抗IL?17A和IL?17F交叉反應(yīng)性抗體變體、包含其的組合物及其制備和使用方法與流程

交叉參考本申請要求2014年10月31日提交的美國臨時申請?zhí)?2/073,574的優(yōu)先權(quán)，該美國臨時申請在此以其整體引入作為參考。序列表本申請包含已以ascii格式電子提交的序列表，在此以其整體引入作為參考。于2015年10月26日創(chuàng)建的該ascii拷貝命名為p32377wo_pctsequencelisting.txt，大小為13,727字節(jié)。本發(fā)明涉及抗il-17a和il-17f交叉反應(yīng)性抗體(抗il-17a/f抗體)的變體。具體而言，本發(fā)明涉及糖基化變體、酸性變體、電荷變體、高分子量種類(hmws)變體和抗還原(reduction-resistant，rr)交聯(lián)變體。本發(fā)明還涉及分離的變體，包含該抗體及其變體的組合物和藥物組合物，及包含該抗體和該變體的制品，以及制備、評價和表征該變體及其組合物的方法。
背景技術(shù)：
：白細(xì)胞介素-17(il-17或il-17a)是t細(xì)胞來源的刺激上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生其他炎性細(xì)胞因子和趨化因子(包括il-6、il-8、g-csf和mcp-1)的促炎分子。參見yao,z.等,j.immunol.,122(12):5483-5486(1995)；yao,z.等,immunity,3(6):811-821(1995)；fossiez,f.等,j.exp.med.,183(6):2593-2603(1996)；kennedy,j.等,j.interferoncytokineres.,16(8):611-7(1996)；cai,x.y.等,immunol.lett,62(1):51-8(1998)；jovanovic,d.v.等,j.immunol.,160(7):3513-21(1998)；laan,m.等,j.immunol.,162(4):2347-52(1999)；linden,a.等,eurrespirj,15(5):973-7(2000)；及aggarwal,s.和gurney,a.l.,jleukocbiol.71(1):1-8(2002)]。il-17a還與其他細(xì)胞因子(包括tnf-α和il-1β)協(xié)同作用來進(jìn)一步誘導(dǎo)趨化因子表達(dá)(chabaud,m.等,j.immunol.161(1):409-14(1998))。已進(jìn)一步顯示il-17a在人巨噬細(xì)胞中通過胞內(nèi)信號發(fā)放刺激ca2+流入和[camp]i減少(jovanovic等,j.immunol.,160:3513[1998])。用il-17處理的成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)nf-κb激活[yao等,immunity,3:811(1995),jovanovic等,上文]，而用它處理的巨噬細(xì)胞激活nf-κb和促分裂原活化蛋白激酶(shalom-barek等,j.biol.chem.,273:27467[1998])。此外，il-17還與涉及骨和軟骨生長的哺乳動物細(xì)胞因子樣因子7具有序列相似性。與il-17多肽具有序列相似性的其他蛋白質(zhì)有人胚胎衍生白細(xì)胞介素相關(guān)因子(edirf)和白細(xì)胞介素-20。白細(xì)胞介素17a公認(rèn)為新出現(xiàn)的細(xì)胞因子家族的原型成員。人和其他脊椎動物基因組的大規(guī)模測序已揭示編碼il-17a相關(guān)蛋白質(zhì)的其他基因的存在，從而定義了新的細(xì)胞因子家族。人類和小鼠中存在至少6個il-17家族成員，包括il-17b、il-17c、il-17d、il-17e和il-17f。參見wo01/46420。編碼人il-17f的基因鄰近il-17定位(hymowitz,s.g.等,emboj,20(19):5332-41(2001))。il-17a和il-17f具有約44％氨基酸同一性，而il-17家族的其他成員具有更有限的15-27％氨基酸同一性，表明il-17a和il-17f形成il-17家族內(nèi)的不同亞組(starnes,t.等,jimmunol.167(8):4137-40(2001)；aggarwal,s.和gurney,a.l.,j.leukocbiol,71(l):1-8(2002))。il-17家族的每個成員形成同二聚體。il-17a和il-17f還形成il-17af異二聚體。人il-17af異二聚體是不同的新細(xì)胞因子，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和基于細(xì)胞的活性測定中都不同于人il-17a和il-17f。通過用純化的重組人il-17af作為標(biāo)準(zhǔn)品，開發(fā)了人il-17af特異性elisa。通過使用此特異性elisa，檢測了人il-17af的誘導(dǎo)表達(dá)，確認(rèn)il-17af異二聚體從培養(yǎng)的活化人t細(xì)胞天然產(chǎn)生。因此，il-17af是不同的新細(xì)胞因子，可作為分離的活化人t細(xì)胞的天然產(chǎn)物檢測到，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和基于細(xì)胞的測定中都將其重組形式表征為不同于和區(qū)別于相關(guān)細(xì)胞因子。參見例如us20060270003和wo2008/067223。類似于il-17a和il-17f同二聚體，已報道il-17af異二聚體細(xì)胞因子通過il-17ra/il-17rc受體復(fù)合物發(fā)放信號(wright等,jimmunol181(4):2799-805(2008))。已開發(fā)il-17a和il-17f拮抗劑如抗體拮抗劑(也稱為抗il-17a和il-17f交叉反應(yīng)性抗體或抗il-17a/f抗體)來治療il-17a和il-17f相關(guān)障礙(參見例如us8,715,669和us8,771,697，在此引入作為參考)。發(fā)明概述抗il-17a和il-17f交叉反應(yīng)性抗體包含：含有序列dyamh(seqidno:1)的重鏈可變結(jié)構(gòu)域cdr1、含有序列g(shù)inwssggigyadsvkg(seqidno:2)的重鏈可變結(jié)構(gòu)域cdr2、含有序列diggfgefywnfgl(seqidno:3)的重鏈可變結(jié)構(gòu)域cdr3，及含有序列rasqsvrsyla(seqidno:4)的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域cdr1、含有序列dasnrat(seqidno:5)的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域cdr2和含有序列qqrsnwppat(seqidno:6)的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域cdr3。參見us8,715,669，在此以其整體引入作為參考?？筰l-17a/f抗體以高親和力結(jié)合人il-17aa同二聚體、il-17ff同二聚體和il-17af異二聚體，并中和人il-17aa同二聚體、il-17ff同二聚體和il-17af異二聚體誘導(dǎo)的促炎癥活性。示例性全長人il-17a和il-17f氨基酸序列分別顯示在seqidno:12和seqidno:13中。之前未報道過本文所述抗il-17a/f抗體的變體。本發(fā)明涉及抗il-17a/f抗體的變體，尤其是糖基化變體、hmws變體、抗還原(rr)交聯(lián)變體、電荷變體和酸性變體。因此，在第一方面，本發(fā)明提供包含抗il-17a和抗il-17f交叉反應(yīng)性抗體及其糖基化變體的組合物，該抗il-17a和抗il-17f交叉反應(yīng)性抗體包含：含有氨基酸序列seqidno:1的重鏈可變結(jié)構(gòu)域cdr1、含有氨基酸序列seqidno:2的cdr2、含有氨基酸序列seqidno:3的cdr3，及含有氨基酸序列seqidno:4的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域cdr1、含有氨基酸序列seqidno:5的cdr2和含有氨基酸序列seqidno:6的cdr3。在某些實施方案中，該糖基化在重鏈可變區(qū)中。在某些實施方案中，該抗體或其變體屬于igg種類。在某些實施方案中，該抗體或其變體屬于igg1、igg2或igg4同種型。在某些實施方案中，該抗體或其變體是單克隆抗體、全人抗體、人源化抗體、嵌合抗體或多特異性抗體(例如雙特異性抗體)。在某些其他實施方案中，該糖基化變體是異二聚體變體，其中只有一個半抗體或只有一個重鏈可變區(qū)是糖基化的。在某些實施方案中，該糖基化變體是同二聚體變體，其中兩個半抗體或兩個重鏈可變區(qū)都是糖基化的。在某些實施方案中，該糖基化在重鏈可變區(qū)cdr2中，優(yōu)選在seqidno:2的asn處。在某些實施方案中，該重鏈可變區(qū)包含與氨基酸序列seqidno:7具有至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％或100％序列同一性的氨基酸序列，和/或該輕鏈可變區(qū)包含與氨基酸序列seqidno:8具有至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在某些實施方案中，該抗體包含：含有與氨基酸序列seqidno:9具有至少約85％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％或100％序列同一性的氨基酸序列的重鏈，和/或含有與氨基酸序列seqidno:10具有至少約85％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％或100％序列同一性的氨基酸序列的輕鏈。在某些實施方案中，該抗體包含含有氨基酸序列seqidno:9的重鏈和含有氨基酸序列seqidno:10的輕鏈。在某些實施方案中，該抗il-17a/f抗體稱為抗il-17a/f抗體mcaf5352a。在某些實施方案中，組合物中糖基化變體的量不超過4％。在某些其他實施方案中，組合物中糖基化變體的量不超過糖基化變體的2％。在某些其他實施方案中，通過大小排阻高效液相層析(se-hplc)來檢測、表征和分析該糖基化變體。在某些實施方案中，如通過se-hplc測量，組合物中糖基化變體的量不超過2％。在某些實施方案中，組合物中糖基化變體的量不超過0％。在某些實施方案中，在哺乳動物細(xì)胞如cho細(xì)胞中產(chǎn)生該抗體。還在其他實施方案中，該組合物包含糖基化變體，且進(jìn)一步包含該抗體的一種或多種其他變體，其中該其他變體選自高分子量種類(hmws)變體、抗還原(rr)交聯(lián)變體和酸性變體。在某些實施方案中，在哺乳動物細(xì)胞如cho細(xì)胞中產(chǎn)生該抗體?？筰l-17a/f抗體mcaf5253a顯示非典型光敏感性，最初觀察到其導(dǎo)致變色(黃化)，amax為～420-440nm，發(fā)現(xiàn)這與高分子量種類(hmws)形成相關(guān)。n2凈化抗il-17樣品減少變色和hmws形成二者，提示氧化驅(qū)動的過程。用多種生物分析技術(shù)(非限制性地包括電荷變體分析、se-hplc、毛細(xì)管電泳-十二烷基硫酸鈉(ce-sds)、胰蛋白酶肽段作圖和完整/還原質(zhì)量分析)表征了該抗體的光敏感性。開發(fā)了新的有機(jī)相-大小排阻層析方法(命名為op-sec)，以使得能夠分級分離和富集假定的不可還原的hmws(nr-hmws或rr-hmws)，證明其是光誘導(dǎo)的錯配二硫鍵交聯(lián)肽。交聯(lián)級分主要包含重鏈-重鏈(hc-hc)(>90％)錯配二硫化物，少量成分為重鏈-輕鏈(hc-lc)錯配二硫化物。因此，在某些實施方案中，該組合物進(jìn)一步包含rr交聯(lián)變體。在某些其他實施方案中，該組合物中rr交聯(lián)變體的量為不超過約1％至不超過約3％。在某些其他實施方案中，該組合物中rr交聯(lián)變體的量不超過約3％。在某些實施方案中，通過還原抗體的還原型op-sec(有機(jī)相大小排阻層析)或還原型ce-sds(毛細(xì)管電泳-sds)來測定該組合物中rr交聯(lián)變體的量。在某些實施方案中，通過還原型ce-sec測定的該組合物中的rr交聯(lián)變體不超過約1％。在某些實施方案中，通過還原抗體的op-sec測定的該組合物中rr交聯(lián)變體的量不超過約3％。在某些實施方案中，該rr交聯(lián)變體包含cys和cys之間的交聯(lián)。在某些實施方案中，該rr交聯(lián)變體包含trp和trp之間的交聯(lián)。在某些實施方案中，該交聯(lián)是分子間或分子內(nèi)交聯(lián)。在某些實施方案中，該rr交聯(lián)變體包含重鏈-重鏈交聯(lián)。在某些其他實施方案中，rr交聯(lián)變體包含重鏈-輕鏈交聯(lián)。在某些其他實施方案中，該rr交聯(lián)變體由光照(例如環(huán)境光照)誘導(dǎo)。在某些其他實施方案中，該組合物進(jìn)一步包含hmws變體。在某些實施方案中，該組合物中hmws變體的量不超過約1％。在某些其他實施方案中，通過se-hplc測定hmws變體的量。在某些具體實施方案中，通過se-hplc測定的該組合物中hmws變體的量不超過約1％。在某些實施方案中，該組合物進(jìn)一步包含酸性變體。在某些具體實施方案中，該組合物中酸性變體的量不超過約42％。在某些實施方案中，通過成像毛細(xì)管等電聚焦(icief)測定酸性變體的量。在某些實施方案中，通過icief測定的該組合物中酸性變體的量不超過約42％。在另一方面，本發(fā)明提供包含抗il-17a和抗il-17f交叉反應(yīng)性抗體的組合物，該抗il-17a和抗il-17f交叉反應(yīng)性抗體包含：具有氨基酸序列seqidno:1的重鏈可變結(jié)構(gòu)域cdr1、具有氨基酸序列seqidno:2的重鏈可變結(jié)構(gòu)域cdr2、具有氨基酸序列seqidno:3的重鏈可變結(jié)構(gòu)域cdr3，及具有氨基酸序列seqidno:4的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域cdr1、具有氨基酸序列seqidno:5的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域cdr2和具有氨基酸序列seqidno:6的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域cdr3，其中該組合物包含一種或多種糖基化變體、rr交聯(lián)變體、hmws變體和酸性變體。在某些實施方案中，該組合物包含rr交聯(lián)變體。在某些實施方案中，通過還原型op-sec測定的該組合物中rr交聯(lián)變體的量不超過約3％。在某些其他實施方案中，該組合物包含hmws變體。在某些其他實施方案中，通過se-hplc測定的該組合物中hmws變體的量不超過約1％。在某些其他實施方案中，該組合物包含酸性變體。在某些其他實施方案中，通過成像毛細(xì)管等電聚焦(icief)測定的該組合物中酸性變體的量不超過約42％。在某些實施方案中，該組合物包含糖基化變體、hmws變體、rr交聯(lián)變體和酸性變體，其中該組合物中糖基化變體的量不超過約2％，該組合物中rr交聯(lián)變體的量不超過約3％，該組合物中hmws變體的量不超過約1％，該組合物中酸性變體的量不超過約42％。在另一方面，本發(fā)明提供包含本文所述組合物和一種或多種可藥用賦形劑的藥物組合物。在某些實施方案中，該藥物組合物包含抗il-17a/f抗體及其變體的主要種類。還在另一方面，本發(fā)明提供制品，其包含含有本文所述藥物組合物的容器，及含有處方信息的包裝說明書，該處方信息說明其用該藥物組合物來治療有需要的患者的用途。在另一方面，本發(fā)明提供制備本文所述組合物的方法，其包括產(chǎn)生包含該il-17a/f抗體的主要種類及其一種或多種變體的組合物；對所產(chǎn)生的組合物進(jìn)行一種或多種分析測定來評價該組合物中一種或多種變體的量。在某些實施方案中，該方法進(jìn)一步包括對所產(chǎn)生的組合物進(jìn)行一輪或多輪純化。還在另一方面，本發(fā)明提供治療免疫相關(guān)疾病或障礙(如自身免疫疾病或障礙和炎性疾病或障礙)或細(xì)胞增殖相關(guān)疾病或障礙的方法，其包括對有需要的個體施用本文所述的藥物組合物。在某些實施方案中，該免疫相關(guān)疾病或障礙非限制性地包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、幼年型慢性關(guān)節(jié)炎、脊椎關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性硬化病、特發(fā)性炎性肌病、綜合征、系統(tǒng)性血管炎、結(jié)節(jié)病、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血小板減少癥、甲狀腺炎、糖尿病、免疫介導(dǎo)的腎病、中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病(如多發(fā)性硬化、特應(yīng)性脫髓鞘性多神經(jīng)病或guillain-barré綜合征和慢性炎性脫髓鞘性多神經(jīng)病)、肝膽疾病(如感染、自身免疫性慢性活動性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、肉芽腫性肝炎和硬化性膽管炎)、炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、麩質(zhì)性敏感性腸病和whipple病、大皰性皮膚病、多形性紅斑和接觸性皮炎、銀屑病、變應(yīng)性疾病(如哮喘、變應(yīng)性鼻炎、特應(yīng)性皮炎、食物超敏反應(yīng)和蕁麻疹)、肺免疫性疾病(如嗜酸細(xì)胞性肺炎、特發(fā)性肺纖維化和過敏性肺炎)、移植相關(guān)疾病(包括移植排斥和移植物抗宿主病)。在某些其他實施方案中，該免疫相關(guān)障礙是哮喘、多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、紅斑狼瘡、銀屑病、慢性阻塞性肺病或特發(fā)性肺纖維化。在某些其他實施方案中，該細(xì)胞增殖相關(guān)障礙非限制性地包括結(jié)直腸癌、腎細(xì)胞癌癥(例如腎細(xì)胞癌)、黑素瘤、膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌(例如三陰乳腺癌、her2陽性乳腺癌或激素受體陽性癌癥)和非小細(xì)胞肺癌(例如鱗狀非小細(xì)胞肺癌或非鱗狀非小細(xì)胞肺癌)。在一些實施方案中，待通過本公開的方法治療的癌癥包括但不限于癌、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病。在一些實施方案中，待通過本公開的方法治療的癌癥包括但不限于鱗狀細(xì)胞癌、肺癌(包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌)、黑素瘤、腎細(xì)胞癌、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃或腹部癌(包括胃腸癌)、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜或子宮癌、涎腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌和多種類型的頭頸癌，以及b細(xì)胞淋巴瘤(包括低級/濾泡性非霍奇金淋巴瘤(nhl)、小淋巴細(xì)胞性(sl)nhl、中級/濾泡性nhl、中級彌漫性nhl、高級免疫母細(xì)胞性nhl、高級淋巴母細(xì)胞性nhl、高級小非裂細(xì)胞性nhl、巨塊病性nhl、套細(xì)胞淋巴瘤、aids相關(guān)淋巴瘤和waldenstrom巨球蛋白血癥)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(cll)、急性髓性白血病(all)、多毛細(xì)胞白血病、慢性成髓細(xì)胞性白血病和移植后淋巴增生性障礙(ptld)，以及與瘢痣病、水腫(如與腦腫瘤相關(guān)的水腫)和meigs綜合征相關(guān)的異常血管增生。在一些實施方案中，該癌癥可以是早期癌癥或晚期癌癥。在一些實施方案中，該癌癥可以是原發(fā)性腫瘤。在一些實施方案中，該癌癥可以是源自任意以上癌癥類型的第二部位處的轉(zhuǎn)移性腫瘤。除非文中清楚地另有說明，上文所述的任何和每個實施方案適用于本發(fā)明的任何和每個方面。除非文中清楚地另有說明，不同方面之內(nèi)和之間的所有實施方案可以組合。本發(fā)明的具體實施方案將從以下某些優(yōu)選實施方案的更詳細(xì)描述和權(quán)利要求書變得顯而易見。附圖簡述圖1a：抗il-17a/f抗體mcaf5352a的組合物的sec層析圖，顯示峰1在組合物中占2％。圖1b顯示放大視圖。圖2：胰蛋白酶和pngase消化后的富集的峰1的sec層析圖。圖3a和3b：pngase處理的富集峰1的lc-ms分析。圖3a：ms-tic結(jié)果顯示去除富集的峰1的聚糖在層析圖中產(chǎn)生了新的峰。圖3b，上圖-原始ms數(shù)據(jù)，顯示未修飾、非糖基化的親本胰蛋白酶肽hc44-65的質(zhì)量；下圖顯示去糖基化的hc44-65，其中asp52取代了asn52。如預(yù)期，去糖基化的肽具有不同于非糖基化的hc44-65肽的保留時間，且具有略高的質(zhì)量。通過所收集的肽的n端測序確認(rèn)了asp52的存在。圖4a和4b：抗il-17a/f抗體mcaf5352a的光誘導(dǎo)變色。圖4a，按照ich指南光照暴露0小時、6小時和24小時時可觀察到的變色的照片。圖4b，光照暴露24小時的mcaf5352a的紫外-可見光光譜。在光照暴露的抗il-17a/f樣品中觀察到獨特的uv吸收光譜，absmax為～430nm。通過暴露更長時間，用環(huán)境光照暴露觀察到了相似的顏色變化(數(shù)據(jù)未顯示)。圖5a和5b：通過sec觀察到光誘導(dǎo)高分子量種類(hmws)形成。圖5a，光照暴露的抗il-17a/f抗體的完整大小排阻層析(sec)分析。圖5b，定量分析顯示hmws形成和光照暴露之間的線性相關(guān)。圖6a和6b：用新的有機(jī)相-大小排阻層析(op-sec)鑒定抗還原交聯(lián)種類。圖6a：dtt處理的光照暴露的抗il-17a/fmcaf5352a的op-sec分析。圖6b：定量分析顯示抗還原交聯(lián)種類形成和光照暴露之間的線性相關(guān)。然后通過級分收集富集交聯(lián)種類。圖7a和7b：光誘導(dǎo)增加mcaf5352a的電荷變體。圖7a：光照暴露后用icief分析檢測到的電荷變體。圖7b：定量分析顯示酸性電荷變體的增加。圖8a和8b：分子內(nèi)和分子間交聯(lián)二者的證據(jù)。圖8a：還原抗il-17a/f抗體mcaf5352樣品的op-sec分析。圖8b，定量分析顯示sec主峰和hmws級分二者中的nr(不可還原或rr(抗還原))-hmws，分別顯示分子內(nèi)和分子間交聯(lián)。圖9a-c：通過胰蛋白酶作圖分析的位點特異性光誘導(dǎo)氧化。圖9a，甲硫氨酸氧化的定量分析；圖9b，最易氧化的色氨酸氧化的定量分析；圖9c，總色氨酸氧化種類的定量分析。圖10：通過sec測定的位點特異性氧化、hmws和通過op-sec測定的rr交聯(lián)種類的水平之間的直接相關(guān)。圖11a-c：esi-tof-ms分析顯示交聯(lián)種類組成。圖11a：從還原型op-sec分級分離/富集的交聯(lián)種類的全ms。圖11b：放大的ms顯示假定的重鏈-重鏈(hc-hc)交聯(lián)種類。圖11c：放大的ms，顯示假定的重鏈-輕鏈(hc-lc)交聯(lián)種類。圖12a和12b：n2凈化減少變色、hmws和交聯(lián)種類形成，表明變色、hmws形成和rr交聯(lián)涉及氧化過程。圖12a，n2凈化的樣品的sec分析，其中觀察到n2凈化減少變色(插圖)；圖12b：n2凈化的樣品的op-sec分析。圖13a和13b：n2凈化減少總氧化。圖13a，抗il-17a/fabmcaf5352a的fc、lc(輕鏈)和fab區(qū)的總氧化的rp-hplc分析；圖13b，定量分析顯示n2凈化顯著減少fc氧化。圖14a和14b：nan3處理顯示單一氧化驅(qū)動的過程。圖14a顯示變色和nan3處理濃度之間的直接相關(guān)。圖14b，通過sec測量的nan3處理對hmws形成的保護(hù)作用和通過op-sec測量的nan3處理對交聯(lián)形成的保護(hù)作用。圖15a-1和15a-2：用o18標(biāo)記流程和ms/ms鑒定光照暴露的il-17a/f抗體mcaf5352a中的rr交聯(lián)肽。圖15a-1和圖15a-2，c232(鉸鏈)和c373(fc)之間的鉸鏈-fcrr交聯(lián)二硫鍵(按出現(xiàn)順序分別為seqidno14和15)；圖15b-1和圖15b-2，c235(鉸鏈)和c96(fab)之間的鉸鏈-fabrr交聯(lián)二硫鍵(按出現(xiàn)順序分別為seqidno16和15)。圖16a和16b：圖16a中的圖片顯示全長抗體中已知的二硫鍵。圖16b列出通過數(shù)據(jù)庫搜索(massmatrixsoftwaresuite)在目標(biāo)抗體中鑒定的光誘導(dǎo)抗還原錯配二硫鍵。確認(rèn)了兩個錯配二硫鍵，其他錯配二硫鍵用o18標(biāo)記檢測為陽性，表明它們存在于光誘導(dǎo)rr交聯(lián)變體中。這些錯配二硫鍵中的幾個涉及鉸鏈區(qū)。圖16b。發(fā)明詳述本文引用的所有出版物、專利和專利申請在此為了所有目的明確引入作為參考。i.定義除非文中清楚地另有說明，本文所用的單數(shù)形式“一”、“一個”和“該”包括復(fù)數(shù)指代物。本文所用的抗體的“糖基化變體”是這樣的抗體，與該抗體的在可變區(qū)中不糖基化的主要種類相比，其具有一個或多個附著于抗體可變區(qū)的糖類部分。在一個實施方案中，該糖基化變體具有附著于抗體的一條或兩條重鏈的寡糖結(jié)構(gòu)。在某些實施方案中，該糖基化位點在重鏈可變區(qū)(vh)cdr2(seqidno:2)氨基酸殘基的asn或vh的氨基酸殘基52處。在某些實施方案中，兩個重鏈可變區(qū)都糖基化(同二聚體變體)。在某些其他實施方案中，兩個重鏈可變區(qū)中只有一個糖基化(異二聚體變體)。在某些實施方案中，共價附著于重鏈可變區(qū)中的asn的寡糖在糖基化變體間可以是異質(zhì)的。術(shù)語“抗il-17a和抗il-17f交叉反應(yīng)性抗體”、“抗il-17a/f抗體”或“抗il-17a/f交叉反應(yīng)性抗體”指結(jié)合并中和il-17a同二聚體、il-17f同二聚體和il-17af異二聚體的抗體。本文中的術(shù)語“主要種類抗體”或“野生型抗體”指組合物中的抗體氨基酸序列結(jié)構(gòu)，其是該組合物中在數(shù)量上在占優(yōu)勢的抗體分子。優(yōu)選地，該主要種類抗體是抗il-17a/f抗體，如結(jié)合并中和il-17a同二聚體、il-17f同二聚體和il-17af異二聚體的抗體。在一個實施方案中，該主要種類抗體是包含cdr-h1(seqidno:1)、cdr-h2(seqidno:2)和cdr-h3(seqidno:3)、cdr-l1(seqidno:4)、cdr-l2(seqidno:5)和cdr-l3(seqidno:6)的抗體。在某些實施方案中，該抗il-17a/f抗體包含含有序列seqidno:7的重鏈可變區(qū)和/或含有序列seqidno:8的輕鏈可變區(qū)。在一個實施方案中，該主要種類抗體是mcaf5352a。本文中的“完整抗體”是包含兩個抗原結(jié)合區(qū)和fc區(qū)的抗體。在某些實施方案中，該完整抗體具有功能性fc區(qū)。在一個實施方案中，如通過lc/ms測量，“完整il-17a/f抗體mcaf5352a”具有約148,724da的分子量(包括fc聚糖，不含c端lys)?？筰l-17a/f抗體的“低分子量種類”或“l(fā)mws”變體包含分子量低于主要種類或完整抗il-17a/f抗體分子量的抗體片段。在某些實施方案中，抗il-17a/f抗體mcaf5352a的lmws變體包含分子量低于主要種類或完整抗il-17a/f抗體mcaf5352a分子量的抗體片段。lmws可以通過大小排阻高效液相層析(se-hplc)和/或非還原型毛細(xì)管電泳-十二烷基硫酸鈉(ce-sds)來檢測?！案叻肿恿糠N類”或“hmws”變體包含分子量大于主要種類或完整抗il-17a/f抗體的抗il-17a/f抗體制備物。在某些實施方案中，該hmws變體包含分子量大于完整或主要種類抗il-17a/f抗體mcaf5352a的抗il-17a/f抗體mcaf5352a制備物(例如，其中完整抗il-17a/f抗體mcaf5352a分子量約為148,724da)。hmws可以通過大小排阻高效液相層析(se-hplc)和/或非還原型毛細(xì)管電泳-十二烷基硫酸鈉(ce-sds)來檢測。在某些實施方案中，該hmws是光誘導(dǎo)的hmws。氨基酸序列變體抗體是具有不同于主要種類抗體的氨基酸序列的抗體。通常，氨基酸序列變體將與主要種類抗體具有至少約70％同源性，優(yōu)選地，它們將與主要種類抗體具有至少約80％、更優(yōu)選至少約90％同源性。在某些實施方案中，氨基酸序列變體將與主要種類抗體具有至少約70％、約80％、約85％、約90％、約92％、約95％、約98％、約99％序列同一性。氨基酸序列變體在主要種類抗體的氨基酸序列內(nèi)或鄰近主要種類抗體的氨基酸序列的某些位置上具有取代、缺失和/或添加。本文的氨基酸序列變體的實例包括脫酰胺抗體變體、在其一條或兩條輕鏈上具有氨基端前導(dǎo)序列延伸(例如vhs-)的抗體、在其一條或兩條重鏈上具有c端賴氨酸殘基的抗體等，且包括重鏈和/或輕鏈的氨基酸序列變異的組合。在某些實施方案中，提供具有一個或多個氨基酸取代的抗體變體。進(jìn)行取代誘變的目的位點包括hvr和fr。表1中在“優(yōu)選的取代”的表頭下顯示保守取代。表1中在“示例性取代”的表頭下提供更實質(zhì)性的改變，如下文參考氨基酸側(cè)鏈種類進(jìn)一步描述?？梢栽谀康目贵w中引入氨基酸取代，并針對希望得到的活性(例如保留/改善的抗原結(jié)合、降低的免疫原性或改善的adcc或cdc)篩選產(chǎn)物。表1氨基酸可以按照共同的側(cè)鏈特性分組：(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性親水性：cys、ser、thr、asn、gln；(3)酸性asp、glu；(4)堿性：his、lys、arg；(5)影響鏈取向的殘基：gly、pro；(6)芳香族：trp、tyr、phe。保守取代將需要將這些種類之一的成員換為另一種類。“脫酰胺”抗體是這樣的抗體，其中其一個或多個天冬酰胺殘基已衍生為例如天冬氨酸、琥珀酰亞胺或異天冬氨酸?！八嵝宰凅w”是主要種類抗體的變體，其比主要種類抗體更酸。酸性變體相對于主要種類抗體獲得負(fù)電荷或失去正電荷。在某些實施方案中，該酸性變體可以因甲硫氨酸或色氨酸氧化而存在。這類酸性變體可以用按照電荷分離蛋白質(zhì)的分離方法(如離子交換層析)解析。在通過陽離子交換層析分離時，主要種類抗體的酸性變體比主峰更早洗脫。“電荷變體”指在給定ph下攜帶不同于主要種類抗體的總電荷的變體。電荷變體可以是酸性變體(獲得負(fù)電荷或失去正電荷的變體)或堿性變體(獲得正電荷或失去負(fù)電荷的變體)。在一個實施方案中，與主要種類抗體相比，抗體的一個或多個氨基酸殘基上的修飾導(dǎo)致電荷變體的不同總電荷?！翱惯€原(rr)交聯(lián)變體”指主要種類抗體的變體，其不能通過諸如二硫蘇糖醇的還原劑化學(xué)還原為重鏈和輕鏈。rr交聯(lián)變體也稱為不可還原(nr)交聯(lián)變體。這類變體可以通過用還原劑處理組合物并用評價蛋白質(zhì)大小的方法(如本文所述的毛細(xì)管電泳-十二烷基硫酸鈉(ce-sds)或有機(jī)相大小排阻層析(op-sec))評價所得到的組合物來評估。在某些實施方案中，該rr交聯(lián)變體產(chǎn)生自暴露于光照，如環(huán)境光照。在某些其他實施方案中，該rr交聯(lián)發(fā)生在cys和cys殘基之間，或trp和trp殘基之間。在某些實施方案中，該rr交聯(lián)發(fā)生在分子間，例如一個抗體分子和另一個抗體分子之間；在某些其他實施方案中，該rr交聯(lián)發(fā)生在分子內(nèi)，例如一個全長抗體分子內(nèi)。“c端賴氨酸變體”指在其重鏈的c端包含賴氨酸(k)殘基的變體?！凹琢虬彼嵫趸凅w”指其中包含一個或多個氧化甲硫氨酸殘基的變體，例如含有序列seqidno:9的全長重鏈的氧化met258、met364和/或met434?！吧彼嵫趸凅w”指其中包含一個或多個氧化色氨酸殘基的變體。在某些實施方案中，該色氨酸氧化變體包含一個或多個色氨酸殘基的氧化，該一個或多個色氨酸殘基選自含有序列seqidno:7的vh序列的重鏈可變區(qū)的w53、w108及含有序列seqidno:8的vl序列的輕鏈可變區(qū)的w94。術(shù)語“抗體”在本文中以最廣泛的含義使用，且涵蓋多種抗體結(jié)果，包括但不限于單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們顯示希望得到的抗原結(jié)合活性。在某些實施方案中，該組合物包含il-17a/f抗體，該il-17a/f抗體是全人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。在某些其他實施方案中，該抗體是雙特異性或多特異性抗體。在某些實施方案中，該雙特異性或多特異性抗體具有至少兩種不同的結(jié)合特異性，結(jié)合特異性之一針對il-17a同二聚體、il-17f同二聚體和il-17af異二聚體?！翱贵w片段”指除完整抗體以外的包含完整抗體的部分的分子，其結(jié)合該完整抗體所結(jié)合的抗原。抗體片段的實例包括但不限于fv、fab、fab'、fab’-sh、f(ab')2；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scfv)；及從抗體片段形成的多特異性抗體。抗體的“種類”指其重鏈所具有的恒定結(jié)構(gòu)域或恒定區(qū)的類型。存在5個主要的抗體種類：iga、igd、ige、igg和igm，這些種類中的幾種可以進(jìn)一步劃分為亞類(同種型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。對應(yīng)于不同種類的免疫球蛋白的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別稱為α、δ、ε、γ和μ。本文的術(shù)語“fc區(qū)”用來定義免疫球蛋白重鏈的c端區(qū)域，其包含至少部分恒定區(qū)。該術(shù)語包括天然序列fc區(qū)和變體fc區(qū)。在一個實施方案中，人igg重鏈fc區(qū)從cys226或從pro230(在含有氨基酸序列seqidno:9的重鏈的實例中分別為cys232和pro236)延伸至重鏈的羧基端。但是，fc區(qū)的c端賴氨酸可以存在或不存在。除非本文另有說明，fc區(qū)或恒定區(qū)中的氨基酸殘基的編號按照kabat等,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md,1991中所述的eu編號系統(tǒng)，也稱為eu指數(shù)。“構(gòu)架”或“fr”指高變區(qū)(hvr)殘基之外的可變結(jié)構(gòu)域殘基?？勺兘Y(jié)構(gòu)域的fr一般由四個fr結(jié)構(gòu)域組成：fr1、fr2、fr3和fr4。因此，hvr和fr序列一般按以下順序出現(xiàn)在vh(或vl)中：fr1-h1(l1)-fr2-h2(l2)-fr3-h3(l3)-fr4。術(shù)語“全長抗體”、“完整抗體”和“全抗體”在本文中可互換使用，指具有基本上類似于天然抗體結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)或具有包含本文所定義的fc區(qū)的重鏈的抗體。術(shù)語“宿主細(xì)胞”、“宿主細(xì)胞系”和“宿主細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用，指已將外源核酸引入其中的細(xì)胞，包括這類細(xì)胞的后代。宿主細(xì)胞包括“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”，其包括最初轉(zhuǎn)化的細(xì)胞及從其衍生的后代，而不考慮傳代數(shù)。后代的核酸含量可以并非與親本細(xì)胞完全相同，而是可以包含突變。本文包括具有與在最初轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中篩選或選擇的功能或生物學(xué)活性相同的功能和生物學(xué)活性的突變體后代?！叭丝贵w”是具有這樣的氨基酸序列的抗體，該氨基酸序列對應(yīng)于由人或人細(xì)胞產(chǎn)生或衍生自利用人抗體庫或其他人抗體編碼序列的非人來源的抗體的氨基酸序列。人抗體的此定義明確排除了包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”指獲自基本上同質(zhì)的抗體群體的抗體，即除了例如包含天然存在的突變或在產(chǎn)生單克隆抗體制劑期間出現(xiàn)的可能的變體抗體(這類變體通常以較小的量存在)外，包含該群體的單種抗體相同的表位和/或結(jié)合相同的表位。與通常包含抗不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑不同，單克隆抗體制劑的每種單克隆抗體抗抗原上的單個決定簇。因此，修飾詞“單克隆”指抗體獲自基本上同質(zhì)的抗體群體的特征，而不解釋為需要通過任意具體的方法來產(chǎn)生該抗體。例如，將要按照本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過多種技術(shù)來制備，其包括但不限于雜交瘤法、重組dna法、噬菌體展示法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因動物的方法，本文描述用于制備單克隆抗體的這類方法和其他示例性方法。在本文中使用時，術(shù)語“高變區(qū)”指抗體的負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)通常包含來自“互補(bǔ)決定區(qū)”或“cdr”的氨基酸殘基(例如，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基24-34(l1)、50-56(l2)和89-97(l3)，重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的31-35b(h1)、50-65(h2)和95-102(h3)；kabat等,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991))和/或來自“高變環(huán)”的那些殘基(例如輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基26-32(l1)、50-52(l2)和91-96(l3)，重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的26-32(h1)、53-55(h2)和96-101(h3)；chothia和leskj.mol.biol.196:901-917(1987))?！皹?gòu)架區(qū)”或“fr”殘基是除本文定義的高變區(qū)殘基外的那些可變結(jié)構(gòu)域殘基。非人(例如嚙齒類)抗體的“人源化”形式是嵌合抗體，其包含最少的衍生自非人免疫球蛋白的序列。在大多數(shù)情況下，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中用來自具有希望得到的特異性、親和力和容量的諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類的非人物種的高變區(qū)(供體抗體)的殘基取代來自受體的高變區(qū)的殘基。在一些情況下，人免疫球蛋白的框架區(qū)(fr)殘基被相應(yīng)的非人殘基取代。此外，人源化抗體可以包含不見于受體抗體中或供體抗體中的殘基。產(chǎn)生這些修飾來進(jìn)一步改進(jìn)抗體性能。通常，人源化抗體將包含至少一個(且通常為兩個)可變結(jié)構(gòu)域的基本上全部，其中全部或基本上全部高變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的那些，全部或基本上全部fr是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗體還將可選地包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。進(jìn)一步的詳情參見jones等,nature321:522-525(1986)；riechmann等,nature332:323-329(1988)；和presta,curr.op.struct.biol.2:593-596(1992)。本文用術(shù)語“fc區(qū)”來定義免疫球蛋白重鏈的c端區(qū)域，包括天然序列fc區(qū)和變體fc區(qū)。雖然免疫球蛋白重鏈fc區(qū)的邊界可以不同，但人igg重鏈fc區(qū)通常定義為從cys226位或從pro230位的氨基酸殘基延伸至其羧基端。fc區(qū)c端賴氨酸(按照eu編號系統(tǒng)的殘基449)可以例如在產(chǎn)生或純化抗體期間去除，或通過重組改造編碼抗體重鏈的核酸去除。因此，完整抗體的組合物可以包含去除了所有k449殘基的抗體群體、未去除k449殘基的抗體群體及具有含k449殘基和不含k449殘基的抗體的混合物的抗體群體。除非另有說明，可變結(jié)構(gòu)域中的hvr殘基和其他殘基(例如fr殘基)在本文中按照kabat等,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991)編號，其在此明確引入作為參考?！発abat中的eu指數(shù)”指人igg1eu抗體的殘基編號?！肮δ苄詅c區(qū)”具有天然序列fc區(qū)的“效應(yīng)子功能”。示例性“效應(yīng)子功能”包括c1q結(jié)合；依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒性；fc受體結(jié)合；依賴抗體的細(xì)胞毒性(adcc)；吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如b細(xì)胞受體；bcr)的下調(diào)等。這類效應(yīng)子功能通常需要fc區(qū)與結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如抗體可變結(jié)構(gòu)域)組合，且可以用多種測定評估?！疤烊恍蛄衒c區(qū)”包含與見于自然界中的fc區(qū)的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人fc區(qū)包括：天然序列人igg1fc區(qū)(非a和a同種異型)；天然序列人igg2fc區(qū)；天然序列人igg3fc區(qū)；和天然序列人igg4fc區(qū)；及其天然存在的變體?！奥憧贵w”指未與異源分子如細(xì)胞毒性部分或放射性標(biāo)記綴合的抗體?！懊庖呔Y合物”是與一個或多個異源分子(包括但不限于細(xì)胞毒性劑)綴合的抗體?！胺治鰷y定”是定性評估和/或定量測量組合物中分析物(例如抗體變體)的存在或量的測定。進(jìn)行測定的組合物可以是純化的組合物，包括藥物組合物?！皞€體”或“對象”是哺乳動物。哺乳動物包括但不限于飼養(yǎng)的動物(例如牛、綿羊、貓、狗和馬)、靈長類(例如人類和非人靈長類，如猴)、兔和嚙齒類(例如小鼠和大鼠)。在某些實施方案中，該個體或?qū)ο笫侨?。本文所用的“處理?及其語法變形)指改變所處理的個體的自然過程的嘗試中的臨床干預(yù)，且可以為了預(yù)防而進(jìn)行或在臨床病理的過程中進(jìn)行。希望得到的處理作用包括但不限于防止疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)、減輕癥狀、減少疾病的任何直接或間接的病理結(jié)果、防止轉(zhuǎn)移、降低疾病進(jìn)展的速率、改善或緩和疾病狀態(tài)及消退或改善的預(yù)后。在一些實施方案中，用包含本發(fā)明的主要種類抗體及其變體的抗體組合物來延遲疾病的發(fā)展或減慢疾病的進(jìn)展。藥物(例如藥物制劑)的“有效量”指對在必要的劑量和時間下達(dá)到希望得到的治療或預(yù)防結(jié)果有效的量?！叭萜鳌敝缚梢杂脕砣菁{或包含藥物組合物或組合物的物體。本文的容器的實例包括小瓶、注射器、靜脈注射袋(intravenousbag)等?！办o脈注射袋”或“iv袋”是可容納溶液的袋子，該溶液可以經(jīng)患者的靜脈施用。在一個實施方案中，該溶液是鹽水溶液(例如約0.9％或約0.45％nacl)。可選地，該iv袋形成自聚烯烴或聚氯乙烯?！靶∑俊笔沁m合用于容納液體或凍干制劑的容器。在一個實施方案中，該小瓶是一次性使用小瓶，例如具有塞子的20-cc一次性使用小瓶?！鞍b說明書”是按照美國食品與藥品管理局(fda)或其他監(jiān)管機(jī)構(gòu)的命名必須放置在每種處方藥的包裝內(nèi)側(cè)的散頁。該散頁通常包括藥物商標(biāo)、其通用名及其作用機(jī)制；陳述其適應(yīng)癥、禁忌癥、警告、預(yù)防措施、副作用和劑型；且包括關(guān)于建議的給藥劑量、時間和途徑的說明。“藥物組合物”是包含具有藥物活性的藥物(例如抗il-17a/f抗體mcaf5352a及其變體形式，如本文中公開的那些)和一種或多種可安全地對人患者施用的“藥物活性賦形劑”(例如緩沖劑、穩(wěn)定劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、防腐劑、表面活性劑等)的組合物。這類組合物可以是例如液體或凍干組合物。在某些實施方案中，該組合物進(jìn)一步包含一種或多種其他活性藥物。術(shù)語“免疫相關(guān)疾病”指其中哺乳動物的免疫系統(tǒng)的成分引起、介導(dǎo)或以其他成分促成哺乳動物中的發(fā)病的疾病。還包括其中刺激或干預(yù)免疫反應(yīng)對疾病進(jìn)程具有改善作用的疾病。免疫介導(dǎo)的炎性疾病、非免疫介導(dǎo)的炎性疾病、感染性疾病、免疫缺陷疾病、瘤形成等也包括在此術(shù)語內(nèi)。術(shù)語“t細(xì)胞介導(dǎo)的疾病”指其中t細(xì)胞直接或間接介導(dǎo)或以其他方式促成哺乳動物中的發(fā)病的疾病。t細(xì)胞介導(dǎo)的疾病可以與細(xì)胞介導(dǎo)的作用、淋巴因子介導(dǎo)的作用等相關(guān)，甚至在例如t細(xì)胞分泌的淋巴因子刺激b細(xì)胞時與b細(xì)胞相關(guān)作用相關(guān)?？梢园凑毡景l(fā)明治療的免疫相關(guān)和炎性疾病(其中一些為免疫細(xì)胞或t細(xì)胞介導(dǎo))的實例包括：系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼年型慢性關(guān)節(jié)炎、脊椎關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性硬化病(scieroderma)、特發(fā)性炎性肌病(皮肌炎、多肌炎)、綜合征、系統(tǒng)性血管炎、結(jié)節(jié)病、自身免疫性溶血性貧血(免疫性全血細(xì)胞減少、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥)、自身免疫性血小板減少(特發(fā)性血小板減少性紫癜，免疫介導(dǎo)的血小板減少癥)自身免疫性血小板減少癥(特發(fā)性血小板減少性紫癜，免疫介導(dǎo)的血小板減少)、甲狀腺炎(grave病、橋本甲狀腺炎、幼年型淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎、萎縮性甲狀腺炎)、糖尿病、免疫介導(dǎo)的腎病(腎小球腎炎、腎小管間質(zhì)性腎炎)、中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病(如多發(fā)性硬化、特應(yīng)性脫髓鞘性多神經(jīng)病或guillain-barré綜合征和慢性炎性脫髓鞘性多神經(jīng)病)、肝膽疾病(如感染性肝炎(甲型、乙型、丙型、丁型、戊型肝炎及其他非親肝病毒)、哮喘、自身免疫性慢性活動性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、肉芽腫性肝炎和硬化性膽管炎)、炎性腸病(包括潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、麩質(zhì)性敏感性腸病和whipple病)、自身免疫或免疫介導(dǎo)的皮膚病(包括大皰性皮膚病、多形性紅斑和接觸性皮炎)、銀屑病、變應(yīng)性疾病(如哮喘、變應(yīng)性鼻炎、特應(yīng)性皮炎、食物超敏反應(yīng)和蕁麻疹)、肺免疫性疾病(如嗜酸細(xì)胞性肺炎、特發(fā)性肺纖維化和過敏性肺炎)、移植相關(guān)疾病(包括移植排斥和移植物抗宿主病)。感染性疾病包括病毒性疾病(如aids(hiv感染)、甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎、皰疹等)、細(xì)菌感染、真菌感染、原生動物感染和寄生蟲感染。術(shù)語“細(xì)胞增殖相關(guān)障礙”或“細(xì)胞增殖性障礙”或“增殖性障礙”指與某種程度的異常細(xì)胞增殖相關(guān)的障礙。在某些實施方案中，該細(xì)胞增殖性障礙是癌癥。在一些實施方案中，該細(xì)胞增殖性障礙是腫瘤。本文所用的“腫瘤”指無論惡性還是良性的所有贅生性細(xì)胞生長和增殖及所有癌前和癌細(xì)胞和組織。在本文中提到時，術(shù)語“癌癥”、“癌性的”、“細(xì)胞增殖性障礙”、“增殖性障礙”和“腫瘤”不相互排斥。在一些實施方案中，待通過本公開的方法治療的癌癥包括但不限于：結(jié)直腸癌、腎細(xì)胞癌癥(例如腎細(xì)胞癌)、黑素瘤、膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌(例如三陰乳腺癌、her2陽性乳腺癌或激素受體陽性癌癥)和非小細(xì)胞肺癌(例如鱗狀非小細(xì)胞肺癌或非鱗狀非小細(xì)胞肺癌)。在一些實施方案中，待通過本公開的方法治療的癌癥包括但不限于癌、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病。在一些實施方案中，待通過本公開的方法治療的癌癥包括但不限于鱗狀細(xì)胞癌、肺癌(包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌)、黑素瘤、腎細(xì)胞癌、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃或腹部癌(包括胃腸癌)、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜或子宮癌、涎腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌和多種類型的頭頸癌，以及b細(xì)胞淋巴瘤(包括低級/濾泡性非霍奇金淋巴瘤(nhl)、小淋巴細(xì)胞性(sl)nhl、中級/濾泡性nhl、中級彌漫性nhl、高級免疫母細(xì)胞性nhl、高級淋巴母細(xì)胞性nhl、高級小非裂細(xì)胞性nhl、巨塊病性nhl、套細(xì)胞淋巴瘤、aids相關(guān)淋巴瘤和waldenstrom巨球蛋白血癥)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(cll)、急性髓性白血病(all)、多毛細(xì)胞白血病、慢性成髓細(xì)胞性白血病和移植后淋巴增生性障礙(ptld)，以及與瘢痣病、水腫(如與腦腫瘤相關(guān)的水腫)和meigs綜合征相關(guān)的異常血管增生。在一些實施方案中，該癌癥可以是早期癌癥或晚期癌癥。在一些實施方案中，該癌癥可以是原發(fā)性腫瘤。在一些實施方案中，該癌癥可以是源自任意以上癌癥類型的第二部位處的轉(zhuǎn)移性腫瘤?！爸亟M”蛋白質(zhì)是通過遺傳修飾的宿主細(xì)胞如中國倉鼠卵巢(cho)宿主細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)?！吧a(chǎn)規(guī)模”指用fda或其他監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的商業(yè)化方法按商業(yè)化規(guī)模(例如按12,000升(l)或更大規(guī)模)生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物(例如抗體)?！凹兓敝敢粋€或多個純化步驟，如蛋白a層析、離子交換層析、大小排阻層析、疏水作用柱層析等?！胺蛛x的”變體指已通過一個或多個純化或分析方法從主要種類或野生型抗體分開的變體。這類分離的變體可以針對其生物學(xué)活性和/或功效進(jìn)行評價。ii.抗體組合物(a)主要種類抗體本文的抗體組合物包含結(jié)合人il-17a、il-17f和il-17af異二聚體的抗體(抗il-17a/f抗體)。在某些實施方案中，該抗體是人抗體。在某些其他實施方案中，該抗體是人源化抗體。該人源化抗體可以例如包含源自非人來源的高變區(qū)，該高變區(qū)摻入人可變重鏈結(jié)構(gòu)域。除非另有說明，可變結(jié)構(gòu)域編號按照kabat等,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991)中所示的編號系統(tǒng)。在某些實施方案中，該抗il-17a/f抗體包含cdr-h1(seqidno:1)、cdr-h2(seqidno:2)和cdr-h3(seqidno:3)、cdr-l1(seqidno:4)、cdr-l2(seqidno:5)和cdr-l3(seqidno:6)。本發(fā)明還考慮那些cdr殘基的氨基酸修飾，例如，其中該修飾基本保持或改善該抗體的親和力。例如，用于本發(fā)明方法的抗體變體可以在以上可變重鏈cdr序列中具有約1個至約7個或約5個氨基酸取代。這類抗體變體可以通過親和力成熟來制備?？紤]多種形式的人源化抗體或親和力成熟抗體。備選地，該人源化抗體或親和力成熟抗體可以是完整抗體，例如完整igg1抗體。在某些實施方案中，該抗il-17a/f抗體包含含有序列seqidno:7的重鏈可變區(qū)和/或含有序列seqidno:8的輕鏈可變區(qū)。在某些具體實施方案中，該抗il-17af抗體包含含有序列seqidno:9的重鏈和/或含有序列seqidno:10的輕鏈。在某些實施方案中，c端lys可選地存在于重鏈中。seqidno:7(vh)seqidno:8(vl)seqidno:9(hc)seqidno:10(lc)seqidno:12(含前導(dǎo)序列的全長人il-17a，swiss-prot檢索號q16552.1)seqidno:13(含前導(dǎo)序列的全長人il-17f，swiss-prot檢索號q96pd4.3)(b)糖基化變體在一方面，本發(fā)明提供處于分離形式、富集形式或處于包含糖基化變體和主要種類抗體的組合物中的糖基化變體抗體。在某些實施方案中，該糖基化是cdr-h2(seqidno:2)的asn殘基上的n連接糖基化。在某些實施方案中，該組合物中糖基化變體的量不超過(即等于或小于)約10％、不超過約9％、不超過約8％、不超過約7％、不超過約6％、不超過約5％、不超過約4％、不超過約3％、不超過約2％或不超過約1％。在某些實施方案中，該組合物中糖基化變體的量不超過約2％。在某些實施方案中，通過lc-ms測定該組合物中糖基化的量。包含高水平糖基化變體的抗il-17a/f抗體組合物顯示與il-17a、il-17f和/或il-17af的結(jié)合減少，和/或?qū)l-17a、il-17f和/或il-17af的中和活性降低，和/或免疫原性提高，和/或血清清除率提高。(c)lmws和hmws變體本發(fā)明提供處于分離形式、富集形式或處于包含lmws和/或hmws變體和主要種類抗體的組合物中的抗il17a/f抗體的低分子量種類(lmws)變體和/或高分子量種類(hmws)變體。該lmws和hmws變體可以用多種技術(shù)(非限制性地包括大小排阻高效液相層析(se-hplc)和/或毛細(xì)管電泳-十二烷基硫酸鈉(ce-sds))分離、表征和定量。使用se-hplc測定(例如，如實施例2中)，組合物中主要種類抗il-17a/f抗體和hmws變體或lmws變體的量可以是：主峰：≥約98.9％，例如≥約99.1％、≥約94.9％，例如≥約95.0％。hmws：≤約1％，例如≤約0.8％、≤約4.9％，例如≤約4.6％。lmws：≤約0.5％，例如≤約0.3％、≤約0.2％，例如≤約0.1％。在某些實施方案中，組合物中hmws變體的量不超過(或等于或小于)約10％、不超過約9％、不超過約8％、不超過約7％、不超過約6％、不超過約5％、不超過約4％、不超過約3％、不超過約2％或不超過約1％。在某些實施方案中，組合物中l(wèi)mws變體的量不超過(或等于或小于)約2％、不超過約1％、不超過約0.5％、不超過約0.3％或不超過約0.1％。在某些實施方案中，通過sec(或se-hplc)測量該組合物中hmws變體或lmws變體的量。在某些實施方案中，如通過sec測量，該組合物包含不超過約1％的hmws變體和/或不超過約0.1％的lmws變體。在某些實施方案中，通過光照暴露誘導(dǎo)hmws變體。包含高水平hmws變體的抗il-17a/f抗體組合物顯示與il-17a、il-17f和/或il-17af的結(jié)合減少，和/或?qū)l-17a、il-17f和/或il-17af的中和活性降低，和/或免疫原性提高，和/或血清清除率提高。(d)rr交聯(lián)變體本發(fā)明涉及處于分離形式、富集形式或處于包含rr交聯(lián)變體和主要種類抗體的組合物中的抗il17a/f抗體的抗還原(rr)交聯(lián)變體。該rr交聯(lián)變體可以用多種技術(shù)(非限制性地包括大小排阻高效液相層析(se-hplc)、有機(jī)相sec(op-sec)和/或毛細(xì)管電泳-十二烷基硫酸鈉(ce-sds))分離、表征和定量。在用諸如dtt的還原劑處理過樣品時，op-sec也可以稱為還原型op-sec。在某些實施方案中，該交聯(lián)由光照暴露誘導(dǎo)。在某些實施方案中，該交聯(lián)是在cys和cys殘基之間。在某些其他實施方案中，該交聯(lián)是在trp和trp殘基之間。該交聯(lián)可以是分子間或分子內(nèi)交聯(lián)。在某些實施方案中，該組合物中rr交聯(lián)變體的量不超過(即等于或小于)約6％、不超過約5％、不超過約4％、不超過約3％、不超過約2％或不超過約1％。在某些實施方案中，通過還原型op-sec測定該組合物中rr交聯(lián)變體的量。在某些實施方案中，如通過還原型op-sec測定，該組合物中rr交聯(lián)變體的量不超過約3％。在某些實施方案中，包含高水平rr交聯(lián)變體的抗il-17a/f抗體組合物顯示與il-17a、il-17f和/或il-17af的結(jié)合減少，和/或?qū)l-17a、il-17f和/或il-17af的中和活性降低，和/或免疫原性提高，和/或血清清除率提高。(e)酸性變體本發(fā)明還涉及處于分離形式、富集形式或處于包含酸性變體和主要種類抗體的組合物中的抗il17a/f抗體的酸性變體。該酸性變體可以用多種技術(shù)(非限制性地包括成像毛細(xì)管等電聚焦(icief)、離子交換層析(iec)或ph梯度iec分析)分離、表征和定量。在某些實施方案中，組合物中酸性變體的量不超過(即等于或小于)約45％、不超過約42％、不超過約40％、不超過約38％、不超過約35％、不超過約32％、不超過約30％、不超過約28％、不超過約25％或不超過約20％、約30％至約42％、約31％至約42％、約32％至約42％、約33％至約42％、約34％至約42％、約35％至約42％、約37％至約42％、約39％至約42％或約40％至約42％。在某些實施方案中，通過icief測定該組合物中酸性變體的量。在某些實施方案中，組合物中酸性變體的量不超過42％。在某些實施方案中，該組合物中主峰的量為至少約50％、至少約54％、至少約56％、至少約58％、至少約59％、至少約60％、至少約61％、至少約63％、至少約66％、至少約68％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％或更多。在某些實施方案中，該組合物中的酸性變體可以包括糖化變體、糖基化變體、脫酰胺變體、二硫鍵還原變體、唾液酸化變體和不可還原變體中的一種、兩種、三種、四種或五種。在某些實施方案中，該酸性變體由光照暴露誘導(dǎo)。在某些實施方案中，包含高水平酸性變體的抗il-17a/f抗體組合物顯示與il-17a、il-17f和/或il-17af的結(jié)合減少，和/或?qū)l-17a、il-17f和/或il-17af的中和活性降低，和/或免疫原性提高，和/或血清清除率提高。通常，純化可以影響存在于該組合物中的變體的量。純化方法的選擇可以增加或減少存在于該組合物中的每種變體的量。常用的純化方法非限制性地包括蛋白a親和柱、疏水作用層析、大小排阻柱和離子交換柱層析。(f)免疫綴合物在某些實施方案中，該組合物包含含有與一種或多種細(xì)胞毒性劑綴合的抗il-17a/f抗體的免疫綴合物，該細(xì)胞毒性劑如化療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如蛋白質(zhì)毒素，細(xì)菌、真菌或動物來源的具有酶活性的毒素，或其片段)或放射性同位素。在一個實施方案中，免疫綴合物是抗體-藥物綴合物(adc)，其中抗體與一種或多種藥物綴合，該藥物包括但不限于美登木素生物堿(參見美國專利號5,208,020、5,416,064和歐洲專利ep0425235b1)；auristatin，如monomethylauristatin藥物部分de和df(mmae和mmaf)(參見美國專利號5,635,483和5,780,588和7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；棘孢霉素(calicheamicin)或其衍生物(參見美國專利號5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296；hinman等,cancerres.53:3336-3342(1993)；及l(fā)ode等,cancerres.58:2925-2928(1998))；蒽環(huán)類抗生素，如柔紅霉素或阿霉素(參見kratz等,currentmed.chem.13:477-523(2006)；jeffrey等,bioorganic&med.chem.letters16:358-362(2006)；torgov等,bioconj.chem.16:717-721(2005)；nagy等,proc.natl.acad.sci.usa97:829-834(2000)；dubowchik等,bioorg.&med.chem.letters12:1529-1532(2002)；king等,j.med.chem.45:4336-4343(2002)；及美國專利號6,630,579)；氨甲喋呤；脫乙酰長春花堿(vindesine)；紫杉烷(taxane)，如多西紫杉醇(docetaxel)、紫杉醇、larotaxel、tesetaxel和ortataxel；單端孢霉烯；及cc1065。在另一實施方案中，免疫綴合物包含與酶活性毒素或其片段綴合的本文所述抗體，該酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉a鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素a鏈(來自銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒蛋白a鏈、相思豆毒蛋白a鏈、塑蓮根毒蛋白a鏈、α-帚曲霉素、油桐(aleuritesfordii)蛋白質(zhì)、香石竹毒蛋白、美洲商陸(phytolacaamericana)蛋白質(zhì)(papi、papii和pap-s)、苦瓜(momordicacharantia)抑制劑、麻風(fēng)樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、sapaonariaofficinalis抑制劑、多花白樹毒蛋白、米托潔林(mitogellin)、局限曲霉素、酚霉素、伊諾霉素和單端孢霉烯。在另一實施方案中，免疫綴合物包含與放射性原子綴合形成放射性綴合物的本文所述抗體。可用多種放射性同位素來產(chǎn)生放射性綴合物。實例包括at211、i131、i125、y90、re186、re188、sm153、bi212、p32、pb212及l(fā)u的放射性同位素。在放射性綴合物用于檢測時，它可以包含用于閃爍照相研究的放射性原子，例如tc99m或i123，或者用于核磁共振(nmr)成像(也稱為磁共振成像，mri)的自旋標(biāo)記物，如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。可以用多種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來產(chǎn)生抗體和細(xì)胞毒性劑的綴合物，如3-(2-吡啶二巰基)丙酸n-琥珀酰亞胺酯(spdp)、4-(n-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸-琥珀酰亞胺酯(smcc)、亞胺基硫烷(it)、亞胺酯的雙功能衍生物(如己二酰亞氨酸二甲酯hcl)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亞胺酯)、醛(如戊二醛)、二-疊氮基化合物(如二(對-疊氮基苯甲?；?己二胺)、二-重氮基衍生物(如二-(對-重氮基苯甲?；?-乙二胺)、二異氰酸酯(如2,6-二異氰酸甲苯酯)和雙活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以按照vitetta等,science238:1098(1987)中所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳14標(biāo)記的3-甲基二乙烯三胺五乙酸1-異硫氰基芐酯(mx-dtpa)是用于將放射性核苷酸與抗體綴合的示例性螯合劑。參見wo94/11026。接頭可以是便于在細(xì)胞中釋放細(xì)胞毒性藥物的“可切割接頭”。例如，可以使用酸敏感接頭、肽酶敏感接頭、光敏感接頭、二甲基接頭或包含二硫化物的接頭(chari等,cancerres.52:127-131(1992)；美國專利號5,208,020)。本文的免疫綴合物或adc明確考慮但不限于用包括但不限于bmps、emcs、gmbs、hbvs、lc-smcc、mbs、mpbh、sbap、sia、siab、smcc、smpb、smph、磺基-emcs、磺基-gmbs、磺基-kmus、磺基-mbs、磺基-siab、磺基-smcc、磺基-smpb和svsb(琥珀酰亞胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)的市售交聯(lián)劑(例如來自piercebiotechnology,inc.,rockford,il.,u.s.a)制備的這類綴合物。iii.制備和分析方法根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，提供用于評價抗il-17a/f抗體組合物的方法，其包括以下一步、兩步、三步或四步：(1)測量該組合物中糖基化變體的量；和/或(2)測量該組合物中rr交聯(lián)變體的量；和/或(3)測量該組合物中hmws變體和/或lmws變體的量；和/或(4)測量該組合物中酸性變體的量?？蛇x地，對包含il-17a/f抗體及其變體的組合物進(jìn)行全部四種分析測定。本發(fā)明還涉及用于制備組合物的方法，其包括：(1)產(chǎn)生包含抗il-17a/f抗體及其一種或多種變體的組合物；和(2)對這樣產(chǎn)生的組合物進(jìn)行一種或多種分析測定來評價其中變體的量。該分析測定可以評價和定量以下任何一種或多種的量：(i)糖基化變體和/或(ii)rr交聯(lián)變體和/或(iii)hmws變體和/或lmws變體和/或(iv)酸性變體。因此，可以分析這些變體中的一種、兩種、三種或四種。在某些實施方案中，使這樣產(chǎn)生的組合物避光。在某些實施方案中，該分析測定評價、定量或分離糖基化變體(包括異二聚體和/或同二聚體變體)、和/或hmws變體、和/或rr交聯(lián)變體、和/或酸性變體。例如，該分析測定可以非限制性地包括se-hplc、op-sec、或icief、離子交換柱層析、反相(rp)hplc、lc/ms、肽作圖分析、胰蛋白酶作圖的lc/ms分析、或胰蛋白酶作圖的肽n糖苷酶消化后的lc/ms、毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光(ce-lif)、2-氨基-苯甲酰胺(2-ab)標(biāo)記和2-氨基苯甲酸(2-aa)標(biāo)記。此外，該方法包括評價抗il-17a/f抗體組合物的生物學(xué)活性，其包括測量該組合物中糖基化變體、和/或hmws變體、和/或rr交聯(lián)變體、和/或酸性變體的量，以測定該組合物對il-17a、il-17f和/或il-17af的結(jié)合親和力，和/或該組合物對il-17a、il-17f和/或il-17af誘導(dǎo)活性的抑制、中和作用，并確認(rèn)該組合物中糖基化變體、和/或hmws變體、和/或rr交聯(lián)變體、和/或酸性變體的量處于各自的可接受范圍內(nèi)。在某些實施方案中，該結(jié)合親和力可以通過例如ria、elisa或來測定。在某些實施方案中，本文提供的抗體具有≤1μm、≤100nm、≤10nm、≤1nm、≤0.1nm、≤0.01nm或≤0.001nm(例如10-8m或更小，例如從10-8m至10-13m，例如從10-9m至10-13m)的解離常數(shù)(kd)。在一個實施方案中，通過放射性標(biāo)記抗原結(jié)合測定(ria)來測量kd。在一個實施方案中，用fab形式的目的抗體及其抗原進(jìn)行ria。例如，通過在未標(biāo)記抗原的滴定系列的存在下用最小濃度的(125i)-標(biāo)記抗原平衡fab，然后用抗-fab抗體包被的平板捕獲結(jié)合的抗原，來測量fab對抗原的溶液結(jié)合親和力(參見例如chen等,j.mol.biol.293:865-881(1999))。為了確定用于測定的條件，用含5μg/ml捕獲抗-fab抗體(cappellabs)的50mm碳酸鈉(ph9.6)過夜包被多孔板(thermoscientific)，然后用含2％(w/v)牛血清白蛋白的pbs在室溫(約23℃)封閉2至5小時。在非吸附平板(nunc#269620)中，將100pm或26pm[125i]-抗原與目的fab的系列稀釋液混合(例如，與presta等,cancerres.57:4593-4599(1997)中的抗vegf抗體fab-12的評估一致)。然后過夜孵育目的fab；但是，孵育可以持續(xù)更長時期(例如約65小時)，以確保達(dá)到平衡。然后，將混合物轉(zhuǎn)移至捕獲平板進(jìn)行室溫孵育(例如孵育1小時)。然后去除溶液，用含0.1％聚山梨酸酯的pbs洗滌平板8次。平板干燥后，加入150μl/孔的閃爍體(microscint-20tm；packard)，在topcounttmγ計數(shù)器(packard)上計數(shù)平板10分鐘。選擇給出小于或等于最大結(jié)合的20％的每種fab的濃度用于競爭結(jié)合測定。根據(jù)另一實施方案，可以用表面等離振子共振測定測量kd。例如，用～10個響應(yīng)單位(ru)的固定化抗原cm5芯片，在25℃下用或(biacore,inc.,piscataway,nj)進(jìn)行測定。在一個實施方案中，按照廠家說明書用n-乙基-n’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)活化羧甲基化葡聚糖生物傳感芯片(cm5,biacore,inc.)。用10mm醋酸鈉ph4.8將抗原稀釋至5μg/ml(～0.2μm)，然后按5μl/分鐘的流速注入，以達(dá)到約10個響應(yīng)單位(ru)的偶聯(lián)蛋白質(zhì)。注入抗原后，注入1m乙醇胺，以封閉未反應(yīng)的基團(tuán)。對于動力學(xué)測量，按約25μl/分鐘的流速在25℃下注入兩倍系列稀釋于含0.05％聚山梨酸酯20(tween-20tm)表面活性劑的pbs(pbst)中的fab(0.78nm至500nm)。通過同時擬合結(jié)合和解離傳感圖，用簡單的1:1langmuir結(jié)合模型(evaluationsoftware，版本3.2)計算結(jié)合速率(kon)和解離速率(koff)。將平衡解離常數(shù)(kd)計算為比值koff/kon。參見例如chen等,j.mol.biol.293:865-881(1999)。如果通過以上表面等離振子共振測定測量的結(jié)合速率超過106m-1s-1，則可以通過使用熒光淬滅技術(shù)來測定結(jié)合速率，如在分光計，如裝配停流的分光光度計(avivinstruments)或具有攪拌杯的8000系列slm-amincotm分光光度計(thermospectronic)中測量，該技術(shù)在濃度遞增的抗原存在下測量含20nm抗抗原的抗體(fab形式)的pbsph7.2在25℃下的熒光發(fā)射強(qiáng)度(激發(fā)＝295nm；發(fā)射＝340nm，16nm帶通)的提高或降低。該方法可選地進(jìn)一步包括將該組合物與一種或多種可藥用賦形劑組合來制備藥物組合物。此外，該藥物組合物可以放入與包裝說明書(例如含有說明其用該藥物組合物來治療癌癥的用途的處方信息)包裝在一起的容器，以制備制品。iv.藥物組合物通過將具有所希望的純度的組合物與可選的可藥用賦形劑(remington'spharmaceuticalsciences第16版,osol,a.編輯(1980))混合，通常以凍干制劑或水溶液的形式制備用于儲存的，包含抗il-17a/f抗體及其一種或多種變體的藥物組合物。也考慮抗體晶體(參見美國專利申請?zhí)?002/0136719)?？伤幱觅x形劑在所利用的劑量和濃度下對受體無毒性，且包括緩沖劑，如乙酸組氨酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他糖類，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如edta；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽抗衡離子，如鈉；金屬絡(luò)合物(例如zn-蛋白質(zhì)絡(luò)合物)；和/或非離子型表面活性劑，如聚山梨酸酯(例如聚山梨酸酯20或80)、pluronicstm或聚乙二醇(peg)。待用于體內(nèi)施用的藥物組合物必須無菌。這可以容易地通過濾過無菌濾膜來達(dá)到。v.治療應(yīng)用和用途可以對有需要的個體施用本文所述的組合物來治療免疫相關(guān)或炎性疾病或細(xì)胞增殖相關(guān)疾病如癌癥。在一方面，提供本文提供的組合物用作藥物。在其他方面，提供用于治療免疫相關(guān)或炎性疾病或細(xì)胞增殖相關(guān)疾病的組合物。在某些實施方案中，提供用于治療方法的組合物。在某些實施方案中，本發(fā)明提供本文所述組合物用于治療患有免疫相關(guān)疾病或炎性疾病或細(xì)胞增殖相關(guān)疾病的個體的方法，該方法包括對該個體施用有效量的組合物。在一個這種實施方案中，該方法進(jìn)一步包括對該個體施用有效量的至少一種例如下文所述的附加治療劑。在另一方面，本發(fā)明提供用于治療免疫相關(guān)疾病或炎性疾病或細(xì)胞增殖相關(guān)疾病的方法。在一個實施方案中，該方法包括對患有這種免疫相關(guān)疾病或炎性疾病或細(xì)胞增殖相關(guān)疾病的個體施用有效量的本文所述組合物。在一個這種實施方案中，該方法進(jìn)一步包括對該個體施用有效量的至少一種例如下文所述的附加治療劑。在另一方面，本發(fā)明提供包含本文提供的任意組合物的藥物制劑，例如用于任何上述治療方法。在一個實施方案中，藥物制劑包含本文提供的任意組合物和可藥用載體。在另一實施方案中，藥物制劑包含本文提供的任意組合物和至少一種例如下文所述的附加治療劑。本發(fā)明的組合物可以在治療中單獨使用或與其他藥物聯(lián)合使用。例如，本發(fā)明的組合物可以與至少一種附加治療劑共同施用。在某些實施方案中，該附加治療劑是拮抗抗體、激動抗體、化療劑或細(xì)胞毒性劑。上文指出的這類聯(lián)合治療涵蓋聯(lián)合施用(其中兩種或多種治療劑包含在相同或分開的制劑中)和分開施用，在分開施用的情況下，本發(fā)明的組合物的施用可以發(fā)生在施用該一種或多種附加治療劑之前、與之同時和/或之后。在一個實施方案中，本發(fā)明的組合物的施用和附加治療劑的施用發(fā)生在彼此的約一個月之內(nèi)、或約一周、兩周或三周之內(nèi)、或約一天、兩天、三天、四天、五天或六天之內(nèi)。本發(fā)明的組合物還可以與放療聯(lián)合使用。vi.制品本文的制品的一個實施方案包括容器，如小瓶、注射器或靜脈注射(iv)袋，其包含本文的組合物或藥物組合物?？蛇x地，該制品進(jìn)一步包括含有描述如何使用本文前一章節(jié)的組合物的處方信息的包裝說明書。在某些實施方案中，使該制品避光。以下實施例說明本發(fā)明的具體實施方案及其多種用途。它們僅是為了解釋的目的而給出，不視為限制本發(fā)明。實施例實施例1抗il-17a/fabmcaf5352a的糖基化變體通過中國倉鼠卵巢(cho)細(xì)胞產(chǎn)生抗il17a/f抗體mcaf5352a。對抗體進(jìn)行用tosoh-biosciencesectskgelg3000swxl(7.8x300mm,5μm)柱在agilent1100hplc系統(tǒng)上進(jìn)行的大小排阻層析(sec)。用流動相緩沖液(0.2mk2hpo4,0.25mkcl,ph6.2)在室溫下按0.5ml/分鐘等度運(yùn)行30分鐘。每次分析注入稀釋在流動相緩沖液中的50μg抗體，并在280nm監(jiān)測。用chromeleon軟件包(dionex)分析數(shù)據(jù)。如圖1a和圖1b中所示，額外的峰(峰1)在sec分析中很明顯分子量略大于ab主峰。lc-ms(液相層析-質(zhì)譜分析法)數(shù)據(jù)確認(rèn)峰1是質(zhì)量增加在約2400-3000da范圍內(nèi)的種類的異質(zhì)混合物(數(shù)據(jù)未顯示)。該質(zhì)量增加位于fab重鏈區(qū)域(數(shù)據(jù)未顯示)。樣品的sec分析顯示，組合物包含約2％峰1。峰1抗dtt處理(數(shù)據(jù)未顯示)。肽作圖lc-ms數(shù)據(jù)表明，n連接糖基化造成峰1的存在(數(shù)據(jù)未顯示)。用胰蛋白酶然后用pngase(肽n糖苷酶，newenglandbiolabs)37℃過夜處理富集的峰1樣品。如圖2中所示，pngase消化后出現(xiàn)新的峰，表明n連接糖基化在肽hc44-65中。隨后，測定了fab上的糖基化位點。胰蛋白酶肽hc44-65包含序列g(shù)lewvsginwssggigyadsvk(seqidno:11,hccdr2序列下劃線)，其中nws是n連接糖基化的共有序列。富集的峰1的胰蛋白酶圖譜的lc-ms分析顯示，pngase處理后多出的峰的質(zhì)量略微增加，與pngase消化引起的asn至asp的轉(zhuǎn)化一致。參加圖3a-b。通過所收集的肽的n端測序確認(rèn)了去糖基化的hc44-65中存在asp52。在質(zhì)譜中觀察到約30種不同的糖肽質(zhì)量，精確質(zhì)量結(jié)構(gòu)分配顯示，許多聚糖可能唾液酸化，確證了峰1的酸性性質(zhì)(數(shù)據(jù)未顯示)。在hccdr2中包含約90％糖基化變體的抗il-17a/f抗體的組合物顯示功效降低。將峰1或富含糖基化變體的抗體樣品的il-17a/f結(jié)合與含2％糖基化變體的組合物樣品相比較。將不同濃度的抗體標(biāo)準(zhǔn)品、對照和樣品加至il-17aa或il-17ff或il-17af包被的96孔板。用抗人-hrp和tmb底物溶液檢測結(jié)合的il-17a/f抗體。將結(jié)果(表示為od)對il-17a/f抗體濃度作圖，用4參數(shù)曲線擬合程序來估計抗il-17a/f抗體樣品相對于參考物質(zhì)的活性。結(jié)果報告為相對功效，指定包含2％糖基化變體的參考物質(zhì)為100％。如以下表2中所示，hccdr2中糖基化的存在大幅降低通過elisa測量的與il-17aa、il-17ff和il-17af的結(jié)合。表2elisa比活性(n＝2)結(jié)合aa57％結(jié)合af69％結(jié)合ff67％結(jié)果顯示，與含有2％糖基化變體的樣品相比，包含含有超過2％糖基化變體的抗il-17a/f抗體的樣品顯示降低很多的結(jié)合活性。實施例2抗il17a/fabmcaf5352a的光誘導(dǎo)變色與hmws形成關(guān)聯(lián)抗il-17a/f抗體mcaf5352a顯示非典型光敏感性，其可從暴露于光照如實驗室環(huán)境光照而導(dǎo)致變色(黃化)、抗還原(rr)交聯(lián)和hmws形成。為了進(jìn)一步理解光敏感性特性，在ich指南條件(日曬試驗)下對抗il-17a/f抗體進(jìn)行光照暴露，并通過電荷變體分析、大小排阻分析、肽作圖和質(zhì)譜分析來評價。光脅迫樣品制備使用以下ich指南條件，用atlassuntestcps+燈箱制備抗體樣品：輻照度級＝250瓦/平方米、總uv劑量＝538瓦特-小時/平方米、總可見光劑量＝1,320,000勒克斯-小時/平方米。暴露時間如所示。用成像毛細(xì)管等電聚焦(icief)分析進(jìn)行電荷變體分析用100μm內(nèi)徑x5-cm長度的fc涂層碳氟化合物毛細(xì)管(pn101701,proteinsimple,sanjose,california)進(jìn)行電荷變體分析。按以下配制兩性電解質(zhì)溶液：700μl1％甲基纖維素溶液(proteinsimple,santaclara,ca)、237μl純化h2o、1ml5murea、44μlpharmalyte8-10.5(gehealthcare)、19μlpharmalyte5-8(gehealthcare,waukesha,wi)、8μlpi標(biāo)記5.5(beckmancoulter,brea,ca)、8μlpi標(biāo)記9.77(convergentbioscience,toronto,on)。將160μl兩性電解質(zhì)溶液與羧肽酶(cpb)處理(cpb與抗體比例1:100，37℃20分鐘)后的40μl1mg/ml抗體混合。聚焦條件為1500v1分鐘，然后3000v10分鐘，然后檢測280nm吸光度。大小排阻層析(sec)用tosoh-biosciencesectskgelg3000swxl(7.8x300mm,5μm)柱在agilent1100hplc系統(tǒng)上進(jìn)行大小排阻層析(sec，也稱為se-lc或sc-hplc)。用流動相緩沖液(0.2mk2hpo4,0.25mkcl,ph6.2)在室溫下按0.5ml/分鐘等度運(yùn)行30分鐘。每次分析注入稀釋在流動相緩沖液中的50μg抗體，并在280nm監(jiān)測。用chromeleon軟件包(dionex,sunnyvale,ca)分析數(shù)據(jù)。有機(jī)相大小排阻層析(op-sec)用兩根串聯(lián)的tosoh-bioscience大小排阻層析tskgelsupersw3000(2x300mm,4μm)柱在agilent1200hplc系統(tǒng)上進(jìn)行有機(jī)相sec。用有機(jī)流動相緩沖液(60％acn(乙腈)于h2o中、0.1％tfa(三氟乙酸))在70℃按0.25ml/分鐘等度運(yùn)行45分鐘。所有樣品按1mg/ml濃度配制在1ml20mmtris(ph7.5)緩沖液中。通過在10mmdtt中37℃孵育樣品15分鐘來進(jìn)行mab的還原，然后加入20μl0.1％tfa，以防止二硫鍵重新形成。每次分析注入25μgmab，并在280nm監(jiān)測。用chromeleon軟件包(dionex,sunnyvale,ca)分析數(shù)據(jù)。qtofpremier質(zhì)譜儀(waters,milford,ma)以正離子電噴霧離子化模式運(yùn)行，并在線偶聯(lián)至hplc系統(tǒng)進(jìn)行op-sec-ms分析。用watersmasslynx軟件包(版本4.1)(milford,ma)進(jìn)行儀器控制和數(shù)據(jù)分析。用隨masslynx提供的maxent1軟件進(jìn)行帶多個電荷離子的去卷積。毛細(xì)管電泳-十二烷基硫酸鈉(ce-sds)毛細(xì)管電泳-十二烷基硫酸鈉(ce-sds)按以下進(jìn)行。用熒光染料5羧基四甲基羅丹明琥珀酰亞胺酯衍生樣品。通過凝膠過濾(用nap-5柱)去除游離染料后，通過加入sds/40mm碘乙酰胺并在70℃加熱5分鐘來制備非還原樣品。對于還原樣品的分析，將衍生的樣品與1％(v/v)終濃度的sds和10μl含有1m二硫蘇糖醇的溶液混合，并在70℃加熱20分鐘。用50μm內(nèi)徑的31.2cm熔融石英毛細(xì)管在beckmancoulterproteomelabpa800系統(tǒng)上分析所制備的樣品，整個分析過程保持20℃。通過10kv電動注射40秒將樣品引入毛細(xì)管。用ce-sds運(yùn)行緩沖液作為篩分介質(zhì)按-15kv恒壓進(jìn)行分離。用在488nm運(yùn)行的氬離子激光器進(jìn)行熒光激發(fā)，在560nm監(jiān)測產(chǎn)生的發(fā)射信號。rcm(還原c-羧甲基化)胰蛋白酶肽作圖和rp-hplc-ms分析將全長抗體樣品稀釋入變性緩沖液(6m胍、360mmtris、2mmedta、ph8.6)，并通過在10mmdtt存在下45℃孵育10分鐘來還原。還原后通過在20mm碘乙酸鈉存在下45℃孵育樣品10分鐘進(jìn)行s-羧甲基化來封閉半胱氨酸，然后用40mmdtt在室溫下猝滅。然后通過上樣至nap-5柱(gehealthcare)并用800ul胰蛋白酶消化緩沖液(20mmtrisph8.0)洗脫來對樣品進(jìn)行脫鹽。用3％胰蛋白酶(w/w,rochelifescience)在37℃消化樣品3.5小時。加入tfa至0.3％終濃度來終止消化。用配有phenomenexjupitertmc-18柱(2x250mm,5μm,)的agilent1200hplc分離胰蛋白酶肽。按0.25ml/分鐘流速用在215分鐘內(nèi)從100％溶劑a(h2o,0.1％tfa)至45％溶劑b(acn,0.1％tfa)的梯度進(jìn)行肽洗脫。用以正離子模式運(yùn)行的orbitrapelitetm質(zhì)譜儀(thermofisherscientific)進(jìn)行在214nm觀察到的層析峰的質(zhì)譜分析。用thermoexcalibur軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。完整和還原質(zhì)譜分析此測定的目的是確認(rèn)完整抗體的分子量及還原抗體的重鏈和輕鏈的分子量。使用proteinchip(ii)43mmx75μm,zorbax300sb-c8,5μm柱，用agilentesi-tof(chiptof)分析樣品。完整樣品按0.1mg/ml配制在5％乙腈/0.1％甲酸中，并用aglientesi–tof分析。還原樣品用20mg/mltcep在60℃處理10分鐘，然后按0.05mg/ml配制在5％乙腈/0.1％甲酸中，并用aglientesi–tof分析。按0.05μl注入樣品進(jìn)行分析。用masshunter軟件(agilentsoftwaresuit)去卷積(deconvoluted)完整和還原質(zhì)量。使用o18標(biāo)記的交聯(lián)肽鑒定除以下例外之外，按上文所述制備和分析樣品。在nap-5脫鹽流程之后，將樣品一分為二，并speed-vac處理至干燥。然后將樣品重新溶解在lc-ms級h2o16或h2o18(99.7％原子純度)中，并用重新溶解在適當(dāng)h2o中的凍干胰蛋白酶按上文所述進(jìn)行胰蛋白酶消化。按上文所述進(jìn)行rp-hplc分析。用高碰撞誘導(dǎo)解離(hcd)片段化所有母離子，并用fouriertransfer(ft)分析儀檢測相關(guān)躍遷來進(jìn)行高質(zhì)量準(zhǔn)確度分析。使用天然胰蛋白酶作圖的錯配二硫鍵交聯(lián)將樣品稀釋入變性緩沖液(7m胍、0.1mm乙酸鈉、10mmn-乙基馬來酰亞胺(nem)、ph5.5)，并在37℃孵育2小時。然后通過上樣至nap-5柱(gehealthcare)并用700ul胰蛋白酶消化緩沖液(0.1mtris、1mm氯化鈣、ph7.5)洗脫來對樣品進(jìn)行脫鹽。用10％胰蛋白酶(w/w,roche重組)在10％乙腈存在下在37℃過夜消化樣品。將消化的樣品一分為二(400μl)，在15mmtris(2-羧乙基)膦(tcep)存在下37℃還原30分鐘。向非還原和還原樣品中加入25％tfa。結(jié)果光照暴露導(dǎo)致抗il-17a/f抗體的光誘導(dǎo)變色和抗還原h(huán)mws形成如圖4中所示，暴露于光照的抗il-17a/f抗體mcaf5352a顯示顯著的光誘導(dǎo)黃化，amax為～430nm。在實驗室環(huán)境光照和ich指南光照條件下都觀察到光敏感性。與色氨酸氧化的預(yù)期光吸收(光吸收在315nm-370nm)相比，光吸收顯著紅移。首先用標(biāo)準(zhǔn)sec方法分析了在不同時間點暴露于光照的樣品，以測定完整蛋白質(zhì)中hmws形成的程度。sec數(shù)據(jù)表明光誘導(dǎo)的聚集存在線性增加，在24小時時間點達(dá)到近30％hmws(圖5)。肽側(cè)鏈的氧化可以影響蛋白質(zhì)的局部環(huán)境，導(dǎo)致疏水部分的暴露和非特異性聚集。為了考察所觀察到的聚集的性質(zhì)，開發(fā)了新的有機(jī)相sec(op-sec)方法來分析光照暴露樣品的還原成分。如圖6中可見，光照暴露的抗il17a/f樣品包含明顯的不可還原種類，其在完整蛋白質(zhì)和重鏈之間洗脫。觀察到此種類以與在sec中觀察到的hmws類似的方式(圖5b)隨光照暴露線性增加(圖6b)。在24小時光照暴露時，此抗還原或不可還原h(huán)mws(rr-hmws或nr-hmws)達(dá)到觀察到的總種類的～16％。還通過ce-sds確認(rèn)了rr-hmws的存在(數(shù)據(jù)未顯示)。光照暴露增加抗il-17a/f抗體mcaf5352a的酸性電荷變體為了理解光照暴露對il-17a/f抗體的總體影響，我們進(jìn)行了icief分析來監(jiān)測電荷變體的變化。icief分析顯示光照暴露后酸性變體顯著增加，對堿性變體幾乎沒有影響(圖7)。icief數(shù)據(jù)確認(rèn)，堿性電荷變體沒有增加。不受限于一種或多種機(jī)制，酸性變體可能與met和/或trp氧化關(guān)聯(lián)。光誘導(dǎo)的hmws包含分子間和分子內(nèi)交聯(lián)二者為了測定從op-sec方法觀察到的nr-hmws是否來自分子間交聯(lián)，我們從sec測定收集了完整hmws聚集體和主峰，并用op-sec方法分析了這些級分。來自sec的hmws級分顯示rr-hmws富集近3倍，而來自sec的主峰級分在總rr-hmws中減少(圖8)。此數(shù)據(jù)表明光照暴露后發(fā)生分子間和分子內(nèi)交聯(lián)二者；但是，sec收集的聚集體中的交聯(lián)種類顯著多于sec收集的主峰，表明主要為分子間交聯(lián)。24小時光照脅迫后通過胰蛋白酶肽作圖檢測到甲硫氨酸和色氨酸氧化用lc-ms/ms分析了胰蛋白酶消化產(chǎn)物，用提取離子層析圖(xic)來定量氧化肽中相對于天然肽的met和trp氧化的量。最易發(fā)生光誘導(dǎo)氧化的殘基是見于fc區(qū)中的三個met殘基(seqidno:9的m258、m364、m434)(圖9a)。三個trp殘基(兩個在hc的cdr中(seqidno:7或seqidno:9的w53和w108)，一個在lc的cdr中(seqidno:8或seqidno:10的w94))顯示廣泛氧化(圖9b)。全部三個trp殘基都顯示總體氧化的線性增加，但各顯示不同量的單個氧化種類(圖9c)。雖然w53和w108的總體氧化程度幾乎相同，但w108的二羥色氨酸轉(zhuǎn)化率高4倍(w108和w53分別為0.45％氧化/小時對0.11％氧化/小時)。w94是最易氧化的trp殘基，總體氧化比w53和w108高近2.5倍。此外，與另外兩個trp殘基相比，w94顯示顯著量的犬尿氨酸種類。如圖10中所示，三個色氨酸(lcw94、hcw56和hcw108)顯示對光誘導(dǎo)氧化的顯著易感性。這些變體的光誘導(dǎo)增加還對應(yīng)總體hmws形成的增加和rr交聯(lián)變體的增加，及著色的定性增加。光誘導(dǎo)的hmws主要包含重鏈-重鏈交聯(lián)變體和較低程度的重鏈-輕鏈交聯(lián)變體收集op-sec光照脅迫樣品的級分用esi-tof-ms進(jìn)行更精確的分析。去卷積的esi-tof-ms數(shù)據(jù)顯示，24小時光照暴露后抗il-17a/f抗體mcaf5352a的hc和lc中都存在顯著的氧化，rr-hmws級分主要包含質(zhì)量～102kda的種類，及較低程度的質(zhì)量～74.5kda的種類(圖11b-c)。這些結(jié)果與op-sec-ms數(shù)據(jù)一致，表明存在hc-hc和hc-lc共價交聯(lián)二者。實施例3光照誘導(dǎo)著色和hmws形成是反應(yīng)性氧種類(ros)驅(qū)動的過程為了首先考察抗il-17a/f抗體的光敏感性是否由氧化引起，在24小時光照暴露之前用n2凈化抗體樣品。用n2凈化樣品觀察到了變色程度的可見降低，與hmws和交聯(lián)種類二者的減少相偶聯(lián)(圖12)。這與通過rp-hplc氧化測定分析的總體氧化的減少相關(guān)(參見下文和圖13)。用反相(rp)-hplc測定進(jìn)行總體氧化的檢測和定量。樣品按1mg/ml濃度配制在50mmtrisph8.0中，并用(ides)(genovis,cambridge,ma)(50單位/100μg抗體)37℃消化4小時。然后用20mmdtt(8m胍、50mmtrisph8.0)37℃還原消化的樣品30分鐘。然后在進(jìn)行分析之前加入tcep(tris(2-羧乙基)膦)至25mm終濃度。用配有biobasicphenyltm柱(2.1x150mm,5μm,)(thermofisherscientific,waltham,ma)的agilent1200hplc分離還原的消化產(chǎn)物。按0.3ml/分鐘流速用19分鐘內(nèi)從68％溶劑a(h2o,0.1％tfa)至55％溶劑b(acn,0.1％tfa)的梯度進(jìn)行肽洗脫。在濃度0.1-100mm的nan3存在下使樣品暴露于光照，以考察ros的涉及。觀察到nan3對抗體的光氧化提供保護(hù)作用；但是，nan3濃度與變色程度和rrhmws形成/rr交聯(lián)形成之間也存在直接相關(guān)(圖14)?？傊贵w對實驗室環(huán)境光照和ich指南的光照條件都顯示獨特的光敏感性，其導(dǎo)致可見區(qū)的強(qiáng)光吸收，λmax為～430nm。與色氨酸氧化引起的預(yù)期光吸收(315nm-370nm之間的光吸收)相比，此光吸收顯著紅移。nan3的加入通過以依賴劑量的方式降低430nm光吸收來提供保護(hù)作用，強(qiáng)烈表明此獨特光吸收是光誘導(dǎo)的單線態(tài)氧衍生反應(yīng)性氧種類的副產(chǎn)物，交聯(lián)種類的形成源自光誘導(dǎo)的單線態(tài)氧，變色與交聯(lián)種類直接相關(guān)。實施例4用o18標(biāo)記鑒定交聯(lián)肽o18標(biāo)記的概念按照以下分析順序：1)在h2o16和h2o18存在下進(jìn)行胰蛋白酶消化；2)通過在c端胰蛋白酶羧酸摻入4個o18分子(與h2o16消化的樣品相比+8da質(zhì)量遷移)來鑒定假定的二肽；3)根據(jù)蛋白酶特異性限制進(jìn)行計算機(jī)模擬片段質(zhì)量數(shù)據(jù)庫搜索來鑒定部分肽序列；4)擴(kuò)展至全部假定的肽；5)推斷所涉及的交聯(lián)化學(xué)物和殘基。使用此方法，計算機(jī)模擬分析了分子量molecularmass＝3889.0041da的交聯(lián)母離子的高質(zhì)量準(zhǔn)確度肽片段，觀察到了假定的肽的交聯(lián)母離子，并確認(rèn)了所鑒定的鉸鏈(c232)和fc(c373)之間的交聯(lián)肽(圖15a-1和15a-2)。使用相同的方法，計算機(jī)模擬分析了分子量molecularmass＝4059.9645da的第二交聯(lián)母離子的高質(zhì)量準(zhǔn)確度肽片段，觀察到了假定的肽的交聯(lián)母離子。鑒定出鉸鏈和fab之間的交聯(lián)肽，確認(rèn)交聯(lián)位點在鉸鏈(c235)和fab(c96)之間(圖15b-1和15b-2)。通過lc/ms肽作圖鑒定并確認(rèn)了其他rr交聯(lián)cys殘基(圖16b)。實施例5變體的活性測定分析了本文所述變體的生物學(xué)活性和功效。通過本公開通篇描述和本領(lǐng)域已知的測定測試了變體的結(jié)合和中和活性。例如，可以通過上文所述elisa測定或例如us8,715,669和us8,790,642(在此為了任何目的以其整體引入作為參考)中所述的biacoretm測定來測定變體對il-17a同二聚體、il-17f同二聚體和/或il-17af異二聚體的結(jié)合親和力。簡言之，可以用biacoretm-3000儀器通過表面等離振子共振(srp)來測量抗il-17a/f抗體變體的結(jié)合親和力。通過包被在cm5生物傳感芯片上的小鼠抗人fc抗體(gehealthcare,cat#br-1008-39)捕獲抗體，以達(dá)到約200個響應(yīng)單位(ru)。對于動力學(xué)測量，可以在25℃按30μl/分鐘流速注入pbt緩沖液(含0.05％tween20的pbs)中的人il-17a、il-17f或il-17a/f的兩倍系列稀釋液(0.98nm至125nm)。細(xì)胞因子可從諸如r&dsystems的商業(yè)來源購得。用簡單的1:1langmuir結(jié)合模型(biacoreevaluationsoftware版本3.2)計算結(jié)合速率(kon)和解離速率(koff)。將平衡解離常數(shù)(kd)計算為比值koff/kon。與抗il-17a/f抗體的主要種類或主要包含抗il-17a/f抗體的主要種類的組合物相比，分離和/或富集的本文所述變體顯示結(jié)合親和力降低。可以通過評價il-17a或f誘導(dǎo)的細(xì)胞因子誘導(dǎo)(例如il6或g-csf)來測定變體的中和活性。例如，在第1天按2x104細(xì)胞/150μl培養(yǎng)基/孔將人新生兒包皮成纖維細(xì)胞(invitrogen)接種在96孔板中。第2天用含細(xì)胞因子/抗體的培養(yǎng)基(150μl)替換培養(yǎng)基?？梢允褂眠m宜量的重組人il-17a同二聚體(例如5ng/ml)、il-17f同二聚體(例如50ng/ml)和il-17af異二聚體(例如25ng/ml)。24小時后收集上清，進(jìn)行g(shù)-csfelisa來測量g-csf誘導(dǎo)。在prism中對數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖，并用同一軟件計算ic50/90值。與抗il17a/f抗體的主要種類相比，該一種或多種糖基化變體、酸性變體、hmws變體和rr交聯(lián)變體顯示中和活性降低。應(yīng)理解，前述公開強(qiáng)調(diào)本發(fā)明的具體實施方案，所有與之等同的修改或替代都在所附權(quán)利要求書中所示的本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12