包含編碼生長因子的外源多核苷酸的穩(wěn)定的神經(jīng)干細胞及其使用方法與流程

優(yōu)先權(quán)要求

本申請要求2015年4月15日提交的美國臨時申請?zhí)?2/147,950的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益，并要求2014年10月20日提交的美國臨時申請?zhí)?2/066,174的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益，每個所述臨時申請通過參考并入本文。

背景技術(shù)：

由于胰島素樣生長因子-1(igf-1)在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)中的細胞發(fā)育和存活中的關鍵作用，這種蛋白質(zhì)對于影響cns的各種不同病癥來說已被認為是潛在重要的治療劑。在動物模型中，通過某些方法(包括病毒載體和鞘內(nèi)注射)遞送igf-1，已顯示出治療als的希望。然而，在臨床試驗中，向人類患者皮下給藥成熟的重組igf-1，在als的治療中沒有表現(xiàn)出功效。因此，對于將治療有效量的igf-1遞送到神經(jīng)元細胞損失的位點的改進的方法，存在著需求。

發(fā)明概述

本公開總的來說涉及包含編碼生長因子的外源多核苷酸的人類神經(jīng)干細胞，所述生長因子包括例如神經(jīng)營養(yǎng)因子。在實施方式中，所述生長因子被所述人類神經(jīng)干細胞穩(wěn)定地表達。這些人類神經(jīng)干細胞可用于在需要的對象(例如患有神經(jīng)變性疾病或障礙的人類對象)中治療神經(jīng)變性疾病或障礙。

本公開提供了一種神經(jīng)干細胞(例如穩(wěn)定的人類神經(jīng)干細胞)，其包含編碼胰島素樣生長因子1(igf-1)的外源多核苷酸。所述神經(jīng)干細胞表達、包括例如穩(wěn)定地過表達igf-1。所述包含編碼igf-1的外源多核苷酸的神經(jīng)干細胞與不包含編碼igf-1的外源多核苷酸的神經(jīng)干細胞相比，令人吃驚地產(chǎn)生數(shù)目顯著增加的gad65陽性的gaba能神經(jīng)元。

本公開還提供了一種神經(jīng)干細胞(例如穩(wěn)定的人類神經(jīng)干細胞)，其包含編碼生長因子的外源多核苷酸。所述神經(jīng)干細胞表達、包括例如穩(wěn)定地過表達所述生長因子。

在上面提到或下面提到的實施方式的任一者的實施方式中，所述生長因子是選自胰島素樣生長因子1(igf-1)、神經(jīng)膠質(zhì)細胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(gdnf)、腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子(bdnf)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3(nt-3)和血管內(nèi)皮生長因子(vegf)的神經(jīng)營養(yǎng)因子。

在上面提到或下面提到的實施方式的任一者的實施方式中，igf-1是igf-1同工型例如igf-1同工型4。在上面提到或下面提到的實施方式的任一者的其他實施方式中，所述igf-1同工型4具有如seqidno1所示的核苷酸序列。

在上面提到或下面提到的實施方式的任一者的實施方式中，所述igf-1同工型包含n-端信號肽、成熟的igf-1蛋白和e-肽。

在上面提到或下面提到的實施方式的任一者的實施方式中，所述人類神經(jīng)干細胞源自于選自下述的組織：皮層，海馬，丘腦，中腦，小腦，后腦，脊髓和背根神經(jīng)節(jié)。

在上面提到或下面提到的實施方式的任一者的實施方式中，所述人類神經(jīng)干細胞是從胎兒或胚胎獲得的。

在上面提到或下面提到的實施方式的任一者的實施方式中，所述人類神經(jīng)干細胞是從具有約5至約20周胎齡的胎兒獲得的。

在上面提到或下面提到的實施方式的任一者的實施方式中，所述人類神經(jīng)干細胞能夠分化成神經(jīng)元和/或神經(jīng)膠質(zhì)。

在上面提到或下面提到的實施方式的任一者的實施方式中，所述人類神經(jīng)干細胞能夠移植到腦和/或脊髓中。

在上面提到或下面提到的實施方式的任一者的實施方式中，所述人類神經(jīng)干細胞被永生化。

在上面提到或下面提到的實施方式的任一者的實施方式中，所述人類神經(jīng)干細胞通過用攜帶永生化基因的反轉(zhuǎn)錄病毒感染而被永生化。

在上面提到或下面提到的實施方式的任一者的實施方式中，所述編碼生長因子的外源多核苷酸被可操作地連接到泛素c(ubc)啟動子(例如具有如seqidno：3所示的核苷酸序列的泛素c(ubc)啟動子)、人磷酸甘油酸激酶1啟動子、人突觸蛋白啟動子或合成的cag啟動子。

本公開還提供了一種人類神經(jīng)干細胞，其包含編碼胰島素樣生長因子1(igf-1)的外源多核苷酸，其中igf-1包含如seqidno：1所示的核苷酸序列，并且其中所述igf-1核苷酸序列被穩(wěn)定地表達。

在上面提到或下面提到的實施方式的任一者的實施方式中，所述人類神經(jīng)干細胞被永生化。

在上面提到或下面提到的實施方式的任一者的實施方式中，所述編碼igf-1的外源多核苷酸被連接到泛素c(ubc)啟動子(例如具有如seqidno：3所示的核苷酸序列的泛素c(ubc)啟動子)、人磷酸甘油酸激酶1啟動子、人突觸蛋白啟動子或合成的cag啟動子。

本公開還提供了一種治療神經(jīng)變性疾病或障礙的方法，所述方法包括向?qū)ο?例如患有神經(jīng)變性疾病或障礙的人類對象)給藥治療有效量的一種或多種包含編碼igf-1的外源多核苷酸的神經(jīng)干細胞(例如穩(wěn)定的人類神經(jīng)干細胞)。

本公開還提供了一種治療神經(jīng)變性疾病或障礙的方法，所述方法包括向?qū)ο?例如患有神經(jīng)變性疾病或障礙的人類對象)給藥治療有效量的一種或多種包含編碼生長因子的外源多核苷酸的神經(jīng)干細胞(例如穩(wěn)定的人類神經(jīng)干細胞)。

在上面提到或下面提到的實施方式的任一者的實施方式中，所述生長因子是選自胰島素樣生長因子1(igf-1)、神經(jīng)膠質(zhì)細胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(gdnf)、腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子(bdnf)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3(nt-3)和血管內(nèi)皮生長因子(vegf)的神經(jīng)營養(yǎng)因子。

在上面提到或下面提到的實施方式的任一者的實施方式中，igf-1是igf-1同工型例如igf-1同工型4。在上面提到或下面提到的實施方式的任一者的其他實施方式中，所述igf-1同工型4具有如seqidno1所示的核苷酸序列。

在上面提到或下面提到的實施方式的任一者的實施方式中，所述igf-1同工型包含n-端信號肽、成熟的igf-1蛋白和e-肽。

在上面提到或下面提到的實施方式的任一者的實施方式中，所述治療有效量的一種或多種人類神經(jīng)干細胞能夠分化成神經(jīng)元和/或神經(jīng)膠質(zhì)。

在上面提到或下面提到的實施方式的任一者的實施方式中，所述治療有效量的一種或多種人類神經(jīng)干細胞能夠移植到腦或脊髓中。

在上面提到或下面提到的實施方式的任一者的實施方式中，所述編碼生長因子的外源多核苷酸被可操作地連接到泛素c(ubc)啟動子(例如具有如seqidno：3所示的核苷酸序列的泛素c(ubc)啟動子)、人磷酸甘油酸激酶1啟動子、人突觸蛋白啟動子或合成的cag啟動子。

在上面提到或下面提到的實施方式的任一者的實施方式中，所述神經(jīng)變性疾病或障礙是肌萎縮性側(cè)索硬化癥(als)、脊髓損傷(sci)、創(chuàng)傷性腦損傷(tbi)、阿爾茲海默氏病(ad)、癡呆癥、輕度認知缺損、糖尿病、與糖尿病相關的cns并發(fā)癥、周圍神經(jīng)病、視網(wǎng)膜神經(jīng)病或多發(fā)性硬化癥。

在上面提到或下面提到的實施方式的任一者的實施方式中，所述脊髓損傷是創(chuàng)傷性脊髓損傷或缺血性脊髓損傷。

在上面提到或下面提到的實施方式的任一者的實施方式中，所述治療有效量的一種或多種神經(jīng)干細胞被注射到神經(jīng)變性區(qū)域中。

在上面提到或下面提到的實施方式的任一者的實施方式中，所述治療有效量的一種或多種神經(jīng)干細胞被給藥到神經(jīng)變性區(qū)域中的約5至約50個位點。

在上面提到或下面提到的實施方式的任一者的實施方式中，所述一個或多個位點相隔大約100微米至約5000微米的距離。

在上面提到或下面提到的實施方式的任一者的實施方式中，至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的所述治療有效量的一種或多種神經(jīng)干細胞能夠在神經(jīng)變性區(qū)域處產(chǎn)生神經(jīng)元。

在上面提到或下面提到的實施方式的任一者的實施方式中，所述對象是人。

本公開還提供了制造包含編碼生長因子的外源多核苷酸的人類神經(jīng)干細胞的方法，其中所述生長因子被穩(wěn)定地表達，所述方法包括：獲得一種或多種人類神經(jīng)干細胞；將所述一種或多種神經(jīng)干細胞鋪在用聚d-賴氨酸和纖連蛋白預包被的組織培養(yǎng)物處理的平皿上；在生長培養(yǎng)基(例如無血清生長培養(yǎng)基)中培養(yǎng)所述一種或多種神經(jīng)干細胞；擴增所述一種或多種神經(jīng)干細胞以產(chǎn)生擴增的神經(jīng)干細胞群體；以及用編碼生長因子的載體感染所述神經(jīng)干細胞。在實施方式中，通過用編碼永生化基因的反轉(zhuǎn)錄病毒感染所述擴增的神經(jīng)干細胞，使所述擴增的神經(jīng)干細胞永生化。

在上面提到或下面提到的實施方式的任一者的實施方式中，所述生長因子是選自胰島素樣生長因子1(igf-1)、神經(jīng)膠質(zhì)細胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(gdnf)、腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子(bdnf)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3(nt-3)和血管內(nèi)皮生長因子(vegf)的神經(jīng)營養(yǎng)因子。

在上面提到或下面提到的實施方式的任一者的實施方式中，igf-1是igf-1同工型例如igf-1同工型4。在上面提到或下面提到的實施方式的任一者的其他實施方式中，所述igf-1同工型4具有如seqidno1所示的核苷酸序列。

在上面提到或下面提到的實施方式的任一者的實施方式中，所述igf-1同工型包含n-端信號肽、成熟的igf-1蛋白和e-肽。

在上面提到或下面提到的實施方式的任一者的實施方式中，所述人類神經(jīng)干細胞是從來自于流產(chǎn)人類胎兒的死后分離的組織獲得的。

在上面提到或下面提到的實施方式的任一者的實施方式中，將所述人類神經(jīng)干細胞用帶有myc-er融合基因拷貝的復制缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒感染。

本公開提供了減少對象腦中的β-淀粉樣蛋白(αβ)沉積、清除對象腦(例如海馬和/或皮層)中的αβ沉積物或防止αβ在對象腦中積累的方法，所述方法包括向所述對象腦的一個或多個區(qū)域給藥治療有效量的一種或多種包含編碼igf-1的外源多核苷酸的人類神經(jīng)干細胞。

本公開提供了增加對象腦(例如海馬和/或皮層)中膽堿能神經(jīng)元數(shù)目的方法，所述方法包括向所述對象腦的一個或多個區(qū)域給藥治療有效量的一種或多種包含編碼igf-1的外源多核苷酸的人類神經(jīng)干細胞。

本公開還提供了恢復對象腦中的突觸的方法，所述方法包括向所述對象腦的一個或多個區(qū)域給藥治療有效量的一種或多種包含編碼igf-1的外源多核苷酸的人類神經(jīng)干細胞。

本公開提供了恢復對象的記憶和/或認知的方法，所述方法包括向所述對象腦的一個或多個區(qū)域給藥治療有效量的一種或多種包含編碼igf-1的外源多核苷酸的人類神經(jīng)干細胞。

附圖簡述

在結(jié)合附圖閱讀時，上面的概述以及下面的本公開的詳細描述將被更好地理解。出于說明本公開的目的，附圖中示出的是目前優(yōu)選的實施方式。然而，應該理解，本公開不限于所示出的準確排列方式、實施例和工具。

圖1.hk532和hk532-igf-i細胞中的igf-i生產(chǎn)和信號轉(zhuǎn)導。(a)在整個早期分化期間hk532和hk532-igf-i中的igf-i生產(chǎn)。(b)用dapi(藍色)和igf-ir(綠色)標記的d7hk532和hk532-igf-i的代表性icc圖像。標尺條50μm。(c)未分化的和分化的(d7)hk532和hk532-igf-i中的igf-i信號轉(zhuǎn)導的western印跡分析。將細胞用ly、u或nvp的抑制劑組處理1h，然后用igf-i處理30min。所有印跡用pigf-ir、igf-ir、perk、erk、pakt和akt進行探測。β-肌動蛋白用作載樣對照。

圖2.誘導的igf-i表達不影響hk532增殖和遷移。(a)在d0、d3和d7，hk532和hk532-igf-i培養(yǎng)物中edu陽性細胞的百分數(shù)的定量。(b-e)用dapi(藍色)和edu(綠色)標記的d0和d7hk532和hk532-igf-i的代表性icc圖像。標尺條200μm。(f-g)在d0和d7，遷移的hk532和hk532-igf-i的吸光度的定量。

圖3.誘導的igf-i表達不影響分化期間祖細胞狀態(tài)的維持或神經(jīng)突生長。(a-b)用dapi(藍色)和巢蛋白(紅色)標記的d0hk532和hk532-igf-i的代表性icc圖像。(c)巢蛋白陽性的d0hk532和hk532-igf-i的定量。(d-e)用dapi(藍色)和tuj1(紅色)標記的d7hk532和hk532-igf-i的代表性icc圖像。(f)神經(jīng)指數(shù)測量(μm²/細胞)的定量。標尺條200μm。

圖4.hk532和hk532-igf-i細胞的終末表型。(a-b)用dapi(藍色)和gad65(綠色)標記的d7hk532和hk532-igf-i細胞的代表性icc圖像。(c-d)用dapi(藍色)和vglut(紅色)標記的d7細胞的代表性icc圖像。標尺條200μm。(e)hk532和hk532-igf-i細胞中g(shù)ad65陽性的gaba能神經(jīng)元的定量。hk532-igf-i細胞優(yōu)先分化成gaba能神經(jīng)元(*p<0.05)。(f)hk532和hk532-igf-i細胞中vglut陽性的谷氨酸能神經(jīng)元的定量。

圖5.hk532-igf-i細胞是神經(jīng)保護性的并在移植到app/ps1ad和wt小鼠中后能夠存活。(a)在原代cn、hk532和hk532-igf-i中對aβ毒性作出響應的凋亡和cc3活化的定量。兩種hk532細胞系都比cn更具有抗性(*p<0.05)。(b-d)用dapi和cc3標記的原代cn的代表性icc圖像(標尺條200μm)。(b)沒有用aβ處理的對照cn，(c)用aβ處理的cn，(d)與hk532共培養(yǎng)的用aβ處理的cn，(e)與hk532-igf-i共培養(yǎng)的用aβ處理的cn。(f)cn/hk532共培養(yǎng)物中aβ介導的凋亡和cc3活化的定量。hk532-igf-i與hk532相比表現(xiàn)出提高的神經(jīng)保護能力(*p<0.05)。(g-h)在移植到穹窿海馬傘中之后10周，(g)app/ps1ad動物和(h)wt動物的海馬區(qū)域中人類早期神經(jīng)前體的dapi、hunu和dcx標記的代表性圖像(10x標尺條200μm；60x標尺條50μm)。

圖6.在hk532-igf-i移植后aβ水平顯著降低。熒光顯微術(shù)顯示出在app/psi介質(zhì)處理的小鼠的海馬(a-c)和皮層(d-f)中aβ斑塊(箭頭)的不同形成。使用hk532-igf-i處理，所述斑塊明顯減少。在所有切片中，用dapi(藍色)對核進行染色。標尺條：100μm。(g)與介質(zhì)和nsc處理的組的non-tg相比熒光強度(a.u.)變化的定量顯示，與假給藥組相比，在hk532-igf-i處理的小鼠中aβ的水平顯著降低，表明hk532-igf-i介導aβ積累。***p<0.001。(h)具體在皮層和海馬中的aβ熒光水平的比較顯示，與介質(zhì)注射的小鼠相比，nsc注射的小鼠的皮層切片中aβ沉積顯著減少，***p<0.001，但是在海馬切片中的水平降低不顯著。

圖7.hk532-igf-i的移植挽救了紋狀體中的膽堿能神經(jīng)元。(a-c)每個組中對chat進行免疫染色(綠色)的紋狀體的熒光圖像。標尺條100μm。(d)chat陽性細胞的高放大倍數(shù)圖像。用dapi(藍色)對核進行染色。標尺條：50μm。(e)遍及所有小鼠的紋狀體的細胞計數(shù)揭示出與non-tg小鼠相比，在介質(zhì)注射的app/psi小鼠中膽堿能神經(jīng)元的顯著損失。*p<0.05。(f)與non-tg小鼠相比膽堿能神經(jīng)元的倍數(shù)變化的計算揭示出在用hk532-igf-i處理的app/psi小鼠中顯著更高的量。*p<0.05。

圖8.hk532-igf-i提高突觸前活性并與內(nèi)源神經(jīng)元形成突觸。(a-c)對突觸小泡蛋白進行染色的海馬切片的熒光顯微術(shù)揭示出與介質(zhì)注射的app/psi小鼠相比，在non-tg和nsc注射的app/psi小鼠中熒光信號強度的明顯提高。標尺條：100μm。(d-f)齒狀回的顆粒細胞層附近的突觸小泡蛋白的高放大倍數(shù)圖像。標尺條：50μm。(g-j)來自于nsc處理組的對人類numa(紅色)、突觸小泡蛋白(綠色)和dapi(藍色)進行免疫染色的切片的熒光圖像，顯示出圍繞nsc的突觸前功能。標尺條：50μm。

圖9.冷凍免疫組織化學顯示出人類細胞移植物在腹角中的存在和在整個灰質(zhì)和白質(zhì)中的廣泛分布(圖9a-c)。在每個圖像中，sc121(綠色)顯示出所有人類細胞質(zhì)，dapi(藍色)顯示出所有細胞核。a中插圖被顯示在a’中，a’中的插圖被顯示在a”中。

詳細描述

本公開提供了神經(jīng)干細胞(例如源自于胎兒或胚胎的人類神經(jīng)干細胞)，其包含編碼生長因子、包括例如神經(jīng)營養(yǎng)因子的外源多核苷酸，其中所述生長因子被所述神經(jīng)干細胞穩(wěn)定地表達。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)干細胞令人吃驚地能夠移植在神經(jīng)元細胞損失的位點處，并以治療有效量穩(wěn)定地表達生長因子，包括例如神經(jīng)營養(yǎng)因子例如成熟的igf-1。神經(jīng)營養(yǎng)因子可以包括例如胰島素樣生長因子1(igf-1)(例如具有如seqidno：1所示的序列的igf-1同工型)、神經(jīng)膠質(zhì)細胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(gdnf)、腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子(bdnf)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3(nt-3)或血管內(nèi)皮生長因子(vegf)。然而，可以由神經(jīng)干細胞分泌的任何蛋白質(zhì)都被設想用于本公開。這些人類神經(jīng)干細胞可以從神經(jīng)干細胞系獲得，并且可用于治療神經(jīng)變性疾病或障礙，包括各種不同的cns適應癥，包括但不限于肌萎縮性側(cè)索硬化癥(als)、脊髓損傷(sci)、創(chuàng)傷性腦損傷(tbi)、阿爾茲海默氏病(ad)、癡呆癥、輕度認知缺損、糖尿病、與糖尿病相關的cns并發(fā)癥、周圍神經(jīng)病、視網(wǎng)膜神經(jīng)病和多發(fā)性硬化癥。

令人吃驚的是，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，包含編碼igf-1的外源多核苷酸并且其中igf-1被神經(jīng)干細胞穩(wěn)定地表達的人類神經(jīng)干細胞，與不包含所述編碼igf-1的外源多核苷酸的神經(jīng)干細胞相比，產(chǎn)生(即可以分化成和/或支持其生長)數(shù)目顯著增加的gad65陽性的gaba能神經(jīng)元。這在治療上與阿爾茲海默氏病相關，因為在小鼠模型和人類患者中已報道了gaba能神經(jīng)元特異性的變性(loreth等，(2012)neurobioldis,2012.47(1):p.1-12；schwab等，(2013)jalzheimersdis,2013.33(4):p.1073-88)。因此，穩(wěn)定地表達igf-1的神經(jīng)干細胞的移植提供了重新產(chǎn)生的gaba能神經(jīng)元的來源，以代替在阿爾茲海默氏病中選擇性損失的gaba能神經(jīng)元，并恢復腦中關鍵的神經(jīng)回路。

本公開的表達生長因子的神經(jīng)干細胞可能是穩(wěn)定和多能的，因為它們高效地移植到腦和脊髓中，一起分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)，并與宿主組織整合。這種整合包括在宿主神經(jīng)元與移植的干細胞來源的神經(jīng)元之間形成突觸連接。在cns中穩(wěn)定的移植和整合的優(yōu)點在于只要所述細胞是活的，則細胞移植以及因此生長因子的生產(chǎn)可能是恒定和穩(wěn)定的。此外，宿主神經(jīng)元與移植的神經(jīng)元之間突觸接觸的形成能夠?qū)⑸L因子直接遞送到與受損或患病神經(jīng)元相鄰的突觸和間質(zhì)空間中。此外，所述神經(jīng)干細胞本身是治療性的，產(chǎn)生廣泛種類的已知生長因子并替換在疾病過程中可能損失的神經(jīng)元。

另外，本公開的神經(jīng)干細胞提供的優(yōu)點在于它們的神經(jīng)膠質(zhì)后代在整個腦和脊髓中廣泛遷移，而它們的神經(jīng)元后代保持定位在它們被注入的位點附近。這種性質(zhì)能夠使人們選擇性地靶向通過神經(jīng)元進行的生長因子的定位遞送或通過神經(jīng)膠質(zhì)進行的在整個cns中的廣泛分布的遞送。生長因子例如神經(jīng)營養(yǎng)因子如igf-1、gdnf、bdnf、nt3、ngf、vegf等的神經(jīng)元分泌的優(yōu)點在于即使是少量的生長因子也能達到治療劑量，因為它被持續(xù)釋放到與靶細胞相鄰的細胞外空間中，包括與高濃度的相應受體緊鄰的突觸間隙的有限空間中，隨后它可以被靶細胞內(nèi)化并逆行轉(zhuǎn)運(rind等，(2005)，jneurosci25:539-549)。

此外，公開了作為其起源或其生長條件的結(jié)果，能夠產(chǎn)生所需比例的神經(jīng)元和/或神經(jīng)膠質(zhì)(例如產(chǎn)生60％神經(jīng)元和40％神經(jīng)膠質(zhì))的神經(jīng)干細胞。根據(jù)需要，那些產(chǎn)生較高比例神經(jīng)元的神經(jīng)干細胞可用于將生長因子局部遞送到特定靶區(qū)域，而那些產(chǎn)生較高比例神經(jīng)膠質(zhì)的神經(jīng)干細胞可用于更加全局性地遞送生長因子?？赡芟Ｍ植拷o藥的生長因子的實例包括但不限于具有多效性效果的神經(jīng)營養(yǎng)因子例如igf-1、ngf、nt3、或bdnf?？赡芟Ｍ中越o藥的生長因子的實例包括但不限于用于酶置換例如用于治療溶酶體疾病的蛋白質(zhì)、針對細胞因子、細胞因子受體或生長因子受體的單克隆抗體。

在實施方式中，所述生長因子是神經(jīng)營養(yǎng)因子例如igf-1，包括例如圖1中所示的ifg1同工型。所述igf-1同工型可以是igf-1同工型4。在實施方式中，所述igf-1同工型4具有如seqidno1所示的核苷酸序列(如seqidno：2所示的氨基酸序列)。這種同工型含有三種不同的潛在生物學效應物：成熟的igf-1蛋白，其能夠結(jié)合各種不同的igf結(jié)合蛋白以及igf-1受體；在pro-igf-1加工期間釋放的羧基(c-)端mgf肽，其可以通過不依賴于igf-1受體的機制充當對抗缺血和其他有害病癥的神經(jīng)保護劑；以及在pre-pro-igf-1加工期間釋放的氨基(n-)端信號肽。

igf-1生物學是復雜的。在兩個不同啟動子控制之下產(chǎn)生6種不同形式的人類igf-1mrna轉(zhuǎn)錄本(在barton(2006)，japplphysiol100:1778-1784中綜述)，它們都產(chǎn)生單個成熟的igf-1蛋白。所述各種不同的轉(zhuǎn)錄本被翻譯成成熟的igf-1蛋白，在此期間產(chǎn)生獨特的切割產(chǎn)物。已知所述轉(zhuǎn)錄本同工型和各種不同的切割產(chǎn)物是組織特異性的。因此，盡管75％的循環(huán)中的成熟igf-1蛋白由肝臟產(chǎn)生，但幾種其他組織(包括肌肉、腎臟和腦/脊髓)也產(chǎn)生它們自己的igf-1轉(zhuǎn)錄本和蛋白。此外，例如腦中的igf-1水平的調(diào)控不依賴于血漿igf-1水平(adams等，(2009)，growthfactors27:181-188)。值得注意的是，大鼠和小鼠igf-1基因的調(diào)控不同于人類igf-1基因，在所述物種之間產(chǎn)生不等同的igf-1同工型(barton(2006),appl.physiol.nutr.metab.31:791-797)。

cns中生長因子的劑量(例如治療有效劑量)和定位可以通過使用不同啟動子，也可以通過使用具有不同的分化和遷移特性的不同神經(jīng)干細胞系來改變。例如，突觸蛋白啟動子可用于驅(qū)動主要在神經(jīng)元后代中的低至中水平的表達，由此確保定位分布于靶神經(jīng)元群體。相反，泛素c啟動子可用于指導向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞后代兩者的表達，能夠使所述生長因子更廣泛地分布。另外，由融合到雞β-肌動蛋白啟動子的巨細胞病毒(cmv)增強子構(gòu)成的合成的cag啟動子，可以指導所述生長因子的非常高水平的表達。此外，根據(jù)需要，產(chǎn)生較高比例神經(jīng)元的神經(jīng)干細胞可用于將生長因子局部遞送到特定靶區(qū)域，而那些產(chǎn)生較高比例神經(jīng)膠質(zhì)的神經(jīng)干細胞可用于更加全局性地遞送生長因子?？赡芟Ｍ植拷o藥的生長因子的實例包括但不限于具有多效性效果的神經(jīng)營養(yǎng)因子例如igf-1、ngf、nt3、或bdnf?？赡芟Ｍ中越o藥的生長因子的實例包括但不限于用于酶置換例如用于治療溶酶體疾病的蛋白質(zhì)、針對細胞因子、細胞因子受體或生長因子受體的單克隆抗體。

神經(jīng)干細胞

提供了包含編碼生長因子例如神經(jīng)營養(yǎng)因子的外源多核苷酸的神經(jīng)干細胞(例如穩(wěn)定的人類神經(jīng)干細胞)。所述神經(jīng)營養(yǎng)因子可以是胰島素樣生長因子1(igf-1)、神經(jīng)膠質(zhì)細胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(gdnf)、腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子(bdnf)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3(nt-3)或血管內(nèi)皮生長因子(vegf)。還提供了包含具有編碼生長因子的外源多核苷酸的神經(jīng)干細胞的神經(jīng)干細胞系。所述神經(jīng)干細胞優(yōu)選是穩(wěn)定的，并且在培養(yǎng)中即使在超過60次細胞倍增后也不分化。

本公開提供了包含編碼胰島素樣生長因子1(igf-1)的外源多核苷酸的神經(jīng)干細胞(例如穩(wěn)定的人類神經(jīng)干細胞)。所述神經(jīng)干細胞表達、包括例如穩(wěn)定地過表達igf-1。所述包含編碼igf-1的外源多核苷酸的神經(jīng)干細胞與不包含編碼igf-1的外源多核苷酸的神經(jīng)干細胞相比，令人吃驚地產(chǎn)生數(shù)目顯著增加的gad65陽性的gaba能神經(jīng)元。所述神經(jīng)干細胞優(yōu)選是穩(wěn)定的，并且在培養(yǎng)中即使在超過60次細胞倍增后也不分化。

本公開提供了一種穩(wěn)定的人類神經(jīng)干細胞，其表達編碼胰島素樣生長因子1(igf-1)的外源多核苷酸。

在實施方式中，所述神經(jīng)營養(yǎng)因子是igf-1，包括例如igf-1同工型，例如具有如seqidno：1所示的序列的igf-1同工型4。令人吃驚的是，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，具有如seqidno：1所示的序列的igf-1同工型4，當被神經(jīng)干細胞表達時是有功能的(例如，它結(jié)合它的受體并啟動具有生理影響的信號轉(zhuǎn)導過程)。這一發(fā)現(xiàn)完全是出人意料的，因為一些現(xiàn)有報道指出，表達成熟igf-1的神經(jīng)干細胞的給藥在提供功能性益處中是無效的(即所述神經(jīng)干細胞在治療疾病或障礙中是無效的)。

當在本文中使用時，術(shù)語“神經(jīng)干細胞”或“nsc”是指可以根據(jù)其分化成中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)的三種主要細胞類型中的每一種的能力在功能上定義的多能干細胞，所述三種主要細胞類型是：神經(jīng)元，星形細胞和少突細胞。當在本文中使用時，術(shù)語“干細胞”是指能夠自我更新的未分化細胞，這意味著通過每次細胞分裂，至少一個子代細胞也將是干細胞。nsc也可指稱神經(jīng)或神經(jīng)元祖細胞或神經(jīng)上皮細胞前體。

本公開還提供了制造包含編碼生長因子的外源多核苷酸的人類神經(jīng)干細胞的方法，其中所述生長因子被穩(wěn)定地表達，所述方法包括：獲得一種或多種人類神經(jīng)干細胞；將所述一種或多種神經(jīng)干細胞鋪在用聚d-賴氨酸和纖連蛋白預包被的組織培養(yǎng)物處理的平皿上；在無血清生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述一種或多種神經(jīng)干細胞；擴增所述一種或多種神經(jīng)干細胞以產(chǎn)生擴增的神經(jīng)干細胞群體；用編碼永生化基因的反轉(zhuǎn)錄病毒感染所述擴增的神經(jīng)干細胞；以及用編碼生長因子的載體感染先前用反轉(zhuǎn)錄病毒感染的神經(jīng)干細胞。這種永生化的神經(jīng)干細胞以及制造所述神經(jīng)干細胞的方法被公開在美國專利號7,544,511中。

在一個實施方式中，所述nsc是多能的，使得每個細胞具有分化成神經(jīng)元、星形細胞或少突細胞的能力。在另一個實施方式中，所述nsc是雙能的，使得每個細胞具有分化成所述cns的三種細胞類型中的兩種細胞類型的能力。在另一個實施方式中，所述nsc至少包括在體外產(chǎn)生神經(jīng)元和星形細胞兩者的雙能細胞，并至少包括在體內(nèi)產(chǎn)生神經(jīng)元的單能細胞。

生長條件可以影響細胞朝著一種或另一種細胞類型分化的方向，表明所述細胞不被指派給單一譜系。在有利于神經(jīng)元分化的培養(yǎng)條件中，細胞、特別是來自于人類cns的細胞大部分是對神經(jīng)元和星形細胞雙能的，極少分化成少突細胞。因此，所公開的方法的分化的細胞培養(yǎng)物可以產(chǎn)生神經(jīng)元和星形細胞。

在實施方式中，從cns分離nsc。當在本文中使用時，術(shù)語“分離的”在指稱細胞時，是指處于與細胞天然存在(例如細胞在生物體中天然存在)的環(huán)境不同的環(huán)境中的細胞，并且將所述細胞從其天然環(huán)境中取出。

可以從所需神經(jīng)元群體天然神經(jīng)起源的區(qū)域以及從胚胎、胎兒、新生兒、青少年或成年人的組織分離nsc。所需細胞群體可以包括具有特定神經(jīng)元表型的細胞，其可以替換或補充這種在疾病進展過程中失去或失活的表型。在實施方式中，從室下區(qū)(svz)或從齒狀回(dg)的顆粒下層(subgranularzone)分離nsc。在優(yōu)選實施方式中，從其中腹側(cè)運動神經(jīng)元的神經(jīng)發(fā)生顯著的脊髓分離nsc，并且在人類胎兒發(fā)育期間腹側(cè)運動神經(jīng)元的神經(jīng)發(fā)生顯著的胎齡時獲得所述nsc。

因此，在實施方式中，從處于約6.5至約20周胎齡的脊髓分離nsc。優(yōu)選地，從處于約7至約9周胎齡的脊髓分離nsc。在另一個實施方式中，從胚胎脊髓組織分離nsc。在又一個實施方式中，從人類分離神經(jīng)干細胞。應該認識到，可分離的nsc群體的比例可以隨著供體的年齡而變。細胞群體的擴增能力也可以隨著供體年齡而變。

例如，中腦腹側(cè)的nsc不同于從處于相同妊娠階段的脊髓獲得的nsc。具體來說，來自于中腦腹側(cè)的nsc可以產(chǎn)生表達酪氨酸羥化酶的多巴胺能神經(jīng)元，而來自于脊髓的nsc可以產(chǎn)生產(chǎn)乙酰膽堿的膽堿能神經(jīng)元。然而，兩種細胞類型都同時產(chǎn)生更加普遍的產(chǎn)谷氨酸和gaba的神經(jīng)元。因此，在實施方式中，所公開的方法包括從脊髓獲得nsc，以治療通過產(chǎn)乙酰膽堿的膽堿能神經(jīng)元的植入而被至少部分改善或減弱的病癥。

也可以從新生兒和成年人組織分離nsc。源自于新生兒和成年人組織的nsc在它們分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)的能力以及它們的生長和分化特征方面是定量等同的。然而，從各種不同的新生兒和成年人cns體外分離nsc的效率可能遠低于從具有更豐富的nsc群體的胎兒組織分離nsc。然而，與使用胎兒來源的nsc相同，本公開的方法能夠使至少約30％的源自于新生兒和成年人來源的nsc在體外分化成神經(jīng)元。因此，新生兒和成年人組織可以如上面在胎兒來源的nsc的情形中所描述的來使用。

在實施方式中，將人類胎兒脊髓組織在顯微鏡下剖開。分離對應于下頸椎/上胸椎區(qū)段的組織區(qū)域。將nsc分離，合并，并在聚d-賴氨酸包被的培養(yǎng)容器上，在含有纖連蛋白和堿性成纖維細胞生長因子(bfgf；fgf-2)的培養(yǎng)基中擴增。將細胞擴增，然后在無防腐劑和抗生素的培養(yǎng)基中濃縮到每微升約10,000個細胞的所需靶細胞密度。濃縮的細胞可以新鮮地用于移植或冷凍以備晚些時候使用。

在實施方式中，所述nsc源自于胚胎干細胞或誘導的多能干細胞。當在本文中使用時，術(shù)語“胚胎干細胞”是指從發(fā)育中的胚胎分離的干細胞，其可以產(chǎn)生身體的所有細胞(例如外胚層、中胚層和/或內(nèi)胚層細胞譜系的細胞)。當在本文中使用時，術(shù)語“誘導的多能干細胞”是指源自于體細胞(例如分化的體細胞)的干細胞，其具有比所述體細胞更高的潛能。胚胎干細胞和誘導的多能干細胞能夠分化成更加成熟的細胞(例如神經(jīng)干細胞或神經(jīng)祖細胞)。用于在體外生長胚胎干細胞或誘導的多能干細胞并將其分化成nsc的方法，可以是例如在daadi等，plosone.3(2):e1644(2008)中描述的那些方法。

存在幾種標準的分子生物學技術(shù)可用于在本文中公開的神經(jīng)干細胞中調(diào)控編碼生長因子的多核苷酸的表達。例如，可以使用不同啟動子來調(diào)控所述生長因子的表達水平和/或調(diào)控所述神經(jīng)干細胞的哪些后代表達所述因子。例如，人類泛素c(ubc)、pgk或cag啟動子在本文公開的人類神經(jīng)干細胞的分化的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)后代中提供生長因子的不同表達水平。pgk啟動子能夠產(chǎn)生每24小時每百萬個細胞約0.5ng蛋白的低的生長因子水平，ubc啟動子能夠產(chǎn)生每24小時每百萬個細胞約2ng蛋白的更大量的生長因子，并且cag啟動子能夠產(chǎn)生每24小時每百萬個細胞約14ng蛋白的更大量的生長因子。此外或可替選地，表達可以被驅(qū)動并限制到神經(jīng)干細胞的某些后代。例如，人突觸蛋白啟動子可用于指導神經(jīng)干細胞的神經(jīng)元后代的生長因子表達。

治療方法

本文所公開的神經(jīng)干細胞可用于治療疾病或障礙的方法中，所述疾病或障礙包括神經(jīng)變性疾病或障礙例如肌萎縮性側(cè)索硬化癥(als)、脊髓損傷(sci)、創(chuàng)傷性腦損傷(tbi)、阿爾茲海默氏病(ad)、癡呆癥、輕度認知缺損、糖尿病、與糖尿病相關的cns并發(fā)癥、周圍神經(jīng)病、視網(wǎng)膜神經(jīng)病或多發(fā)性硬化癥。這些方法可以包括向?qū)ο蠼o藥治療有效量的本文中公開的神經(jīng)干細胞，包括例如通過注射。在實施方式中，用所述公開的神經(jīng)干細胞治療的對象在所述神經(jīng)干細胞給藥之前、期間和/或之后被免疫抑制。

在某些實施方式中，疾病、障礙或病癥的“治療”至少部分包括：(1)預防所述疾病、障礙或病癥，即在暴露于或易感所述疾病、障礙或病癥但尚未經(jīng)歷或表現(xiàn)出所述疾病、障礙或病癥的癥狀的哺乳動物中導致所述疾病、障礙或病癥的臨床癥狀不發(fā)生；(2)抑制所述疾病、障礙或病癥，即中止或減輕所述疾病、障礙或病癥或其臨床癥狀的發(fā)生；或(3)緩解所述疾病、障礙或病癥，即引起所述疾病、障礙或病癥或其臨床癥狀消退。如果給藥所述公開的神經(jīng)干細胞的對象與未用所述公開的神經(jīng)干細胞治療的對象相比在海馬依賴性行為任務中表現(xiàn)出改善，則可以認為神經(jīng)變性疾病或障礙得到治療。

當在本文中使用時，術(shù)語“預防”、“遏制”、“抑制”是指一種行動過程(例如給藥本文所公開的nsc)，其發(fā)起的方式(例如在疾病狀態(tài)或病癥的臨床癥狀例如aβ的沉積物發(fā)作之前)使得可以暫時或永久地預防、遏制或減少所述疾病狀態(tài)或病癥的臨床表現(xiàn)(例如aβ沉積物的形成)的發(fā)生。這種預防、遏制或減少不必定是絕對有用的。

在某些實施方式中，本文中使用的“有效量”是指在所述對象上提供治療效果所需的脊髓來源的神經(jīng)干細胞的量。當在本文中使用時，“治療有效量”是指所給藥的將在某種程度上緩解待治療的疾病、障礙或病癥的一種或多種癥狀的充足量的脊髓來源的神經(jīng)干細胞。在某些實施方式中，結(jié)果是疾病的征兆、癥狀或病因的減輕和/或緩和，或生物系統(tǒng)的任何其他所需變化。例如，在某些實施方式中，對于治療用途來說，“有效量”是提供疾病癥狀的臨床顯著降低而沒有過多不良副作用所需的脊髓來源的神經(jīng)干細胞的量。在某些實施方式中，使用諸如劑量遞增研究的技術(shù)來確定任何個體病例中的適合的“有效量”。術(shù)語“治療有效量”包括例如預防有效量。在其他實施方式中，脊髓來源的神經(jīng)干細胞的“有效量”是有效地實現(xiàn)所需藥理效果或治療改進而沒有過多不良副作用的量。在其他實施方式中，應該理解，“有效量”或“治療有效量”隨對象而變，這是由于對象的代謝、年齡、體重、總體狀況，待治療的病癥，待治療的病癥的嚴重性以及處方醫(yī)生的判斷不同。

所述神經(jīng)干細胞可以被移植到運動皮層和/或脊髓灰質(zhì)中以在als中挽救變性的上和下運動神經(jīng)元，移植到梗塞位點中以在缺血性或出血性中風的急性和慢性階段中挽救受影響的神經(jīng)元并減小半影區(qū)的尺寸，移植到meynert基底核中以在癡呆癥和阿爾茲海默氏病患者中保護膽堿能神經(jīng)元，移植到海馬或腦的其他區(qū)域中以在衰老期間或阿爾茲海默氏病中減緩癡呆癥的發(fā)展或在癲癇中減少癲癇發(fā)作，移植到白質(zhì)纖維束例如內(nèi)囊和胼胝體中用于創(chuàng)傷性腦損傷或中風中的神經(jīng)保護。所述神經(jīng)干細胞可以從這些位置在整個腦中徑向遷移以分配igf-1蛋白，用于治療其他適應癥例如糖尿病和與糖尿病相關的cns并發(fā)癥。所述神經(jīng)干細胞可以被移植到肋間肌和/或膈肌中，以增加als或頸部脊髓損傷患者的肌肉終板并提高呼吸量。所述神經(jīng)干細胞可以被移植到骨骼肌中以在肌肉萎縮癥和各種不同的運動神經(jīng)元疾病中增加肌纖維。所述神經(jīng)干細胞可以被移植到小腦和/或腦干中，以挽救被包括脊髓性肌萎縮、延髓性肌萎縮和小腦性共濟失調(diào)的病癥所影響的運動神經(jīng)元。所述神經(jīng)干細胞可以被脊柱內(nèi)移植，用于在多發(fā)性硬化癥中再生具髓鞘的少突細胞。所述神經(jīng)干細胞可以被移植到鞘內(nèi)空間或蛛網(wǎng)膜下空間中以獲得igf-1的全局分布，用于酶缺陷疾病中的神經(jīng)保護。

本公開提供了減少對象腦(例如海馬和/或皮層)中的β-淀粉樣蛋白(aβ)沉積(例如aβ沉積水平)的方法，所述方法包括向所述對象腦的一個或多個區(qū)域給藥治療有效量的一種或多種包含編碼igf-1的外源多核苷酸的人類神經(jīng)干細胞。所述對象腦中的aβ水平可以被降低5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或更多，包括當與未給藥治療有效量的一種或多種包含編碼igf-1的外源多核苷酸的人類神經(jīng)干細胞的對象腦相比時。所述對象腦中的aβ水平可以被降低2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍，包括當與未給藥治療有效量的一種或多種包含編碼igf-1的外源多核苷酸的人類神經(jīng)干細胞的對象腦相比時。在某些實施方式中，所述對象患有阿爾茲海默氏病。

本公開提供了清除對象腦(例如海馬和/或皮層)中的aβ沉積物或防止aβ在對象腦(例如海馬和/或皮層)中積累的方法，所述方法包括向所述對象腦的一個或多個區(qū)域給藥治療有效量的一種或多種包含編碼igf-1的外源多核苷酸的人類神經(jīng)干細胞。在某些實施方式中，所述對象患有阿爾茲海默氏病。

本公開提供了防止aβ在對象腦(例如海馬和/或皮層)中積累的方法，所述方法包括向所述對象腦的一個或多個區(qū)域給藥治療有效量的一種或多種包含編碼igf-1的外源多核苷酸的人類神經(jīng)干細胞。在某些實施方式中，所述對象患有阿爾茲海默氏病。

本公開提供了提高對象腦(例如海馬和/或皮層)中的膽堿能神經(jīng)元數(shù)目的方法，所述方法包括向所述對象腦的一個或多個區(qū)域給藥治療有效量的一種或多種包含編碼igf-1的外源多核苷酸的人類神經(jīng)干細胞。所述對象腦中的膽堿能神經(jīng)元數(shù)目可以被提高5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或更多，包括當與未給藥治療有效量的一種或多種包含編碼igf-1的外源多核苷酸的人類神經(jīng)干細胞的對象腦相比時。所述對象腦中的膽堿能神經(jīng)元數(shù)目可以被提高2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍，包括當與未給藥治療有效量的一種或多種包含編碼igf-1的外源多核苷酸的人類神經(jīng)干細胞的對象腦相比時。在某些實施方式中，所述對象患有阿爾茲海默氏病。

本公開還提供了恢復對象腦中的突觸的方法，所述方法包括向所述對象腦的一個或多個區(qū)域給藥治療有效量的一種或多種包含編碼igf-1的外源多核苷酸的人類神經(jīng)干細胞。在某些實施方式中，所述對象患有阿爾茲海默氏病。

本公開提供了恢復對象的記憶和/或認知的方法，所述方法包括向所述對象腦的一個或多個區(qū)域給藥治療有效量的一種或多種包含編碼igf-1的外源多核苷酸的人類神經(jīng)干細胞。在某些實施方式中，所述對象患有阿爾茲海默氏病。

在實施方式中，所述nsc可以用可接受的藥用載體稀釋。當在本文中使用時，術(shù)語“可藥用載體”是指本公開的細胞與其一起給藥，并且被聯(lián)邦或州政府的管理機構(gòu)批準或列于美國藥典或其他公認藥典中可用于動物、更具體來說用于人類的稀釋劑、佐劑、賦形劑或介質(zhì)。這些藥用載體可以是液體例如水和油，包括石油、動物、植物或合成起源的油，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。所述藥用載體可以是鹽水、阿拉伯膠、明膠、淀粉糊、滑石、角蛋白、膠體二氧化硅、尿素等。當給藥到患者時，所述神經(jīng)干細胞和可藥用載體可以是無菌的。當所述細胞被靜脈內(nèi)給藥時，水是有用的載體。鹽水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液也可用作液體載體，特別是用于注射溶液。適合的藥用載體還包括賦形劑例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、單硬脂酸甘油酯、氯化鈉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如果需要，本發(fā)明的組合物還可以含有少量潤濕劑或乳化劑或ph緩沖劑。在有利情況下，本發(fā)明的組合物可以采取溶液、乳液、緩釋制劑的形式或任何其他適合于使用的形式。適合的載體的選擇在普通技術(shù)人員的技巧范圍之內(nèi)。

從在培養(yǎng)中擴增的神經(jīng)干細胞的操作，可以獲得各種不同的神經(jīng)元亞型。因此，如有需要，在所公開的方法的基礎上，可以將特定神經(jīng)元亞型從其他無關或不想要的細胞中分離和純化出來以改善結(jié)果，并且可將其用于認知功能障礙的治療。

本公開的方法中的nsc可以源自于一個位點，并作為自體移植物移植到同一對象內(nèi)的另一個位點。此外，本公開的方法中的nsc可以源自于遺傳一致的供體并作為同系異體移植物(isograft)移植。此外，本公開的方法中的nsc可以源自于同一物種的遺傳不一致的成員并作為同種異體移植物移植?；蛘撸琻sc可以源自于非人類來源并作為異種移植物移植。通過開發(fā)強有力的免疫抑制劑，同種異體移植物和非人類神經(jīng)前體細胞例如豬來源的神經(jīng)前體細胞的異種移植物可以被移植到人類對象中。

樣品組織可以通過任何標準方法來解離。在一個實施方式中，使用移液器和不含二價陽離子的緩沖液(例如鹽水)，通過輕柔研磨將組織解離以形成解離細胞的懸液。為了避免過高的局部細胞濃度，充分解離以主要獲得單細胞是合乎需要的。

為了nsc的成功商業(yè)應用，維持通過多次連續(xù)傳代后仍具有穩(wěn)定的擴增和分化能力的穩(wěn)健(robust)和一致的培養(yǎng)物是合乎需要的。如上所述，可以優(yōu)化培養(yǎng)方法以實現(xiàn)來自于不同區(qū)域和cns發(fā)育年齡的nsc的各個細胞系的長期穩(wěn)定的擴增，同時維持它們獨特的祖細胞性質(zhì)。在一個實施方式中，干細胞可以按照在u.s.8,460,651、u.s.8,236,299、u.s.7,691,629、u.s.5,753,506、u.s.6,040,180或u.s.7,544,511中陳述的方法來培養(yǎng)，所述專利整體通過參考并入本文。

在實施方式中，本公開的方法的nsc可以包括用于移植的預分化細胞。為了獲得細胞的最大得率并簡化程序，收獲匯合的培養(yǎng)物用于移植，其主要包含未分化細胞的群體。然而，應該認識到，由于細胞密度提高，也可以存在少量剛剛開始自發(fā)分化的細胞群體。

在實施方式中，將nsc濃縮在溶液例如上面描述的可臨床使用的休眠或冷凍溶液中。在實施方式中，將nsc濃縮至適合的細胞密度，其可以與用于所述細胞給藥的細胞密度相同或不同。在實施方式中，取決于多種因素例如注射位點、有益效果所必需的最低劑量和毒性副作用考量，用于給藥的細胞密度可以在每微升約1,000個細胞至每微升約1,000,000個細胞之間變化。

使用已知方法時供體細胞的低的細胞存活率，使得有必要向相對小的區(qū)域遞送大量細胞以嘗試有效治療。然而，注射體積是施加在宿主組織上的靜水壓，并且與大的注射體積相伴的延長的注射時間加重手術(shù)風險。另外，供體細胞的過量注射引起宿主實質(zhì)組織的壓縮和隨后的損傷。在補償體積限制的嘗試中，已知方法要求制備高細胞密度的注射用懸液。然而，高細胞密度促進被移植細胞的緊密簇集并抑制細胞遷移或擴散，阻止了超出有限區(qū)域之外的有效治療并損害了在宿主組織中的無縫整合。

相反，作為通過本公開的方法制備的細胞的體內(nèi)存活率提高的結(jié)果，每次注射需要較少數(shù)目的細胞。事實上已顯示，從注射時起6個月后存在高達3至4倍的注射細胞數(shù)目，證實了使用本公開的方法時的顯著定量存活率。此外，由于所述定量存活率，可以實現(xiàn)所需細胞劑量的可重復的給藥。因此，在一個實施方式中，將nsc濃縮至每微升約1,000至約1,000,000個細胞的密度。在一個實施方式中，將nsc濃縮至每微升約2,000至約80,000個nsc的密度。在另一個實施方式中，每微升約5,000至約50,000個nsc已被用于有效移植。在另一個實施方式中，使用每微升約10,000至30,000個nsc。在優(yōu)選實施方式中，將nsc濃縮至每微升約70,000個nsc的密度。

在另一個實施方式中，將nsc濃縮至每微升約1,000至約10,000個細胞、每微升約10,000至約20,000個細胞、每微升約20,000至約30,000個細胞、每微升約30,000至約40,000個細胞、每微升約40,000至約50,000個細胞、每微升約50,000至約60,000個細胞、每微升約60,000至約70,000個細胞、每微升約70,000至約80,000個細胞、每微升約80,000至約90,000個細胞或每微升約90,000至約100,000個細胞的密度。

在另一個實施方式中，將nsc濃縮至每微升約100,000至約200,000個細胞、每微升約200,000至約300,000個細胞、每微升約300,000至約400,000個細胞、每微升約400,000至約500,000個細胞、每微升約500,000至約600,000個細胞、每微升約600,000至約700,000個細胞、每微升約700,000至約800,000個細胞、每微升約800,000至約900,000個細胞、每微升約900,000至約1,000,000個細胞的密度。

在另一個實施方式中，可以將懸浮在每個注射位點小于約100微升注射體積中的nsc遞送到治療區(qū)域。例如，在可以進行多次注射的人類對象的認知功能障礙的治療中，可以使用每個注射位點0.1和約100微升的注射體積。在優(yōu)選實施方式中，可以將懸浮在每個注射位點約1微升注射體積中的nsc遞送到治療區(qū)域。

在實施方式中，本公開的方法包括將nsc以每微升約1,000至約10,000個細胞、每微升約10,000至約20,000個細胞、每微升約20,000至約30,000個細胞、每微升約30,000至約40,000個細胞、每微升約40,000至約50,000個細胞、每微升約50,000至約60,000個細胞、每微升約60,000至約70,000個細胞、每微升約70,000至約80,000個細胞、每微升約80,000至約90,000個細胞或每微升約90,000至約100,000個細胞的細胞密度注射到對象腦的一個或多個區(qū)域中。

在某些實施方式中，本公開的方法包括將nsc以每微升約100,000至約200,000個細胞、每微升約200,000至約300,000個細胞、每微升約300,000至約400,000個細胞、每微升約400,000至約500,000個細胞、每微升約500,000至約600,000個細胞、每微升約600,000至約700,000個細胞、每微升約700,000至約800,000個細胞、每微升約800,000至約900,000個細胞或每微升約900,000至約1,000,000個細胞的細胞密度注射到對象腦的一個或多個區(qū)域中。

在實施方式中，本公開的方法包括將nsc以每微升約5,000至約50,000個細胞的細胞密度注射。在優(yōu)選實施方式中，本公開的方法包括將nsc以每微升約70,000個細胞的細胞密度注射。

在實施方式中，本公開的方法包括nsc的多次注射，將約4,000至約40,000個細胞、約40,000至約80,000個細胞、約80,000至約120,000個細胞、約120,000至約160,000個細胞、約160,000至約200,000個細胞、約200,000至約240,000個細胞、約240,000至約280,000個細胞、約280,000至約320,000個細胞、約320,000至約360,000個細胞或約360,000至約400,000個細胞的總細胞數(shù)目引入到對象腦的一個或多個區(qū)域中。

在某些實施方式中，本公開的方法包括nsc的多次注射，將約400,000至約800,000個細胞、約800,000至約1,200,000個細胞、約1,200,000至約1,600,000個細胞、約1,600,000至約2,000,000個細胞、約2,000,000至約2,400,000個細胞、約2,400,000至約2,800,000個細胞、約2,800,000至約3,200,000個細胞、約3,200,000至約3,600,000個細胞或約3,600,000至約4,000,000個細胞的總細胞數(shù)目引入到對象腦的一個或多個區(qū)域中。

擴增的nsc被懸浮在其中用于遞送到治療區(qū)域的介質(zhì)的體積在本文中可以被稱為注射體積。注射體積取決于注射位點和組織的變性狀態(tài)。更具體來說，注射體積的下限可以由高細胞密度的粘稠懸液的實際液體操作以及細胞簇集的傾向性決定。注射體積的上限可以由避免損傷宿主組織所必需的由注射體積施加的壓力限度以及實際手術(shù)時間決定。

在本公開的方法中可以使用任何適用于將細胞注射到所需區(qū)域中的裝置。在實施方式中，使用能夠在一定時間段內(nèi)以基本上恒定的流速遞送亞微升體積的注射器。細胞可以通過針頭或柔性管線或任何其他適合的轉(zhuǎn)移裝置而被裝載在所述裝置中。

在另一個實施方式中，將細胞注射在腦中約2至約5個之間的位點處。在實施方式中，將細胞注射在腦中約5至約10個之間的位點處。在實施方式中，將細胞注射在腦中約10至約30個之間的位點處。在實施方式中，將細胞注射在腦中約10至約50個之間的位點處。所述位點中的至少兩個位點可以相隔大約100微米至約5,000微米的距離。在實施方式中，注射位點之間的距離為約400至約600微米。在實施方式中，注射位點之間的距離為約100至約200微米、約200至約300微米、約300至約400微米、約400至約500微米、約500至約600微米、約600至約700微米、約700至約800微米、約800至約900微米或約900至約1,000微米。在實施方式中，注射位點之間的距離為約1,000至約2,000微米、約2,000至約3,000微米、約3,000至約4,000微米或約4,000至約5,000微米。注射位點之間的距離可以在整個脊髓組織中產(chǎn)生基本上不中斷且連續(xù)的供體細胞存在的基礎上并在平均注射體積被證實在動物模型例如大鼠或豬中實現(xiàn)約2-3個月存活的基礎上確定。在人類中的實際注射次數(shù)和注射間距可以從動物模型中的結(jié)果外推。

本公開的方法的nsc可以在體內(nèi)產(chǎn)生大量神經(jīng)元。當nsc在移植之前沒有明顯預分化時，所述nsc在分化之前可以在體內(nèi)增殖多達2至4次細胞分裂，由此進一步增加有效供體細胞的數(shù)目。在分化后，神經(jīng)元分泌特定神經(jīng)遞質(zhì)。此外，神經(jīng)元在體內(nèi)移植物周圍的環(huán)境中分泌對不同病癥有益的生長因子、酶和其他蛋白質(zhì)或物質(zhì)。因此，由于移植的細胞在體內(nèi)產(chǎn)生大量神經(jīng)元的能力，并且由于認知功能障礙可能由失去的要素(包括神經(jīng)元來源的要素)引起或?qū)е滤鲆負p失，通過本公開的方法可以治療多種病癥。因此，患有由缺少這些神經(jīng)元來源的要素例如生長因子、酶和其他蛋白質(zhì)而造成的認知功能障礙的對象，可以通過本公開的方法有效地治療。

在實施方式中，包含一定量nsc的組合物可以按照已知方法給藥到對象，例如靜脈內(nèi)給藥如快速濃注或通過在一段時間內(nèi)連續(xù)輸注，通過肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦和脊髓內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、關節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)或鞘內(nèi)途徑。細胞的腦和脊髓內(nèi)、鞘內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下給藥是優(yōu)選的，其中腦和脊髓內(nèi)、鞘內(nèi)或靜脈內(nèi)途徑是特別優(yōu)選的；然而，也可以使用本領域中公知的其他細胞給藥范式。

在一個實施方式中，本發(fā)明的nsc組合物被配制成注射制劑，并包含例如適合于腦和脊髓內(nèi)遞送的活性成分的水性溶液或懸液。當制備注射用、特別是用于腦內(nèi)遞送的組合物時，可以存在連續(xù)相，其包含滲漲度調(diào)節(jié)劑(tonicitymodifier)的水性溶液，所述溶液被緩沖到低于約7或低于約6例如約2至約7、約3至約6或約3至約5的ph。所述滲漲度調(diào)節(jié)劑可以包含例如氯化鈉、葡萄糖、甘露糖醇、海藻糖、甘油或使所述制劑的滲透壓與血液等滲的其他藥劑?；蛘?，當在制劑中使用較大量滲漲度調(diào)節(jié)劑時，可以將它在注射之前用可藥用稀釋劑稀釋，以使所述混合物與血液等滲。

在任何上述方法的某些實施方式中，包含nsc的組合物被給藥一次。在任何上述方法的某些實施方式中，在所述包含nsc的組合物的初始劑量給藥后，進行一次或多次后續(xù)劑量的給藥?？梢栽诒竟_的方法中使用的給藥方案(例如首次給藥與一次或多次后續(xù)給藥之間的間隔)的實例包括約每周一次至約每12個月一次的間隔、約每兩周一次至約每6個月一次的間隔、約每月一次至約每6個月一次的間隔、約每月一次至約每3個月一次的間隔或約每3個月一次至約每6個月一次的間隔。在某些實施方式中，給藥為每月、每兩個月、每三個月、每四個月、每五個月、每六個月或在疾病復發(fā)后進行。

在實施方式中，將nsc注射在約5至約50個之間的位點處。在實施方式中，將nsc注射在約10至約30個之間的位點處。所述位點中的至少兩個位點可以相隔大約100微米至約5000微米的距離。在實施方式中，注射位點之間的距離為約400至約600微米。在人類中的實際注射次數(shù)可以從動物模型中的結(jié)果外推。

本公開的方法可以包括在nsc注射之前、同時或之后給藥一種或多種免疫抑制藥物。

在某些實施方式中，所述nsc和免疫抑制藥物可以被共同給藥。構(gòu)成所述療法的nsc和免疫抑制藥物可以是組合劑型或在旨在基本上同時給藥的分開的劑型中。所述nsc和免疫抑制藥物也可以被順序給藥，其中nsc或免疫抑制藥物通過要求多步給藥的方案來給藥。因此，方案可能要求nsc和免疫抑制藥物的順序給藥，其中將分開的活性劑分開給藥。多個給藥步驟之間的時間長度可以在例如幾分鐘至幾小時至數(shù)日的范圍內(nèi)，這取決于nsc和免疫抑制藥物的性質(zhì)例如治療性化合物的效力、溶解性、生物利用度、血漿半衰期和動力學曲線，并且取決于食物攝入的影響和對象的年齡和狀況。靶分子濃度的晝夜變化也可能決定最佳給藥間隔。不論是同時、基本上同時還是順序給藥，nsc和免疫抑制藥物都可能涉及要求將nsc通過靜脈內(nèi)途徑給藥并且將免疫抑制藥物通過口服途徑、經(jīng)皮途徑、靜脈內(nèi)途徑、肌內(nèi)途徑或通過例如粘膜組織的直接吸收給藥的方案。如果所述神經(jīng)干細胞和免疫抑制藥物被分開或一起地通過口服、吸入噴霧、直腸內(nèi)、表面、頰(例如舌下)或腸胃外(例如皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)和真皮內(nèi)注射或輸注技術(shù))給藥，每種這些治療性化合物都將被包含在可藥用賦形劑、稀釋劑或其他制劑組分的適合的藥用制劑中。

無需多言，相信本領域普通技術(shù)人員使用前面的描述和后面的說明性實施例，可以制造和利用本公開的藥劑并實踐所要求保護的方法。提供下面的工作例是為了便于本公開的實踐，并且不應被解釋為以任何方式限制本公開的剩余部分。

實施例

本發(fā)明由下面的實施例進一步說明，所述實施例不應被解釋為以任何方式進行限制。下面描述后面的實驗例中所使用的材料和方法。

實施例1：材料和方法

hk532制備

人類hk532nsc細胞系(nsi-hk532和nsi-hk532.ubc-igf-i)由neuralstem,inc.(rockville,md)提供。簡單來說，從獲自選擇性流產(chǎn)后的8周胎齡的人類胎兒的皮層組織制備hk532。所述材料在符合國立衛(wèi)生研究院(nih)和fda的指南的知情同意下捐獻給neuralstem,inc.。指南由外部獨立評審團如所述進行評審并批準(johe等，(1996)genesdev.10(24):3129-40)。使用含有永生化基因和新霉素抗性基因的反轉(zhuǎn)錄病毒載體將皮層nsc有條件地永生化。所述永生化基因包含在3’末端融合有編碼人類雌激素受體的c-端配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的cdna片段的人類c-myccdna。選擇具有新霉素抗性的細胞并作為單一細胞系繁殖(hk532)。然后將所述細胞系用復制缺陷型重組慢病毒載體轉(zhuǎn)導，以誘導由人類泛素c(ubc)啟動子驅(qū)動的人類igf-i的表達。得到的細胞不需進一步選擇就作為單一細胞系進行繁殖(hk532.ubc-igf-i)。使用在相同ubc啟動子下表達綠色熒光蛋白(gfp)的對照構(gòu)建物轉(zhuǎn)導hk532，產(chǎn)生大約90-95％的gfp陽性增殖細胞。

hk532培養(yǎng)和分化

hk532和hk532-igf-i細胞兩者的培養(yǎng)如以前所描述來進行[42]。簡單來說，將細胞生長在用10mmhepes緩沖液中的100μg/ml聚d-賴氨酸(millipore,billerica,ma)包被24h，然后用pbs中的25μg/ml纖連蛋白包被1小時的培養(yǎng)瓶上?；蛘撸瑢⒓毎臃N在用聚l-賴氨酸包被的插片上，然后與皮層神經(jīng)元(cn)共培養(yǎng)。將細胞在增補有10ng/ml成纖維細胞生長因子(fgf)的n2b+培養(yǎng)基(由neuralstem,inc.,rockville,md提供)中培養(yǎng)，用于祖細胞狀態(tài)生長和維持。對于分化來說，將細胞在不含fgf的nsdm分化培養(yǎng)基(增補有4mml-谷氨酰胺、20μml-丙氨酸、6μml-天冬酰胺、67μml-脯氨酸、250nm維生素b12、25mg/l胰島素、100mg/l轉(zhuǎn)鐵蛋白、20nm孕酮、100μm腐胺和30nm亞硒酸鈉的dmem)中培養(yǎng)。分化細胞的數(shù)據(jù)作為分化后的天數(shù)(即未分化的(d0)、第1天(d1)、第3天(d3)等)示出。每2天進行培養(yǎng)基更換，更換50％的培養(yǎng)基。

igf-i生產(chǎn)和信號轉(zhuǎn)導

hk532和hk532-igf-i細胞中的igf-i表達和信號轉(zhuǎn)導按照以前的描述通過elisa和western印跡來確定(vincent等，endocrinesocietyabstracts(2003)p3-316p.548；以及chia等，amjepidemiol(2008)167(12):1438-45)。簡單來說，為了確認igf-i生產(chǎn)，從未分化的(d0)和分化的(d3和d7)hk532和hk532-igf-i細胞收集調(diào)制過的培養(yǎng)基，使用centricon濾器(3kda截留分子量；millipore,billerica,ma)濃縮10倍至1ml，并在人類特異性igf-ielisa(assaydesigns,enzolifesciencesinc.,farmingdale,ny)上按照制造商的說明書運行。對于igf-i信號轉(zhuǎn)導分析來說，將hk532和hk532-igf-i細胞在處理培養(yǎng)基(不添加胰島素的nsdm分化培養(yǎng)基)中培養(yǎng)4小時，然后添加選擇抑制劑培養(yǎng)1小時，隨后添加外源igf-i(20nm)培養(yǎng)30min。抑制劑包括akt途徑抑制劑ly294002(ly；20μm；sigma-aldrich,st.louis,mo)、mapk抑制劑u0126(u；20μm；calbiochem,lajolla,ca)或igf-ir抑制劑nvpaew541(nvp；1μm；sigma-aldrich)。對于western印跡來說，將全細胞蛋白提取在冰冷的ripa緩沖液(20mmtris，ph7.4，150mmnacl，1mmedta，0.1％sds，1mm去氧膽酸鈉，1％tritonx-100，0.1胰蛋白酶單位/l抑肽酶，10mg/ml的亮抑肽酶，以及50mg/mlpmsf)中，測定蛋白質(zhì)濃度，將樣品在sds-page凝膠上電泳并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜。第一抗體(除非另有指明，否則從cellsignalingtechnology,inc.(danvers,ma)獲得)包括：phospho-igf-ir(pigf-ir)，igf-irβ(tyr1135/1136)，phospho-akt(ser473)(pakt)，akt，phospho-erk(perk)，erk和β-肌動蛋白(chemicon,temecula,ca)。在第一抗體4℃溫育過夜后，將膜與適合的偶聯(lián)到辣根過氧化物酶的第二抗體(cellsignalingtechnology,danvers,ma)在22℃溫育1小時，用化學發(fā)光底物(supersignalwestpico；pierce,fisherscientific,hampton,nh)顯色，并暴露到kodakbiomaxxar膠片(sigma-aldrich)。

細胞遷移

將未分化的hk532和hk532-igf-i細胞在4℃過夜儲存(1x10⁶個細胞/ml或3x10⁶個細胞/管)后添加到遷移插片，或可選地在6孔板上培養(yǎng)并在分化的d7移動到插片。在插片下方添加含有或不含igf-i(終濃度為10nm)的nsdm加上10％fbs。24小時后，將遷移通過插片的細胞用qcm24孔比色法細胞遷移測定試劑(millipore)染色。使用標準的labsystemsfluoroskanascentfl微孔板讀板器在530和590nm處對遷移進行定量。

細胞增殖和分化

細胞增殖和分化使用標準的實驗室免疫細胞化學(icc)方案(kim等，journalofbiologicalchemistry(1997)272:21268-21273；lunn等，neurobioldis(2012)46(1):59-68)來評估。簡單來說，將hk532和hk532-igf-i細胞在24孔板中，在聚l-賴氨酸和纖連蛋白包被的玻璃蓋片上培養(yǎng)。在d0、d3和d7，如前所述[45]通過將細胞與10μm5’-乙炔基-2’-脫氧尿苷(edu)溫育2小時，然后固定并按照click-itedu試劑盒(invitrogen)的制造商提供的流程進行處理，來測量細胞增殖。edu摻入通過對使用裝備有數(shù)字相機的olympusbx-51顯微鏡捕獲的熒光圖像進行定量來測量。對于所有樣品(n＝3)來說，每個增殖實驗計數(shù)約2.5–2.7x10³個細胞。

為了評估分化，將細胞用4％pfa固定，用0.1％triton/pbs通透化，并在5％正常驢血清/0.1％triton/pbs中阻斷。接下來，除非另有指明，否則將ki67(novus,littleton,co)、tuj1(neuromics,edina,mn)、巢蛋白(chemicon,millipore)、gad65/67(millipore)、vglut2(millipore)或igf-irβ(1:500,sigma)第一抗體以1:1000的稀釋倍數(shù)在4℃溫育過夜。然后將細胞在cy3、cy5或fitc偶聯(lián)的第二抗體(jacksonimmunoresearch,westgrove,pa)中溫育，然后使用含有dapi的prolonggold抗褪色試劑(molecularprobes,invitrogen,carlsbad,ca)固定在玻璃載片上。使用olympusbx-51顯微鏡捕獲圖像，并且對于所有樣品(n＝3)來說，每個分化實驗計數(shù)約2.5–2.7x10³個細胞。

接下來，我們使用以前所描述的我們建立的神經(jīng)指數(shù)測量(lunn等，stemcellsdev(2010)19(12):1983-93)，檢查了誘導的igf-i表達對祖細胞狀態(tài)的維持和軸突生長的影響。簡單來說，在分化的前7天將細胞在玻璃蓋片上單層培養(yǎng)，并在d0、d3和d7用巢蛋白免疫標記以鑒定神經(jīng)祖細胞或用tuj1免疫標記以觀察原初神經(jīng)元過程。對于所有巢蛋白標記的樣品(n＝3)來說，每個實驗計數(shù)超過2.5x10³個細胞?；蛘撸褂胢etamorph(moleculardevices,sunnyvale,ca)分析tuj1標記的圖像和它們相應的dapi圖像。設定閾值并使用區(qū)域統(tǒng)計測量被神經(jīng)突覆蓋的區(qū)域。使用“計數(shù)核”插件計數(shù)細胞數(shù)目并進行手動調(diào)整，以校正任何錯誤計數(shù)的細胞。神經(jīng)元數(shù)目和神經(jīng)突長度使用復合神經(jīng)指數(shù)測量值來分析，所述測量值被表示為完整的神經(jīng)元面積除以核的數(shù)目。數(shù)據(jù)被呈現(xiàn)為每個細胞的神經(jīng)突面積(μm²/細胞)(lunn等，stemcellsdev(2010)19(12):1983-93)。每種條件計數(shù)總共6個圖像，其代表了約7.5x10³個dapi標記的細胞(n＝3)。

原代cn制備和神經(jīng)保護作用的評估

按照我們以前發(fā)表的流程來分離原代cn(lunn等，stemcellsdev(2010)19(12):1983-93)。簡單來說，從e15sprague-dawley大鼠胚胎收集cn，移除膜，并將組織切成2–3mm小塊。通過將組織在0.5％胰蛋白酶/edta中在37℃下溫育10分鐘，然后用血清包被的玻璃移液管研磨1分鐘，將細胞解離。將得到的細胞懸液施加到24孔板中的聚l-賴氨酸包被的玻璃蓋片，并在生長培養(yǎng)基中溫育，所述培養(yǎng)基包含增補有2.5mg/ml白蛋白、2.5μg/ml過氧化氫酶、2.5μg/mlsod、0.01mg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、15μg/ml半乳糖、6.3ng/ml孕酮、16μg/ml腐胺、4ng/ml硒、3ng/mlβ-雌二醇、4ng/ml氫化可的松、1x青霉素/鏈霉素/新霉素(gibcobrl)和1xb-27添加劑(gibcobrl)的neurobasal培養(yǎng)基(gibcobrl,invitrogen)。

為了檢查cn、hk532和hk532-igf-i對有毒的ad微環(huán)境的易感性，將細胞用10μmaβ(1-42)(rpeptide)處理約72小時。細胞損傷通過切開的半胱天冬酶-3活化(cc3)來評估，其通過對icc后cc3陽性細胞的百分數(shù)進行計數(shù)來確定。對于所有樣品(n＝3)來說，每個實驗計數(shù)約2.5x10³個細胞。為了評估神經(jīng)保護效果，將分化的d7hk532-igf-i接種在插片上并與原代cn培養(yǎng)物在常規(guī)生長培養(yǎng)基中共培養(yǎng)。24小時后，將共培養(yǎng)物用10μmaβ(1-42)(rpeptide)處理72小時。將原代cn固定，使用cc3抗體(1:1000，cellsignaling)如上所述進行icc分析。

體內(nèi)移植

為了證實在體內(nèi)移植后hk532-igf-i細胞存活并整合在海馬區(qū)中，從jacksonlaboratory(barharbor,me)獲得6周齡的b6c3-tg(appswe/psen1δe9)85dbo/j(app/ps1；n＝5)和野生型b6c3f1/j(wt；n＝8)小鼠。在11周齡時，小鼠接受皮下他克莫司顆粒(fk-506；由neuralstem,inc.供應)，并在12周齡時進行細胞移植手術(shù)。簡單來說，將小鼠用異氟烷麻醉并置于標準的立體定向框(stoeltingcompany,wooddale,il)中。將皮膚切開，并在預測的注射區(qū)域處進行大型開顱手術(shù)。將hk532-igf-i細胞懸液通過雙側(cè)注射給藥到穹窿海馬傘中的3個位點處(總共6次注射)，所述位點由下述從前鹵測量的坐標(分別為后部/側(cè)向/腹側(cè))表示：-0.82/±0.75/2.5，-1.46/±2.3/2.9，-1.94/±2.8/2.9。每次注射由1μl體積構(gòu)成(在60秒內(nèi)給藥，在針頭抽出之前停留60秒)，細胞濃度為30,000個細胞/μl。然后使用可吸收縫合線將皮膚封閉。在手術(shù)后，小鼠被給藥腹膜內(nèi)麻醉性疼痛藥物2天，并在整個研究中繼續(xù)給藥他克莫司顆粒。在細胞移植后2周和10周將小鼠處死以備分析。簡單來說，將動物麻醉并灌注冰冷的鹽水，將腦剖開并沿著半球間邊界切開。將腦在4％pfa中后固定過夜并在30％蔗糖中低溫保存，用于免疫組織化學(ihc)。

對于ihc來說，將固定的腦組織用最佳切割溫度化合物(oct)包埋，并使用低溫恒溫器切片成14μm薄片。每只動物選擇10個海馬切片用于ihc，以檢測移植的細胞并確認準確靶向到穹窿海馬傘。將切片在pbs中重新水合，在含有0.5％tritonx-100的pbs中通透化20分鐘，并在含有5％驢血清和0.1％tritonx-100的1xpbs中阻斷30min。將針對雙皮層蛋白(doublecortin)(dcx；millipore)和人類核(hunu；millipore)的第一抗體在阻斷液中1:200稀釋，并與切片在4℃溫育過夜。在第一抗體溫育后，將切片在pbs中洗滌三次，并與熒光偶聯(lián)的在驢中產(chǎn)生的第二抗體(alexa488和alexa594；1:500；invitrogen)溫育1小時。在染色完成后，使用含有dapi核染料的prolonggold抗褪色固定培養(yǎng)基(molecularprobes,invitrogen)將載片用玻璃蓋片固定。使用leicasp2共聚焦顯微鏡捕獲熒光圖像。

統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)被呈現(xiàn)為平均值±標準偏差(sd)，n＝3，或呈現(xiàn)為三個獨立實驗的代表性圖像。使用graphpadprism(graphpadsoftware,inc.,lajolla,ca)進行統(tǒng)計分析。配對t-檢驗被用于成對比較。p<0.05的值被認為是統(tǒng)計學顯著性的(*p<0.05)。

實施例2：igf-i生產(chǎn)和信號轉(zhuǎn)導

hk532細胞是以前尚未描述過的新的皮層nsc。為了提高它們作為細胞治療劑的潛在功效并確定igf-i生產(chǎn)對它們的神經(jīng)保護能力的影響，使用編碼全長人類igf-i的慢病毒載體產(chǎn)生hk532-igf-i細胞系。調(diào)制過的培養(yǎng)基的elisa分析證實親代hk532細胞產(chǎn)生非常低到不可檢測的基礎水平的igf-i，而hk532-igf-i細胞在d0至d7之間產(chǎn)生3-5ng/ml的igf-i，提高約50倍(圖1a)。因此，hk532-igf-i細胞產(chǎn)生相當可觀水平的igf-i，該水平在整個早期分化中被維持，證實了穩(wěn)健和穩(wěn)定的igf-i表達。

進行了生長因子受體水平和活化如何受到自分泌igf-i表達的調(diào)控的研究。通過ihc，在d7觀察到沿著親代hk532細胞和hk532-igf-i兩者的細胞表面的igf-ir表達(圖1b)。western印跡分析證實了該表達并且也揭示出在兩種細胞系中，在分化后受體表達顯著增加(圖1c)。盡管在d0和d7，在hk532-igf-i中觀察到相對于hk532略微降低的igf-ir表達水平，但igf-ir磷酸化和信號轉(zhuǎn)導的激活在所述細胞系之間沒有顯著差異，并且添加外源igf-i引起受體磷酸化的增加(圖1c)；在分化后這種激活明顯更加顯著。

考慮到igf-i信號轉(zhuǎn)導激活了有絲分裂原活化的細胞外信號調(diào)控的激酶/細胞外信號調(diào)控的激酶(mek/erk)、有絲分裂原活化的蛋白激酶(mapk)和磷脂酰肌醇3-激酶(pi3k)/akt途徑，因此在hk532和hk532-igf-i細胞中評估了這些關鍵途徑的磷酸化和下游激活(圖1c)。盡管在d0和d7存在基礎的mapk信號轉(zhuǎn)導，但在細胞系之間不存在顯著差異，并且igf-i刺激僅在分化后提高信號轉(zhuǎn)導。然而，在d0hk532-igf-i細胞和分化后的兩種細胞系中，基礎akt信號轉(zhuǎn)導顯著提高。在分化后的hk532細胞中外源igf-i的添加促進akt的穩(wěn)健增加，而在hk532-igf-i中，在igf-i刺激后觀察到非常少的akt激活。這些數(shù)據(jù)證實了相對于親代細胞，hk532-igf-i對外源igf-i的響應性降低。值得注意的是，mapk信號轉(zhuǎn)導的抑制提高akt磷酸化并且akt信號轉(zhuǎn)導的抑制引起相反的觀察結(jié)果，表明這些途徑能夠進行補償性信號轉(zhuǎn)導。然而，使用受體拮抗劑nvp抑制igf-ir信號轉(zhuǎn)導不影響mapk信號轉(zhuǎn)導，但將igf-ir和akt的活化顯著降低至低于兩種細胞系中的基礎水平(圖1c)。合在一起，這些數(shù)據(jù)證實了hk532-igf-i細胞表現(xiàn)出正常的igf-ir和mapk/akt信號轉(zhuǎn)導概況。

實施例3：igf-i表達不改變hk532增殖或遷移

edu摻入被用于評估igf-i對hk532和hk532-igf-i細胞增殖的影響。分別有約36％和33％的未處理的d0hk532和hk532-igf-i是edu陽性的(圖2a-e)。在d3，分別有6％和9％的hk532和hk532-igf-i是edu陽性的，并且到d7，少于3％的任一細胞系是edu陽性的。因此，在d0、d3或d7沒有觀察到增殖概況的差異，并且兩個細胞系在d7時表現(xiàn)出極小的增殖。這些數(shù)據(jù)證實在分化的初始階段中igf-i不促進或維持增殖。

也在d0和d7時評估了igf-i對hk532和hk532-igf-i遷移的影響。在兩個時間點處，對hk532和hk532-igf-i觀察到可比的遷移水平(圖2f-g)。此外，當在跨孔插片下方添加另外的igf-i時，沒有觀察到變化。因此，誘導的igf-i表達沒有對祖細胞遷移產(chǎn)生可察覺的影響。

實施例4：表達igf-i的hk532保留神經(jīng)分化能力

接下來，檢查了igf-i對hk532祖細胞狀態(tài)的維持和軸突生長的影響。分別有約92％和90％的d0hk532和hk532-igf-i是巢蛋白陽性的，表明igf-i表達不影響祖細胞狀態(tài)的維持。還使用作為神經(jīng)元分化的早期指示物的已建立的神經(jīng)指數(shù)方法，評估了igf-i對神經(jīng)突生長的影響。對于hk532和hk532-igf-i細胞兩者來說，在d0至d7之間，隨著細胞分化，神經(jīng)指數(shù)增加，并且在測試的任何時間點處沒有觀察到所述細胞系之間的差異(圖3f)。這些數(shù)據(jù)證實igf-i不影響初始hk532分化。

實施例5：在hk532-igf-i中是gaba能但不是谷氨酸能表型增加

為了確定igf-i對終末分化的影響，確定了在d0、d3和d7時表現(xiàn)出谷氨酸能(vglut)和gaba能(gad65)表型的細胞的比例。gad65陽性細胞被定量，并且在hk532-igf-i中與親代hk532細胞相比顯著增加，分別為總細胞的74％和67％(圖4a、b、e)。hk532(61％)和hk532-igf-i(67％)培養(yǎng)物中vglut陽性細胞的百分數(shù)沒有顯著差異(圖4c、d、f)。這些數(shù)據(jù)證實了igf-i的存在提高了由細胞分化產(chǎn)生的gaba能神經(jīng)元的數(shù)目，但對谷氨酸能神經(jīng)元的數(shù)目沒有顯著影響。

實施例6：hk532-igf-i在體外對aβ毒性有抗性并且保護原代cn

aβ(1-42)是ad相關毒性的常用體外模型(bruce等，(1996)pnas93(6):2312-6)。當暴露于aβ時，在原代cn和兩種nsc細胞系中觀察到顯著的凋亡和cc3活化(圖5a)。hk532和hk532-igf-i中的凋亡水平顯著低于在原代cn中觀察到的水平(p<0.05；圖5a)。為了檢查改性的祖細胞的保護能力，也在與hk532和hk532-igf-i間接共培養(yǎng)的原代cn中評估了aβ毒性(圖5b-e)。同樣由cc3活化所指示的原代cn中的凋亡顯著降低，當與hk532共培養(yǎng)時低于40％，當與hk532-igf-i共培養(yǎng)時低于30％(p<0.05；圖5f)。這些數(shù)據(jù)表明hk532-igf-i細胞系是神經(jīng)保護性的，并且能夠防止aβ誘導的原代cn的死亡。

實施例7：在ad小鼠模型中hk532-igf-i能夠在移植后存活并且摻入到體內(nèi)

為了確立臨床前試驗的可行性，將hk532-igf-i細胞移植到app/ps1雙重轉(zhuǎn)基因小鼠這種常用的ad模型中(cao等，jbiolchem(2007)282(50):36275-82)。這種試驗性研究用于確認細胞在海馬的穹窿海馬傘中的準確和正確的解剖學放置并評估移植的細胞隨時間的存活。在所有注射的動物中實現(xiàn)了靶向準確性。在移植后2周(數(shù)據(jù)未示出)和10周(圖5e、f)時，通過針對hunu和dcx的ihc檢測到移植的人類細胞。在ad(圖5e)和wt動物(圖6f)兩者的海馬區(qū)中，移植的細胞是明顯的。dcx這種標記神經(jīng)元前體的結(jié)合微管的磷酸化蛋白對hunu標記的細胞的共染色指示了神經(jīng)發(fā)生，并表明移植的皮層祖細胞處于早期神經(jīng)元分化階段。

實施例8：在ad小鼠模型中hk532-igf-i的給藥減少體內(nèi)aβ斑塊形成

為了評估體內(nèi)hk532-igf-i移植對aβ病理的全局影響，在每只小鼠多個海馬和皮層切片上使用針對5種aβ同工型(aβ-37、38、39、40和42)的多克隆抗體進行免疫染色。在測量免疫反應性總面積和強度的基礎上，對切片的熒光圖像進行定量。正如預期，結(jié)果顯示在介質(zhì)注射的app/ps1小鼠中存在明顯的aβ斑塊形成，并且在non-tg動物中不存在aβ(圖6a-b、d-e)。此外，與介質(zhì)注射的app/ps1小鼠相比，用hk532-igf-i處理的app/ps1小鼠中的aβ水平存在十分顯著的降低(p<0.0001；非配對t-檢驗)(圖6b-c、e-g)。該數(shù)據(jù)顯示，hk532-igf-i不僅起到保護神經(jīng)元組織免于aβ誘導的損傷的作用，而且通過清除aβ沉積物和/或抗拒aβ積累而減弱aβ的沉積。

為了獲得關于nsc處理的小鼠中aβ減少的機制的更多見解，將海馬和皮層中aβ水平的差異分開進行考慮。在nsc處理的小鼠的皮層中aβ顯著減少(p<0.0005；非配對t-檢驗)(圖6h)。然而，在nsc處理的小鼠的海馬中aβ的減少不顯著(p＝0.1061；非配對t-檢驗)(圖6h)。

實施例9：在ad小鼠模型中hk532-igf-i的給藥在體內(nèi)提高膽堿能活性

為了評估在我們的ad模型中膽堿能神經(jīng)元的存在并調(diào)查hk532-igf-i移植對這些神經(jīng)元的影響，將來自于每只小鼠的紋狀體切片用針對chat的抗體進行免疫染色，以鑒定表達高水平chat的膽堿能神經(jīng)元(圖7a-d)。我們對每個切片的紋狀體整體成像，并為每個紋狀體計數(shù)chat陽性細胞的數(shù)目。細胞計數(shù)表明與wt相比，app/ps1小鼠中紋狀體膽堿能神經(jīng)元顯著損失(p＝0.0115；非配對t-檢驗)(圖7e)。此外，與介質(zhì)注射的ad小鼠相比，nsc處理的app/ps1小鼠中膽堿能神經(jīng)元的數(shù)目存在顯著增加(p＝0.0366；非配對t-檢驗)(圖7f)。這些結(jié)果表明在app/ps1小鼠中通過hk532-igf-i移植挽救了紋狀體中的膽堿能功能。

實施例10：在ad小鼠模型中hk532-igf-i的給藥在體內(nèi)提高突觸前活性

為了確定在app/ps1小鼠中hk532-igf-i是否提高突觸密度，將來自于所有動物的海馬切片用突觸前標志物突觸小泡蛋白進行免疫染色。與介質(zhì)注射的轉(zhuǎn)基因小鼠相比，在移植有hk532-igf-i的app/ps1小鼠的海馬處發(fā)現(xiàn)熒光強度的可察覺的提高(圖8a-f)。這種提高的強度與在未注射和假注射處理的兩種non-tg小鼠中發(fā)現(xiàn)的水平可比。這些數(shù)據(jù)表明，在ad中hk532-igf-i移植通過恢復突觸而挽救了記憶和認知。

為了調(diào)查hk532-igf-i細胞是否與內(nèi)源神經(jīng)元形成突觸，在hk532-igf-i處理的小鼠的海馬切片上進行了針對人類numa和小鼠與人類兩種起源的突觸小泡蛋白的共同染色。在nsc所位于的多形層的區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了相當多的突觸小泡蛋白陽性染色(圖8i)。此外，突觸標志物明顯地包圍numa染色的細胞(圖8g-j)，表明人類nsc來源的細胞可以與內(nèi)源神經(jīng)元形成突觸。

實施例11：hk532.ubc-igf1在脊髓中的存活和整合

為了證實在脊髓中的存活和整合，將hk532.ubc-igf1移植到sod1g93a大鼠這種已建立的肌萎縮性側(cè)索硬化癥(als)的動物模型的頸部脊髓中。將總共1.8x10⁵個細胞注射到每只動物中，靶向頸部脊髓(c4-c6脊椎水平)的腹角。將動物通過瞬時霉酚酸酯(在移植后的7天中30mg/kgip)并通過連續(xù)他克莫司遞送進行免疫抑制。在標準的灌注-固定之前，動物存活56天。冷凍免疫組織化學揭示出人類細胞移植物存在于腹角中并在整個灰質(zhì)和白質(zhì)中廣泛分布(圖9a-c)。

除非另有指明，否則在本說明書和權(quán)利要求書中用于表示成分、性質(zhì)例如分子量、反應條件等的量的所有數(shù)字，都應被理解為在所有情況下用術(shù)語“約”來修飾。因此，在說明書和權(quán)利要求書中陳述的數(shù)值參數(shù)是近似值，其可能隨著試圖通過本公開獲得的所需性質(zhì)而變，除非指明不是如此。最起碼，并且不試圖將等同性原則的應用限于權(quán)利要求書的范圍，每個數(shù)值參數(shù)至少應該根據(jù)所報道的有效數(shù)字的數(shù)目并應用常規(guī)的舍入技術(shù)進行解釋。

盡管陳述本公開的廣闊范圍的數(shù)值范圍和參數(shù)是近似值，但在具體實施例中陳述的數(shù)值被盡可能精確地報道。然而，任何數(shù)值固有地含有由它們相應的試驗測量中存在的標準偏差必然引起的一定誤差。

在描述本公開的情形中(特別是在權(quán)利要求書的情形中)使用的沒有具體數(shù)量的指稱，應該被解釋為涵蓋了單數(shù)和復數(shù)兩者，除非在本文中另有指明或與上下文明顯矛盾。本文中對值的范圍的敘述僅僅打算用作對落于所述范圍內(nèi)的每個單獨的值各個進行指稱的簡寫方法。除非本文中另有指明，否則每個單個值被并入到本說明書中，如同它在本文中被單個地敘述。本文中描述的所有方法可以以任何適合的順序進行，除非本文中另有指明或除非與上下文明顯矛盾。本文中提供的任何和所有實例或示例性語言(如“例如”)的使用，僅打算更好地說明本公開，并且不對以其它方式要求保護的本公開的范圍造成限制。本說明書中的所有語言都不應被解釋為指示任何非權(quán)利要求要素對于本公開的實踐來說是必不可少的。

本文公開的本公開的可替選要素或?qū)嵤┓绞降姆纸M不應被解釋為限制。每個組成員可以被單個地或與所述組的其他成員或本文中存在的其他要素以任何組合形式被提到并要求保護。預計，組的一個或多個成員可以出于方便和/或?qū)＠缘脑虮话诮M中或從組中刪除。當發(fā)生任何這樣的包含或刪除時，本說明書被視為含有所述修改的組，由此完成了在權(quán)利要求書中使用的所有markush組的書面描述。

本文中描述了本公開的某些實施方式，包括本發(fā)明人已知的用于執(zhí)行本公開的最佳方式。當然，對于本領域普通技術(shù)人員來說，在閱讀了上面的描述之后，對這些描述的實施方式的改變將變得顯而易見。本發(fā)明人期望專業(yè)技術(shù)人員視情況利用這些改變，并且本發(fā)明人打算以本文中具體描述的之外的其他方式實踐本公開。因此，本公開包括權(quán)利要求書中敘述的主題內(nèi)容的被適用法律所容許的所有修改和等同物。此外，上述要素以其所有可能的變化形式的任何組合都被本公開所涵蓋，除非本文中另有指示或除非與上下文明顯矛盾。

本文中公開的特定實施方式在權(quán)利要求書中可以用“由……構(gòu)成”或“基本上由……構(gòu)成”的語言進一步限制。當在不論是提交的還是通過修改添加的權(quán)利要求中使用時，過渡性術(shù)語“由……構(gòu)成”排除了在所述權(quán)利要求中沒有指明的任何要素、步驟或成分。過渡性術(shù)語“基本上由……構(gòu)成”將權(quán)利要求的范圍限制到指明的材料或步驟以及不實質(zhì)性影響基本和新穎特征的那些材料或步驟。如此要求的本公開的實施方式在本文中被固有或明確地描述并授予權(quán)利。

應該理解，本文中公開的本公開的實施方式說明了本公開的原理。可以使用的其他修改在本公開的范圍內(nèi)。因此，例如但不是限制性的，可以按照本文中的教導使用本公開的可替選配置。因此，本公開不限于具體示出和描述的內(nèi)容。

盡管在本文中已參考各種不同的具體材料、程序和實施例對本公開進行了描述和說明，但應該理解，本公開不限于為此目的選擇的材料和程序的特定組合。正如本領域技術(shù)人員將會認識到的，可以暗示這些詳情的大量變化。所述說明書和實施例打算僅僅被當作示例性的，本公開的真實范圍和精神由權(quán)利要求書指明。本申請中指出的所有參考文獻、專利和專利申請通過參考以其整體并入本文。

序列表

<110>神經(jīng)干細胞公司

<120>包含編碼生長因子的外源多核苷酸的穩(wěn)定的神經(jīng)干細胞及其使用方法

<130>3708869.00181us

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