗原性蛋白質(zhì)的rad26載體；且用于加強(qiáng)免疫的一或多個(gè)組合物包含分離的蛋白質(zhì)，所述分離的蛋白質(zhì)包含seqidno:5或seqidno:6所示氨基酸序列，且包含分別編碼具有seqidno:1-4所示氨基酸序列的一或多個(gè)抗原性蛋白質(zhì)的mva載體。更優(yōu)選地，mva載體存在于第三組合物中。附圖簡(jiǎn)述關(guān)于本發(fā)明的前文概述以及如下詳細(xì)描述結(jié)合附圖得以更好地理解。應(yīng)理解本發(fā)明不限于圖中示出的明確的實(shí)施方案。在圖中：圖1a和1b示出對(duì)取自用不同疫苗組合免疫接種的獼猴(macacamulatta)(nhp)在初次給予引發(fā)疫苗之后28周和56周的血清樣品進(jìn)行進(jìn)化枝cgp140包膜(env)蛋白和嵌合包膜(env)蛋白酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)的結(jié)果；圖中示出log10-轉(zhuǎn)化的ec90elisa滴度，符號(hào)表示檢測(cè)的各個(gè)動(dòng)物的滴度；水平線表示組幾何平均數(shù)滴度，虛線表示檢測(cè)低限；圖1a：在第28周的進(jìn)化枝cgp140env和嵌合envelisa滴度；圖1b：在第56周的進(jìn)化枝cgp140env和嵌合envelisa滴度；圖2示出使用生物素?；倪M(jìn)化枝cenv和嵌合env抗原對(duì)自從免疫接種的nhp在第28周獲得的血清樣品純化的免疫球蛋白g(igg)抗體進(jìn)行的抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用(adcp)測(cè)定的結(jié)果；圖中示出各個(gè)動(dòng)物的吞噬作用分值應(yīng)答；符號(hào)表示來(lái)自檢測(cè)的各個(gè)動(dòng)物的分值，灰色列表示組幾何平均數(shù)滴度；圖3示出對(duì)在tzm-b1細(xì)胞中從免疫接種的nhp在第56周獲得的血清樣品進(jìn)行的針對(duì)第1級(jí)envhiv-1假病毒的中和抗體(nab)測(cè)定的結(jié)果；檢測(cè)的第1級(jí)envhiv-1假病毒包括mw965.26(進(jìn)化枝c)、sf162.ls(進(jìn)化枝b)、mn-3(進(jìn)化枝a)、dj263.8(進(jìn)化枝a)和bal.26(進(jìn)化枝b)；符號(hào)表示各個(gè)動(dòng)物的log10-轉(zhuǎn)化的id50(平均感染劑量)滴度，組幾何平均數(shù)滴度以水平線表示；及圖4示出使用總體潛在的t細(xì)胞表位(pte)肽集合對(duì)從免疫接種的nhp在第54周獲得的樣品進(jìn)行的ifn-γ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(elispot)測(cè)定的結(jié)果；結(jié)果以平均斑點(diǎn)形成單位(sfu)/106周圍血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)示出；符號(hào)表示各個(gè)動(dòng)物的數(shù)值；水平線表示組幾何平均數(shù)，虛線表示檢測(cè)低限閾值。發(fā)明詳述在發(fā)明背景和整個(gè)說(shuō)明書中引用或描述了許多出版物、文章和專利，這些均以其全文并入本文作參考。本說(shuō)明書中包括的對(duì)這些文檔、法案、材料、裝置、條款的討論等是為了本發(fā)明提供語(yǔ)境的目的。這種討論不是承認(rèn)這些中的任何或全部構(gòu)成了相對(duì)于本文公開(kāi)或請(qǐng)求保護(hù)的發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)的一部分。除非特別限定，本文使用的所有技術(shù)和學(xué)術(shù)術(shù)語(yǔ)均具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的相同含義。另外，本文中使用的某些術(shù)語(yǔ)具有在本說(shuō)明書中闡述的含義。本文引用的所有專利、公開(kāi)的專利申請(qǐng)及出版物均就如全文顯示一樣并入本文作參考。必須注意如本文及在所附權(quán)利要求書中所用，除非上下文明確指出，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“所述”包括復(fù)數(shù)形式。除非特別指出，在一系列成分之前的術(shù)語(yǔ)“至少”應(yīng)理解為是指這個(gè)系列的每一成分。本領(lǐng)域技術(shù)人員使用不超過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)將意識(shí)到或者能確定本文描述的本發(fā)明的具體實(shí)施方案的許多等價(jià)物。這種等價(jià)物為本發(fā)明所涵蓋。在本說(shuō)明書及權(quán)利要求書中，除非上下文語(yǔ)境需要，則單詞“包含”應(yīng)理解為是指包含指定的整數(shù)或步驟或者一組整數(shù)或步驟，但是不除外任何其它整數(shù)或步驟或者一組整數(shù)或步驟。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“包含”可以用術(shù)語(yǔ)“含有”、“包括”代替，或者有時(shí)使用術(shù)語(yǔ)“具有”。當(dāng)在本文中使用時(shí)，“由…組成”排除在要求的要素中未指定的任何要素、步驟或成分。當(dāng)在本文中使用時(shí)，“基本由…組成”不排除不實(shí)質(zhì)上影響權(quán)利要求的基本和新特性的材料或步驟。任何前述術(shù)語(yǔ)“包含”、“含有”、“包括”和“具有”當(dāng)在本發(fā)明的某方面或?qū)嵤┓桨钢惺褂脮r(shí)，可以用術(shù)語(yǔ)“由…組成”或者“基本由…組成”代替以改變公開(kāi)的范圍。如本文所用，在多個(gè)列舉的要素之間使用的連接詞“和/或”應(yīng)理解為涵蓋個(gè)體及組合選項(xiàng)。例如，在兩個(gè)要素由“和/或”連接時(shí)，第一個(gè)選項(xiàng)是指第一個(gè)要素?zé)o第二個(gè)要素的應(yīng)用。第二個(gè)選項(xiàng)是指第二個(gè)要素?zé)o第一個(gè)要素的應(yīng)用。第三個(gè)選項(xiàng)是指第一個(gè)和第二個(gè)要素一起的應(yīng)用。任一這些選項(xiàng)應(yīng)理解為在該含義范圍內(nèi)，因此符合如本文所用術(shù)語(yǔ)“和/或”的要求。也應(yīng)理解一種以上的選項(xiàng)的同時(shí)應(yīng)用也在該含義范圍內(nèi)，因此符合術(shù)語(yǔ)“和/或”的要求。如本文所用，“對(duì)象”是指將通過(guò)或者已經(jīng)通過(guò)本發(fā)明實(shí)施方案的方法治療的任何動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選人。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物”涵蓋任何哺乳動(dòng)物。舉例的哺乳動(dòng)物包括但不限于牛、馬、羊、豬、貓、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(nhp)如猴或猿、人等，更優(yōu)選人。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“保護(hù)性免疫性”或者“保護(hù)性免疫應(yīng)答”是指接種的對(duì)象能控制針對(duì)其進(jìn)行免疫接種的病原性物質(zhì)的感染。通常，已經(jīng)產(chǎn)生“保護(hù)性免疫應(yīng)答”的對(duì)象僅發(fā)生輕度至中等程度的臨床癥狀或者根本無(wú)癥狀。通常，對(duì)某物質(zhì)具有“保護(hù)性免疫應(yīng)答”或者“保護(hù)性免疫性”的對(duì)象將不因所述物質(zhì)感染而死亡?！跋俨《疽職さ鞍住笔侵冈谙俨《疽職ど系牡鞍踪|(zhì)(例如ad26、ad35、rad48、rad5hvr48載體)，其參與確定特定腺病毒的血清型和/或向性。腺病毒衣殼蛋白典型包括纖維、五鄰體和/或六鄰體蛋白質(zhì)。如本文所用，特定腺病毒的“衣殼蛋白”如“ad26衣殼蛋白”或者“ad35衣殼蛋白”可例如是嵌合衣殼蛋白，其包括至少部分ad26或ad35衣殼蛋白。在某些實(shí)施方案中，衣殼蛋白是ad26或ad35的完整衣殼蛋白。在某些實(shí)施方案中，六鄰體、五鄰體和纖維是ad26或ad35的六鄰體、五鄰體和纖維。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“共同輸送”或“一起給予”是指同時(shí)給予兩種成分，如病毒表達(dá)載體和分離的抗原性多肽。“同時(shí)給予”可以是至少在同一天內(nèi)給予兩種成分。當(dāng)兩種成分是“一起給予”時(shí)，其可以在分開(kāi)的組合物中在短時(shí)間內(nèi)相繼給予，如在24、20、16、12、8或4小時(shí)內(nèi)，或者在1小時(shí)內(nèi)，或者其可以在一個(gè)組合物中同時(shí)給予。術(shù)語(yǔ)“佐劑”和“免疫刺激劑”在本文可互換使用，定義為引起免疫系統(tǒng)刺激的一或多種物質(zhì)。在本文中，佐劑用于增強(qiáng)對(duì)本發(fā)明的表達(dá)載體及抗原性多肽如本發(fā)明的腺病毒載體、mva載體和/或抗原性hiv抗原性多肽的免疫應(yīng)答。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“感染”是指致病物質(zhì)對(duì)宿主的侵襲。當(dāng)致病物質(zhì)能侵襲宿主并在宿主體內(nèi)復(fù)制或增殖時(shí)，認(rèn)為其是“感染性的”。舉例的感染性物質(zhì)包括病毒，例如人免疫缺陷病毒(hiv)和某些腺病毒、朊病毒、細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物等物種。人免疫缺陷病毒(hiv)是慢病毒屬(其是逆轉(zhuǎn)錄病毒科的一部分)的一個(gè)成員。兩個(gè)hiv物種感染人：hiv-1和hiv-2。hiv-1是最常見(jiàn)的hiv病毒株，已知其比hiv-2更具致病性。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“人免疫缺陷病毒”和“hiv”是指但不限于hiv-1和hiv-2。在某些舉例的實(shí)施方案中，本文描述的包膜蛋白是指存在于經(jīng)識(shí)別的五個(gè)慢病毒血清群任何上的那些：靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如hiv-1、hiv-2、猿猴免疫缺陷病毒(siv))；綿羊和山羊(例如綿羊髓鞘脫落病毒、山羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒)；馬(馬傳染性貧血病毒)；貓(例如貓免疫缺陷病毒(fiv))；及牛(例如牛免疫缺陷病毒(biv))(見(jiàn)internationalcommitteeontaxonomyofviruses描述)。將hiv分類為具有高度遺傳趨異的多個(gè)進(jìn)化枝。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“hiv進(jìn)化枝”或者“hiv亞型”是指根據(jù)其遺傳相似性程度分類的相關(guān)人免疫缺陷病毒。目前有三組hiv-1分離株：m、n和o。m組(主要毒株)由至少10個(gè)進(jìn)化枝a-j組成。o組(外部毒株)可以由相似數(shù)目的進(jìn)化枝組成。n組是新的hiv-1分離株，其未被分類為m組或o組。在某些舉例的實(shí)施方案中，本文描述的廣泛中和抗體將識(shí)別并產(chǎn)生針對(duì)2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個(gè)進(jìn)化枝和/或兩或多組hiv的免疫應(yīng)答。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)異源引發(fā)-加強(qiáng)組合、特別是用編碼一或多個(gè)hiv抗原性蛋白質(zhì)的表達(dá)載體如rad26引發(fā)及隨后用分離的hiv抗原性蛋白質(zhì)如hiv包膜糖蛋白加強(qiáng)、及優(yōu)選進(jìn)一步用編碼一或多個(gè)hiv抗原性蛋白質(zhì)的rad26或mva加強(qiáng)，在產(chǎn)生針對(duì)一或多個(gè)hiv亞型的保護(hù)性免疫應(yīng)答中驚人地有效。hiv抗原性蛋白質(zhì)如本文所用，術(shù)語(yǔ)“hiv的抗原性多肽”、“hiv抗原性多肽”、“hiv抗原性蛋白質(zhì)”、“hiv免疫原性多肽”或者“hiv免疫原”是指在需要其的對(duì)象中能誘導(dǎo)針對(duì)hiv的免疫應(yīng)答如體液和/或細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答的多肽。抗原性多肽可以是hiv的蛋白質(zhì)、其片段或表位或者多個(gè)hiv蛋白質(zhì)或其部分的組合，其可以在需要其的對(duì)象中誘導(dǎo)針對(duì)hiv的免疫應(yīng)答或者產(chǎn)生免疫性例如保護(hù)性免疫性。優(yōu)選地，抗原性多肽在宿主中能產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答，例如誘導(dǎo)針對(duì)病毒疾病或感染的免疫應(yīng)答，和/或在對(duì)象(即接種)中產(chǎn)生針對(duì)病毒疾病或感染的免疫性，其保護(hù)對(duì)象對(duì)抗所述病毒疾病或感染。例如，抗原性多肽可包含來(lái)自猿猴免疫缺陷病毒(siv)或hiv的蛋白質(zhì)或其片段，如hiv或siv包膜gp160蛋白、hiv或siv基質(zhì)/衣殼蛋白以及hiv或sivgag、pol和env基因產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，抗原性多肽可以是hiv-1或hiv-2抗原或其片段。舉例的hiv抗原包括但不限于gag、pol和env基因產(chǎn)物，其編碼結(jié)構(gòu)蛋白和必需酶。gag、pol和env基因產(chǎn)物是作為多聚蛋白合成的，其進(jìn)一步被加工為多個(gè)其它的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。gag基因的初始蛋白質(zhì)產(chǎn)物是病毒結(jié)構(gòu)蛋白gag多聚蛋白，其被進(jìn)一步加工為ma、ca、sp1、nc、sp2和p6蛋白質(zhì)產(chǎn)物。pol基因編碼病毒酶(pol，聚合酶)，初始蛋白質(zhì)產(chǎn)物被進(jìn)一步加工為rt、rnaseh、in和pr蛋白質(zhì)產(chǎn)物。env基因編碼結(jié)構(gòu)蛋白，特別是病毒粒包膜的糖蛋白。env基因的初始蛋白質(zhì)產(chǎn)物是gp160，其被進(jìn)一步加工為gp120和gp41。hiv抗原的其它實(shí)例包括基因調(diào)節(jié)蛋白tat和rev；輔助蛋白nef、vpr、vif和vpu；衣殼蛋白、核殼蛋白和p24病毒蛋白。本發(fā)明的異源核酸序列可編碼任何hiv抗原，優(yōu)選編碼gag、env和/或pol基因產(chǎn)物或者其一部分。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述抗原性多肽包含hivgag、env或者pol抗原，或者其任何部分或組合，更優(yōu)選hiv-1gag、env或pol抗原或者其任何部分或組合。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，由本發(fā)明的載體編碼的抗原性多肽或肽是嵌合hiv抗原。如本文所用，“嵌合抗原”是指從天然序列的片段裝配的重組蛋白質(zhì)。“嵌合抗原”可以是使用遺傳算法經(jīng)計(jì)算產(chǎn)生及優(yōu)化的。嵌合抗原與天然抗原類似，但是經(jīng)優(yōu)化以使得最大化覆蓋在天然序列中發(fā)現(xiàn)的潛在t細(xì)胞表位，這樣改良了免疫應(yīng)答的寬度和覆蓋。本發(fā)明的嵌合hiv抗原優(yōu)選是嵌合gag-pol-env抗原，更優(yōu)選是嵌合hiv-1gag-pol-env抗原。如本文所用，“嵌合hivgag-pol-env抗原”特別是指包含衍生自hiv的gag、pol和env多聚蛋白序列的一或多個(gè)的多個(gè)表位的嵌合抗原。本發(fā)明的嵌合hivgag-pol-env抗原的表位序列與天然hiv抗原的序列類似，但是經(jīng)優(yōu)化為存在更寬大的可能的t細(xì)胞表位陣列以改良在循環(huán)hiv序列中發(fā)現(xiàn)的表位的覆蓋。例如，為了提供潛在的t細(xì)胞表位的最大覆蓋，嵌合gag、pol和env抗原被設(shè)計(jì)為提供一或多個(gè)hiv進(jìn)化枝的優(yōu)化的覆蓋。選擇序列數(shù)據(jù)庫(kù)經(jīng)計(jì)算機(jī)模擬的9個(gè)連續(xù)氨基酸(9-聚體)的片段的重組序列，其與真實(shí)蛋白質(zhì)相似并使得疫苗候選物與全局?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)之間9-聚體序列匹配數(shù)最大化。嵌合gag、pol和env抗原具有與天然抗原相似的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，完全由無(wú)人工連接的天然序列組成。pol抗原可含有突變體以消除催化活性。單體envgp140嵌合抗原可含有點(diǎn)突變以消除裂解和融合活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合hivgag-pol-env抗原是具有衍生自gag基因產(chǎn)物序列的表位的嵌合hivgag抗原、具有衍生自pol基因產(chǎn)物序列的表位的嵌合hivpol抗原，或者具有衍生自env基因產(chǎn)物序列的表位的嵌合hivenv抗原。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合hivgag-pol-env抗原包含衍生自gag、pol和/或env基因產(chǎn)物序列的表位的組合。示例的及非限制性示例包括具有衍生自env和pol基因產(chǎn)物序列的表位的嵌合env-pol抗原、具有衍生自env和gag基因產(chǎn)物序列的表位的嵌合env-gag抗原、具有衍生自gag和pol基因產(chǎn)物序列的表位的嵌合gag-pol抗原，以及具有衍生自gag和env基因產(chǎn)物序列的表位的嵌合gag-env抗原。在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合hivgag-pol-env抗原包含衍生自來(lái)自一或多個(gè)進(jìn)化枝的gag、pol和env基因產(chǎn)物序列的表位的組合。舉例的嵌合hivgag-pol-env抗原包括在例如us20120076812、barouchetal.,natmed2010,16:319-323[54]、barouchetal.,cell155:1-9,2013[65]中描述的那些，所有這些文獻(xiàn)均以其全文并入本文作參考。優(yōu)選地，嵌合hivgag-pol-env抗原包括但不限于包含選自seqidno:1-4所示氨基酸序列的抗原。鑒于本發(fā)明揭示，嵌合hiv抗原可以使用本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生。見(jiàn)例如us20120076812、fischeretal,natmed,2007.13(1):p.100-6[53]、barouchetal.,natmed2010,16:319-323[54]所述，所有這些文獻(xiàn)均以其全文并入本文作參考。包膜糖蛋白如本文所用，術(shù)語(yǔ)“包膜糖蛋白”、“env糖蛋白”及“env”每個(gè)均是指但不限于在hiv病毒粒包膜表面上及hiv感染的細(xì)胞的漿膜表面上表達(dá)的糖蛋白或者其片段，其在需要的對(duì)象中可誘導(dǎo)針對(duì)hiv的免疫應(yīng)答或者產(chǎn)生免疫性。所述env基因編碼gp160，gp160被蛋白酶解為gp120和gp41。更特別地，gp160三聚體化為(gp160)3，然后經(jīng)歷裂解為兩個(gè)非共價(jià)相關(guān)的片段gp120和gp41。隨后通過(guò)gp120/gp41異二聚體的三聚體介導(dǎo)病毒進(jìn)入。gp120是受體結(jié)合片段，結(jié)合具有cd4受體的靶細(xì)胞如t輔助細(xì)胞上的cd4受體。gp41與gp120非共價(jià)結(jié)合，是融合片段并提供使hiv進(jìn)入細(xì)胞的第二步。gp41最初包埋在病毒包膜內(nèi)，但是當(dāng)gp120結(jié)合cd4受體時(shí)，gp120改變其構(gòu)象導(dǎo)致gp41暴露，在此其可有助于與宿主細(xì)胞融合。gp140是三聚體gp160-即(gp160)3-的未裂解的胞外域，其已經(jīng)用作天然狀態(tài)的裂解的病毒刺突(viralspike)的代用品。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，可以給予env糖蛋白(例如gp160、gp140、gp120或gp41)、優(yōu)選穩(wěn)定化三聚體gp140蛋白，引發(fā)或加強(qiáng)免疫以增強(qiáng)由表達(dá)載體單獨(dú)誘導(dǎo)的免疫性。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定化三聚體gp140蛋白”和“穩(wěn)定化gp140三聚體”均是指gp140多肽的三聚體，包括增加三聚體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的多肽序列。gp140多肽可具有或者可以被修飾為包括三聚體化結(jié)構(gòu)域以穩(wěn)定gp140的三聚體。舉例的三聚體化結(jié)構(gòu)域包括但不限于t4-fibritin“foldon”三聚體化結(jié)構(gòu)域、衍生自gcn4的卷曲螺旋三聚體化結(jié)構(gòu)域[66]以及大腸桿菌天冬氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶的催化亞單位作為三聚體標(biāo)簽[67]。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，穩(wěn)定化的三聚體gp140蛋白質(zhì)包含seqidno:5所示氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，穩(wěn)定化的三聚體gp140蛋白質(zhì)可以作為加強(qiáng)免疫給予或者作為加強(qiáng)免疫的成分與病毒表達(dá)載體一起給予。優(yōu)選地，穩(wěn)定化三聚體gp140蛋白質(zhì)是進(jìn)化枝c或者進(jìn)化枝agp140蛋白質(zhì)，更優(yōu)選是進(jìn)化枝cgp140蛋白質(zhì)。進(jìn)化枝c三聚體gp140蛋白質(zhì)在豚鼠中能誘導(dǎo)針對(duì)來(lái)自不同進(jìn)化枝的一系列hiv-1變體及具有不同中和敏感性的強(qiáng)力中和抗體應(yīng)答[68,60]。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，“包膜糖蛋白”是包含衍生自一或多個(gè)hiv進(jìn)化枝的一或多個(gè)env多聚蛋白序列的多個(gè)表位的嵌合包膜蛋白。例如，如本文所用，“gp140蛋白”可以是“嵌合gp140蛋白”，其含有衍生自一或多個(gè)hiv進(jìn)化枝的一或多個(gè)gp140蛋白質(zhì)序列的多個(gè)表位。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，嵌合gp140蛋白質(zhì)是包含seqidno:6所示氨基酸序列的嵌合gp140的穩(wěn)定化三聚體。分離的gp140蛋白質(zhì)可以與腺病毒表達(dá)載體或mva表達(dá)載體共同輸送。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，gp140蛋白質(zhì)與ad26或mva是作為兩個(gè)獨(dú)立配制物分別給予的，或者在單一配制物中一起給予。同時(shí)給予或者共同輸送可以在同時(shí)、在1小時(shí)內(nèi)或者在同一天內(nèi)進(jìn)行。此外，gp140蛋白質(zhì)可以在佐劑化的配制物中給予。合適的佐劑可以是例如磷酸鋁或者基于皂苷的佐劑。鑒于本發(fā)明揭示，抗原性多肽可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法產(chǎn)生和分離。例如，抗原性多肽可以從宿主細(xì)胞表達(dá)，優(yōu)選針對(duì)抗原性多肽生產(chǎn)而優(yōu)化的重組宿主細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，重組基因用于表達(dá)含有消除裂解和融合活性的突變的gp140蛋白，優(yōu)選在對(duì)象(例如人)免疫(例如當(dāng)摻入本發(fā)明組合物時(shí)，例如本發(fā)明疫苗)時(shí)產(chǎn)生的抗病毒免疫應(yīng)答(例如細(xì)胞或體液免疫應(yīng)答)具有增加的寬度、強(qiáng)度、深度或者壽命的優(yōu)化的gp140蛋白。優(yōu)化的gp140蛋白也可以包括一或多個(gè)裂解位點(diǎn)突變、因子xa位點(diǎn)和/或foldon三聚體化結(jié)構(gòu)域。前導(dǎo)/信號(hào)序列可以與優(yōu)化的gp140蛋白質(zhì)的n末端可操縱地連接以用于最大化的蛋白質(zhì)表達(dá)。前導(dǎo)/信號(hào)序列通常在轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔中期間從新生多肽裂解?？梢允褂眠m于感興趣的宿主細(xì)胞的任何前導(dǎo)/信號(hào)序列。舉例的前導(dǎo)/信號(hào)序列包含seqidno:7所示氨基酸序列。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離的抗原性多肽是穩(wěn)定化三聚體gp140，如在nkololaetal2010,j.virology84(7):3270-3279[68]、kovacsetal,pnas2012,109(30):12111-6[60]、wo2010/042942和wo2014/107744中描述的那些，所有這些文獻(xiàn)均以其全文并入本文作參考。腺病毒本發(fā)明的腺病毒屬于腺病毒科(adenoviridae)家族，優(yōu)選是屬于哺乳動(dòng)物腺病毒屬(mastadenovirus)。其可以是人腺病毒，但也可以是感染其它物種的腺病毒，包括但不限于牛腺病毒(例如牛腺病毒3，badv3)、犬腺病毒(例如cadv2)、豬腺病毒(例如padv3或5)，或者猿猴腺病毒(包括猴腺病毒和猿腺病毒，如黑猩猩腺病毒或大猩猩腺病毒)。優(yōu)選地，腺病毒是人腺病毒(hadv或adhu)，或者猿猴腺病毒如黑猩猩或大猩猩腺病毒(chad、adch或sadv)。在本發(fā)明中，如果未指明物種的ad，是指人腺病毒，例如縮寫符號(hào)“ad5”是指與hadv5相同，其是人腺病毒血清型5。如本文所用，符號(hào)“rad”是指重組腺病毒，例如“rad26”是指重組人腺病毒26。大多數(shù)深入研究已經(jīng)使用人腺病毒進(jìn)行，根據(jù)本發(fā)明的某些方面優(yōu)選人腺病毒。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組腺病毒基于人腺病毒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組腺病毒基于人腺病毒血清型5、11、26、34、35、48、49、50、52等。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，腺病毒是血清型26或35之一的人腺病毒。這些血清型的優(yōu)勢(shì)是在人群中的低血清陽(yáng)性率和/或低現(xiàn)存中和抗體滴度。rad26載體的制備在例如wo2007/104792及在abbinketal.,(2007)virol81(9):4654-63[11]中描述，所述文獻(xiàn)均以其全文并入本文作參考。舉例的ad26基因組序列見(jiàn)于genbank登記號(hào)ef153474及wo2007/104792中seqidno:1。rad35載體的制備在例如美國(guó)專利號(hào)7,270,811、wo00/70071及在vogelsetal.,(2003)jvirol77(15):8263-71[12]中描述，所有這些文獻(xiàn)均以其全文并入本文作參考。舉例的ad35基因組序列見(jiàn)于genbank登記號(hào)ac_000019及wo00/70071的圖6。猿猴腺病毒通常在人群中也具有低血清陽(yáng)性率和/或低現(xiàn)有中和抗體滴度，也已經(jīng)報(bào)道了使用黑猩猩腺病毒載體進(jìn)行的大量工作(例如us6083716，wo2005/071093，wo2010/086189，wo2010085984，farinaetal,2001,jvirol75:11603-13[13]；cohenetal,2002,jgenvirol83:151-55[69]；kobingeretal,2006,virology346:394-401[70]；tatsisetal.,2007,moleculartherapy15:608-17[71]；也參見(jiàn)bangariandmittal,2006,vaccine24:849-62[72]；及l(fā)asaroandertl,2009,molther17:1333-39[73])。因此，在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組腺病毒基于猿猴腺病毒，例如黑猩猩腺病毒。在某些實(shí)施方案中，重組腺病毒基于猿猴腺病毒類型1、7、8、21、22、23、24、25、26、27.1、28.1、29、30、31.1、32、33、34、35.1、36、37.2、39、40.1、41.1、42.1、43、44、45、46、48、49、50或sa7p。優(yōu)選地，腺病毒載體是復(fù)制缺陷重組病毒載體，如rad26、rad35、rad48、rad5hvr48等。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，腺病毒載體包含來(lái)自兩個(gè)罕見(jiàn)血清型：ad26和ad35的衣殼蛋白。在典型的實(shí)施方案中，所述載體是rad26或rad35病毒。因此，可用于本發(fā)明實(shí)施方案中的載體包括ad26或ad35衣殼蛋白(例如纖維、五鄰體或六鄰體蛋白)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到非必須是完整ad26或ad35衣殼蛋白用于本發(fā)明載體中。因此，包含至少一部分ad26或ad35衣殼蛋白的嵌合衣殼蛋白可用于本發(fā)明載體中。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的載體也可以包含這樣的衣殼蛋白，其中所述纖維、五鄰體和六鄰體蛋白均衍生自不同血清型，只要至少一個(gè)衣殼蛋白衍生自ad26或ad35即可。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述纖維、五鄰體和六鄰體蛋白均衍生自ad26或均衍生自ad35。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識(shí)到衍生自多個(gè)血清型的元件可以組合在一個(gè)重組腺病毒載體中。因此，可以產(chǎn)生組合了不同血清型的希望性質(zhì)的嵌合腺病毒。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合腺病毒可以組合ad26和ad35血清型現(xiàn)有免疫性的缺失與如在靶細(xì)胞中溫度穩(wěn)定性、裝配、錨定、產(chǎn)品收得率、重定向或改良的感染、dna的穩(wěn)定性等特性。在某些實(shí)施方案中，可用于本發(fā)明中的重組腺病毒載體主要或者全部衍生自ad35或ad26(即載體是rad35或rad26)。在一些實(shí)施方案中，腺病毒是復(fù)制缺陷的，例如由于其在基因組e1區(qū)域中含有缺失所致。對(duì)于衍生自ad26或ad35的本發(fā)明的腺病毒，典型地將腺病毒的e4-orf6編碼序列與人腺病毒亞群c如ad5的e4-orf6交換。這樣使得這種腺病毒在熟知的表達(dá)ad5的e1基因的補(bǔ)充細(xì)胞系如293細(xì)胞、per.c6細(xì)胞等中增殖(見(jiàn)例如havenga,etal.,2006,jgenvirol87:2135-43[61]，wo03/104467)。然而，這種腺病毒在不表達(dá)ad5的e1基因的非補(bǔ)充細(xì)胞中不能復(fù)制。在某些實(shí)施方案中，腺病毒是人腺病毒血清型35，在其中已經(jīng)克隆了編碼一或多個(gè)hiv抗原性多肽的核酸的e1區(qū)域中具有缺失，以及具有ad5的e4-orf6區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，腺病毒是人腺病毒血清型26，在其中已經(jīng)克隆了編碼一或多個(gè)hiv抗原性多肽的核酸的e1區(qū)域中具有缺失，及具有ad5的e4orf6區(qū)域。對(duì)于ad35腺病毒，典型地保留在腺病毒中e1b55k開(kāi)放讀框的3‘末端，例如在pix開(kāi)放讀框直接上游的166bp或者包含其的片段如在pix起始密碼子直接上游的243bp片段，在5‘末端由bsu36i限制位點(diǎn)作記號(hào)，因?yàn)檫@樣由于pix基因的啟動(dòng)子部分存在于這個(gè)區(qū)域而增加腺病毒的穩(wěn)定性(見(jiàn)例如[61]，如前；wo2004/001032)。重組腺病毒載體的制備為本領(lǐng)域熟知。rad26載體的制備在例如wo2007/104792及在abbinketal.,(2007)virol81(9):4654-63[11]中描述。舉例的ad26基因組序列見(jiàn)于genbank登記號(hào)ef153474及wo2007/104792中seqidno:1。rad35載體的制備在例如美國(guó)專利號(hào)7,270,811及在vogelsetal.,(2003)jvirol77(15):8263-71[12]中描述。舉例的ad35基因組序列見(jiàn)于genbank登記號(hào)ac_000019。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可用于本發(fā)明的載體包括在wo2012/082918中描述的那些載體，所述文獻(xiàn)以其全文并入本文作參考。典型地，可用于本發(fā)明中的載體是使用包含完整重組腺病毒基因組的核酸產(chǎn)生的(例如質(zhì)粒、粘?；蛘邨U狀病毒載體)。因此，本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明腺病毒載體的分離的核酸分子。本發(fā)明的核酸分子可以是通過(guò)克隆獲得的或者合成產(chǎn)生的rna形式或者dna形式。所述dna可以是雙鏈或單鏈的?？捎糜诒景l(fā)明中的腺病毒載體典型是復(fù)制缺陷的。在這些實(shí)施方案中，通過(guò)缺失或失活病毒復(fù)制關(guān)鍵區(qū)域如e1區(qū)域而使病毒復(fù)制缺陷。所述區(qū)域可以通過(guò)例如在該區(qū)域內(nèi)插入感興趣的基因如編碼抗原性多肽的基因(通常與啟動(dòng)子連接)而基本上缺失或失活。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體可以在其它區(qū)域如e2、e3或e4區(qū)域中含有缺失，或者在一或多個(gè)這些區(qū)域內(nèi)插入與啟動(dòng)子連接的異源基因。對(duì)于e2-和/或e4-突變的腺病毒，通常使用e2-和/或e4-補(bǔ)充細(xì)胞系產(chǎn)生重組腺病毒。在腺病毒e3區(qū)域中的突變不需要由這類細(xì)胞系補(bǔ)充，因?yàn)閑3不是復(fù)制所需的。包裝細(xì)胞系典型用于產(chǎn)生足量的腺病毒載體以用于本發(fā)明中。包裝細(xì)胞是包含在復(fù)制缺陷載體中已經(jīng)缺失或失活的那些基因的細(xì)胞，因此使得病毒在細(xì)胞中復(fù)制。合適的包裝細(xì)胞系包括例如per.c6、911、293和e1a549。如上所述，眾多的hiv抗原性多肽可以在載體中表達(dá)。如果需要，編碼hiv抗原性多肽的異源基因可以經(jīng)密碼子優(yōu)化以保證在處理的宿主(例如人)中正確表達(dá)。密碼子優(yōu)化是本領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用的一種技術(shù)。典型地，異源基因克隆進(jìn)腺病毒基因組的e1和/或e3區(qū)域中。異源hiv基因可以在腺病毒衍生的啟動(dòng)子(例如主要晚期啟動(dòng)子)的控制下(即可操縱地連接)，或者可以在異源啟動(dòng)子的控制下。舉例的合適的異源啟動(dòng)子包括巨細(xì)胞病毒(cmv)啟動(dòng)子和rous肉瘤病毒(rsv)啟動(dòng)子。優(yōu)選地，所述啟動(dòng)子位于表達(dá)盒內(nèi)感興趣的異源基因的上游。如上所述，可用于本發(fā)明的腺病毒載體可以編碼本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種hiv抗原性多肽，包括但不限于本文論述的抗原性多肽。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，腺病毒載體是rad26載體，如在abbink,jvirol,2007.81(9):p.4654-63[11]中所述那些載體，所述文獻(xiàn)以其全文并入本文作參考。mva載體可用于本發(fā)明的mva載體利用衍生自修飾的痘苗安卡拉病毒的弱化的病毒，特征在于其喪失在人細(xì)胞系中再生復(fù)制的能力。mva載體可以表達(dá)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何hiv抗原性多肽，包括但不限于本文論述的抗原性多肽。mva已經(jīng)通過(guò)在經(jīng)皮膚接種安卡拉痘苗病毒毒株的雞胚胎成纖維細(xì)胞上超過(guò)570次連續(xù)傳代而產(chǎn)生[chorioallantoisvacciniavirusankaravirus,cva；參見(jiàn)mayretal.(1975),infection3,6-14[74]]，所述毒株維持在土耳其安卡拉的接種學(xué)會(huì)(vaccinationinstitute)多年并用作人體接種疫苗的基礎(chǔ)。然而，由于與痘苗病毒相關(guān)的常見(jiàn)的嚴(yán)重接種后并發(fā)癥，進(jìn)行了一些嘗試以產(chǎn)生更弱化的較安全的天花疫苗。在1960-1974年間，prof.antonmayr通過(guò)在cef細(xì)胞中超過(guò)570次連續(xù)傳代在弱化cva方面取得成功[74]。在多種動(dòng)物模型中示出所得mva是無(wú)毒性的[75]。mva作為前天花疫苗的早期開(kāi)發(fā)的一部分，有在處于痘苗病毒不良反應(yīng)危險(xiǎn)的對(duì)象中使用mva-517組合listerelstree的臨床試驗(yàn)[77,78]。在1976年，衍生自mva-571種子病毒(相應(yīng)于第571代)的mva在德國(guó)注冊(cè)為在二期腸道外天花疫苗接種程序中的引發(fā)疫苗。隨后，mva-572用于大約120,000個(gè)高加索白人個(gè)體，大多數(shù)兒童在1-3歲之間，未報(bào)道嚴(yán)重副作用，盡管該群中許多對(duì)象處于與痘苗病毒相關(guān)并發(fā)癥的高危險(xiǎn)中[76]。mva-572保藏在europeancollectionofanimalcellcultures，保藏號(hào)ecaccv94012707。作為用于弱化mva而進(jìn)行傳代的結(jié)果，根據(jù)在cef細(xì)胞中進(jìn)行的傳代數(shù)而有許多不同毒株或分離株。例如，在德國(guó)在天花根除程序期間mva-572以小劑量用作前疫苗，mva-575普遍地用作獸用疫苗。mva以及mva-bn與祖先cva病毒相比缺少大約15％(六個(gè)區(qū)域的31kb)的基因組。所述缺失影響許多毒力和宿主范圍基因，以及a型包涵體基因。mva-575于2000年12月7日保藏在europeancollectionofanimalcellcultures(ecacc)，保藏號(hào)為v00120707。弱化的cva-病毒mva(修飾的安卡拉痘苗病毒)通過(guò)cva在原代雞胚成纖維細(xì)胞上系列增殖(超過(guò)570代)而獲得。即使mayr等在二十世紀(jì)七十年代期間證實(shí)mva在人體和哺乳動(dòng)物中是高度弱化和無(wú)毒性的，但是一些研究人員報(bào)道m(xù)va在哺乳動(dòng)物和人細(xì)胞系中不是充分弱化的，因?yàn)樵谶@些細(xì)胞中可發(fā)生殘留的復(fù)制[79,80；美國(guó)專利號(hào)5,185,146；81]。推測(cè)使用各種已知的mva毒株已經(jīng)獲得了在這些出版物中報(bào)道的結(jié)果，因?yàn)槭褂玫牟《镜男再|(zhì)顯然不同，特別是其在不同細(xì)胞系中的生長(zhǎng)習(xí)性不同。這種殘留的復(fù)制出于各種原因包括在人體中使用相關(guān)聯(lián)的安全性原因而是不合需要的。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了具有增強(qiáng)的安全性模式以開(kāi)發(fā)更安全的產(chǎn)物如疫苗或藥物的mva毒株，如bavariannordic所揭示。bavariannordic將mva進(jìn)一步傳代并稱作mva-bna。mva-bn的一個(gè)代表性樣品于2000年8月30日保藏在europeancollectionofcellcultures(ecacc)，保藏號(hào)為v00083008。mva-bn在wo02/42480(us2003/0206926)和wo03/048184(us2006/0159699)中進(jìn)一步描述，所述文獻(xiàn)以其全文并入本文作參考。mva的“衍生物”或“變體”是指呈現(xiàn)出與本文所述mva基本相同的復(fù)制特性、但是在其基因組的一或多個(gè)部分存在不同的病毒。例如，mva-bn以及mva-bn的衍生物或變體在人和小鼠、甚至在重度免疫抑制的小鼠體內(nèi)不能再生地復(fù)制。更特別地，mva-bn或者mva-bn的衍生物或變體優(yōu)選在雞胚成纖維細(xì)胞(cef)中也具有再生復(fù)制能力，但是在人角化細(xì)胞系hacat[82],、人骨肉瘤細(xì)胞系143b(ecacc保藏號(hào)91112502)、人胚胎腎細(xì)胞系293(ecacc保藏號(hào)85120602)及人子宮頸腺癌細(xì)胞系hela(atcc保藏號(hào)ccl-2)中無(wú)再生復(fù)制能力。此外，mva-bn的衍生物或變體在hela細(xì)胞和hacat細(xì)胞系中較mva-575具有低至少2倍、更優(yōu)選3倍的病毒擴(kuò)增比率。關(guān)于mva變體的這些性質(zhì)的檢測(cè)和測(cè)定在wo02/42480(us2003/0206926)和wo03/048184(us2006/0159699)中描述。術(shù)語(yǔ)“不能再生復(fù)制”或者“無(wú)再生復(fù)制能力”在例如wo02/42480中描述，其也教導(dǎo)了怎樣獲得具有上述希望性質(zhì)的mva。該術(shù)語(yǔ)適用于使用wo02/42480或者美國(guó)專利號(hào)6,761,893所述測(cè)定法在感染4天后病毒擴(kuò)增比率低于1的病毒，所述文獻(xiàn)以其全文并入本文作參考。術(shù)語(yǔ)“不能再生復(fù)制”是指在感染4天后病毒擴(kuò)增比率低于1的病毒。在wo02/42480或者美國(guó)專利號(hào)6,761,893中描述的測(cè)定法可用于確定病毒擴(kuò)增比率。病毒的擴(kuò)增或復(fù)制通常以從感染的細(xì)胞中產(chǎn)生的病毒的量(輸出)與最初用于感染細(xì)胞的病毒的量(輸入)的比率表示，稱作“擴(kuò)增比率”。擴(kuò)增比率為“1”定義為其中從感染的細(xì)胞中產(chǎn)生的病毒的量與最初用于感染細(xì)胞的病毒的量相同，意味著感染的細(xì)胞容許病毒感染且再生。相反，擴(kuò)增比率低于1，即輸出與輸入水平相比降低，表示缺少再生復(fù)制及因此病毒弱化?；趍va的疫苗的優(yōu)勢(shì)包括其安全性以及可以大規(guī)模產(chǎn)生疫苗的能力。進(jìn)一步地，除了其效力，工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的可行性也是有利的。此外，基于mva的疫苗可以輸送多個(gè)異源抗原并容許同時(shí)誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫性?？捎糜诒景l(fā)明的mva載體可以使用本領(lǐng)域已知方法制備，如在wo/2002/042480、wo/2002/24224、us20110159036、us8197825等中描述的那些方法，所述文獻(xiàn)的相關(guān)內(nèi)容并入本文作參考。另一方面，復(fù)制缺陷的mva病毒毒株也可以適用于本發(fā)明，如毒株mva-572和mva-575，或者任何其它相似弱化的mva毒株。也適用于本發(fā)明的毒株可以是突變體mva，如缺失的絨毛膜尿囊安卡拉痘苗病毒(dcva)。dcva包含在mva基因組的deli、delii、deliii、deliv、delv和delvi缺失位點(diǎn)。所述位點(diǎn)特別用于插入多個(gè)異源序列。dcva在人細(xì)胞系(如人293、143b和mrc-5細(xì)胞系)中可再生復(fù)制(擴(kuò)增比率大于10)，然后通過(guò)進(jìn)一步突變優(yōu)化可用于基于病毒的疫苗接種策略中(見(jiàn)wo2011/092029)。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，mva載體包含編碼一或多個(gè)抗原性hiv蛋白如hiv嵌合抗原的核酸。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，mva載體編碼一或多個(gè)包含選自seqidno:1-4的氨基酸序列的hiv抗原性多肽、更優(yōu)選編碼四個(gè)具有seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3和seqidno:4所示氨基酸序列的hiv抗原性多肽。編碼hiv抗原性蛋白質(zhì)的核酸序列可以插入mva的一或多個(gè)基因間區(qū)域(igr)。在某些實(shí)施方案中，igr選自igr07/08、igr44/45、igr64/65、igr88/89、igr136/137和igr148/149。在某些實(shí)施方案中，重組mva的少于5、4、3或2個(gè)igr包含編碼hiv如嵌合抗原和/或進(jìn)一步的hiv抗原性多肽的抗原決定簇的異源核苷酸序列。所述異源核苷酸序列可另外或替代地插入mva基因組的一或多個(gè)天然發(fā)生的缺失位點(diǎn)中，特別是插入主要缺失位點(diǎn)i、ii、iii、iv、v或vi中。在某些實(shí)施方案中，重組mva的少于5、4、3或2個(gè)天然發(fā)生的缺失位點(diǎn)包含編碼hiv包膜糖蛋白和/或進(jìn)一步的hiv蛋白的抗原決定簇的異源核苷酸序列。包含編碼hiv蛋白的抗原決定簇的異源核苷酸序列的mva的插入位點(diǎn)的數(shù)目可以是1、2、3、4、5、6、7或更多。在某些實(shí)施方案中，異源核苷酸序列插入4、3、2或更少的插入位點(diǎn)中。優(yōu)選地，使用兩個(gè)插入位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，使用三個(gè)插入位點(diǎn)。優(yōu)選地，重組mva包含插入2或3個(gè)插入位點(diǎn)的至少2、3、4、5、6或7個(gè)基因。本發(fā)明提供的重組mva病毒可以通過(guò)本領(lǐng)域已知常規(guī)方法產(chǎn)生。獲得重組痘病毒或者在痘病毒基因組中插入外來(lái)編碼序列的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。例如，標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)方法如dna克隆、dna和rna分離、western印跡分析、rt-pcr及pcr擴(kuò)增技術(shù)在molecularcloning,alaboratorymanual(2nded.)[83]中描述，處理和操縱病毒的技術(shù)在virologymethodsmanual[b.w.j.mahyetal.(eds.),academicpress(1996)]中描述。相似地，對(duì)mva進(jìn)行處理、操縱和遺傳工程化的技術(shù)和專門技能在molecularvirology:apracticalapproach[a.j.davison&r.m.elliott(eds.),thepracticalapproachseries,irlpressatoxforduniversitypress,oxford,uk(1993)(見(jiàn)例如chapter9:expressionofgenesbyvacciniavirusvectors)]和currentprotocolsinmolecularbiology[johnwiley&son,inc.(1998)(見(jiàn)例如chapter16,sectioniv:expressionofproteinsinmammaliancellsusingvacciniaviralvector)]中描述。對(duì)于本發(fā)明揭示的各種重組mva的產(chǎn)生，可以使用不同的方法。插入病毒中的dna序列可以置于其中已經(jīng)插入與mva的一部分dna同源的dna的大腸桿菌質(zhì)粒構(gòu)建體中。單獨(dú)地，插入的dna序列可以與啟動(dòng)子連接。啟動(dòng)子-基因連接可以位于質(zhì)粒構(gòu)建體中，以便所述啟動(dòng)子-基因連接在兩端具有與在含有非必需基因座的mvadna的區(qū)域兩側(cè)的dna序列同源的dna。所得質(zhì)粒構(gòu)建體可以通過(guò)在大腸桿菌內(nèi)增殖而擴(kuò)增并分離。含有插入的dna基因序列的分離的質(zhì)?？梢赞D(zhuǎn)染進(jìn)例如雞胚成纖維細(xì)胞(cef)的細(xì)胞培養(yǎng)物中，同時(shí)將該培養(yǎng)物用mva感染。分別在質(zhì)粒和病毒基因組中在同源mvadna之間的重組可以產(chǎn)生由于存在外源dna序列而修飾的mva。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，合適的細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞如cef細(xì)胞可以用痘病毒感染。感染的細(xì)胞隨后可以用包含一或多個(gè)外源或異源基因的第一質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染，優(yōu)選在痘病毒表達(dá)控制元件的轉(zhuǎn)錄控制下。如上所述，質(zhì)粒載體還包含能指導(dǎo)外源序列插入痘病毒基因組的所選擇部分的序列。任選地，質(zhì)粒載體還含有包含與痘病毒啟動(dòng)子可操縱地連接的標(biāo)記和/或選擇基因的盒。合適的標(biāo)記或選擇基因是例如編碼綠色熒光蛋白、β-半乳糖苷酶、新霉素-磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的基因或者其它標(biāo)記。選擇或標(biāo)記盒的使用簡(jiǎn)化了產(chǎn)生的重組痘病毒的鑒別與分離。然而，重組痘病毒也可以通過(guò)pcr技術(shù)鑒別。隨后，進(jìn)一步的細(xì)胞可以用如上述獲得的重組痘病毒感染及用包含一或多個(gè)第二外來(lái)或異源基因的第二載體轉(zhuǎn)染。這種基因應(yīng)導(dǎo)入痘病毒基因組的不同插入位點(diǎn)，第二載體在指導(dǎo)一或多個(gè)第二外來(lái)基因整合進(jìn)痘病毒基因組中的痘病毒同源序列方面也不同。在同源重組發(fā)生后，可以分離包含兩或更多個(gè)外來(lái)或異源基因的重組病毒。對(duì)于將另外的外來(lái)基因?qū)胫亟M病毒中，可以重復(fù)感染和轉(zhuǎn)染步驟，使用在之前的步驟中分離的重組病毒進(jìn)行感染及使用包含進(jìn)一步的一或多個(gè)外來(lái)基因的進(jìn)一步的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染?；蛘?，上述感染和轉(zhuǎn)染步驟可互換，即將合適的細(xì)胞首先用包含外來(lái)基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染，然后用痘病毒感染。再或者，也可以將每個(gè)外來(lái)基因?qū)氩煌《局?，用所有獲得的重組病毒共同感染細(xì)胞并篩選包含所有外來(lái)基因的重組體。第三種選項(xiàng)是在體外連接dna基因組與外來(lái)序列并使用輔助病毒重建重組的痘苗病毒dna基因組。第四種選項(xiàng)是在大腸桿菌或另一細(xì)菌物種中在克隆的作為細(xì)菌人工染色體(bac)的痘苗病毒基因組與兩側(cè)是與痘苗病毒基因組中希望的整合位點(diǎn)兩側(cè)序列同源的dna序列的線性外來(lái)序列之間進(jìn)行同源重組。所述異源hiv基因如編碼一或多個(gè)hiv抗原性多肽的核酸可以在一或多個(gè)痘病毒啟動(dòng)子的控制下(即可操縱地連接)。在某些實(shí)施方案中，痘病毒啟動(dòng)子是pr7.5啟動(dòng)子、雜合早期/晚期啟動(dòng)子或者prs啟動(dòng)子、prs5e啟動(dòng)子、合成或天然的早期或晚期啟動(dòng)子，或者牛痘病毒ati啟動(dòng)子。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，mva載體表達(dá)多價(jià)嵌合env/gag/pol抗原，如在barouchetal.,natmed2010,16:319-323[54]、barouchetal.,cell155:1-9,2013[65]中描述的那些，所有這些文獻(xiàn)均以其全文并入本文作參考。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，mva載體可表達(dá)本文描述的任何抗原性多肽，包括但不限于hiv嵌合抗原如hiv嵌合gag-pol-env抗原。免疫原性組合物如本文所用，“免疫有效量”是指組合物在有需要的對(duì)象中足以誘導(dǎo)希望的免疫作用或免疫應(yīng)答的量。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫有效量是指在有需要的對(duì)象中足以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫有效量是指在有需要的對(duì)象中足以產(chǎn)生免疫性的量，例如提供針對(duì)如病毒感染等疾病的保護(hù)作用。免疫有效量根據(jù)多種因素而可以變化，如對(duì)象的身體狀況、年齡、體重、健康狀況等；特定的應(yīng)用，是誘導(dǎo)免疫應(yīng)答或是提供保護(hù)性免疫性；給予的特定重組載體；由給予的重組載體編碼的免疫原；給予的特定抗原性多肽；以及需要這種免疫性的特定疾病如病毒感染。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)本發(fā)明揭示可易于確定免疫有效量。作為一般指導(dǎo)，當(dāng)關(guān)于重組病毒載體使用的免疫有效量可以是在大約108個(gè)病毒顆粒至大約1012個(gè)病毒顆粒的范圍，例如108、109、1010、1011、1012個(gè)病毒顆粒。免疫有效量可以在單一組合物中給予，或者在多個(gè)組合物中給予，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)組合物(例如片劑、膠囊或注射劑)，其中多個(gè)膠囊或注射劑的給予共同為對(duì)象提供免疫有效量。通常，當(dāng)關(guān)于多肽如分離的抗原性多肽使用時(shí)，免疫有效量的范圍可以是例如大約0.3至大約3000微克(μg)，例如1-1000μg、例如10-500μg、例如大約50、100、150、200、250、300、350、400、450或500μg。也可以為對(duì)象給予免疫有效量，隨后以所謂的引發(fā)-加強(qiáng)方案給予同一對(duì)象另一劑的免疫有效量。引發(fā)-加強(qiáng)方案的一般概念為疫苗領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。如果需要，在該方案中可以任選增加給予進(jìn)一步的加強(qiáng)免疫。免疫原性組合物是包含免疫有效量的用于本發(fā)明的純化或者部分純化的腺病毒或mva載體的組合物。根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法可以將所述組合物配制為疫苗(也稱作“免疫原性組合物”)。這種組合物可包含佐劑以增強(qiáng)免疫應(yīng)答。配制物中每種成分的最佳比率可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)根據(jù)本發(fā)明揭示確定。免疫原性組合物的制備和使用為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。液態(tài)藥物組合物通常包括液體運(yùn)載體如水、石油、動(dòng)物油或植物油、礦物油或合成油。組合物中也可以包含生理鹽水溶液、葡萄糖或其它糖溶液或二醇如乙二醇、丙二醇或者聚乙二醇。本發(fā)明的組合物可包含其它hiv-1抗原或者所述引發(fā)或加強(qiáng)免疫可包括其它抗原。與本發(fā)明的腺病毒載體組合使用的其它抗原對(duì)于本發(fā)明不是關(guān)鍵的，可例如是hiv-1抗原及表達(dá)其的核酸?？捎糜诒景l(fā)明的免疫原性組合物可包括佐劑。根據(jù)本發(fā)明適于共同給予的佐劑應(yīng)是在人體中潛在安全的、良好耐受和有效的佐劑，包括qs-21、detox-pc、mpl-se、mogm-csf、titermax-g、crl-1005、gerbu、teramide、psc97b、adjumer、pg-026、gsk-i、gcmaf、b-alethine、mpc-026、adjuvax、cpgodn、betafectin、鋁鹽(例如adjuphos)、adjuplex和mf59?？梢越o予的其它佐劑包括凝集素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和淋巴因子如α-干擾素、γ-干擾素、血小板衍生生長(zhǎng)因子(pdgf)、粒細(xì)胞集落刺激因子(gcsf)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gmcsf)、腫瘤壞死因子(tnf)、表皮生長(zhǎng)因子(egf)、il-i、il-2、il-4、il-6、il-8、il-10和il-12或者其編碼核酸。本發(fā)明的組合物可包含藥物可接受的賦形劑、運(yùn)載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它材料。這種材料應(yīng)是無(wú)毒的且應(yīng)不干擾活性成分的效力。運(yùn)載體或其它材料的精確性質(zhì)可依賴于給予途徑，例如肌內(nèi)、皮下、口腔、靜脈內(nèi)、經(jīng)皮、粘膜內(nèi)(例如腸道)、鼻內(nèi)或者腹膜內(nèi)途徑。在動(dòng)物或人生物體中在給予時(shí)誘導(dǎo)或刺激抗hiv免疫應(yīng)答的能力可以在體外或體內(nèi)使用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)化的多種測(cè)定評(píng)估。關(guān)于可用于評(píng)估免疫應(yīng)答發(fā)生和激活的技術(shù)的一般性描述見(jiàn)例如coliganetal.(1992and1994,currentprotocolsinimmunology；edjwiley&sonsinc,nationalinstituteofhealth)所述。細(xì)胞免疫性的測(cè)量可以通過(guò)測(cè)量由激活的效應(yīng)細(xì)胞包括衍生自cd4+和cd8+t細(xì)胞的那些細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子狀況(例如通過(guò)elispot量化il-10或ifnγ產(chǎn)生細(xì)胞)、通過(guò)確定免疫效應(yīng)細(xì)胞的激活狀態(tài)(例如通過(guò)傳統(tǒng)的[3h]胸苷吸收的t細(xì)胞增殖測(cè)定)、通過(guò)在敏化的對(duì)象中測(cè)定抗原特異性t淋巴細(xì)胞(例如在細(xì)胞毒性測(cè)定中肽特異性裂解等)進(jìn)行。刺激細(xì)胞和/或體液應(yīng)答的能力可以通過(guò)抗體結(jié)合和/或結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)確定(見(jiàn)例如harlow,1989,antibodies,coldspringharborpress)。例如，應(yīng)答給予的提供免疫原的組合物產(chǎn)生的抗體的滴度可以通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)測(cè)量。免疫應(yīng)答也可以通過(guò)中和抗體測(cè)定測(cè)量，其中病毒的中和定義為通過(guò)病毒與特異性抗體的反應(yīng)/抑制/中和而喪失的感染性。免疫應(yīng)答可進(jìn)一步通過(guò)抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用(adcp)測(cè)定進(jìn)行測(cè)量。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，在給予對(duì)象時(shí)，表達(dá)載體如重組腺病毒載體或重組mva載體表達(dá)免疫原性多肽。本文描述的任何抗原性多肽均可以由表達(dá)載體編碼并使用本發(fā)明的方法給予對(duì)象。表達(dá)的免疫原性多肽呈遞給對(duì)象的免疫系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)需要的應(yīng)答以產(chǎn)生免疫性，或者誘導(dǎo)免疫應(yīng)答以治療或預(yù)防疾病或感染。例如，應(yīng)答可以是產(chǎn)生特異于所述免疫原性多肽的抗體。優(yōu)選地，在給予對(duì)象時(shí)，表達(dá)載體表達(dá)嵌合hivgag-pol-env抗原。根據(jù)表達(dá)的嵌合hiv抗原的序列組成，本發(fā)明的嵌合hivgag-pol-env抗原呈遞給對(duì)象的免疫系統(tǒng)可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異于hivgag、pol和/或env基因產(chǎn)物的抗體。疫苗組合本發(fā)明的一個(gè)一般方面涉及疫苗組合以在有需要的對(duì)象中誘導(dǎo)針對(duì)人免疫缺陷病毒(hiv)的免疫應(yīng)答，所述疫苗組合包含：(i)第一組合物，其包含免疫有效量的編碼一或多個(gè)hiv抗原性多肽的一或多個(gè)表達(dá)載體及藥物可接受的運(yùn)載體；(ii)第二組合物，其包含免疫有效量的分離的抗原性多肽及藥物可接受的運(yùn)載體；和(iii)免疫有效量的編碼一或多個(gè)另外的抗原性多肽的一或多個(gè)另外的表達(dá)載體，其中第一和第二組合物之一用于引發(fā)免疫且另一個(gè)組合物用于加強(qiáng)免疫，并且免疫有效量的另外的表達(dá)載體存在于第二組合物中或者在與第二組合物一起給予的第三組合物中用于引發(fā)或加強(qiáng)免疫。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離的抗原性多肽包含hiv包膜糖蛋白。舉例的包膜糖蛋白包括上述任何hiv包膜糖蛋白，包括但不限于來(lái)自任何hiv進(jìn)化枝的gp160、gp140、gp120或gp41。優(yōu)選地，分離的抗原性多肽包含穩(wěn)定化的hiv包膜蛋白三聚體，如穩(wěn)定化的hivgp140三聚體，特別是進(jìn)化枝c的穩(wěn)定化的hivgp140三聚體，如包含seqidno:5所示氨基酸序列的多肽。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，hiv包膜糖蛋白是嵌合hiv包膜糖蛋白，如嵌合hivgp140蛋白質(zhì)，如包含seqidno:6所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體或另外的表達(dá)載體是腺病毒載體或mva載體。優(yōu)選地，不同來(lái)源的載體用于引發(fā)和加強(qiáng)免疫。例如，當(dāng)腺病毒載體用于引發(fā)免疫時(shí)，mva載體用于加強(qiáng)免疫。同樣，當(dāng)mva載體用于引發(fā)免疫時(shí)，腺病毒載體用于加強(qiáng)免疫。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用一或多個(gè)腺病毒載體、更優(yōu)選rad26載體引發(fā)免疫，使用一或多個(gè)mva載體與分離的hiv抗原性多肽如hiv包膜蛋白一起用于加強(qiáng)免疫。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，一或多個(gè)腺病毒載體、優(yōu)選rad26載體用于引發(fā)免疫，及一或多個(gè)腺病毒載體、優(yōu)選rad26載體與分離的hiv抗原性多肽如hiv包膜蛋白、優(yōu)選穩(wěn)定化的三聚體gp140蛋白一起用于加強(qiáng)免疫。用于加強(qiáng)免疫的腺病毒載體可編碼與用于引發(fā)免疫的腺病毒載體編碼的那些蛋白質(zhì)相同的抗原性蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，分離的hiv抗原性多肽及一或多個(gè)腺病毒載體、優(yōu)選rad26載體用于引發(fā)免疫，分離的hiv抗原性多肽及一或多個(gè)腺病毒載體、優(yōu)選rad26載體用于加強(qiáng)免疫。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，上述任何hiv抗原性多肽均可以由所述表達(dá)載體和另外的表達(dá)載體編碼。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗原性多肽是hiv嵌合抗原，更優(yōu)選是嵌合hivgag-pol-env抗原。舉例的嵌合hivgag-pol-env抗原包括但不限于包含seqidno:1-4所示氨基酸序列的嵌合抗原。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，第一組合物包含編碼一或多個(gè)嵌合hiv抗原性多肽如嵌合hivgag-pol-env抗原的rad26載體，第二組合物包含分離的hiv包膜蛋白，如穩(wěn)定化的hivgp140三聚體或者嵌合hiv包膜蛋白，以及所述另外的表達(dá)載體是編碼一或多個(gè)嵌合hiv抗原性多肽如嵌合hivgag-pol-env抗原的mva載體。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一組合物包含編碼具有seqidno:1-4所示氨基酸序列的一或多個(gè)蛋白質(zhì)的rad26載體，第二組合物包含具有seqidno:5或seqidno:6所示氨基酸序列的分離的抗原性多肽，以及所述另外的表達(dá)載體是編碼具有seqidno:1-4所示氨基酸序列的一或多個(gè)蛋白質(zhì)的mva載體。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一組合物包含編碼分別具有seqidno:1、seqidno:3和seqidno:4所示氨基酸序列的三種嵌合hiv蛋白的rad26載體，第二組合物包含具有seqidno:5所示氨基酸序列的分離的穩(wěn)定化hivgp140三聚體，以及mva載體存在于第三組合物中及編碼具有seqidno:1-4所示氨基酸序列的四種嵌合hiv抗原性蛋白。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，第一組合物可包含一個(gè)表達(dá)載體或者一個(gè)以上的表達(dá)載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一組合物包含一個(gè)表達(dá)載體，如腺病毒載體，更優(yōu)選rad26載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一組合物包含一個(gè)以上的表達(dá)載體，如1、2、3或4個(gè)表達(dá)載體，優(yōu)選腺病毒載體，如rad26載體。所述一或多個(gè)表達(dá)載體可表達(dá)相同或不同hiv抗原性多肽。每個(gè)表達(dá)載體可表達(dá)一個(gè)hiv抗原性多肽序列，或者表達(dá)一個(gè)以上hiv抗原性多肽序列。作為說(shuō)明性及非限制性例子，第一組合物可包含三個(gè)rad26載體，每個(gè)載體表達(dá)不同的hiv抗原性多肽，優(yōu)選選自seqidno:1-4所示多肽、更優(yōu)選seqidno:1、3和4所示多肽。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，所述一或多個(gè)另外的表達(dá)載體可以是一個(gè)表達(dá)載體或者一個(gè)以上的表達(dá)載體，如2、3、4或更多個(gè)表達(dá)載體。所述一或多個(gè)另外的表達(dá)載體可表達(dá)相同或不同的抗原性多肽。所述一或多個(gè)另外的表達(dá)載體的每個(gè)載體可表達(dá)一個(gè)抗原性多肽序列或者多個(gè)抗原性多肽序列。作為說(shuō)明性和非限制性例子，使用兩個(gè)另外的表達(dá)載體，優(yōu)選mva載體，每個(gè)mva載體編碼不同的嵌合hiv抗原序列，如選自seqidno:1-4的嵌合hivgag-pol-env抗原序列。優(yōu)選地，在本發(fā)明這種實(shí)施方案中，一個(gè)mva載體編碼包含seqidno:1和3所示序列的hiv抗原性多肽，另一mva載體編碼包含seqidno:2和4所示序列的hiv抗原性多肽。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的疫苗組合有效地誘導(dǎo)針對(duì)一或多個(gè)hiv進(jìn)化枝的免疫應(yīng)答。誘導(dǎo)針對(duì)hiv感染的保護(hù)性免疫性的方法本發(fā)明提供了使用一或多個(gè)表達(dá)載體組合分離的抗原性多肽在有需要的對(duì)象中引發(fā)和加強(qiáng)對(duì)一或多個(gè)hiv進(jìn)化枝的免疫應(yīng)答的方法。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)一般方面，在有需要的對(duì)象中誘導(dǎo)針對(duì)人免疫缺陷病毒(hiv)的免疫應(yīng)答的方法包括如下步驟：(i)給予對(duì)象第一組合物，其包含免疫有效量的編碼一或多個(gè)hiv抗原性多肽的一或多個(gè)表達(dá)載體及藥物可接受的運(yùn)載體；(ii)給予對(duì)象第二組合物，其包含免疫有效量的分離的抗原性多肽及藥物可接受的運(yùn)載體；(iii)給予對(duì)象免疫有效量的編碼一或多個(gè)另外的hiv抗原性多肽的一或多個(gè)另外的表達(dá)載體，其中步驟(a)和(b)以任一順序進(jìn)行，一個(gè)步驟用于引發(fā)免疫且另一個(gè)步驟用于加強(qiáng)免疫，并且免疫有效量的一或多個(gè)另外的表達(dá)載體存在于第二組合物中或者在與第二組合物一起給予的第三組合物中用于引發(fā)或加強(qiáng)免疫。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的任何疫苗組合均可用于本發(fā)明方法中。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，當(dāng)涉及本發(fā)明描述的方法使用的術(shù)語(yǔ)“誘導(dǎo)免疫應(yīng)答”涵蓋了提供保護(hù)性免疫性和/或接種對(duì)象以對(duì)抗感染如hiv感染的預(yù)防目的，以及在有需要的對(duì)象中引起希望的免疫應(yīng)答或有效抗感染如hiv感染的治療目的。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法用于預(yù)防目的，如提供保護(hù)性免疫性?？捎糜诒景l(fā)明方法中的分離的抗原性多肽、表達(dá)載體、另外的表達(dá)載體、由表達(dá)載體編碼的抗原性多肽等的實(shí)施方案在上文詳細(xì)描述和下文示例的實(shí)施例中論述。在本發(fā)明揭示的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，編碼一或多個(gè)hiv抗原性多肽的一或多個(gè)腺病毒載體用于引發(fā)免疫應(yīng)答。一或多個(gè)分離的hiv抗原性多肽可以與一或多個(gè)腺病毒載體一起用于引發(fā)免疫。引發(fā)免疫可以給予多次，例如初始引發(fā)免疫在第0時(shí)給予，隨后再次引發(fā)免疫在初始引發(fā)免疫給予之后大約10-14周給予。一或多個(gè)分離的hiv抗原性多肽與編碼一或多個(gè)另外的hiv抗原性多肽的一或多個(gè)另外的腺病毒或mva載體一起用于加強(qiáng)免疫應(yīng)答。加強(qiáng)免疫也可以多次給予，例如首次在初始引發(fā)免疫給予后大約22-26周給予，隨后再次加強(qiáng)免疫在初始引發(fā)免疫給予后大約46-50周給予。監(jiān)測(cè)由所述免疫誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。本發(fā)明揭示的方法的實(shí)施方案還涵蓋較短的引發(fā)-加強(qiáng)方案，是指最終的加強(qiáng)免疫是在初始引發(fā)免疫給予后大約22-26周給予。引發(fā)免疫可以在第0周給予。加強(qiáng)免疫可以多次給予，例如首次在初始引發(fā)免疫給予之后大約7-9周或者11-13周給予，隨后再一次加強(qiáng)免疫在初始引發(fā)免疫給予后大約22-26周給予。在某些實(shí)施方案中，一或多個(gè)分離的hiv抗原性多肽與一或多個(gè)腺病毒載體一起給予以引發(fā)免疫。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于意識(shí)到引發(fā)和加強(qiáng)給予的方案可以基于在給予后測(cè)量的免疫應(yīng)答而調(diào)整。例如，加強(qiáng)組合物通常在給予引發(fā)組合物之后幾周或幾個(gè)月后給予，例如在給予引發(fā)組合物之后大約2-3周或4周、或者8周、或者16周、或者20周、或者24周、或者28周、或者30周、或者32周或者1-2年給予。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于本文揭示的方法中的腺病毒載體包括rad26載體。在一個(gè)舉例的實(shí)施方案中，rad26載體用于引發(fā)免疫應(yīng)答，mva載體與分離的抗原性多肽一起用于加強(qiáng)免疫應(yīng)答，反之亦然。在所述方法的一或多個(gè)實(shí)施方案中，多個(gè)rad26載體用于引發(fā)免疫應(yīng)答，及多個(gè)分離的抗原性蛋白質(zhì)任選與多個(gè)mva載體一起用于加強(qiáng)免疫應(yīng)答，反之亦然。在根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，多個(gè)rad26載體用于引發(fā)免疫，隨后多個(gè)mva載體及分離的抗原性多肽用于加強(qiáng)免疫。優(yōu)選地，加強(qiáng)免疫是在最后的引發(fā)之后10-36周、更優(yōu)選在引發(fā)后12-24周給予。在各自的引發(fā)組合物和加強(qiáng)組合物(然而使用許多加強(qiáng)組合物)中的抗原不需要是相同的，但是應(yīng)共有抗原決定簇或者彼此基本相似。包含表達(dá)載體和/或抗原性多肽的免疫原性組合物的給予典型是肌內(nèi)或皮下給予。然而，也可以考慮其它給予方法如靜脈內(nèi)、經(jīng)皮、真皮內(nèi)或經(jīng)鼻給予。肌內(nèi)給予免疫原性組合物可以通過(guò)使用注射針注射表達(dá)載體如腺病毒和/或mva載體和/或抗原性多肽的懸浮液而完成。另一種選擇是使用無(wú)針注射裝置給予所述組合物(例如使用biojectortm)或者含有所述疫苗的凍干粉末。對(duì)于靜脈內(nèi)、經(jīng)皮或皮下注射或者在病患部位注射，所述載體是腸道外可接受的水溶液形式，其是無(wú)熱原的且具有合適ph、等滲性和穩(wěn)定性。另外，分離的抗原性多肽是腸道外可接受的溶液形式，具有合適的ph、等滲性和穩(wěn)定性。本領(lǐng)域技術(shù)人員使用例如等滲載體如氯化鈉注射液、林格注射液、乳酸化林格注射液能制備合適的溶液。如果需要，可以包含防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、抗氧化劑和/或其它添加劑。也可以應(yīng)用緩釋制劑。典型地，給予根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的疫苗組合物具有預(yù)防性目的以在感染或者癥狀發(fā)生之前產(chǎn)生針對(duì)hiv抗原的免疫應(yīng)答。根據(jù)本發(fā)明可以治療或預(yù)防的疾病和病癥包括其中免疫應(yīng)答可發(fā)揮保護(hù)性或治療性作用的那些。在其它實(shí)施方案中，可以給予表達(dá)載體如腺病毒載體和/或mva載體和/或抗原性多肽用于暴露后預(yù)防。將含有表達(dá)載體例如腺病毒載體和/或mva載體及抗原性多肽的免疫原性組合物給予對(duì)象，在對(duì)象中產(chǎn)生抗hiv免疫應(yīng)答。足以誘導(dǎo)可檢測(cè)的免疫應(yīng)答的組合物的量定義為“免疫有效劑量”。如下文實(shí)施例所示，本發(fā)明的免疫原性組合物誘導(dǎo)體液及細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。在本發(fā)明的典型實(shí)施方案中，免疫應(yīng)答是保護(hù)性免疫應(yīng)答。給予的實(shí)際量、速率和時(shí)程依賴于治療的疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重度。治療處方如劑量的決定等在全科醫(yī)生及其它醫(yī)生或者在獸用時(shí)在獸醫(yī)的職責(zé)內(nèi)，典型地要考慮治療的疾病、患者個(gè)體的狀況、給予部位、給予方法及為醫(yī)生已知的其它因素。示例的上述技術(shù)和方案可見(jiàn)于remington'spharmaceuticalsciences,16thedition,osol,a.ed.,1980。在產(chǎn)生腺病毒和mva載體及任選將這種顆粒配制為組合物之后，可以將載體給予個(gè)體、特別是人或其它靈長(zhǎng)類動(dòng)物?？梢越o予人或者另外的哺乳動(dòng)物如小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、豚鼠、兔、綿羊、山羊、豬、馬、牛、驢、猴、狗或貓。給予非人哺乳動(dòng)物不需要是為了治療目的，而是可用于實(shí)驗(yàn)，例如研究對(duì)于gp140蛋白質(zhì)或者由腺病毒或mva載體表達(dá)的抗原的免疫應(yīng)答的機(jī)制。在一個(gè)示例的方案中，給予的(例如肌內(nèi)給予)腺病毒或mva載體的范圍是大約100μl至大約10ml含有大約104至大約1012個(gè)病毒顆粒/ml濃度的鹽水溶液。典型地，在一次給予期間給予人對(duì)象的腺病毒或mva載體的量為大約109至大約1012個(gè)病毒顆粒(vp)，更典型為大約1010至大約1012vp。最初接種之后如上述進(jìn)行加強(qiáng)。可例如給予范圍為大約0.001-30mg/kg體重的分離的hiv抗原性多肽。技術(shù)人員將意識(shí)到某些因素可影響有效治療對(duì)象需要的劑量，包括但不限于對(duì)象的疾病或病癥的嚴(yán)重度、先前的治療、一般狀況和/或年齡及存在的其它疾病。如果需要，所述組合物可以存在于試劑盒、包裝或分配器中，其可包含含有活性成分一或多個(gè)單位劑量形式。所述試劑盒例如可包含金屬或塑料箔，如泡罩包裝。所述試劑盒、包裝或分配器可以附有給藥說(shuō)明書。本發(fā)明的組合物可以單獨(dú)給予或者組合其它治療，根據(jù)治療的狀況及可以影響治療的其它因素同時(shí)或相繼給予。實(shí)施方案實(shí)施方案1是疫苗組合物，其在有需要的對(duì)象中誘導(dǎo)針對(duì)人免疫缺陷病毒(hiv)的免疫應(yīng)答，其包含：(i)第一組合物，其包含免疫有效量的編碼一或多個(gè)hiv抗原性多肽的一或多個(gè)表達(dá)載體及藥物可接受的運(yùn)載體；(ii)第二組合物，其包含免疫有效量的分離的抗原性多肽及藥物可接受的運(yùn)載體；和(iii)免疫有效量的編碼一或多個(gè)另外的抗原性多肽的一或多個(gè)另外的表達(dá)載體，其中第一和第二組合物之一用于引發(fā)免疫且另一組合物用于加強(qiáng)免疫，并且免疫有效量的另外的表達(dá)載體存在于第二組合物中或者在與第二組合物一起給予的第三組合物中用于引發(fā)或加強(qiáng)免疫。實(shí)施方案2是根據(jù)實(shí)施方案1的疫苗組合，其中分離的抗原性多肽包含hiv包膜糖蛋白。實(shí)施方案3是根據(jù)實(shí)施方案2的疫苗組合，其中分離的抗原性多肽包含穩(wěn)定化hivgp140三聚體。實(shí)施方案4是根據(jù)實(shí)施方案1-3任一項(xiàng)的疫苗組合，其中一或多個(gè)表達(dá)載體及一或多個(gè)另外的表達(dá)載體是腺病毒載體或mva載體。實(shí)施方案5是根據(jù)實(shí)施方案4的疫苗組合，其中一或多個(gè)表達(dá)載體是rad26載體及一或多個(gè)另外的表達(dá)載體是mva載體；一或多個(gè)表達(dá)載體是mva載體及一或多個(gè)另外的表達(dá)載體是rad26載體；或者一或多個(gè)表達(dá)載體是rad26載體及一或多個(gè)另外的表達(dá)載體也是rad26載體。實(shí)施方案6是根據(jù)實(shí)施方案1-5任一項(xiàng)的疫苗組合，其中一或多個(gè)表達(dá)載體及一或多個(gè)另外的表達(dá)載體編碼包含選自seqidno:1-4的氨基酸序列的一或多個(gè)hiv抗原性多肽。實(shí)施方案7是根據(jù)實(shí)施方案6的疫苗組合，其中一或多個(gè)表達(dá)載體是編碼包含選自seqidno:1-4的氨基酸序列的一或多個(gè)hiv抗原性多肽的rad26載體；分離的抗原性多肽包含seqidno:5或seqidno:6所示氨基酸序列；并且一或多個(gè)另外的表達(dá)載體是編碼包含選自seqidno:1-4的氨基酸序列的一或多個(gè)hiv抗原性多肽的mva載體。實(shí)施方案8是根據(jù)實(shí)施方案7的疫苗組合，其中第一組合物用于引發(fā)免疫，第二組合物和免疫有效量的一或多個(gè)另外的表達(dá)載體用于加強(qiáng)免疫。實(shí)施方案9是根據(jù)實(shí)施方案8的疫苗組合，其中免疫有效量的一或多個(gè)另外的表達(dá)載體存在于第三組合物中。實(shí)施方案10是根據(jù)實(shí)施方案9的疫苗組合，其中第一組合物包含編碼分別具有seqidno:1、seqidno:3和seqidno:4所示氨基酸序列的三個(gè)hiv抗原性多肽的rad26載體；分離的抗原性多肽包含具有seqidno:5所示氨基酸序列的穩(wěn)定化hivgp140三聚體；并且第三組合物包含編碼具有seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3和seqidno:4所示氨基酸序列的四個(gè)hiv抗原性多肽的mva載體。實(shí)施方案11是根據(jù)實(shí)施方案1-10任一項(xiàng)的疫苗組合，其中將所述疫苗組合給予對(duì)象誘導(dǎo)針對(duì)多個(gè)hiv進(jìn)化枝的免疫應(yīng)答。實(shí)施方案12是根據(jù)實(shí)施方案1-11任一項(xiàng)的疫苗組合，用于產(chǎn)生針對(duì)hiv感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答，其中第一組合物用于引發(fā)免疫應(yīng)答，第二組合物和免疫有效量的一或多個(gè)另外的表達(dá)載體用于加強(qiáng)免疫應(yīng)答。實(shí)施方案13是包含實(shí)施方案1-12任一項(xiàng)的疫苗組合的試劑盒。實(shí)施方案14是一種在需要的對(duì)象中誘導(dǎo)針對(duì)人免疫缺陷病毒(hiv)的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括：(i)給予對(duì)象第一組合物，其包含免疫有效量的編碼一或多個(gè)hiv抗原性多肽的一或多個(gè)表達(dá)載體及藥物可接受的運(yùn)載體；(ii)給予對(duì)象第二組合物，其包含免疫有效量的分離的抗原性多肽及藥物可接受的運(yùn)載體；和(iii)給予對(duì)象免疫有效量的編碼一或多個(gè)另外的hiv抗原性多肽的一或多個(gè)另外的表達(dá)載體，其中步驟(i)和(ii)以任一順序進(jìn)行，其中一個(gè)步驟用于引發(fā)免疫且另一個(gè)步驟用于加強(qiáng)免疫，并且所述免疫有效量的一或多個(gè)另外的表達(dá)載體存在于第二組合物中或者存在于與第二組合物一起給予的第三組合物中用于引發(fā)或加強(qiáng)免疫。實(shí)施方案15是根據(jù)實(shí)施方案14的方法，其中分離的抗原性多肽包含hiv包膜糖蛋白。實(shí)施方案16是根據(jù)實(shí)施方案15的方法，其中分離的抗原性多肽包含穩(wěn)定化的hivgp140三聚體。實(shí)施方案17是根據(jù)實(shí)施方案14-16任一項(xiàng)的方法，其中一或多個(gè)表達(dá)載體及一或多個(gè)另外的表達(dá)載體是腺病毒載體或mva載體。實(shí)施方案18是根據(jù)實(shí)施方案17的方法，其中一或多個(gè)表達(dá)載體是rad26載體及一或多個(gè)另外的表達(dá)載體是mva載體；一或多個(gè)表達(dá)載體是mva載體及一或多個(gè)另外的表達(dá)載體是rad26載體；或者一或多個(gè)表達(dá)載體是rad26載體及一或多個(gè)另外的表達(dá)載體也是rad26載體。實(shí)施方案19是根據(jù)實(shí)施方案14-18任一項(xiàng)的方法，其中一或多個(gè)表達(dá)載體和一或多個(gè)另外的表達(dá)載體編碼包含選自seqidno:1-4的氨基酸序列的一或多個(gè)hiv抗原性多肽。實(shí)施方案20是根據(jù)實(shí)施方案19的方法，其中一或多個(gè)表達(dá)載體是編碼包含選自seqidno:1-4的氨基酸序列的一或多個(gè)hiv抗原性多肽的rad26載體；分離的抗原性多肽包含seqidno:5或seqidno:6所示氨基酸序列；并且一或多個(gè)另外的表達(dá)載體是編碼包含選自seqidno:1-4的氨基酸序列的一或多個(gè)hiv抗原性多肽的mva載體。實(shí)施方案21是根據(jù)實(shí)施方案20的方法，其中第一組合物用于引發(fā)免疫，第二組合物和免疫有效量的一或多個(gè)另外的表達(dá)載體用于加強(qiáng)免疫。實(shí)施方案22是根據(jù)實(shí)施方案21的方法，其中免疫有效量的一或多個(gè)另外的表達(dá)載體存在于第三組合物中。實(shí)施方案23是根據(jù)實(shí)施方案22的方法，其中第一組合物包含編碼分別具有seqidno:1、seqidno:3和seqidno:4所示氨基酸序列的三個(gè)hiv抗原性多肽的rad26載體；分離的抗原性多肽包含具有seqidno:5所示氨基酸序列的穩(wěn)定化hivgp140三聚體，并且第三組合物包含編碼具有seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3和seqidno:4所示氨基酸序列的四個(gè)hiv抗原性多肽的mva載體。實(shí)施方案24是根據(jù)實(shí)施方案14-23任一項(xiàng)的方法，其中給予對(duì)象所述疫苗組合誘導(dǎo)針對(duì)多個(gè)hiv進(jìn)化枝的免疫應(yīng)答。實(shí)施方案25是在需要的對(duì)象中誘導(dǎo)針對(duì)人免疫缺陷病毒(hiv)的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括：(i)給予對(duì)象引發(fā)疫苗，其包含免疫有效量的編碼一或多個(gè)hiv抗原性多肽的一或多個(gè)表達(dá)載體及藥物可接受的運(yùn)載體；和(ii)給予對(duì)象加強(qiáng)疫苗，其包含免疫有效量的分離的抗原性多肽、免疫有效量的編碼一或多個(gè)另外的hiv抗原性多肽的一或多個(gè)另外的表達(dá)載體及藥物可接受的運(yùn)載體，其中分離的抗原性多肽及一或多個(gè)另外的表達(dá)載體存在于同一組合物或分開(kāi)的組合物中；并且其中加強(qiáng)疫苗在給予引發(fā)疫苗之后給予。實(shí)施方案26是根據(jù)實(shí)施方案25的方法，其中加強(qiáng)疫苗在初始給予引發(fā)疫苗之后大約22-26周首次給予。實(shí)施方案27是根據(jù)實(shí)施方案25或26的方法，進(jìn)一步包括在初始給予對(duì)象引發(fā)疫苗之后但是在首次給予加強(qiáng)疫苗之前再次給予引發(fā)疫苗。實(shí)施方案28是根據(jù)實(shí)施方案27的方法，其中在初始給予引發(fā)疫苗之后大約10-14周再次給予引發(fā)疫苗。實(shí)施方案29是根據(jù)實(shí)施方案25-28任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括再次給予對(duì)象加強(qiáng)疫苗。實(shí)施方案30是根據(jù)實(shí)施方案29的方法，其中在前次給予加強(qiáng)疫苗之后大約22-26周再次給予加強(qiáng)疫苗。實(shí)施方案31是根據(jù)實(shí)施方案25-30任一項(xiàng)的方法，其中一或多個(gè)表達(dá)載體是rad26載體及一或多個(gè)另外的表達(dá)載體是mva載體；一或多個(gè)表達(dá)載體是mva載體及一或多個(gè)另外的表達(dá)載體是rad26載體；或者一或多個(gè)表達(dá)載體是rad26載體及一或多個(gè)另外的表達(dá)載體也是rad26載體。實(shí)施方案32是根據(jù)實(shí)施方案25-30任一項(xiàng)的方法，其中一或多個(gè)表達(dá)載體是編碼包含選自seqidno:1-4的氨基酸序列的一或多個(gè)hiv抗原性多肽的rad26載體；其中分離的抗原性多肽包含seqidno:5或seqidno:6所示氨基酸序列；并且一或多個(gè)另外的表達(dá)載體是編碼包含選自seqidno:1-4的氨基酸序列的一或多個(gè)hiv抗原性多肽的rad26載體或mva載體。實(shí)施方案33是根據(jù)實(shí)施方案32的方法，其中一或多個(gè)另外的表達(dá)載體是rad26載體。實(shí)施方案34是根據(jù)實(shí)施方案32的方法，其中一或多個(gè)另外的表達(dá)載體是mva載體。實(shí)施方案35是根據(jù)實(shí)施方案25的方法，其中加強(qiáng)疫苗在初始給予引發(fā)疫苗之后大約8-12周首次給予，以及在初始給予引發(fā)疫苗之后大約24周再次給予。實(shí)施方案36是根據(jù)實(shí)施方案35的方法，其中引發(fā)疫苗進(jìn)一步包含免疫有效量的分離的hiv抗原性多肽，其中分離的hiv抗原性多肽存在于同一組合物中或者在分開(kāi)的組合物中。實(shí)施方案37是根據(jù)實(shí)施方案34-35任一項(xiàng)的方法，其中一或多個(gè)表達(dá)載體是編碼一或多個(gè)hiv抗原性多肽序列的rad26載體，所述hiv抗原性多肽序列優(yōu)選包含選自seqidno:1-4的氨基酸序列，其中分離的抗原性多肽是hiv包膜糖蛋白，優(yōu)選包含seqidno:5或seqidno:6所示氨基酸序列，并且一或多個(gè)另外的表達(dá)載體是編碼一或多個(gè)hiv抗原性多肽序列的rad26或mva載體，所述hiv抗原性多肽序列優(yōu)選包含選自seqidno:1-4的氨基酸序列。實(shí)施方案38是根據(jù)實(shí)施方案37的方法，其中一或多個(gè)表達(dá)載體是編碼seqidno:1、3和4所示hiv抗原性多肽序列的rad26載體；以及一或多個(gè)另外的表達(dá)載體是編碼seqidno:1、3和4所示hiv抗原性多肽序列的rad26載體。實(shí)施方案39是在需要的對(duì)象中誘導(dǎo)針對(duì)人免疫缺陷病毒(hiv)的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括：(i)給予對(duì)象引發(fā)疫苗，其包含免疫有效量的編碼seqidno:1、3和4所示hiv抗原性多肽的一或多個(gè)rad26表達(dá)載體及藥物可接受的運(yùn)載體；和(ii)給予對(duì)象加強(qiáng)疫苗，其包含免疫有效量的包含seqidno:5或seqidno:6所示氨基酸序列的分離的hiv包膜糖蛋白及藥物可接受的運(yùn)載體；并且其中加強(qiáng)疫苗在給予引發(fā)疫苗之后給予。實(shí)施方案40是根據(jù)實(shí)施方案39的方法，其中加強(qiáng)疫苗包含佐劑、優(yōu)選鋁鹽，更優(yōu)選磷酸鋁。實(shí)施方案41是根據(jù)實(shí)施方案39或40的方法，其中加強(qiáng)疫苗中的分離的hiv包膜糖蛋白包含seqidno:5所示氨基酸序列。實(shí)施方案42是根據(jù)實(shí)施方案39-41任一項(xiàng)的方法，其中第二引發(fā)疫苗在步驟(i)之后及在步驟(ii)之前給予對(duì)象，所述第二引發(fā)疫苗包含免疫有效量的編碼seqidno:1、3和4所示hiv抗原性多肽的一或多個(gè)rad26表達(dá)載體及藥物可接受的運(yùn)載體。實(shí)施方案43是根據(jù)實(shí)施方案39-42任一項(xiàng)的方法，其中進(jìn)一步的加強(qiáng)疫苗在步驟(ii)之后給予對(duì)象，所述進(jìn)一步的加強(qiáng)疫苗包含免疫有效量的包含seqidno:5或seqidno:6、優(yōu)選seqidno:5所示氨基酸序列的分離的hiv包膜糖蛋白及藥物可接受的運(yùn)載體。實(shí)施方案44是根據(jù)實(shí)施方案39-43任一項(xiàng)的方法，其中免疫有效量的包含seqidno:5所示氨基酸序列的分離的hiv包膜糖蛋白是250μg。實(shí)施方案45是根據(jù)實(shí)施方案39-44任一項(xiàng)的方法，其中免疫有效量的編碼seqidno:1、3和4所示hiv抗原性多肽的一或多個(gè)rad26表達(dá)載體由包含三個(gè)rad26載體組成，第一個(gè)載體編碼seqidno:1所示hiv抗原性多肽，第二個(gè)載體編碼seqidno:3所示hiv抗原性多肽，以及第三個(gè)載體編碼seqidno:4所示hiv抗原性多肽，其中三個(gè)rad26表達(dá)載體的給予總劑量為5×1010vp。如下本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明的性質(zhì)。應(yīng)理解如下實(shí)施例不限制本發(fā)明，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書確定。實(shí)施例實(shí)施例1：在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中研究hiv疫苗方案進(jìn)行動(dòng)物研究以鑒別多價(jià)hiv-1疫苗方案以進(jìn)行持續(xù)試制。所述研究檢測(cè)了使用兩次引發(fā)免疫(在第0周和12周)及第一次加強(qiáng)免疫(在第24周)的延長(zhǎng)接種時(shí)間方案。第二次加強(qiáng)免疫在第52周給予。特別地，所述研究檢測(cè)了使用腺病毒或mva載體與包膜糖蛋白的組合在異源疫苗組合中的影響。體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答在接種的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(也稱作nhp)中檢測(cè)。接種和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)使用四個(gè)不同的疫苗平臺(tái)接種獼猴(macacamulatta)(nhp)，每組12只動(dòng)物(組ii-v)，兩個(gè)對(duì)照組(組i和vi)也具有12只動(dòng)物/組。第一個(gè)對(duì)照組(組i)接受表達(dá)hiv-1嵌合env1(seqidno:1)、嵌合gagpol1(seqid:no3)和嵌合gagpol2(seqidno:4)基因而無(wú)任何分離的hiv抗原性蛋白質(zhì)的ad26載體的引發(fā)和加強(qiáng)疫苗。ad26載體分別稱作“ad26.mos1env”、“ad26.mos1gag-pol”和“ad26.mos2gag-pol”，統(tǒng)稱為“ad26mos”。第二個(gè)對(duì)照組(組vi)僅接受安慰劑(“sham”)引發(fā)和加強(qiáng)疫苗。除了組vi之外的所有組均在第0周和第12周接受兩次ad26mos引發(fā)疫苗，隨后在第24周接受第一次加強(qiáng)疫苗。隨后的加強(qiáng)疫苗在第52周給予。特別地，ii組接受兩次ad26mos引發(fā)疫苗，隨后接受兩次加強(qiáng)疫苗，使用250μg進(jìn)化枝cenvgp140三聚體蛋白(seqidno:5)及佐劑磷酸鋁(后文稱作“gp140藥物產(chǎn)品”或者“gp140dp”)。iii組接受兩次引發(fā)疫苗ad26mos，隨后接受兩次加強(qiáng)疫苗，即共同給予的ad26mos與gp140dp。iv組接受兩次ad26mos引發(fā)疫苗，隨后接受兩次加強(qiáng)疫苗，即含有兩個(gè)不同mva載體的組合物，一個(gè)mva載體表達(dá)嵌合env1基因(seqidno:1)和嵌合gagpol1基因(seqidno:3)，另一個(gè)mva載體表達(dá)嵌合env2基因(seqidno:2)和嵌合gagpol2基因(seqidno:4)，所述基因位于載體上分開(kāi)的位置。所述mva載體稱作“mva.mos1env/gag-pol”和“mva.mos2env/gag-pol”，統(tǒng)稱為“mvamos”。v組接受兩次引發(fā)疫苗ad26mos，隨后接受兩次加強(qiáng)疫苗，即共同給予mvamos和gp140dp。在nhp上檢測(cè)的疫苗方案在下表1a中概括示出。表1a：在nhp上檢測(cè)的疫苗方案組0周12周24周52周組iad26mos1ad26mosad26mosad26mos組iiad26mosad26mosgp140dp3gp140dp組iiiad26mosad26mosad26mos+gp140dpad26mos+gp140dp組ivad26mosad26mosmvamos2mvamos組vad26mosad26mosmvamos+gp140dpmvamos+gp140dp組vishamshamshamsham1ad26mos＝ad26.mos1gag-pol+ad26.mos1env+ad26.mos2gag-pol(總共5x1010vp)2mvamos＝mva.mos1env/gag-pol+mva.mos2env/gag-pol(總共1x108pfu)3gp140dp＝通過(guò)即時(shí)混合制備的純化的進(jìn)化枝cenvgp140三聚體蛋白與佐劑(250μg蛋白質(zhì)+0.425mg磷酸鋁)對(duì)取自根據(jù)表1a所述方案在初始給予引發(fā)疫苗之后在28周和/或54/56周的處理的nhp的樣品進(jìn)行如下初始核心測(cè)定實(shí)驗(yàn)，包括elisa結(jié)合抗體測(cè)定、抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用(adcp)測(cè)定及elispot測(cè)定。在第72周進(jìn)行猿猴/人免疫缺陷病毒(shiv)攻擊實(shí)驗(yàn)。elisa結(jié)合抗體(ab)測(cè)定hiv-1特異性體液應(yīng)答在第28和56周通過(guò)修改的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)確定。96孔平底平板(nunc)的一列孔用100μl/孔的在10ml的1×dulbecco’s磷酸鹽緩沖鹽水(dpbs)(gibco/lifetechnologies)中稀釋的10μg進(jìn)化枝c(c97za.012)gp140包被蛋白(seqidno:5)或者10μg嵌合1蛋白質(zhì)(seqidno:6)包被，在4℃保溫過(guò)夜。來(lái)自先前研究的已知陽(yáng)性血清樣品用作陽(yáng)性對(duì)照，預(yù)接種(pre-vaccination)血清樣品用作陰性對(duì)照。將平板用200μl的elisawash(1000mlpbs(1×)和0.5mltween20(sigma))洗滌一次。將孔用250μl封閉液(在pbs中blockercasein(pierce))封閉并在室溫保溫3-4小時(shí)。在保溫后，棄去封閉液。然后，在每個(gè)平板的第一列的孔中加入150μl封閉液和6μl樣品血清，在所有其它孔中加入100μl封閉液。然后沿著平板系列稀釋50μl至100μl封閉液，從最終列棄去50μl，由此每個(gè)孔具有100μl樣品。將平板在室溫保溫1小時(shí)。棄去孔的內(nèi)容物，然后將孔用200μl的elisawash洗滌3次。然后，在每個(gè)孔中加入在封閉液中的100μl的1:2000二級(jí)抗體peroxidase-affinipure山羊抗人igg(jacksonimmunoresearchlabs)。將平板再次在室溫保溫1小時(shí)及用elisawash洗滌3次。將孔用100μl的serubluetmbmicrowellsolution(kpllaboratories)顯色，在使用100μl的tmbstopsolution(kplresearchproducts)之后0.5分鐘終止顯色。將平板在elisa平板讀器上在450nm和550nm讀數(shù)(moleculardevices-versamax，及softmaxpro4.7.1軟件)。使用如下等式(i)計(jì)算elisaec90滴度，其中變量得自通過(guò)softmaxpro產(chǎn)生的四參數(shù)曲線擬合：其中h表示斜率，f表示應(yīng)答百分比。使用關(guān)于jointranking的dunn方法，通過(guò)與對(duì)照組非參數(shù)比較進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，具有最高幾何平均數(shù)滴度的組分別定義為對(duì)照組。進(jìn)化枝cgp140(c97)和嵌合1(mos1)elisa測(cè)定實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在圖1a(28周)和圖1b(56周)中概括示出。進(jìn)化枝cgp140env和嵌合1env抗原顯示無(wú)偏差的良好相關(guān)性(數(shù)據(jù)未示出)?？贵w依賴性細(xì)胞吞噬作用(adcp)測(cè)定使用純化自在第28周從處理的nhp獲得的血清樣品的免疫球蛋白g抗體(igg)測(cè)量功能性非中和抗體應(yīng)答。使用melongel柱(thermoscientific)純化igg并使用nanodrop分光光度計(jì)(thermoscientific)量化。如以其全文并入本文作參考的ackermanetal.(2011)(arobust,high-throughputassaytodeterminethephagocyticactivityofclinicalantibodysamples.j.immunol.methods366,8-19)所述進(jìn)行adcp測(cè)定。更特別地，將進(jìn)化枝c(c97)env(seqidno:5)和嵌合m(mos1)(seqidno:6)env生物素?；目乖c1μm黃綠色熒光中性抗生物素蛋白珠(invitrogen)保溫過(guò)夜。然后洗滌該珠并以終稀釋度1:100重懸浮于磷酸鹽緩沖液鹽水-牛血清白蛋白(pbs-bsa)中。將純化自血清樣品的抗體和9×105抗原標(biāo)記的珠在圓底96孔平板中混合，將該平板保溫2小時(shí)。然后將得自急性髓性白血病的人單個(gè)核細(xì)胞(thp-1細(xì)胞，2×104個(gè)細(xì)胞)加入每個(gè)孔中，終體積為200μl，將平板保溫過(guò)夜。第二天，除去一半的培養(yǎng)體積，用100μl的4％多聚甲醛替換，之后將平板在裝備了hts平板讀器的bdlsrii流式細(xì)胞分析儀上分析。為了進(jìn)行分析，將樣品門控活細(xì)胞，并確定thp-1細(xì)胞吞噬作用珠的比例。如下計(jì)算吞噬作用得分：(陽(yáng)性珠百分比)×(陽(yáng)性珠平均熒光強(qiáng)度)。在第28周進(jìn)行adcp測(cè)定獲得的結(jié)果在圖2中概括示出，結(jié)果示出個(gè)體動(dòng)物的吞噬作用得分應(yīng)答。使用關(guān)于jointranking的dunn方法對(duì)所有配對(duì)通過(guò)非參數(shù)比較進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。進(jìn)化枝cgp140env和嵌合menv抗原展示無(wú)偏差的良好相關(guān)性，這與上述elisa及下文描述的中和抗體(nab)測(cè)定的結(jié)果一致。中和抗體(nab)測(cè)定在tzm.bl細(xì)胞中使用基于熒光素酶的病毒中和測(cè)定測(cè)量針對(duì)第1級(jí)(tier1)hivenv假病毒的中和抗體(nab)應(yīng)答。特別地，在第1級(jí)的病毒包括mw965.26(進(jìn)化枝c)、sf162.ls(進(jìn)化枝b)、mn-3(進(jìn)化枝a)、dj263.8(進(jìn)化枝a)和bal.26(進(jìn)化枝b)。簡(jiǎn)而言之，將96孔平底平板用得自在第56周的nhp的血清樣品包被，制備在100μl的10％dulbecco’smodifiedeaglemedium(dmem)中三倍系列稀釋的血清樣品。然后，在每個(gè)孔中加入體積為50μl的200tcid50病毒(組織培養(yǎng)感染劑量，或者在50％接種的細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生病理學(xué)改變的致病物質(zhì)的量)。將平板在37℃保溫1小時(shí)。然后加入1×104個(gè)細(xì)胞/孔的tzm.bl細(xì)胞，在100μl體積的含有deae-葡聚糖終濃度為11μg/ml的10％dmem(sigma)中。ic50以與未稀釋的病毒對(duì)照組相比在減去細(xì)胞對(duì)照相關(guān)發(fā)光單位(無(wú)病毒存在的tzm.bl細(xì)胞)之后導(dǎo)致相關(guān)發(fā)光單位降低50％的血清稀釋度計(jì)算。圖3示出在56周得自nhp的樣品中針對(duì)mw965.26(進(jìn)化枝c)、sf162.ls(進(jìn)化枝b)、mn-3(進(jìn)化枝a)、dj263.8(進(jìn)化枝a)和bal.26(進(jìn)化枝b)的hiv-1第1級(jí)tzm-bl中和測(cè)定的結(jié)果。符號(hào)表示檢測(cè)的個(gè)體動(dòng)物的log10轉(zhuǎn)化的id50滴度，組幾何平均滴度以水平線表示。nab測(cè)定的結(jié)果與elisa測(cè)定的結(jié)果一致。elispot測(cè)定如前以其全文并入本文作參考的liuetal.,2009,nature457:87-91所述通過(guò)ifn-γelispot測(cè)定評(píng)估hiv-1特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。elispot測(cè)定利用覆蓋總體潛在的人t細(xì)胞表位的hiv-1潛在t細(xì)胞表位(pte)肽的集合。在早期研究中，細(xì)胞免疫寬度分析利用覆蓋每個(gè)抗原的10-16個(gè)肽的子集，隨后使用各個(gè)肽進(jìn)行表位作圖，基本上如我們先前在barouchetal.,2010,nat.med.16:319-323[54]中所報(bào)道，所述文獻(xiàn)以其全文并入本文作參考。表位特異性cd8+和cd4+t淋巴細(xì)胞應(yīng)答通過(guò)細(xì)胞耗竭研究確定。簡(jiǎn)而言之，經(jīng)處理的nhp的免疫原性在第54周獲得的樣品中通過(guò)ifn-γelispot測(cè)定使用pte肽集合進(jìn)行評(píng)估。用pte肽集合刺激周圍血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)，及在保溫后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌、標(biāo)記及顯色以顯現(xiàn)斑點(diǎn)形成細(xì)胞。以平均斑點(diǎn)形成單位(sfu)/106個(gè)pbmc表示的elispot測(cè)定的結(jié)果在圖4中示出。研究結(jié)論如上述動(dòng)物研究結(jié)果及圖1-4示出，在引發(fā)-加強(qiáng)組合中rad載體和/或mva載體與分離的抗原性多肽的組合可用于在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中產(chǎn)生廣泛的hiv特異性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。特別地，證實(shí)了在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中在一或多次加強(qiáng)免疫中摻入gp140蛋白在產(chǎn)生廣泛hiv特異性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答中的用途。此外，檢測(cè)的所有疫苗接種方案在所有免疫的動(dòng)物(組ii-v)中均示出免疫原性。特別地，給予表達(dá)一或多個(gè)hiv-1抗原的一或多個(gè)rad26載體(第0周和第12周)，隨后在第24周和52周用rad26載體或mva載體及分離的進(jìn)化枝cgp140蛋白質(zhì)加強(qiáng)免疫，導(dǎo)致對(duì)于hiv-1有效的加強(qiáng)體液應(yīng)答，通過(guò)elisa和adcp測(cè)定結(jié)果示出(見(jiàn)圖1a、1b和2，特別是組iii(標(biāo)示為ad26/ad26+env)及組v(標(biāo)示為ad26/mva+env))。此外，給予一或多個(gè)rad26載體，隨后在第24周和52周用有或無(wú)進(jìn)化枝cgp140蛋白的mva載體加強(qiáng)免疫，通過(guò)elispot測(cè)定測(cè)量能顯著增加細(xì)胞免疫應(yīng)答(見(jiàn)圖4，特別是組iv(標(biāo)示為ad26/mva)和組v(標(biāo)示為ad26/mva+env))。實(shí)施例2：在人體中hiv疫苗方案的研究在健康的未感染hiv的成年男性和女性中進(jìn)行如下多中心、隨機(jī)的、平行組、安慰劑對(duì)照的、雙盲臨床研究：1/2a期研究以評(píng)估同源ad26嵌合載體疫苗接種方案或者ad26嵌合及mva嵌合異源載體載體疫苗接種方案的安全性/耐受性和免疫原性，使用高劑量、低劑量或者無(wú)進(jìn)化枝cgp140蛋白加佐劑進(jìn)行hiv預(yù)防。這項(xiàng)研究在進(jìn)行中。總體原則進(jìn)行研究以評(píng)估7個(gè)引發(fā)-加強(qiáng)免疫接種方案的安全性/耐受性和免疫原性。對(duì)象接受四劑研究疫苗：在第0周和第12周給予ad26mos或安慰劑；及在第24周和48周給予ad26mos或mvamos，均有或無(wú)糖蛋白140藥物產(chǎn)品(低或高劑量)，或者僅給予安慰劑。使用的研究疫苗是如下所述的ad26mos、mvamos和gp140dp(也見(jiàn)實(shí)施例1)：(i)ad26mos由在同一小瓶中提供及以2:1:1比率給予的如下三個(gè)疫苗產(chǎn)物組成：ad26.mos1env、ad26.mos1gag-pol和ad26.mos2gag-pol，其分別表達(dá)hiv-1嵌合env1(seqidno:1)、嵌合gagpol1(seqid:no3)及嵌合gagpol2(seqidno:4)基因；(ii)mvamos由在單獨(dú)的小瓶中提供及以1:1比率給予的如下兩個(gè)疫苗產(chǎn)物組成：mva-嵌合1(表達(dá)具有seqidno:1和3序列的嵌合1hiv-1gag、pol和env蛋白的mva病毒)和mva-嵌合2(表達(dá)具有seqidno:2和4序列的嵌合2hiv-1gag、pol和env蛋白的mva病毒)；及(iii)gp140藥物產(chǎn)品含有hiv-1進(jìn)化枝c糖蛋白140(具有seqidno:5序列的重組三聚體gp140)，通過(guò)構(gòu)建為產(chǎn)生gp140的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系產(chǎn)生。在這項(xiàng)研究中，gp140藥物產(chǎn)品與作為佐劑的磷酸鋁一起給予，給予的gp140藥物產(chǎn)品簡(jiǎn)稱為“gp140dp”。目的這項(xiàng)研究的主要目的包括(1)評(píng)估含有ad26mos、mvamos和/或gp140dp成分的各種引發(fā)-加強(qiáng)接種方案的安全性/耐受性，及(2)比較不同疫苗接種方案之間的hivenv結(jié)合抗體應(yīng)答。這項(xiàng)研究的第二個(gè)目的包括評(píng)估其它抗體結(jié)合、抗體效應(yīng)子功能和抗體鑒定，以及細(xì)胞應(yīng)答。這項(xiàng)研究的探究性研究目的包括(1)探究在一亞組對(duì)象的粘膜分泌物中的對(duì)不同疫苗接種方案的免疫應(yīng)答；(2)探究不同的疫苗接種方案之間的基因表達(dá)模式；及(3)探究針對(duì)ad26抗體的中和抗體。接種與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所述研究包括48周接種時(shí)期，期間在基線(第0周)、12周和24周接種對(duì)象，及在第48周加強(qiáng)免疫接種，48-周隨訪期至在第96周的最終訪問(wèn)。如表1b所示給予接種，在特定臨床門診取血樣以評(píng)估免疫應(yīng)答?；诘?8周的數(shù)據(jù)分析，隨后選擇接受隨機(jī)化方案的對(duì)象持續(xù)長(zhǎng)期隨訪(在第96周后大約2年)以進(jìn)行進(jìn)一步研究。如果第28周數(shù)據(jù)是不確定的，則在方案選擇中考慮第52周數(shù)據(jù)。在不能明確確定的情況中，這種延長(zhǎng)的隨訪期可包括一組以上的對(duì)象，以評(píng)估免疫應(yīng)答的持續(xù)性。研究結(jié)束是對(duì)對(duì)象的最后一次訪問(wèn)。表1b：在人體檢測(cè)的疫苗接種方案*adj是(無(wú)菌磷酸鋁濕凝膠懸浮液；用作gp140的佐劑；鋁含量為0.425mg/0.5ml劑；50μg(低劑量)和250μg(高劑量)是指gp140蛋白的總蛋白質(zhì)含量。劑量和給予根據(jù)隨機(jī)化在四個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)象接受研究疫苗劑，在第0周的第一天、第12周和第24周及在第48周加強(qiáng)，通過(guò)在三角肌肌內(nèi)注射給予。對(duì)于僅注射一次的觀測(cè)(即在第0周和12周)，可以使用任一三角肌注射。當(dāng)在一次觀測(cè)時(shí)給予兩次研究疫苗注射時(shí)(即第24周和48周)，每次注射使用不同的三角肌(醫(yī)學(xué)指征允許除外)。給予的研究疫苗的劑量如下所示：(i)ad26mos(ad26.mos1env+ad26.mos1gag-pol+ad26.mos2gag-pol)：總劑量為5×1010病毒顆粒(vp)/0.5ml注射(ii)mvamos(mva-嵌合1+mva-嵌合2)：總劑量為108噬斑形成單位(pfu)/0.5ml注射(iii)gp140dp：低劑量：每0.5ml注射液中50μggp140dp總蛋白質(zhì)，混合藥用磷酸鋁佐劑(0.425mg鋁)，高劑量：每0.5ml注射液中250μggp140dp總蛋白質(zhì)，混合藥用磷酸鋁佐劑(0.425mg鋁)。(iv)安慰劑：0.9％鹽水，0.5ml注射液免疫原性評(píng)估進(jìn)行評(píng)估體液免疫應(yīng)答的測(cè)定，包括但不限于：env特異性血清結(jié)合抗體測(cè)定、nab測(cè)定及抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用(adcp)測(cè)定，以及表位作圖(見(jiàn)表2)。表2：體液免疫應(yīng)答測(cè)定adcp＝抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用；elisa＝酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定；gmt＝幾何平均數(shù)滴度；ig＝免疫球蛋白；mo＝月；nab＝中和抗體；vac＝接種；a根據(jù)對(duì)抗體介導(dǎo)的中和作用的敏感性的hiv-1病毒分類：極高(1a級(jí))，高于平均(1b級(jí))，中等(2級(jí))，或者低(3級(jí))1。如果1級(jí)示出陽(yáng)性結(jié)果則僅評(píng)估2級(jí)。進(jìn)行評(píng)估細(xì)胞免疫應(yīng)答的測(cè)定，包括但限于：elispot、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，及多參數(shù)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)(見(jiàn)表3)。表3：t細(xì)胞免疫應(yīng)答測(cè)定elispot＝酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定；hla＝人白細(xì)胞抗原；ifnγ＝干擾素γ；il-2＝白細(xì)胞介素2；mo＝月；pbmc＝周圍血單個(gè)核細(xì)胞；tnfα＝腫瘤壞死因子α；vac＝接種。注意：hla僅檢測(cè)一次(使用基線血樣)實(shí)施例3：在人體中進(jìn)一步研究hiv疫苗接種方案在人體中進(jìn)行進(jìn)一步臨床研究以評(píng)估在健康未感染hiv的對(duì)象中使用表達(dá)嵌合hiv抗原的rad26載體和分離的進(jìn)化枝cgp140三聚體蛋白的不同疫苗接種方案的安全性/耐受性和免疫原性。特別地，與實(shí)施例2所述研究對(duì)比，檢測(cè)較短時(shí)間的方案和較少劑量的方案。優(yōu)化疫苗接種方案可以增加對(duì)完整方案的順應(yīng)性和/或便于使用及易于給予。接種和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在健康的未感染hiv的18-50歲的成年男性和女性中進(jìn)行單中心的、隨機(jī)的、平行組、安慰劑對(duì)照的、雙盲1期臨床研究。這項(xiàng)研究中由36個(gè)目標(biāo)人對(duì)象參與。將對(duì)象分成三組(組1-3)，每組隨機(jī)12個(gè)對(duì)象。將每組的對(duì)象進(jìn)一步隨機(jī)分成兩個(gè)亞組：亞組a(10個(gè)對(duì)象)和亞組b(2個(gè)對(duì)象)。亞組a中的對(duì)象接受研究疫苗，亞組b的對(duì)象接受安慰劑。不考慮對(duì)象的基線ad26血清陽(yáng)性率，均注冊(cè)于研究中。所述研究包括48周最大接種時(shí)期，及直至72周的接種后隨訪期。對(duì)象根據(jù)下表4所示方案接受研究疫苗或安慰劑。見(jiàn)實(shí)施例2關(guān)于用于研究中的疫苗組合物的描述。表4：在研究中給予研究疫苗的方案組1表示“基本情況”方案，其允許這項(xiàng)研究與實(shí)施例2中的研究的數(shù)據(jù)橋連。在第0、12、24和48周給予組1中的對(duì)象四次接種，這是與實(shí)施例2的研究中的組1中的對(duì)象相同劑量方案(見(jiàn)實(shí)施例2中表1b)。在24周內(nèi)組2和3接受三次接種(組2：第0、12和24周；組3：第0、8和24周)。在特定臨床門診取血樣以評(píng)估免疫應(yīng)答。更特別地，組2探究一種較短的更便利的方案，與“基本情況”不同，這不需要對(duì)象返回臨床門診在第48周后期加強(qiáng)接種。組3檢驗(yàn)了rad26載體引發(fā)與完整方案在性質(zhì)上相似的應(yīng)答的能力，在24周后由于在第二次接種給予額外劑量的gp140dp而獲得超過(guò)“基本情況”方案的水平的免疫原性水平。一旦所有對(duì)象在第28周完成或較早停止接種，進(jìn)行期中分析(盲)。一旦所有對(duì)象在第52周完成或較早停止接種，進(jìn)行初始分析(非盲)。一旦所有對(duì)象在第72周完成其最終研究，進(jìn)行最終分析。實(shí)施例4：在人體中對(duì)hiv疫苗接種方案的另外研究也進(jìn)行在人體中的進(jìn)一步臨床研究以評(píng)估在健康的未感染hiv的對(duì)象中使用mva載體和進(jìn)化枝cgp140三聚體蛋白的不同的疫苗接種方案的安全性/耐受性和免疫原性，其中檢測(cè)了與實(shí)施例2中的研究相比較短給予時(shí)間方案和較少劑量方案。對(duì)象根據(jù)下表5所述方案接受研究疫苗或安慰劑。研究中使用的疫苗組合物如實(shí)施例2所述。將研究參與者如實(shí)施例3中的研究所述隨機(jī)分組。表5：在研究中給予研究疫苗的方案第一粗(組1)再次表示“基本情況”方案，其允許這項(xiàng)研究與實(shí)施例2的研究的數(shù)據(jù)橋連。在第0、12、24和48周給予對(duì)象四次接種，這與實(shí)施例2的研究中組4的對(duì)象接受的劑量方案相同(見(jiàn)實(shí)施例2中表1b)。其它組(組2和3)接受較短時(shí)間方案，在第0、8或12周及24周接種。這項(xiàng)研究中的引發(fā)是使用ad26載體，加強(qiáng)是使用mva載體。這些方案的可能的優(yōu)勢(shì)包括與組1的方案(共48周)相比更加便利及更短時(shí)間(共24周)。在特定的臨床門診取血樣以評(píng)估免疫應(yīng)答。應(yīng)理解本文描述的實(shí)施例和實(shí)施方案只是例證本發(fā)明，在不偏離本發(fā)明精神的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施方案進(jìn)行改變。因此應(yīng)理解本發(fā)明不限于所揭示的特定實(shí)施方案，而是涵蓋在所附權(quán)利要求書限定的本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的修改。參考文獻(xiàn)1.gurwith,m.,etal.,safetyandimmunogenicityofanoral,replicatingadenovirusserotype4vectorvaccineforh5n1influenza:arandomised,double-blind,placebo-controlled,phase1study.lancetinfectdis,2013.13(3):p.238-50.2.centersfordisease,control,andprevention,vitalsigns:hivpreventionthroughcareandtreatment--unitedstates.mmwrmorbmortalwklyrep,2011.60(47):p.1618-23.3.centlivre,m.,etal.,inhiv-1pathogenesisthedieiscastduringprimaryinfection.aids,2007.21(1):p.1-11.4.wawer,m.j.,etal.,ratesofhiv-1transmissionpercoitalact,bystageofhiv-1infection,inrakai,uganda.jinfectdis,2005.191(9):p.1403-9.5.flynn,n.m.,etal.,placebo-controlledphase3trialofarecombinantglycoprotein120vaccinetopreventhiv-1infection.jinfectdis,2005.191(5):p.654-65.6.pitisuttithum,p.,etal.,randomized,double-blind,placebo-controlledefficacytrialofabivalentrecombinantglycoprotein120hiv-1vaccineamonginjectiondrugusersinbangkok,thailand.jinfectdis,2006.194(12):p.1661-71.7.gray,g.e.,etal.,safetyandefficacyofthehvtn503/phambilistudyofaclade-b-basedhiv-1vaccineinsouthafrica:adouble-blind,randomised,placebo-controlledtest-of-conceptphase2bstudy.lancetinfectdis,2011.11(7):p.507-15.8.buchbinder,s.p.,etal.,efficacyassessmentofacell-mediatedimmunityhiv-1vaccine(thestepstudy):adouble-blind,randomised,placebo-controlled,test-of-concepttrial.lancet,2008.372(9653):p.1881-93.9.rerks-ngarm,s.,etal.,vaccinationwithalvacandaidsvaxtopreventhiv-1infectioninthailand.nengljmed,2009.361(23):p.2209-20.10.mcelrath,m.j.,etal.,hiv-1vaccine-inducedimmunityinthetest-of-conceptstepstudy:acase-cohortanalysis.lancet,2008.372(9653):p.1894-905.11.abbink,p.,etal.,comparativeseroprevalenceandimmunogenicityofsixrareserotyperecombinantadenovirusvaccinevectorsfromsubgroupsbandd.jvirol,2007.81(9):p.4654-63.12.vogels,r.,etal.,replication-deficienthumanadenovirustype35vectorsforgenetransferandvaccination:efficienthumancellinfectionandbypassofpreexistingadenovirusimmunity.jvirol,2003.77(15):p.8263-71.13.farina,s.f.,etal.,replication-defectivevectorbasedonachimpanzeeadenovirus.jvirol,2001.75(23):p.11603-13.14.barouch,d.h.,etal.,internationalseroepidemiologyofadenovirusserotypes5,26,35,and48inpediatricandadultpopulations.vaccine,2011.29:p.5203-5209.15.mast,t.c.,etal.,internationalepidemiologyofhumanpre-existingadenovirus(ad)type-5,type-6,type-26andtype-36neutralizingantibodies:correlatesofhighad5titersandimplicationsforpotentialhivvaccinetrials.vaccine,2010.28(4):p.950-7.16.chen,h.,etal.,adenovirus-basedvaccines:comparisonofvectorsfromthreespeciesofadenoviridae.jvirol,2010.84(20):p.10522-32.17.thorner,a.r.,etal.,agedependenceofadenovirus-specificneutralizingantibodytitersinindividualsfromsub-saharanafrica.jclinmicrobiol,2006.44(10):p.3781-3.18.sprangers,m.c.,etal.,quantifyingadenovirus-neutralizingantibodiesbyluciferasetransgenedetection:addressingpreexistingimmunitytovaccineandgenetherapyvectors.jclinmicrobiol,2003.41(11):p.5046-52.19.waddington,s.n.,etal.,adenovirusserotype5hexonmediateslivergenetransfer.cell,2008.132(3):p.397-409.20.liu,j.,etal.,magnitudeandphenotypeofcellularimmuneresponseselicitedbyrecombinantadenovirusvectorsandheterologousprime-boostregimensinrhesusmonkeys.jvirol,2008.82(10):p.4844-52.21.liu,j.,etal.,immunecontrolofansivchallengebyat-cell-basedvaccineinrhesusmonkeys.nature,2009.457(7225):p.87-91.22.lore,k.,etal.,myeloidandplasmacytoiddendriticcellsaresusceptibletorecombinantadenovirusvectorsandstimulatepolyfunctionalmemorytcellresponses.jimmunol,2007.179(3):p.1721-9.23.unpublished,barouch.etal.24.barouchetal.,.inaidsvaccine.2009.paris,france.25.kuschner,r.a.,etal.,aphase3,randomized,double-blind,placebo-controlledstudyofthesafetyandefficacyofthelive,oraladenovirustype4andtype7vaccine,inu.s.militaryrecruits.vaccine,2013.31(28):p.2963-71.26.masopust,d.andl.j.picker,hiddenmemories:frontlinememorytcellsandearlypathogeninterception.jimmunol,2012.188(12):p.5811-7.27.bell,j.a.,etal.,illnessandmicrobialexperiencesofnurserychildrenatjuniorvillage.americanjournalofhygiene,1961.74:p.267-292.28.rhee,e.g.andd.h.barouch,adenoviruses,inprinciplesandpracticeofinfectiousdiseases,g.l.mandell,j.e.bennett,andr.dolin,editors.2010,elsevier:philadelphia,pa.29.brandt,c.d.,etal.,infectionsin18,000infantsandchildreninacontrolledstudyofrespiratorytractdisease.i.adenoviruspathogenicityinrelationtoserologictypeandillnesssyndrome.amjepidemiol,1969.90(6):p.484-500.30.fox,j.p.,etal.,theviruswatchprogram:acontinuingsurveillanceofviralinfectionsinmetropolitannewyorkfamilies.vi.observationsofadenovirusinfections:virusexcretionpatterns,antibodyresponse,efficiencyofsurveillance,patternsofinfections,andrelationtoillness.amjepidemiol,1969.89(1):p.25-50.31.fox,j.p.,c.e.hall,andm.k.cooney,theseattleviruswatch.vii.observationsofadenovirusinfections.amjepidemiol,1977.105(4):p.362-86.32.noel,j.,etal.,identificationofadenovirusesinfaecesfrompatientswithdia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