本揭示內(nèi)容是有關(guān)于新穎的分子量為43kda的致病性轉(zhuǎn)活化反應(yīng)-脫氧核糖核酸-結(jié)合蛋白(transactivationresponsive-dna-bindingprotein,43kda,tdp-43)、可結(jié)合至該致病性tdp-43的抗體及該抗體的用途。先前技術(shù)神經(jīng)退化性疾病已成為現(xiàn)代社會(huì)不可忽視的健康議題。依據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告，截至2025年，全球?qū)?huì)有超過75％的老年人口患有各式神經(jīng)退化性疾病。額顳葉退化癥(frontotemporallobardegeneration,ftld)是美國年齡小于65歲的人口中第二常見的失智癥；已知tdp-43是造成ftld及肌肉萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(amyotrophiclateralsclerosis,als)的主因之一。然而，針對(duì)該些疾病，目前尚無有效的治療方法，故各式研究仍致力于探討參與調(diào)控致病性tdp-43形成的分子及相關(guān)機(jī)制。有鑒于此，相關(guān)領(lǐng)域亟需確認(rèn)參與調(diào)控致病性tdp-43的分子，藉此制備可用以預(yù)防或治療由致病性tdp-43所造成的神經(jīng)退化性疾病的藥物。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明是基于發(fā)現(xiàn)分子量為43kda的轉(zhuǎn)活化反應(yīng)-脫氧核糖核酸-結(jié)合蛋白(transactivationresponsive-dna-bindingprotein,43kda,tdp-43)寡聚體存在于病人腦中，此寡聚體于活體內(nèi)外皆具有神經(jīng)毒性，并會(huì)交聯(lián)至阿爾茨海默癥的淀粉樣蛋白-β(alzheimer’samyloid-β,aβ)而使aβ形成淀粉樣蛋白寡聚體。因此，一種能結(jié)合至tdp-43寡聚體的分子(例如，抗體)將可用以抑制tdp-43蛋白病變(proteinopathies)，并藉以制備出可診斷、預(yù)防或治療由致病性tdp-43所造成的神經(jīng)退化性疾病的藥物(例如，疫苗及被動(dòng)式免疫法)。據(jù)此，本揭示內(nèi)容旨在提供一種可專一結(jié)合至tdp-43寡聚體的抗體或其片段。該抗體包含一重鏈可變區(qū)及一輕鏈可變區(qū)，其中該重鏈可變區(qū)包含seqidno：1、seqidno：2及seqidno：3的氨基酸序列，而該輕鏈可變區(qū)則包含seqidno：5、seqidno：6及seqidno：7的氨基酸序列。tdp-43寡聚體為一直徑約2至400納米(nanometer,nm)的顆粒。較佳的情況是，tdp-43寡聚體為一直徑約40至60納米的球型顆粒。依據(jù)某些較佳的實(shí)施方式，本發(fā)明抗體的重鏈可變區(qū)具有seqidno：4的氨基酸序列，而其輕鏈可變區(qū)則具有seqidno：8的氨基酸序列。在一實(shí)施方式中，本發(fā)明抗體是由一雜交瘤細(xì)胞株所制備，而該雜交瘤細(xì)胞株已寄存于生物資源保存及研究中心(bioresourcecollectionandresearchcenter,bcrc)，寄存編號(hào)為bcrc960494。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明抗體是由一雜交瘤細(xì)胞株所制備，而該雜交瘤細(xì)胞株已寄存于生物資源保存及研究中心，寄存編號(hào)為bcrc960495。在再另一實(shí)施方式中，本發(fā)明抗體是由一雜交瘤細(xì)胞株所制備，而該雜交瘤細(xì)胞株已寄存于生物資源保存及研究中心，寄存編號(hào)為bcrc960496。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明抗體是由一雜交瘤細(xì)胞株所制備，而該雜交瘤細(xì)胞株已寄存于生物資源保存及研究中心，寄存編號(hào)為bcrc960497。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明抗體是由一雜交瘤細(xì)胞株所制備，而該雜交瘤細(xì)胞株已寄存于生物資源保存及研究中心，寄存編號(hào)為bcrc960498。因此，本揭示內(nèi)容的第二方面提供了該抗體的用途，即，用以制備一種用以預(yù)防或治療與tdp-43寡聚體相關(guān)疾病的藥物或醫(yī)藥組合物。該藥物或醫(yī)藥組合物包含一有效量的上述抗體及一藥學(xué)上可接受的賦形劑。依據(jù)本揭示內(nèi)容較佳的實(shí)施方式，本發(fā)明抗體包含一重鏈可變區(qū)及一輕鏈可變區(qū)，其中該重鏈可變區(qū)包含seqidno：1、seqidno：2及seqidno：3的氨基酸序列，而該輕鏈可變區(qū)則包含seqidno：5、seqidno：6及seqidno：7的氨基酸序列。在一特定實(shí)施例中，該重鏈可變區(qū)具有seqidno：4的氨基酸序列，而該輕鏈可變區(qū)則具有seqidno：8的氨基酸序列。依據(jù)本揭示內(nèi)容其余較佳的實(shí)施方式，該抗體是由一雜交瘤細(xì)胞株所制備，而該雜交瘤細(xì)胞株已寄存于生物資源保存及研究中心，寄存編號(hào)為bcrc960494、bcrc960495、bcrc960496、bcrc960497或bcrc960498。本發(fā)明抗體的重量約占醫(yī)藥組合物總重量的0.1％至99％。在一實(shí)施方式中，本發(fā)明抗體的重量至少占醫(yī)藥組合物總重量的1％。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明抗體的重量至少占醫(yī)藥組合物總重量的5％。在再另一實(shí)施方式中，本發(fā)明抗體的重量至少占醫(yī)藥組合物總重量的10％。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明抗體的重量至少占醫(yī)藥組合物總重量的25％。本揭示內(nèi)容的藥物或醫(yī)藥組合物可用以治療與tdp-43寡聚體相關(guān)的疾病，該疾病可以是阿爾茨海默癥(alzheimer’sdisease)、嗜銀顆粒性認(rèn)知癥(argyrophilicgraindisease)、肌肉萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(amyotrophiclateralsclerosis,als)、關(guān)島肌肉萎縮性脊髓側(cè)索硬化-帕金森氏失智癥(als-parkinsonismdementiacomplexofguam)、血管性失智癥(vasculardementia)、額顳葉失智癥(frontotemporaldementia)、語意失智癥(semanticdementia)、雷維體失智(dementiawithlewybodies)、亨汀頓氏舞蹈癥(huntington’sdisease)、小腦萎縮癥(spinocerebellarataxia)、包涵體肌病(inclusionbodymyopathy)、包涵體肌炎(inclusionbodymyositis)或帕金森氏癥(parkinson’sdisease)。因此，本揭示內(nèi)容的第三方面提供了一種用以預(yù)防或治療一個(gè)體的與tdp-43寡聚體相關(guān)疾病的方法。該方法包含投予該個(gè)體一治療有效量的本發(fā)明抗體，藉以抑制tdp-43蛋白病變。依據(jù)某些較佳的實(shí)施方式，本發(fā)明抗體包含一重鏈可變區(qū)及一輕鏈可變區(qū)，其中該重鏈可變區(qū)包含seqidno：1、seqidno：2及seqidno：3的氨基酸序列，而該輕鏈可變區(qū)則包含seqidno：5、seqidno：6及seqidno：7的氨基酸序列。在一特定實(shí)施例中，該重鏈可變區(qū)具有seqidno：4的氨基酸序列，而該輕鏈可變區(qū)則具有seqidno：8的氨基酸序列。依據(jù)本揭示內(nèi)容其余較佳的實(shí)施方式，該抗體是由一雜交瘤細(xì)胞株所制備，而該雜交瘤細(xì)胞株已寄存于生物資源保存及研究中心，寄存編號(hào)為bcrc960494、bcrc960495、bcrc960496、bcrc960497或bcrc960498。本揭示內(nèi)容的方法可用以治療與tdp-43寡聚體相關(guān)的疾病，該疾病可以是阿爾茨海默癥、嗜銀顆粒性認(rèn)知癥、肌肉萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、關(guān)島肌肉萎縮性脊髓側(cè)索硬化-帕金森氏失智癥、血管性失智癥、額顳葉失智癥、語意失智癥、雷維體失智、亨汀頓氏舞蹈癥、小腦萎縮癥、包涵體肌病、包涵體肌炎或帕金森氏癥。本揭示內(nèi)容的第四方面提供了一種用以診斷一個(gè)體是否罹患與tdp-43寡聚體相關(guān)的疾病的方法。該方法包含由該個(gè)體取得一生物樣品；將該生物樣品與本發(fā)明抗體接觸，以決定該生物樣品中tdp-43寡聚物的含量；以及將該生物樣品中tdp-43寡聚物的含量與取自一健康個(gè)體的對(duì)照樣品的tdp-43寡聚物含量進(jìn)行比對(duì)；其中，若該生物樣品中tdp-43寡聚物的含量顯著高于或低該對(duì)照樣品的tdp-43寡聚物含量，即代表該個(gè)體患有與神經(jīng)退化性疾病。依據(jù)本揭示內(nèi)容較佳的實(shí)施方式，該生物樣品可以是腦部切片樣品、腦脊液樣品、全血樣品、血清樣品、血漿樣品、尿液樣品或黏液樣品。依據(jù)某些較佳的實(shí)施方式，本發(fā)明抗體包含一重鏈可變區(qū)及一輕鏈可變區(qū)，其中該重鏈可變區(qū)包含seqidno：1、seqidno：2及seqidno：3的氨基酸序列，而該輕鏈可變區(qū)則包含seqidno：5、seqidno：6及seqidno：7的氨基酸序列。在一特定實(shí)施例中，該重鏈可變區(qū)具有seqidno：4的氨基酸序列，而該輕鏈可變區(qū)則具有seqidno：8的氨基酸序列。依據(jù)其余較佳的實(shí)施方式，該抗體是由一雜交瘤細(xì)胞株所制備，而該雜交瘤細(xì)胞株已寄存于生物資源保存及研究中心，寄存編號(hào)為bcrc960494、bcrc960495、bcrc960496、bcrc960497或bcrc960498。因此，本揭示內(nèi)容的第五方面提供了一種用以偵測一生物樣品的致病性tdp-43表達(dá)的試劑盒。偵測的結(jié)果可用以評(píng)估該個(gè)體是否患有與tdp-43寡聚體相關(guān)的疾病。該試劑盒至少包含一容器及用以偵測tdp-43寡聚體的試劑，其中該試劑包含本發(fā)明的抗-tdp-43寡聚體抗體及一附于容器內(nèi)的說明書，該說明書用以告知利用本發(fā)明的抗-tdp-43寡聚體抗體來偵測致病性tdp-43(即上述的tdp-43寡聚體)的方法。該說明書可以是書冊(cè)、磁帶、cd、vcd或dvd。該試劑盒可另包含一用以對(duì)照指出tdp-43寡聚體于健康個(gè)體的正常含量的對(duì)照組。在參閱下文實(shí)施方式后，本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
：中具有通常知識(shí)者當(dāng)可輕易了解本發(fā)明的基本精神及其他發(fā)明目的，以及本發(fā)明所采用的技術(shù)手段與實(shí)施方式。附圖說明為讓本發(fā)明的上述與其他目的、特征、優(yōu)點(diǎn)與實(shí)施例能更明顯易懂，所附圖式的說明如下：圖1、全長tdp-43會(huì)形成與淀粉樣蛋白相似的寡聚體。圖1a：全長tdp-43的分析式粒徑篩析層析(analyticalsize-exclusionchromatography,sec)結(jié)果，其中由大腸桿菌純化的tdp-43是以光波波長為280納米時(shí)的吸光值進(jìn)行偵測(實(shí)線)，而由人類hek293細(xì)胞純化的tdp-43則是由隙縫印跡法(slotblotting)的強(qiáng)度進(jìn)行定量(虛線)；圖中所示的停留時(shí)間為分子量標(biāo)準(zhǔn)組的停留時(shí)間。圖1b：tdp-43的斑點(diǎn)雜交法(dotblotting)結(jié)果，其利用抗-淀粉樣蛋白寡聚體的抗體a11來進(jìn)行偵測；以a11分別對(duì)新鮮純化且未經(jīng)粒徑篩析層析處理的tdp-43(預(yù)載tdp-43)、經(jīng)粒徑篩析層析處理的tdp-43(沖提體積，tdp-43寡聚體)及緩沖液進(jìn)行免疫染色。圖1c：將新鮮純化的tdp-43分別沾點(diǎn)于緩沖液、包含9m尿素的緩沖液、包含7.2m鹽酸胍(guanidinehydrochloride,gdnhcl)的緩沖液或包含2％十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecylsulfate,sds)的緩沖液中，并以90℃加熱或不加熱1小時(shí)；該試驗(yàn)重復(fù)三次，并分別以a11抗體、抗-tdp-43的n端(殘基1-260)的抗體及抗-tdp-43的c端(殘基250-414)的抗體來進(jìn)行偵測。圖1d：以穿透式電子顯微鏡(transmissionelectronmicroscope,tem)來檢測tdp-43寡聚體(比例尺為500納米)，左上方為單一寡聚體的放大圖(比例尺為50納米)。圖1e：原子力顯微鏡(atomicforcemicroscope,afm)來檢測tdp-43寡聚體(比例尺為500納米)，左上方為單一寡聚體的放大圖(比例尺為50納米)。圖1f及圖1g：為經(jīng)粒徑篩析層析處理后，tdp-43寡聚體的動(dòng)態(tài)光散射(dynamiclightscattering,dls)分析結(jié)果；其中粒徑可以散射光強(qiáng)度及顆粒數(shù)量來表示。圖2、dp-43的結(jié)構(gòu)、硫代黃素t(thioflavint,tht)熒光及dna結(jié)合特性圖2a：全長tdp-43(實(shí)線)及短式tdp-43(虛線)的遠(yuǎn)紫外光旋光儀光譜(far-uvcdspectra)；波長范圍為250至190納米。圖2b：全長tdp-43(實(shí)線)及短式tdp-43(虛線)的bis-ans熒光光譜；緩沖液訊號(hào)標(biāo)示為點(diǎn)線。圖2c：tdp-43及aβ纖維與硫代黃素t的結(jié)合光譜；全長tdp-43的硫代黃素t熒光發(fā)散波長以實(shí)線連接的■表示，短式tdp-43的硫代黃素t熒光發(fā)散波長以虛線連接的●表示，而aβ纖維的硫代黃素t熒光發(fā)散波長則以點(diǎn)線連接的▲表示；僅aβ纖維具有與硫代黃素t結(jié)合的訊號(hào)。圖2d：利用熒光滴定來檢測tdp-43與tardna的結(jié)合；以單股tardna-a位(實(shí)心)及-b位(空心)分別滴定全長tdp-43(方形)及短式tdp-43(圓形)；利波長為280納米的光波進(jìn)行激發(fā)時(shí)，于350納米波長可偵測到tdp-43或tdp-43s的最大發(fā)散量；該些結(jié)果是以起始點(diǎn)為基準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，且連接線為最適線。圖3、tdp-43與aβ的交聯(lián)圖3a：在不含或含有0.4至4％的tdp-43時(shí)，aβ纖維化的硫代黃素t試驗(yàn)結(jié)果；該濃度是以tdp-43的摩爾百分比來表示。圖3b：時(shí)間點(diǎn)為0，不含或含有tdp-43的光致交聯(lián)(photo-inducedcross-linking,picup)試驗(yàn)結(jié)果，其中tdp-43的濃度是以摩爾百分比來表示。圖3c：不含或含有4％tdp-43的aβ終點(diǎn)產(chǎn)物的穿透式電子顯微鏡結(jié)果(比例尺為100納米)。圖4tdp-43寡聚體會(huì)于活體外及活體內(nèi)引發(fā)神經(jīng)軸突退化及毒性tdp-43對(duì)人類be(2)-c細(xì)胞的細(xì)胞毒性可藉由溴化噻唑藍(lán)四氮唑(mtt,3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide)(圖4a)及乳酸去氫酶(lactatedehydrogenase,ldh)ldh試驗(yàn)來分析(圖4b)(數(shù)量為3，平均值±平均標(biāo)準(zhǔn)偏差)。圖4c：利用mtt試驗(yàn)來分析tdp-43對(duì)初代神經(jīng)元培養(yǎng)的細(xì)胞毒性；在該試驗(yàn)中，細(xì)胞存活率是以緩沖液對(duì)照組做為基準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(數(shù)量為3，平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差).圖4a及圖4c是以單因子變異數(shù)分析(oneway-anova)及tukey事后測定(tukeyposttest)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，圖4b則是以單因子變異數(shù)分析及雙尾、不成對(duì)的student’st-test(twotailed,unpairedstudent’st-test)進(jìn)行分析(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001)。圖4d：以對(duì)照組或0.44μm的tdp-43處理的初代神經(jīng)元的免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果；樣品分別以map-2、gfap及dapi進(jìn)行熒光染色。圖4e：將tdp-43注射至小鼠海馬回，會(huì)造成海馬回的ca區(qū)的神經(jīng)元減少；分別將緩沖液對(duì)照組及tdp-43注入海馬回中(每組只數(shù)為3只)后，以神經(jīng)元特定標(biāo)志neun及核特定染劑dapi進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色；箭頭所指處為神經(jīng)元減少的位置(比例尺為50微米)。圖5、tdp-o抗體可專一地辨識(shí)tdp-43寡聚體圖5a：將新鮮純化的tdp-43分別溶于原緩沖液、包含9m尿素的緩沖液、包含7.2m鹽酸胍的緩沖液或包含2％十二烷基硫酸鈉的緩沖液中，并于90℃加熱或不加熱1小時(shí)后，以多克隆抗體tdp-o來進(jìn)行斑點(diǎn)雜交法分析，其中該多克隆抗體tdp-o是以tdp-43寡聚體為免疫原所制備的抗體；tdp-o與tdp-43所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)相似于圖1c所示的a11結(jié)果。圖5b：分別以a11及tdp-o抗體對(duì)aβ寡聚體進(jìn)行斑點(diǎn)雜交法分析；結(jié)果顯示a11可辨識(shí)aβ寡聚體，tdp-o則不會(huì)。圖5c：原倍tdp-43(點(diǎn)線)及3倍濃縮的tdp-43(實(shí)線)的粒徑篩析層析結(jié)果，其中tdp-43寡聚體的沖提體積為★，tdp-43單體的沖提體積為☆，數(shù)字則為分子量標(biāo)準(zhǔn)組。圖5d：收集1ml的粒徑篩析層析分液，以tdp-o(上圖)及n1-260抗體(下圖)進(jìn)行斑點(diǎn)雜交法分析。圖5e：以酵素免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,elisa)分析由粒徑篩析層析純化的tdp-43寡聚體及單體；將tdp-43樣品依濃度涂布于elisa盤后，分別以tdp-o(■)及n1-260(□)抗體偵測tdp-43寡聚體，而分別以tdp-o(●)及n1-260(○)抗體偵測tdp-43單體；tdp-o抗體對(duì)tdp-43寡聚體具有顯著較高的專一性。圖6、ftld-tdp轉(zhuǎn)基因鼠的tdp-43寡聚體表達(dá)量會(huì)隨著年齡增加而增加圖6a：將取自于野生型、6個(gè)月或12個(gè)月大的tdp-43轉(zhuǎn)基因鼠(tdp-43tg+/+transgenicmice)腦部的切片進(jìn)行免疫熒光染色，藉以偵測人類tdp-43及tdp-43寡聚體的表達(dá)；以抗-tdp寡聚體、tdp-43及dapi染色細(xì)胞(比例尺為100微米)；框選區(qū)域進(jìn)一步以更高倍率顯示于最右欄(比例尺為25微米)。圖6b：定量結(jié)果指出具有tdp-o及tdp-43沉淀的細(xì)胞比例與年齡相關(guān)(每組3只，其中各小鼠隨機(jī)取5視野進(jìn)行定量，數(shù)據(jù)以平均值±平均標(biāo)準(zhǔn)偏差表示；結(jié)果是以單因子變異數(shù)分析及tukey事后測定進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001)。圖7、ftld-tdp病患會(huì)表達(dá)tdp-43寡聚體共有三名ftld-tdp病患、三名神經(jīng)及病理分析上皆為正常的同齡健康個(gè)體，以及三名罹患阿爾茨海默癥而無tdp-43包涵體的病患(做為神經(jīng)退化疾病對(duì)照)接受本研究分析；該些個(gè)體的腦部切片代表圖分列于圖7中，其中(a)、(c)及(e)為利用tdp-o抗體對(duì)ftld-tdp病患的海馬回(c)及前額葉皮質(zhì)部位(a,e)進(jìn)行tdp-43免疫組織化學(xué)染色圖；tdp-o可辨識(shí)深染、卵圓形或不規(guī)則形的位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的包涵體(箭號(hào))及神經(jīng)纖維網(wǎng)(neuropil，為營養(yǎng)不良的軸突)中逗號(hào)形式的包涵體(箭頭)；在某些如(e)圖所示的皮質(zhì)區(qū)域中，神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)會(huì)呈現(xiàn)粗顆粒狀的免疫反應(yīng)；如(b)、(d)及(f)所示，對(duì)照個(gè)體的腦部切片并不會(huì)產(chǎn)生任何tdp-o的免疫染色反應(yīng)；相較于針對(duì)tdp-43單體的抗體，tdp-o抗體不會(huì)染到細(xì)胞核，證實(shí)該抗體可專一地結(jié)合至不正常折疊的tdp-43；各圖中的比例尺皆為20微米。圖8、由病人海馬回免疫沉淀萃取的tdp-43寡聚體會(huì)被tdp-o抗體以免疫金標(biāo)定法標(biāo)定萃取ftld-tdp病患的海馬回組織，并以tdp-o抗體進(jìn)行免疫沉淀；將萃取物以n端tdp-43抗體及免疫金標(biāo)記后，利用電子顯微鏡(electronmicroscopy,em)分析觀察(比例尺為50納米)。圖8a：ftld-tdp病患的tdp-43寡聚體(比例尺為100納米)。圖8b：tdp-43寡聚體的放大圖(比例尺為50納米)。圖9、tdp-o單克隆抗體對(duì)tdp-43寡聚體具有高度專一性分別將tdp-o-3、-5、-8、-9及-10雜交瘤細(xì)胞株所產(chǎn)生的tdp-o單克隆抗體，以不同濃度(每毫升1-2x10-5微克)進(jìn)行elisa試驗(yàn)分析，藉以偵測以十二烷基硫酸鈉解構(gòu)變性或未解構(gòu)變性的tdp-43。圖10、tdp-o單克隆抗體對(duì)純化的tdp-43寡聚體具有高度專一性利用tdp-o雜交瘤細(xì)胞株的條件培養(yǎng)液對(duì)以粒徑篩析層析純化過的tdp-43寡聚體及單體進(jìn)行elisa試驗(yàn)分析。圖10a：以superdex20010/300gl管柱分離并收集tdp-43寡聚體及單體。圖10b：在elisa試驗(yàn)中，利用tdp-o-3、-5、-8、-9及-10雜交瘤細(xì)胞株的條件培養(yǎng)液來偵測tdp-43寡聚體及單體。圖11、5株tdp-o單克隆抗體的重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)具有一致性的氨基酸序列x表任何的氨基酸殘基，而cdr則是互補(bǔ)性決定區(qū)(complementaritydeterminingregion)的縮寫。圖12、tdp-o單克隆抗體可減少由tdp-43寡聚體所產(chǎn)生的細(xì)胞毒殺反應(yīng)利用mtt試驗(yàn)來檢測be(2)-c細(xì)胞的存活率。將數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。以單因子變異數(shù)分析，*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。該些結(jié)果顯示投予tdp-o抗體可顯著減少由tdp-43寡聚體所引發(fā)的毒性。具體實(shí)施方式為了使本揭示內(nèi)容的敘述更加詳盡與完備，下文針對(duì)了本發(fā)明的實(shí)施方式與具體實(shí)施例提出了說明性的描述；但這并非實(shí)施或運(yùn)用本發(fā)明具體實(shí)施例的唯一形式。實(shí)施方式中涵蓋了多個(gè)具體實(shí)施例的特征以及用以建構(gòu)與操作這些具體實(shí)施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實(shí)施例來達(dá)成相同或均等的功能與步驟順序。i.定義“tdp-43蛋白病變”(tdp-43proteinopathy)一詞在本文中是指與分子量為43kda的轉(zhuǎn)活化反應(yīng)-脫氧核糖核酸-結(jié)合蛋白(transactivationresponsive-dna-bindingprotein,43kda,tdp-43)相關(guān)的疾病。tdp-43為一種疾病蛋白，其與具有泛素包涵體(ubiquitin-positiveinclusion,ftld-u)表現(xiàn)的額顳葉退化癥及肌肉萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥相關(guān)。tdp-43蛋白病變包含，但不限于，阿爾茨海默癥、嗜銀顆粒性認(rèn)知癥、肌肉萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、關(guān)島肌肉萎縮性脊髓側(cè)索硬化-帕金森氏失智癥、血管性失智癥、額顳葉失智癥、語意失智癥、雷維體失智、亨汀頓氏舞蹈癥、小腦萎縮癥、包涵體肌病、包涵體肌炎或帕金森氏癥?！坝行Я俊?effectiveamount)一詞于本說明書中是指對(duì)與tdp-43寡聚體相關(guān)的疾病達(dá)到理想治療結(jié)果的有效劑量及治療時(shí)間周期。“藥學(xué)上可接受的”(pharmaceuticallyacceptable)一詞是指當(dāng)投予至人體后，通常被視為安全的分子或組合物，例如該些具有生理兼容性及不會(huì)產(chǎn)生過敏或類似不當(dāng)反應(yīng)的分子或組合物。較佳的情況是，“藥學(xué)上可接受的”(pharmaceuticallyacceptable)一詞在本說明書中是指經(jīng)由美國聯(lián)邦或州政府的管理機(jī)構(gòu)認(rèn)可且可應(yīng)用于動(dòng)物或人類的分子或組合物。“投予”(administered、administering或administration)在本說明書中為可互換的詞匯，且指直接給予本發(fā)明的專一性抗體或組合物的方法。“個(gè)體”(subject)或“病患”(patient)是指包含人類的動(dòng)物，其是可接受本發(fā)明的組合物及/或方法的治療。除非特定指出單一性別，否則“個(gè)體”(subject)或“病患”(patient)同時(shí)意指雄性及雌性。因此，“個(gè)體”(subject)或“病患”(patient)包含任何可接受治療的哺乳類動(dòng)物?！皞€(gè)體”(subject)或“病患”(patient)包含，但不限于，人類、大鼠、小鼠、天竺鼠、猴子、豬、羊、牛、馬、狗、貓、鳥及家禽。在本發(fā)明實(shí)施例中，病患為人類?！爸委煛?treat或treatment)在本說明書是指產(chǎn)生一藥學(xué)及/或生理的效果，例如偵測致病性tdp-43的表現(xiàn)、預(yù)防或治療器官萎縮，或是抑制失智癥、肌肉無力及僵直。該效果可以是預(yù)防性的，即完全或部分預(yù)防一疾病或其病征；及/或是治療性的，即部分或完全治愈一疾病及/或其所造成的不適。“治療”(treatment)在本說明書包含預(yù)防、治療或減緩一哺乳類動(dòng)物(特別是人類)的疾??；該治療包含：(1)預(yù)防、治療或減緩一個(gè)體罹患一疾病(例如神經(jīng)退化性疾病)，其中該個(gè)體為罹患該疾病的高風(fēng)險(xiǎn)族群，或是已罹患該疾病而尚未確診斷定；(2)抑制一疾病(例如抑制其發(fā)生)；或(3)減輕一疾病(例如減輕與該疾病相關(guān)的征狀)?！翱贵w”(antibody或antibodies)在本說明書中采廣義定義，包含具有生物活性的單克隆抗體、多克隆抗體、多專一性抗體(例如雙專一性抗體)及上述任一抗體片段；該生物活性是指在包含他種蛋白及/或分子的混合物中，能辨識(shí)標(biāo)的蛋白并專一結(jié)合至抗原的特性。依據(jù)本揭示內(nèi)容的一實(shí)施方式，本發(fā)明抗體為一多克隆抗體，其可專一地辨識(shí)tdp-43寡聚體?！皢慰寺】贵w”(monoclonalantibody)一詞在本說明書是指一抗體，其由一群具有相同構(gòu)型的抗體分離出來，且不需經(jīng)過特定方法加以建構(gòu)。相較于多克隆抗體，其包含可分別辨識(shí)不同抗原決定位置(epitope)的多種抗體，單克隆抗體僅能專一辨識(shí)一抗原的單一抗原決定位置。本揭示內(nèi)容的單克隆抗體可以藉由融合方法或重組dna方法來制備。本說明書的單克隆抗體可包含“嵌合型”(chimeric)或“重組型”(recombinant)抗體，其中該抗體重鏈及/或輕鏈的部分區(qū)域是與一源自一特定物種的抗體或一分屬一特定抗體型或亞型的抗體，具有相同或同源的對(duì)應(yīng)序列；而重鏈及輕鏈的其他區(qū)域則是與源自其他物種或分屬其他抗體型或亞型的另一抗體，或是抗體片段(只要該片段具有相關(guān)的生物活性)，具有相同或同源的對(duì)應(yīng)序列。依據(jù)本揭示內(nèi)容的一特定實(shí)施方式，本發(fā)明抗體為一單克隆抗體，其可專一地辨識(shí)tdp-43寡聚體。非人類(例如小鼠)抗體的“人源化”(humanized)抗體是指一種包含源自非人類免疫球蛋白的最小序列的嵌合型抗體。人源化抗體為人類的免疫球蛋白，其可變區(qū)的殘基由源自非人類物種(例如小鼠、大鼠、兔子或其他具有所需專一性或親合性的非人類靈長類)的可變區(qū)殘基所取代。在某些情況下，人類免疫球蛋白的fv骨架區(qū)域(fvframeworkregion,fr)殘基是由相對(duì)應(yīng)的非人類殘基所取代。一般來說，人源化抗體大致包含至少一個(gè)(通常為二個(gè))可可變區(qū)，其中全部或多數(shù)fr區(qū)域?yàn)槿祟惷庖咔虻鞍椎男蛄小Ｈ嗽椿贵w可以選擇性地包含一免疫球蛋白(通常為一人類免疫球蛋白)的恒定區(qū)的部分序列。本說明書所用的單數(shù)名詞“一”(a或an)及“該”(the)涵蓋該名詞的復(fù)數(shù)型；而所用的復(fù)數(shù)名詞時(shí)亦涵蓋該名詞的單數(shù)型。ii.發(fā)明說明已知分子量為43kda的轉(zhuǎn)活化反應(yīng)-脫氧核糖核酸-結(jié)合蛋白(transactivationresponsive-dna-bindingprotein,43kda,tdp-43)為一種致病性蛋白，其與具有泛素包涵體(ubiquitin-positiveinclusion,ftld-u)表現(xiàn)的額顳葉退化癥及肌肉萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥相關(guān)。本申請(qǐng)案發(fā)明人發(fā)現(xiàn)全長的tdp-43會(huì)形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且具神經(jīng)毒性的球形寡聚體，該寡聚體會(huì)交聯(lián)至阿爾茨海默癥的淀粉樣蛋白-β(alzheimer’samyloid-β,aβ)并導(dǎo)致aβ形成淀粉樣蛋白寡聚體；因此，一能與tdp-43寡聚體結(jié)合的藥劑(例如抗體)將可用以抑制tdp-43蛋白病變；據(jù)此，該藥劑可用以制備一種藥物(例如疫苗或被動(dòng)式免疫法)，藉以預(yù)防或治療由致病性tdp-43所造成的神經(jīng)退化性疾病。因此，本揭示內(nèi)容的第一方面提供了一種抗體，更具體來說，該抗體為一種能辨識(shí)tdp-43寡聚體的抗體，并藉此抑制一蛋白(特別是tdp-43)的聚集，其中該聚集現(xiàn)象與一疾病相關(guān)。一般來說，蛋白聚集是一種自傳播反應(yīng)(self-propagatingmanner)，一旦開始，聚集反應(yīng)將會(huì)接連自動(dòng)地發(fā)生，并引發(fā)構(gòu)型改變及/或更多蛋白分子的聚合，最終形成無法被蛋白酶分解的有毒產(chǎn)物。經(jīng)此形成的蛋白寡聚體被認(rèn)為是造成神經(jīng)退化性疾病的近因的一，該些神經(jīng)退化性疾病包含阿爾茨海默癥、嗜銀顆粒性認(rèn)知癥、肌肉萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、關(guān)島肌肉萎縮性脊髓側(cè)索硬化-帕金森氏失智癥、血管性失智癥、額顳葉失智癥、語意失智癥、雷維體失智、亨汀頓氏舞蹈癥、小腦萎縮癥、包涵體肌病、包涵體肌炎及帕金森氏癥。依據(jù)本揭示內(nèi)容較佳的實(shí)施方式，tdp-43寡聚體為粒徑約2至400納米的顆粒。較佳的情況是，tdp-43寡聚體為粒徑約2至400納米的顆粒，例如20至30納米、30至40納米、40至50納米、50至60納米、60至70納米、70至80納米、80至90納米、90至100納米、100至120納米、120至140納米、140至160納米、160至180納米、180至200納米、200至220納米、220至240納米、240至260納米、260至280納米、280至300納米、300至320納米、320至340納米、340至360納米、360至380納米及380至400納米。更佳的情況是，tdp-43寡聚體為粒徑約40至60納米的球形或環(huán)狀顆粒。本揭示內(nèi)容的抗體可專一地結(jié)合至上述tdp-43寡聚體、其抗原決定位置、其不同構(gòu)型及各構(gòu)型的抗原決定位置。在較佳實(shí)施方式中，本抗體可優(yōu)先結(jié)合至致病性tdp-43，更具體來說，該致病性tdp-43為一全長的tdp-43寡聚體顆粒，其粒徑大小約為2至400納米。為制備所述的單克隆抗體，先將適量的tdp-43寡聚體注入諸如小鼠、大鼠或兔子等動(dòng)物體內(nèi)，使其產(chǎn)生免疫反應(yīng)。一般來說，佐劑會(huì)先與tdp-43寡聚體溶液混合，再將其注入動(dòng)物體內(nèi)。適用于本發(fā)明的佐劑包含弗氏完全佐劑(freund＇scompleteadjuvant,fca)、弗氏不完全佐劑(freund＇sincompleteadjuvant,fia)及氫氧化鋁佐劑?？贵w的注射可以血管、皮下、腹腔或肌肉等方式給予。抗原注射的時(shí)間間隔并無特定限定。抗原注射的間隔時(shí)間可為數(shù)天至數(shù)周，較佳的方法是，2至3周，共1至10次(較佳為2至5次)。注射后，一旦抗體的效價(jià)到達(dá)2或更高的吸光值，則停止后續(xù)注射，并繼續(xù)飼養(yǎng)該動(dòng)物1個(gè)月。接著，至少再注射一次。于最后一劑注射數(shù)天后(較佳約3至5天)，取出該動(dòng)物的脾臟細(xì)胞及區(qū)域淋巴結(jié)。采取血液樣品并將之離心處理以分離血清?？衫萌魏芜m合的方法來檢測所得血清中的抗體效價(jià)，例如酵素免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,elisa)、酵素免疫分析(enzymeimmunoassay,eia)或放射免疫分析(radioimmunoassay,ria)。在一較佳的實(shí)施例中，是利用elisa來測定抗體的效價(jià)。由分離的脾臟細(xì)胞及區(qū)域淋巴結(jié)制備可產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。在制備可產(chǎn)生抗體的細(xì)胞時(shí)，宜先盡可能移出組織殘?jiān)凹t血球。在此步驟可使用商業(yè)購買的紅血球去除劑?；蛘呤牵梢允褂冒然@及三羥甲基氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane(tris))的緩沖液。立即將可產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與永生細(xì)胞(例如骨髓瘤細(xì)胞)進(jìn)行融合，以制得雜交瘤細(xì)胞；雜交瘤細(xì)胞為一種可持續(xù)生長繁殖，并產(chǎn)生抗體的半永生細(xì)胞?？梢允褂糜蓜?dòng)物(例如小鼠)取得的常用的細(xì)胞株。較適用于本發(fā)明的細(xì)胞株為可有效融合、持續(xù)產(chǎn)生高量抗體、對(duì)次黃嘌呤-胺蝶呤-胸腺核苷(hypoxanthine-aminopterin-thymidine,hat)培養(yǎng)液具有敏感性，且唯有在與可產(chǎn)生抗體的細(xì)胞融合后方可存活的細(xì)胞株。適合的骨髓瘤細(xì)胞包含，但不限于，小鼠骨髓瘤細(xì)胞株(例如骨髓瘤fo細(xì)胞)及人類骨髓瘤細(xì)胞株(例如karpas707h)。細(xì)胞融合通常是將脾臟細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞與商業(yè)取得的骨髓瘤細(xì)胞在一促進(jìn)細(xì)胞融合因子的作用下，進(jìn)行融合反應(yīng)，例如平均分子量約為200至20,000kda的聚乙二醇(polyethyleneglycol,peg)或其他類似物?；蛘呤牵?xì)胞融合可以利用商業(yè)細(xì)胞融合儀，藉由電刺激(例如電融合)來進(jìn)行融合反應(yīng)。融合后，將所得細(xì)胞稀釋并培養(yǎng)于hat培養(yǎng)液中。由該些融合細(xì)胞中挑選出適合的雜交瘤細(xì)胞。于hat培養(yǎng)液中存活的融合細(xì)胞會(huì)形成聚集群落。收集各培養(yǎng)液的上清液，且以tdp-43寡聚體檢測是否具有抗體效價(jià)。如上所述，可以使用酵素免疫吸附法、酵素免疫分析或放射免疫分析來進(jìn)行檢測，其將tdp-43寡聚體或寡聚體解構(gòu)后形成tdp-43的單體涂布于盤中，并由此進(jìn)行篩選。一旦確認(rèn)可產(chǎn)生抗體的孔洞，即可將其中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至不含胺蝶呤的次黃嘌呤-胸腺核苷(hypoxanthine-thymidine,ht)培養(yǎng)液中培養(yǎng)。經(jīng)過培養(yǎng)，再次確認(rèn)培養(yǎng)上清液中的抗體效價(jià)。由最終篩選出的細(xì)胞中，分離出單一顆細(xì)胞。待單一顆細(xì)胞生長繁殖成一聚集群落后，篩選對(duì)tdp-43寡聚體具有高度專一性的聚集群落，并使其持續(xù)生長繁殖以制成雜交瘤細(xì)胞株。依據(jù)本揭示內(nèi)容較佳的實(shí)施方式，共篩選出5株雜交瘤細(xì)胞株：tdp-o-3、tdp-o-5、tdp-o-8、tdp-o-9及tdp-o-10，單克隆抗體可由該些雜交瘤細(xì)胞株以任何方式進(jìn)行分離或制備。舉例來說，可以將雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)于低血清濃度的培養(yǎng)液中，再由該培養(yǎng)上清液制備抗體。或者是，將雜交瘤細(xì)胞株注入動(dòng)物的腹腔，由腹水來制備抗體?？贵w可以任何方式進(jìn)行純化，該方式包含親和性管柱、膠濾層析、離子交換層析或相關(guān)技術(shù)?？梢允褂萌魏蜗嚓P(guān)領(lǐng)域的本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法或其組合。依據(jù)特定的實(shí)施方式，本揭示內(nèi)容的單克隆抗體分別由雜交瘤細(xì)胞株tdp-o-3、tdp-o-5、tdp-o-8、tdp-o-9及tdp-o-10制備，該些雜交瘤細(xì)胞株已寄存于臺(tái)灣新竹的食品工業(yè)發(fā)展及研究中心(developmentandresearchinstitute,fidri)的生物資源保存及研究中心(bioresourcecollectionandresearchcenter,bcrc)，其寄存編號(hào)分別為bcrc960494、bcrc960495、bcrc960496、bcrc960497及bcrc960498。依據(jù)較佳實(shí)施方式，本單克隆抗體的重鏈及輕鏈可變區(qū)分別包含一致性的氨基酸序列(consensussequence)。據(jù)此，本單克隆抗體分別包含一重鏈可變區(qū)及一輕鏈可變區(qū)，其中該重鏈可變區(qū)包含seqidno：1、seqidno：2及seqidno：3的氨基酸序列，而該輕鏈可變區(qū)則包含seqidno：seqidno：5、seqidno：6及seqidno：7的氨基酸序列。較佳的實(shí)施方式為，人源化單克隆抗體的重鏈可變區(qū)具有seqidno：4的氨基酸序列，而其輕鏈可變區(qū)則具有seqidno：8的氨基酸序列。在本揭示內(nèi)容所述的氨基酸序列中(特別是seqidno：1到seqidno：6及seqidno：8)，xaa表示任何已知的氨基酸殘基的l-或d-形式。在一實(shí)施例中，xaa是一酸性氨基酸殘基(例如天門冬氨酸(aspartate)或谷氨酸(glutamate))。在另一實(shí)施例中，xaa是一堿性氨基酸殘基(例如賴氨酸(lysine)、精氨酸(arginine)或組氨酸(histidine))。在再另一實(shí)施例中，xaa是一非極性氨基酸殘基(例如丙氨酸(alanine)、纈氨酸(valine)、亮氨酸(leucine)、異亮氨酸(isoleucine)、脯氨酸(proline)、苯丙氨酸(phenylalanine)、甲硫氨酸(methionine)或色氨酸(tryptophan))。在另一實(shí)施例中，xaa是一不帶電的極性氨基酸殘基(例如甘氨酸(glycine)、天冬酰氨酸(asparagine)、谷胺酰胺(glutamine)、半胱氨酸(cysteine)、絲氨酸(serine)、蘇氨酸(threonine)或酪氨酸(tyrosine))?；蛘呤牵?tdp-43寡聚體的單克隆抗體可以由dna基因克隆來制備。將用以編碼抗-tdp-43寡聚體單克隆抗體的dna分離出來后，再用傳統(tǒng)步驟進(jìn)行測序，例如可專一結(jié)合至用以編碼單克隆抗體的重鏈及輕鏈基因的寡核苷酸探針。較佳的dna來源是利用該些雜交瘤細(xì)胞株(例如tdp-o-3、tdp-o-5、tdp-o-8、tdp-o-9或tdp-o-10雜交瘤細(xì)胞株)。一旦分離后，可將dna建構(gòu)至表達(dá)載體，再將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞(例如大腸桿菌細(xì)胞、猿猴細(xì)胞cos、中國倉鼠卵巢細(xì)胞cho或不會(huì)產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞)，藉此于重組宿主細(xì)胞中制備出單克隆抗體。所制得的單克隆抗體及用以編碼該些單克隆抗體的dna可用以制備嵌合型抗體(例如雙專一性抗體)、人源化抗體及/或其中的抗體片段。非人類來源的單克隆抗體因具有免疫抗原性(immunogenicity)而會(huì)造成過敏反應(yīng)。單克隆抗體多是源自小鼠，其注射至人體后往往會(huì)引起嚴(yán)重的免疫反應(yīng)。為降低本發(fā)明抗-tdp-43寡聚體單克隆抗體的免疫抗原性，將小鼠抗-tdp-43寡聚體單克隆抗體的重鏈及輕鏈可變區(qū)與抗體的恒定區(qū)接合，藉此制備人源化抗體。為制備人源化的抗-tdp-43寡聚體抗體，先將該些用以編碼抗體的dna分離并測序，再據(jù)以進(jìn)行人源化建構(gòu)。依據(jù)本揭示內(nèi)容較佳的實(shí)施方式，對(duì)互補(bǔ)性決定區(qū)(complementarydeterminingregion,cdr)進(jìn)行轉(zhuǎn)接(grafting)，其將抗體的vh及vl基因中的cdr置換為特定的cdr編碼片段(例如該些抗-tdp-43寡聚體抗體中，用以編碼與tdp-43寡聚體結(jié)合的氨基酸片段的dna片段)。由此制備出的抗體僅有cdrs源自于小鼠的抗體，而vh及vl基因中其他的骨架區(qū)，以及恒定區(qū)的基因(即ck或ch1-h-ch2-ch3)則是人類的igg。在較佳的實(shí)施方式中，人源化抗-tdp-43寡聚體單克隆抗體包含一重鏈可變區(qū)及一輕鏈可變區(qū)。所制成的人源化抗-tdp-43寡聚體單克隆抗體可依據(jù)相關(guān)領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)步驟來進(jìn)行純化，包含掃流過濾(cross-flowfiltration)、親和性管柱層析(affinitycolumnchromatography)或膠體過慮(gelfiltration)等方法。須知，人源化抗體的作用應(yīng)與小鼠抗-tdp-43寡聚體抗體的作用相同或大致相似。較佳的情況是，相較于老鼠抗體，人源化抗-tdp-43寡聚體抗體(不論是fab或全長igg的形式)在施用至人類個(gè)體時(shí)，應(yīng)會(huì)產(chǎn)生較佳的作用。在某些實(shí)施方式中，人源化抗-tdp-43寡聚體抗體可用以制備本揭示內(nèi)容的雙專一性抗體?？衫萌魏位铙w外或活體內(nèi)的tdp-43蛋白病變模式來確認(rèn)本發(fā)明的抗-tdp-43寡聚體抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知，可利用動(dòng)物模式(例如實(shí)施例7所述的動(dòng)物模式)來確認(rèn)本發(fā)明的抗-tdp-43寡聚體抗體。或者是，可利用實(shí)施例8所述的相關(guān)病人樣品來確認(rèn)本發(fā)明的抗-tdp-43寡聚體抗體。依據(jù)本揭示內(nèi)容一實(shí)施例所述的活體外試驗(yàn)數(shù)據(jù)，本發(fā)明的抗-tdp-43寡聚體抗體可抑制由tdp-43寡聚體所引發(fā)的細(xì)胞毒性。依據(jù)一實(shí)施例，足以抑制由-tdp-43寡聚體所引發(fā)的細(xì)胞毒性的抗-tdp-43寡聚體抗體濃度約為每毫升0.001-5.0毫克；舉例來說，每毫升0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0毫克。較佳的濃度約為每毫升0.01-1.0毫克。更佳的濃度約為每毫升0.02-0.08毫克。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知，tdp-43蛋白病變的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ娇勺鰹轭A(yù)防性測試或治療性測試。在預(yù)防性測試中，在動(dòng)物產(chǎn)生tdp-43蛋白病變或其征癥前，即先投予藥物，藉以測試本發(fā)明的抗-tdp-43寡聚體抗體對(duì)tdp-43蛋白病變或其征癥的預(yù)防、減緩或延緩的功效。在治療性測試中，藥物是在動(dòng)物產(chǎn)生tdp-43蛋白病變或其征癥后方進(jìn)行投予，藉以測試本發(fā)明的抗-tdp-43寡聚體抗體對(duì)tdp-43蛋白病變或其征癥的治療、減輕或舒緩的功效。tdp-43蛋白病變的征狀包含，但不限于，致病性tdp-43于測試個(gè)體的腦部、脊髓、腦脊液或血清的數(shù)量變化。據(jù)此，本揭示內(nèi)容提供一種醫(yī)藥組合物或一藥物，其可用以治療一種與aβ堆積相關(guān)的神經(jīng)退化性疾病。該醫(yī)藥組合物包含一有效量的本發(fā)明抗-tdp-43寡聚體抗體及一藥學(xué)上可接受的賦形劑。該種可利用本揭示內(nèi)容的醫(yī)藥組合物或藥物進(jìn)行治療的tdp-43寡聚體相關(guān)疾病包含，但不限于，阿爾茨海默癥、嗜銀顆粒性認(rèn)知癥、肌肉萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、關(guān)島肌肉萎縮性脊髓側(cè)索硬化-帕金森氏失智癥、血管性失智癥、額顳葉失智癥、語意失智癥、雷維體失智、亨汀頓氏舞蹈癥、小腦萎縮癥、包涵體肌病、包涵體肌炎及帕金森氏癥。一般來說，本發(fā)明的抗-tdp-43寡聚體抗體的重量約占醫(yī)藥組合物總重量的0.1％至99％。在一實(shí)施方式中，本發(fā)明抗-tdp-43寡聚體抗體的重量至少占醫(yī)藥組合物總重量的1％。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明抗-tdp-43寡聚體抗體的重量至少占醫(yī)藥組合物總重量的5％。在再另一實(shí)施方式中，本發(fā)明抗-tdp-43寡聚體抗體的重量至少占醫(yī)藥組合物總重量的10％。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明抗-tdp-43寡聚體抗體的重量至少占醫(yī)藥組合物總重量的25％。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明醫(yī)藥組合物或藥物更可包含一藥劑，該藥劑為一已知可用以改善一神經(jīng)退化性疾病的征狀的藥劑；例如乙酰膽堿酵素抑制劑(acetylcholinesteraseinhibitor,achei)、aβ抑制劑或毒蕈堿受器(muscarinicreceptor)拮抗劑及其類似物。本發(fā)明醫(yī)藥組合物或藥物依照可接受的藥物制作方法來進(jìn)行制備，例如于remington＇spharmaceuticalsciences,17thedition,ed.alfonosor.gennaro,mackpublishingcompany,easton,pa(1985)所述的方法。藥學(xué)上可接受的賦形劑為該些與劑型中其他成分兼容且可為生物體接受的物質(zhì)。本發(fā)明的抗-tdp-43寡聚體抗體可單獨(dú)或與藥學(xué)上可接受的賦形劑一起以口服、腹腔注射、顱內(nèi)注射、脊內(nèi)注射、肌肉注射、靜脈注射、皮膚吸收、腸內(nèi)注射或吸入投予等方式投予至個(gè)體。在一較佳的實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗-tdp-43寡聚體抗體以靜脈注射的方式投予至個(gè)體。在另一較佳實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗-tdp-43寡聚體抗體是以脊內(nèi)注射的方式投予至個(gè)體?？墒褂玫墓腆w賦形劑可以包含一或多種物質(zhì)，該物質(zhì)可以是調(diào)味劑、潤滑劑、增溶劑、懸浮劑、填充劑、助流劑、壓縮助劑、粘合劑、片劑崩解劑或包覆性材料。若以粉末形式存在，該賦形劑為一可與細(xì)碎活性成分混合的細(xì)碎的固體。若以片劑方式存在，活性成分是與一具有壓縮特性的賦形劑，以適當(dāng)比例壓縮為所需的形狀及大小。粉末及片劑最好包含高達(dá)99％的活性成分。適用于本發(fā)明的固體賦形劑可以是磷酸鈣、硬脂酸鎂、滑石、糖、乳糖、糊精、淀粉、明膠、纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯吡咯烷酮或其類似物。本發(fā)明的抗-tdp-43寡聚體抗體亦可配制為無菌溶液或懸浮液形式的液體醫(yī)藥組合物，其可以靜脈、肌肉、皮下、脊內(nèi)、腹腔或顱內(nèi)等方式注射至個(gè)體?？诜队杩梢允且后w或固體形式。為因應(yīng)以黏膜方式投予，本發(fā)明的藥物或醫(yī)藥組合物可以配制為各式劑量形式，例如若要經(jīng)由口腔黏膜吸收，本發(fā)明的藥物或醫(yī)藥組合物可以頰及/或舌下藥物劑量單位進(jìn)行配制。各式藥學(xué)上可接受的具有生物降解性的聚合賦形劑亦可使用于本發(fā)明，該類賦形劑不但提供適度的生物附著及藥物釋放特性，更可與頰及/或舌下藥物劑量單位中的活性試劑及其他成分兼容。一般來說，聚合賦形劑包含可附著于口腔黏膜的濕潤表面的親水性聚合物。適用于本發(fā)明的聚合賦形劑包含，但不限于，丙烯酸聚合物及共聚物、水解聚乙烯醇、聚乙烯氧化物、聚丙烯酸酯、乙烯聚合物及共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、聚葡萄糖、瓜爾膠、果膠、淀粉及纖維素聚合物。因此，本發(fā)明亦提供一種治療哺乳類動(dòng)物(特別是人類)的與tdp-43寡聚體相關(guān)的疾病的方法，該方法包含投予本發(fā)明包含抗-tdp-43寡聚體抗體的藥物及醫(yī)藥組合物至該個(gè)體。該藥物或醫(yī)藥組合物可以任何能將組合物活性成分有效傳遞至哺乳類動(dòng)物(特別是人類)的特定位置的方式投予，例如透過口、鼻、肺、皮膚(例如被動(dòng)或離子電滲傳遞)或非口服(例如直腸、脂肪、皮下、靜脈、脊內(nèi)、肌肉、鼻腔、小腦內(nèi)、眼液或軟膏)來投予。此外，本發(fā)明組合物的投予可以與其他活性成分同時(shí)投予。在某些實(shí)施方式中，投予至個(gè)體的有效劑量約為每公斤個(gè)體體重的1至100毫克，例如每公斤個(gè)體體重的10、20、30、40、50、60、70、80、90或100毫克；較佳的是每公斤個(gè)體體重的50至70毫克，例如每公斤個(gè)體體重的50、60或70毫克；最佳的是每公斤個(gè)體體重的50毫克。該些劑量可以是單一次投予劑量，或是分成多次投予。依據(jù)本揭示內(nèi)容可選擇的實(shí)施方式，該方法更可包含投予該個(gè)體一乙酰膽堿酵素抑制劑、aβ抑制劑或毒蕈堿受器拮抗劑，其中該抑制劑/拮抗劑可與本發(fā)明的抗-tdp-43寡聚體抗體同時(shí)或先后投予。在某些實(shí)施方式中，該乙酰膽堿酵素抑制劑可以是阿蘭他敏(alantamine)、星斯林(cymserine)、多奈派劑(donepezil)、er127528、加蘭他敏(galantamine)、甘斯替敏(ganstigmine)、石杉?jí)A甲(huperzinea)、苯羥基丙氨酸(phenserine)、苯乙基正星斯林(phenethylnorcymserine)、卡巴拉汀(rivastigmine)、rs1259、sph1371、他克林(tacrine)、噻星斯林(thiacymserine)或蘭奈派齊(zanapezil)。在其他實(shí)施方式中，該aβ抑制物可以是巴比留主(bapineuzumab)、ptb2、鯊肌醇(scyllo-inositol)、ppi1019、rs0406、sp233、egcg、exberyl-1或sen606。而該毒蕈堿受器拮抗劑可以是氧化震顫素(oxotremorine)或占諾美林(xanomeline)。本發(fā)明的抗-tdp-43寡聚體抗體可做為一種用以偵測或診斷一個(gè)體是否罹患與tdp-43寡聚體相關(guān)的疾病的工具。因此，本發(fā)明提供一種用以偵測或診斷一個(gè)體罹患或疑似患有tdp-43寡聚體相關(guān)疾病的方法。該方法包含下述步驟：由該個(gè)體取得一生物樣品；將該生物樣品與本發(fā)明的抗體接觸，藉以決定該生物樣品中tdp-43寡聚物的含量；以及將該生物樣品中tdp-43寡聚物的含量與取自一健康個(gè)體的對(duì)照樣品的tdp-43寡聚物含量進(jìn)行比對(duì)；其中，若該生物樣品中tdp-43寡聚物的含量顯著高于或低于該對(duì)照樣品的tdp-43寡聚物含量時(shí)，即代表該個(gè)體患有與神經(jīng)退化性疾病。上述生物樣品包含，但不限于，腦部切片樣品、腦脊液樣品、全血樣品、血清樣品、血漿樣品、尿液樣品、黏液樣品及該些樣品的純化或過濾產(chǎn)物?？衫萌魏蜗嚓P(guān)領(lǐng)域的本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法來檢測抗體的結(jié)合，例如酵素免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,elisa)、三明治免疫分析法(sandwichimmunoassay)、原位免分析法(insituimmunoassays，例如利用膠態(tài)金、酵素或同位素標(biāo)的)、westernblot法、凝集分析法(agglutinationassay，例如膠體凝集分析法、血球凝集分析法等)、補(bǔ)體結(jié)合分析法(complementfixationassay)、免疫熒光染色法(immunofluorescenceassay)及免疫電泳法(immunoelectrophoresisassay)等。在一實(shí)施方式中，是利用elisa來測定抗體的結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，可利用體液(例如腦脊液、全血、血清、血漿、黏液及該些體液的純化或過濾產(chǎn)物)來檢測自體抗體。在一較佳的實(shí)施方式中，是利用腦脊液樣品來偵測抗體。在其他實(shí)施方式中，是利用腦部切片樣品來偵測抗體。為確保相關(guān)領(lǐng)域的本領(lǐng)域技術(shù)人員可有效利用本發(fā)明，本發(fā)明的抗-tdp-43寡聚體抗體可組裝為試劑盒形式，便于診斷、偵測或確認(rèn)一神經(jīng)退化性疾病。在較佳的實(shí)施方式中，是利用能與本發(fā)明的抗-tdp-43寡聚體抗體反應(yīng)的致病性tdp-43來診斷一個(gè)體是否罹患神經(jīng)退化性疾病。舉例來說，相較于對(duì)照組(取自一健康個(gè)體的樣品)，若在一生物樣品中發(fā)現(xiàn)較高量或較低量的可與本發(fā)明的抗-tdp-43寡聚體抗體反應(yīng)的致病性tdp-43，表示該個(gè)體罹患與tdp-43寡聚體相關(guān)的疾病。該數(shù)據(jù)可用以進(jìn)行后續(xù)相關(guān)治療。舉例來說，若一個(gè)體發(fā)現(xiàn)具有致病性tdp-43，即可開始進(jìn)行tdp-43寡聚體相關(guān)疾病(例如ad、als及pd)的治療，早期的治療往往具有較佳的療效。在一實(shí)施方式中，本發(fā)明利用抗-tdp-43寡聚體抗體提供一種用以診斷tdp-43寡聚體相關(guān)疾病的試劑盒。試劑盒的成分包含：一容器、用以偵測生物樣品中tdp-43寡聚體的試劑及一附于容器內(nèi)的說明書，其中該試劑包含利用本揭示內(nèi)容任一實(shí)施例揭示方法所制備的抗-tdp-43寡聚體抗體，而該說明書是用以告知利用本發(fā)明的抗-tdp-43寡聚體抗體來偵測致病性tdp-43(即上述的tdp-43寡聚體)的方法。該說明書可以是書冊(cè)、磁帶、cd、vcd或dvd。該試劑盒可另包含一用以對(duì)照指出tdp-43寡聚體于健康個(gè)體的正常含量的負(fù)對(duì)照。下文提出多個(gè)實(shí)驗(yàn)例來說明本發(fā)明的某些方面，以利本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
：中具有通常知識(shí)者實(shí)作本發(fā)明。不應(yīng)將這些實(shí)施例視為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。據(jù)信本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀了此處提出的說明后，可在不需過度解讀的情形下，完整利用并實(shí)踐本發(fā)明。此處所引用的所有公開文獻(xiàn)，其全文皆視為本說明書的一部分。實(shí)施例材料及方法材料由hek細(xì)胞所分離的人類tdp-43取自于origenetechnologies,inc.(rockville,md,usa)。由產(chǎn)品數(shù)據(jù)可知，將一trueorf殖株(即rc210639)轉(zhuǎn)染至人類hek293細(xì)胞后，可制得一重組tdp-43蛋白；該重組tdp-43蛋白的c端具有一myc-ddk標(biāo)志(tag)，故可利用抗-ddk親和性管柱進(jìn)行純化。短式tdp-43(殘基101-285)則是依照kuo等人所述的步驟(nucleicacidsres(2009)37,1799-1808)來制備。用于westernblot法的抗-n端殘基1-260的tdp-43抗體(標(biāo)記為n1-260)及用于免疫組織化學(xué)染色的抗-tdp-43抗體皆是購買自abcam(cambridge,uk)?？?c端殘基350-414的tdp-43抗體(標(biāo)記為c350-414)是購買自novus(littleton,co,usa)，而抗-淀粉樣蛋白寡聚體的抗體a11則是購買自biosource(invitrogen,carlsbad,ca,usa)?？筪dk單克隆抗體是購自origenetechnologies,inc。aβ肽是由中央研究院基因體中心的肽合成實(shí)驗(yàn)室所合成。其余化學(xué)藥劑則皆是購自sigmaaldrich(st.louis,mo,usa)或amresco(solon,oh,usa)。除非另有所指，否則所有細(xì)胞培養(yǎng)試劑皆是購自gibco(invitrogen)。純化tdp-43先由包含一用以編碼全長tdp-43的cdna的載體pcmv-taq2b克隆出tdp-43片段。再將該克隆產(chǎn)物以限制酶xhoi/bamhi亞克隆至載體pet14b(novagen,merckkgaa,darmstadt,germany)，以產(chǎn)生n端組氨酸標(biāo)志(his-tag)。將所得的n端具有一組氨酸標(biāo)志的tdp-43轉(zhuǎn)殖至大腸桿菌株rosetta2(novagen,merckkgaa,darmstadt,germany)進(jìn)行表達(dá)。收集細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮于30mmtris-hcl(ph8)緩沖液后置于冰上，以微流儀(microfluidizer)打破細(xì)胞，其中該緩沖液包含500mmnacl、10％甘油、1mmdtt、2％rnasea、2％dnasei及蛋白酶抑制劑(完全，不含edta，購買自rocheappliedscience,mannheim,germany)。于4℃，以27,000×g離心該溶菌產(chǎn)物。先以包含30mmtris(ph8)、500mmnacl、1mmdtt、20mm咪唑(imidazole)及10％甘油的緩沖液平衡一ni-nta親合性管柱(gehealthcarebio-sciencesab,uppsala,sweden)后，將所得的上清液注入該管柱。將咪唑溶于上述緩沖液后，利用不同濃度的咪唑來沖提蛋白產(chǎn)物。約200mm的咪唑可沖提出tdp-43蛋白。利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis,sds-page)及古瑪西藍(lán)(coomassieblue)來確認(rèn)所純化的組氨酸標(biāo)志tdp-43蛋白。純化的tdp-43包含n端殘基mgsshhhhhhssglvprgshmle。估算的分子約為47,147da。再進(jìn)一步將該蛋白產(chǎn)物進(jìn)行透析。依據(jù)nickpace(paceetal.,(1995)proteinsci4,2411-2423)所述的公式，扣除于280納米時(shí)的吸光背景值，以消光系數(shù)為44,920cm-1m-1計(jì)算蛋白濃度。在計(jì)算短式tdp-43的濃度時(shí)，消光系數(shù)則為15,470cm-1m-1。粒徑篩析層析(sizeexclusionchromatography,sec)先以分子量標(biāo)記組來標(biāo)準(zhǔn)化superdex-20010/300gl分析式凝膠過濾管柱(gehealthcarebio-sciencesab,uppsala,sweden)，其中該分子量標(biāo)記組是分別將鐵蛋白(ferritin,440kda)、β-淀粉酶(β-amylase,200kda)、胎牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,66kda)及細(xì)胞色素c(cytochromec,12.4kda)溶于包含30mmtris(ph7.4)及150mmnacl的緩沖液中。流速為每分鐘0.5毫升。由大腸桿菌制備的重組tdp-43先以0.2微米的過濾膜過濾，再將體積為300微升的過濾液注入superdex-200管柱。利用分液收集器(fractioncollector)自動(dòng)收集分液，其中每管分液為1毫升。收集預(yù)載樣品及包含寡聚體的分液，并利用斑點(diǎn)雜交法以a11抗體(1:1000)在不同的曝光時(shí)間下進(jìn)行分析。藉由動(dòng)態(tài)光散射來確認(rèn)各寡聚體分液。由hek細(xì)胞制得、體積為100微升，而濃度為2微摩爾的tdp-43亦同時(shí)以相同步驟進(jìn)行檢測。進(jìn)一步利用斑點(diǎn)雜交法來分析各分液。隙縫印跡法(slotblotting)由于濃度過低，故利用斑點(diǎn)雜交法來分析由hek293細(xì)胞分離，且經(jīng)粒徑篩析層析處理的tdp-43。自每管1毫升的分液中，取200微升注入先以內(nèi)部真空系統(tǒng)平衡的bio-dotsf微過濾儀(bio-rad,hercules,ca,usa)。偵測時(shí)，一級(jí)抗體為抗-ddk單克隆抗體(origenetechnologies,inc.,rockville,md,usa)。訊號(hào)強(qiáng)度是利用imagej1.42(nationalinstitutesofhealth,md,usa)來進(jìn)行定量。斑點(diǎn)雜交法(dotblotting)以10mmtris-hcl緩沖液在有或無變性劑的情況下，10倍稀釋純化的tdp-43。不同濃度的樣品分別包含無變性劑、含9m尿素、含7.2m鹽酸胍或含2％十二烷基硫酸鈉的緩沖液。最終tdp-43的濃度為0.4μm。分別將樣品置于室溫或90℃處理1小時(shí)。將各tdp-43樣品，以2微升的體積點(diǎn)漬于硝化纖維膜上進(jìn)行斑點(diǎn)雜交法。簡單來說，經(jīng)阻斷及以tris為緩沖基底且包含0.002％吐溫20(tween20)的生理食鹽水(即tbst)洗滌后，將膜分別與抗-n端殘基1-260的tdp-43抗體(1:2,000)、抗-c端殘基350-414的tdp-43抗體(1:2,000)及抗-類淀法蛋白寡聚體的抗體a11(1:1,000)進(jìn)行反應(yīng)，其中，該些抗體皆溶于包含5％牛奶的tbst緩沖液中；之后再以與辣根過氧化酶(horseradishperoxidase,hrp)接合的二級(jí)抗體抗-兔子或抗-小鼠igg(1:5,000,millipore,billerica,massachusetts,usa)偵測之。最終利用ecl化學(xué)冷光試劑(eclchemiluminescencereagent,millipore)分析表達(dá)。穿透式電子顯微鏡(transmissionelectronmicroscope,tem)于4℃的環(huán)境下，將新鮮純化的tdp-43置于包含10mmtris(ph8)的緩沖液進(jìn)行透析反應(yīng)至隔日。再將樣品置于4℃，以17,000×g離心30分鐘去除沉淀物后，取上清液定量并進(jìn)行穿透式電子顯微鏡分析。先將tdp-43樣品置于輝光-放電(glow-discharged)、400-篩孔福爾瓦碳包覆的銅柵(formvarcarbon-coatedcoppergrids400-meshformvarcarbon-coatedcoppergrids,emsinc.,hatfield,pa,usa)5分鐘，清洗后再以2％醋酸鈾酰(uranylacetate)進(jìn)行負(fù)染。以tecnaig2spirittwintem(fei,hillsboro,or,usa)或hitachih-7000tem(hitachiinc.,japan)在75kv加壓的環(huán)境下，檢測各樣品。原子力顯微鏡(atomicforcemicroscope,afm)于4℃的環(huán)境下，將新鮮純化的tdp-43置于包含10mmtris(ph8)的緩沖液進(jìn)行透析反應(yīng)至隔日。再將樣品置于4℃，以17,000×g離心30分鐘去除沉淀物后，取上清液定量并進(jìn)行原子力顯微鏡分析。將10微升的tdp-43滴于云母片(tedpella,redding,ca,u.s.a.)上，靜置5分鐘以使細(xì)胞貼附。以1毫升的二次水洗滌樣品，并將樣品由云母片上小心取下。將樣品置于室溫直至干燥，再以輕敲模式(tappingmode)進(jìn)行原子力顯微鏡分析(nanonics,jerusalem,israel)。本實(shí)驗(yàn)是使用彈性常數(shù)為1.6n/m的ppp-zeilr(nanosensors,neuchatel,switzerland)，且尖端半徑<10納米的原子力顯微尖端來進(jìn)行。動(dòng)態(tài)光散射(dynamiclightscattering,dls)將該些由粒徑篩析層析沖提的寡聚體分液進(jìn)行動(dòng)態(tài)光散射分析。首先，將樣品溶于包含30mmtris(ph7.4)及150mmnacl的緩沖液中。以50mw后纖維平衡zetasizernanozs動(dòng)態(tài)光散射儀(malverninstruments,worcestershire,uk)后，進(jìn)行樣品分析。依據(jù)各溶液設(shè)定適當(dāng)?shù)酿ざ燃罢凵渎剩瑴囟葎t固定為25℃。旋光儀(circulardichroism,cd)于4℃的環(huán)境下，將新鮮純化的tdp-43置于包含10mmtris(ph8)的緩沖液進(jìn)行透析反應(yīng)至隔日。再將樣品置于4℃，以17,000×g離心30分鐘去除沉淀物后，取上清液定量并進(jìn)行旋光儀分析。在一圓形的石英電池(hellma,foresthills,ny,usa)中，以設(shè)定1毫米路徑長度及室溫條件的jascoj-815分光光譜儀(jascoinc.,easton,md,usa)來測量遠(yuǎn)紫外光旋光儀光譜。收集250至190毫米的光譜，并以緩沖液背景值校正。內(nèi)源性及bis-ans熒光顯微鏡(intrinsicandbis-ansfluorescencespectroscopy)于4℃的環(huán)境下，將新鮮純化的tdp-43置于包含10mmtris(ph8)的緩沖液進(jìn)行透析反應(yīng)至隔日。再將樣品置于4℃，以17,000×g離心30分鐘去除沉淀物后，取上清液定量并進(jìn)行定量。以波長為280或295納米的光源激發(fā)，收集1.5μm的tdp-43在波長為305至400納米之間的內(nèi)源性熒光。以波長為400納米的光源激發(fā)，收集tdp-43、tdp-43s及緩沖液對(duì)照組在波長為450至600納米之間的bis-ans光譜。該些樣品包含0.8μm的tdp-43及5μm的bis-ans。所有實(shí)驗(yàn)皆是于溫度為25℃的循環(huán)式水浴槽，以fluoromax-3光譜熒光計(jì)(horibajobinyvon,kyoto,japan)完成。硫代黃素t(thioflavint,tht)結(jié)合于4℃的環(huán)境下，將新鮮純化的tdp-43置于包含10mmtris(ph8)的緩沖液進(jìn)行透析反應(yīng)至隔日。再將樣品置于4℃，以17,000×g離心30分鐘去除沉淀物后，取上清液定量并進(jìn)行定量。以tdp-43樣品及aβ40纖維進(jìn)行硫代黃素t結(jié)合檢測。先將1μm的樣品與相同摩爾濃度的硫代黃素t混合，以波長為442納米的光源激發(fā)后，收集波長為455至505納米的發(fā)散光譜。依照前述方法來制備濃度為25μm的aβ40纖維原液(chenandglabe,j.biol.chem.(2006)281,24414-24422)。簡單來說，將合成的aβ溶于6m的鹽酸胍(gdnhcl)中，再于10mm的磷酸鹽緩沖液(pbs,ph7.4)重新折疊。再來，將25μm的aβ于25℃的環(huán)境下，靜置超過10天。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，須先將成熟的纖維稀釋至1μm。將所得光譜扣除緩沖背景值。剛果紅光譜(congoredspectroscopy)加入10μm的剛果紅，并以紫光/可見光譜儀du800(beckmancoulter,ca)測量0.5μm的經(jīng)透析的tdp-43及成熟的aβ纖維于400至600納米的吸光值。以oc抗體進(jìn)行斑點(diǎn)雜交法將經(jīng)透析的tdp-43及aβ纖維(2微升，0.5μm)點(diǎn)漬于硝化纖維膜上，并利用標(biāo)準(zhǔn)斑點(diǎn)雜交法實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行后續(xù)分析。其中，實(shí)驗(yàn)所使用的抗體分別為oc抗體(millipore,1:10,000)及hrp接合的抗-兔子igg(1:10,000)。以熒光滴定(fluorescencetitration)來偵測dna結(jié)合使用熒光滴定來偵測dna結(jié)合所造成的蛋白構(gòu)型改變。以單股tardna來滴定新鮮純化且經(jīng)透析、濃度為1.5μm的全長tdp-43及短式tdp-43(殘基101-285)，其中該單股tardna包含tardnaa-位置(seqidno：9)及b-位置(seqidno：10)。以波長為280納米的光源激發(fā)內(nèi)源性蛋白熒光，并觀察tdp-43構(gòu)型的改變。以fluoromax-3光譜熒光計(jì)(horibajobinyvon,nj,usa)收集發(fā)散光譜。收集全長或短式tdp-43于350納米的發(fā)散光，扣除dna對(duì)照組的數(shù)值后，以稀釋倍數(shù)校正之。之后，以起始強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化所得數(shù)值，再代入單一蛋白與配體(ligand)的結(jié)合公式(chenetal.,proteinsci(2004)13,2196-2206)：r＝(2pt)-1*[(kd+lt+pt)-((kd+lt+pt)2-4ptlt)1/2]其中，γ為所觀察的訊號(hào)改變，其是代表結(jié)合蛋白；pt為總tdp-43濃度；lt為總配體濃度；而kd則為解離常數(shù)。依照dna及tdp-43的比例來繪制結(jié)果。聚合物交聯(lián)及硫代黃素t試驗(yàn)依照先前流程來制備aβ(chenetal.,j.biol.chem.(2011)286,9646-9656；nietal.,faseb(2011)25,1390-1401)。將aβ40溶于包含8m鹽酸胍的緩沖液a(10mm磷酸鈉，ph7.4)中，進(jìn)行再折疊，并以280納米的吸光值進(jìn)行定量(ε＝1,280cm-1m-1)。以10mm的tris-hcl(ph8)及150mm的nacl配制包含25μm的aβ、50μm的硫代黃素t及不同濃度且經(jīng)透析的tdp-43(濃度為0到1μm，即0-4％)的實(shí)驗(yàn)樣品。將該些樣品靜置于elisa的96-孔盤，并以透明薄膜密封，利用微盤分析儀(spectramaxm5,moleculedevices)于25℃、不同時(shí)間點(diǎn)下進(jìn)行測量。硫代黃素t是以442納米激發(fā)，而以485納米測量其發(fā)散光譜。光致交聯(lián)(photo-inducedcross-linking,picup)本實(shí)驗(yàn)依前述的步驟流程進(jìn)行(bitanetal.,j.biol.chem.(2001)276,35176-35184)。簡單來說，以包含8m尿素及10mm磷酸鈉的緩沖液來制備aβ原液，以利后續(xù)sds-page分析。以包含10mmtris-hcl(ph8)及150mmnacl的緩沖液，在包含或不包含不同濃度的tdp-43的情況下，配制濃度為25μm的aβ樣品。立即進(jìn)行光致交聯(lián)試驗(yàn)分析。將90％的aβ溶液與各5％的3mmru(bpy)及20mmaps均勻混合。之后，將樣品置于一封閉的空間，以手動(dòng)曝露于藍(lán)光發(fā)光二極管30秒。加入sds-page的樣品緩沖液可中止光致交聯(lián)反應(yīng)，再以16％的tris-tricinesds-page分析該樣品。所有的反應(yīng)皆需立即性處理。利用可辨識(shí)aβ殘基1-17的抗-aβ抗體6e10(chemiconinc.,billerica,ma)及抗-n端tdp-43(殘基1-260)的抗體，以westernblot法來分析凝膠。tdp-43對(duì)于人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞毒性分別利用溴化噻唑藍(lán)四氮唑(mtt,3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide)及乳酸去氫酶(lactatedehydrogenase,ldh,promega,madison,wi,unitedstates)試驗(yàn)來檢測tdp-43對(duì)人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤be(2)-c細(xì)胞株(美國菌種保存中心編號(hào)crl-2268)的細(xì)胞毒性。將細(xì)胞培養(yǎng)于包含10％胎牛血清(fetalbovineserum,fbs,biologicalindustry)之rpmi生長培養(yǎng)液(gibco)中，并置于37℃、5％co2的潮濕環(huán)境中生長。將60,000細(xì)胞種植于透明的96-孔洞elisa盤(corning,ny,usa)中，并靜置至隔夜。洗滌細(xì)胞后，將培養(yǎng)液置換為40微升的無血清的rpmi培養(yǎng)液，接著加入10微升的以透析緩沖液連續(xù)稀釋的tdp-43樣品，該tdp-43樣品為新鮮透析及離心的樣品。收取上清液，并以透析緩沖液做為一緩沖液對(duì)照組。將細(xì)胞靜置24小時(shí)，再利用mtt試驗(yàn)依照標(biāo)準(zhǔn)程進(jìn)行分析。簡言之，將7微升的濃度為每毫升5微克的mtt加入各孔洞，靜置3小時(shí)。去除培養(yǎng)液后，加入二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,dmso)溶解細(xì)胞，直到結(jié)晶紫染劑完全溶出。以elisa盤分析儀(spectramaxm5,moleculedevices,usa)測量570到690納米的吸光值，再將690納米的讀值訊號(hào)減去570納米的讀值訊號(hào)。平均五次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并以不含細(xì)胞的背景值予以校正。細(xì)胞存活率是將投予緩沖液的細(xì)胞讀值設(shè)為100％后，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的計(jì)算結(jié)果。ldh試驗(yàn)則是依照說明書指示步驟進(jìn)行。簡單來說，將20,000細(xì)胞種植于生長培養(yǎng)液中，靜置24小時(shí)。細(xì)胞的處理方法如mtt試驗(yàn)所述。將ldh受質(zhì)與試劑緩沖液均勻混合后，放置于室溫。將細(xì)胞冷卻至室溫30分鐘，再加入受質(zhì)反應(yīng)。避光1小時(shí)，以560納米激發(fā)受質(zhì)熒光，并以elisa盤分析儀讀取590納米的發(fā)散值。取三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果平均，并以不含細(xì)胞的背景值予以校正。mtt及l(fā)dh試驗(yàn)的p-值皆是以不成對(duì)的student＇st-test計(jì)算。tdp-43對(duì)小鼠初代皮質(zhì)神經(jīng)元的毒性由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(nlac，臺(tái)灣)購買懷孕的c57bl/6jnarl小鼠，相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)皆是經(jīng)過臺(tái)灣臺(tái)北陽明大學(xué)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物照護(hù)及使用委員會(huì)(institutionalanimalcareandusecommittee,iacuc)許可后進(jìn)行。自第19天的小鼠胚胎取出初代皮質(zhì)神經(jīng)元，以每孔洞2x105細(xì)胞的細(xì)胞量種植于96-孔盤，并培養(yǎng)于包含2μm的fdu的神經(jīng)基底培養(yǎng)液(21103049,gibco,usa)中。于活體外生長8天后，投予初代皮質(zhì)神經(jīng)元新鮮透析的tdp-43，靜置24小時(shí)，再加入每毫升0.5毫克的mtt，靜置3小時(shí)。透析緩沖液為本實(shí)驗(yàn)的緩沖液對(duì)照組。加入與mtt試劑等量的包含10％十二烷基硫酸鈉及20mmhcl的溶解緩沖液，靜置至隔日，使mtt的結(jié)晶紫染劑可以完全溶解。以elisa盤分析儀(tecan,switzerland)測量各孔洞570納米的吸光值。取三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果平均，并以不含細(xì)胞的背景值予以校正。mtt試驗(yàn)的p-值是以不成對(duì)的student＇st-test計(jì)算。免疫細(xì)胞化學(xué)染色(immunocytochemistry)將初代神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)于一置于24-孔盤且以聚-d-離氨酸(poly-d-lysine)涂布的12毫米蓋玻片上(每孔洞含3×105細(xì)胞)。于37℃、5％co2的潮濕環(huán)境，以tdp-43(0.6μm)或緩沖液對(duì)照處理細(xì)胞24小時(shí)后，以4％的三聚甲醛(paraformaldehyde)于室溫固定細(xì)胞20分鐘。之后，以pbs洗滌細(xì)胞3次，每次10分鐘，再以包含0.3％采酮x-100(tritonx-100)及10％胎牛血清的阻斷緩沖液于室溫處理1小時(shí)。接著，以抗-微管相關(guān)蛋白-2(microtubuleassociatedprotein-2,map-2,mab378,millipore,usa)抗體及兔子抗-膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,gfap,z0334,dako,glostrup,denmark)抗體于室溫處理2小時(shí)，再以接有得克薩斯紅(texas-red)的山羊抗-小鼠igg二級(jí)抗體(abdserotec,uk)或接有熒光異硫氰酸鹽(fluoresceinisothiocyanate,fitc)的山羊抗-小鼠igg二級(jí)抗體(millipore,usa)于室溫偵測1小時(shí)。最后，以包含dapi的包埋膠(+dapi,h-1200,vectorlab.)包埋細(xì)胞，再利用olympus熒光顯(bx-61,olympus)微鏡觀察染色結(jié)果。將tdp-43注入至海馬回組織由臺(tái)灣臺(tái)南成功大學(xué)購入并于該校飼養(yǎng)c57/bl6j小鼠，在該校的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物照護(hù)及使用委員會(huì)規(guī)范下，將不同藥劑投予至2個(gè)月大的c57/bl6j小鼠的海馬回中。首先由鼻管投予小鼠異氟烷吸入性麻醉劑(氧氣的1.2％)。將重組全長的tdp-43投予至各小鼠雙側(cè)的海馬回組織中。相對(duì)于前囟(bregma)的立體定向坐標(biāo)為前后側(cè)(anteroposterior,ap)-2mm、中側(cè)(mediolateral,ml)±1mm及背側(cè)(dorsoventral,dv)-2mm。將注射針頭緩慢地刺入特定深度后，以帶有一微量注射器(hamiltoncompany,nv,usa)的不銹鋼注射針將2微升的tdp-43(2.2μm)以每分鐘1微升的速度注入。注射完后將針頭放置5分鐘后再抽出，以防包含tdp-43的注射液滲出。小鼠腦部的免疫熒光染色將20周大的雄性野生型小鼠，以及6及12個(gè)月大的tdp-43轉(zhuǎn)基因小鼠(tdp-43tg+/+)進(jìn)行免疫熒光染色。所有的小鼠皆飼養(yǎng)于成功大學(xué)，且實(shí)驗(yàn)流程依照該校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物照護(hù)及使用委員會(huì)的規(guī)范來進(jìn)行。在投予tdp-43兩周后，將小鼠深層麻醉，再以溶于0.01m的pbs(ph7.4)的4％三聚甲醛由心臟進(jìn)行灌流。取出腦組織并將其置于30％蔗糖/4％pfa溶液至隔日。將腦組織細(xì)切成厚度為10微米的薄片，再以阻斷緩沖液于室溫作用1小時(shí)，該阻斷緩沖液是將0.2％采酮x-10及5％正常驢血清溶于0.01mpbs調(diào)配而成。在進(jìn)行海馬回組織注射實(shí)驗(yàn)時(shí)，將腦組織置于小鼠單克隆抗-neun的抗體(1:300,millipore,temecula,ca)中，于4℃放置至隔日；再以與alexafluor555熒光染劑接合的驢抗-小鼠抗體(1:300,chemicon,temecula,ca)于室溫作用1小時(shí)。最后以dapi復(fù)染該腦組織，并以包含熒光包埋介質(zhì)(dako,glostrup,denmark)進(jìn)行包埋。利用正立熒光顯微鏡(bx51,olympus,tokyo,japan)來檢測各腦組織的染色結(jié)果。在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因鼠的共存研究時(shí)，將腦組織切片分別置于抗-tdp-43抗體(1:1000,abcam,ab104223)、tdpo(1:1000,ltkbiolaboratories,taiwan)、與alexafluor488熒光染劑接合的山羊抗-兔子抗體及與alexfluor555熒光染劑接合的驢抗-小鼠抗體(1:300,invitrogen)中。將該腦組織置于dapi染劑中，最后以包含熒光包埋介質(zhì)(dako,glostrup,denmark)封片。利用雷射掃描共焦顯微鏡來(nikonte2000epfs-c1-si)檢測各腦組織的染色結(jié)果。制備并確認(rèn)對(duì)tdp-43寡聚體具有專一性的多克隆抗體在4℃的環(huán)境下，以10mmtris-hcl(ph8.0)透析經(jīng)純化的全長tdp-43，并將所得產(chǎn)物進(jìn)行離心，以制備最終濃度約為每毫升0.2毫克的免疫原蛋白。以該免疫原蛋白免疫注射紐西蘭白兔，并以標(biāo)準(zhǔn)制備流程(臺(tái)灣ltkbiolaboratories)來制備多克隆抗體。簡單來說，免疫原蛋白是以2周的間隔時(shí)間，每次以0.5毫升的體積注入至白兔體內(nèi)。經(jīng)6次注射后，犧牲白兔，取出其血清。為以斑點(diǎn)雜交法及elisa分析確認(rèn)tdp-o，將全長的tdp-43注入粒徑篩析層析(superdex-20010/300gl,gehealthcarebio-sciencesab,uppsala,sweden)處理，其中該緩沖液包含30mm的tris-hcl(ph8.0)及150mm的nacl，流速則為每分鐘0.3毫升。以1毫升為單位體積收集沖提液，將利用tdp-o及n1-260抗體進(jìn)行斑點(diǎn)雜交法分析。另外以微bcatm蛋白分析試劑盒(microbcatmproteinassaykit,thermoscientific,rockford,il)定量tdp-43寡聚體及單體后，將其以連續(xù)稀釋法涂布于elisa盤。利用標(biāo)準(zhǔn)流程來進(jìn)行elisa分析。簡言之，將涂布的樣品置于4℃至隔日，再于室溫以包含10％脫脂牛奶的tbst處理2小時(shí)。洗滌elisa盤后，利用tdp-o(以1:12,500的比例溶于包含3％脫脂牛奶的tbst中)或抗-n端殘基1-260的tdp-43抗體(以1:1,000的比例溶于包含3％脫脂牛奶的tbst中)于室溫偵測2小時(shí)。洗滌后，再以與hrp接合的抗-兔子抗體(1:1,000,merckmillipore,billerica,massachusetts,usa)于室溫偵測2小時(shí)，經(jīng)再次洗滌后，以100毫升的3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine,tmb,merckmillipore,billerica,massachusetts,usa)呈色反應(yīng)。以100毫升的250mmhcl中止反應(yīng)，再利用spectramaxm5(moleculardevice,sunnyvale,ca)于450納米的波長下讀取樣品的吸光值。制備β5纖維利用化學(xué)方法(mdbio,inc.,usa)來合成位于tdp-43片段的rrm2區(qū)的β5肽。將該肽溶于乙腈后，以pbs緩沖液(ph7.4)將起始濃度為每毫升5毫克的肽進(jìn)行十倍稀釋。以17,000×g的轉(zhuǎn)速離心30分鐘，收取上清液并利用0.2微米的過濾膜(pall,usa)過濾。之后，將樣品靜置于室溫7天。利用穿透式電子顯微鏡觀察形成的β5纖維。依前述方法以tdp-o抗體進(jìn)行斑點(diǎn)雜交法來分析各樣品。ftld-tdp病患的腦組織的tdp-o染色以二甲苯洗滌以石臘包埋的腦組織切片三次進(jìn)行脫臘。利用不同濃度的酒精水合該腦組織切片后，以1倍tbs洗滌5分鐘。將切片組織置于檸檬酸鈉(ph6)以全火力(1,500瓦)微波15分鐘，以恢復(fù)抗原表現(xiàn)。將組織置于包含3％過氧化氫的1倍tbs，作用20分鐘，藉以阻斷內(nèi)源性過氧化酶的活性；接著再以1倍tbs洗滌5分鐘。將組織置于10％正常山羊血清(invitrogen)，于室溫下作用1小時(shí)以阻斷非專一性結(jié)合。加入以1:1000比例稀釋于抗體緩沖液(包含5％胎牛血清白蛋白及0.5％吐溫-20的1倍tbs)的一級(jí)抗體，并于4℃作用至隔日。以洗滌緩沖液(包含0.5％吐溫-20的1倍tbs)洗滌樣品3次。將帶有生物素標(biāo)記的二級(jí)抗體以1:500的比例稀釋于抗體緩沖液后，加入樣品，于室溫作用1小時(shí)。以洗滌液洗滌樣品三次，再將樣品置于vectastainabc過氧化酶試劑(vectastainabcperoxidasereagent,vectorlabs,pk-6100)30分鐘后，以1倍tbs洗滌一次。加入dab過氧化酶受質(zhì)試劑(dabperoxidasesubstratereagent,vectorlabs,sk-4100)2-10分鐘，以達(dá)到最佳的染色效果。以梅爾氏蘇木精溶液(mayershematoxylinsolution,sigmaaldrich)進(jìn)行復(fù)染，再以不同濃度的酒精及二甲苯進(jìn)行脫水反應(yīng)。以permount(sigmaaldrich)包埋脫水后的組織切片。由加州戴維斯分校的阿爾茨海默中心所提供的取自3組對(duì)照、3位罹患ftld-tdp病患及3位罹患阿爾茨海默癥病患的腦部樣品亦同步進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)是經(jīng)機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)的認(rèn)證許可，且取得各病患的知情同意書。ftld-tdp腦部的tdp-43寡聚體的免疫沉淀及免疫標(biāo)記以每毫升約0.05克的溶解緩沖液溶解取自2對(duì)照及1罹患ftld-tdp病患的冷凍腦組織，該溶解緩沖液包含50mmtris(ph7.4)、150mmnacl、0.5％吐溫x-100及蛋白酶抑制劑(calbiochem,merckmillipore)。以組織研磨儀(wheaton,nj,usa)于冰上均質(zhì)化溶解的樣品。之后，以17,000xg的轉(zhuǎn)速于4℃離心10分鐘，收集可溶部分進(jìn)行免疫沉淀分析。在進(jìn)行組織分層前，依照使用說明書將tdp-o抗體交聯(lián)至免疫沉淀微珠(bead)。簡單來說，將40微克的tdp-o抗體加入包含10微升蛋白a-及10微升蛋白g-magsepharosetmxtra(gehealthcare)的結(jié)合緩沖液(50mmtris,ph7.5,150mmnacl)，于室溫靜置1小時(shí)。在抗體結(jié)合至微珠后，加入包含50mm的庚二亞氨酸二甲酯二鹽酸鹽(dimethylpimelimidatedihydrochloride)及200mm的三乙醇胺(triethanlamine,ph8.9)的交聯(lián)試劑，于室溫作用1小時(shí)，以進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)；加入100mm的乙醇胺(ph8.9)于室溫作用30分鐘以中止反應(yīng)。接著，將海馬回組織的可溶部分及與tdp-o抗體交聯(lián)的免疫沉淀微珠于室溫反應(yīng)1小時(shí)。以結(jié)合緩沖液至少洗滌6次反應(yīng)物，藉以移除未結(jié)合的蛋白成份。以緩和抗原/抗體沖提緩沖液(gentleag/abelutionbuffer,thermo,ph6.6)沖提標(biāo)的蛋白，再利用電子顯微鏡及免疫金標(biāo)記來分析沖提產(chǎn)物。在進(jìn)行免疫金標(biāo)記時(shí)，將10微升的沖提產(chǎn)物置于400-篩孔福爾瓦碳包覆的銅柵(400-meshformvarcarbon-coatedcoppergrids,emsinc.,hatfield,pa,usa)5分鐘，以pbs洗滌后，加入包含1％bsa的pbs，于室溫作用1小時(shí)。之后，以包含0.1％bsa及n1-260抗體(1:5,000,ab57105,abcam)的pbs于室溫反應(yīng)1小時(shí)，以標(biāo)記該銅柵；接著以包含50mm的tris(ph7.5)、500mm的nacl及0.1％的tween-20的高鹽吐溫緩沖液(highsalttweenbuffer,hstbuffer)及pbs洗滌該銅柵。而后將該銅柵置于6納米、以金接合的二級(jí)抗-小鼠igg抗體(1:40,jacksonimmunoresearch)，并于室溫反應(yīng)1小時(shí)。以hst及pbs洗滌銅柵以移除未結(jié)合的抗體。利用包含1％戊二醛的pbs于室溫作用10分鐘以固定該銅柵后，以二次水洗滌6次。最后，加入2％醋酸鈾酰(uranylacetate)進(jìn)行負(fù)染色(negativelystained)后，利用穿透式電子顯微鏡(feitecnaig2f20s-twintem)觀察染色結(jié)果。純化單克隆tdp-o抗體單克隆tdp-o抗體利用蛋白g瓊脂糖試劑盒(proteingagarosekit,kpl)依照使用說明書進(jìn)行純化。簡單來說，將混合于20％乙醇的蛋白g瓊脂糖(1.5毫升)注入一可拋棄式管柱。以10毫升的包含0.1m磷酸鈉(ph7.4)及0.15m氯化鈉的洗滌緩沖液洗滌管柱中的樹脂。利用結(jié)合緩沖液(5毫升)稀釋取自tdp-o雜交瘤細(xì)胞的條件培養(yǎng)液(5毫升)后，將該混合液注入管柱，并倒置管柱使混合液均勻混合。之后，以5毫升洗滌緩沖液洗滌管柱4次，直到od280區(qū)近于0。加入1毫升的包含0.2m甘氨酸(ph2.85)的沖提緩沖液，緩慢地沖提抗體，并收集于含有240微升的5倍洗滌液的收集管中。濃縮收集的抗體，利用amiconultra-430kdacutoff(millipore)將緩沖液置換為洗滌緩沖液。利用抗體于280納米的吸光值來定量抗體濃度(1毫克抗體的吸光值為1.34)。間接elisa將20納克(nanogram,ng)的全長tdp-43寡聚體蛋白溶于200微升的包含50mmtris(ph7.4)及150mmnacl的tbs溶液后，涂布于elisa96-孔洞盤(nuncmaxisorp)，并置放于4℃至隔日。移除涂布溶液，分別加入有或無包含0.2％的十二烷基硫酸鈉的tbs緩沖液，置于室溫1小時(shí)。以十二烷基硫酸鈉處理的tdp-43寡聚體將會(huì)變性，而以不含十二烷基硫酸鈉的緩沖液處理的tdp-43寡體則會(huì)維持原寡聚體的構(gòu)型。處理后，移除緩沖液，并加入200微升的包含10％脫脂牛奶的tbst緩沖液(20mmtris,ph7.6,137mmnacl,0.001％tween20)，于室溫作用2小時(shí)。利用pbst(每孔洞300微升)洗滌孔洞3次，再加入100微升的以包含5％脫脂牛奶的tbst稀釋的mtdp-o抗體(稀釋濃度由每毫升0.00001至2微克)，置于室溫1小時(shí)。以300微升的pbs洗滌2次后，藉由100微升的與hrp接合的抗-小鼠抗體偵測結(jié)合抗體的表現(xiàn)，其中該抗體是以1:1,000的比例稀釋于包含5％脫脂牛奶的tbst溶液。室溫作用1小時(shí)后，以300微升的pbs洗滌2次，再加入100微升的3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine,tmb,kplsureblue)，于室溫反應(yīng)10分鐘。加入100微升的250mm的hcl來中止反應(yīng)，并以spectramaxm5(moleculardevices)讀取波長450納米時(shí)的光密度(opticaldensity,od)。制備tdp-43寡聚體及單體以進(jìn)行間接elisa試驗(yàn)以amiconultra-430kdacutoff將每毫升180微克的tdp-43蛋白進(jìn)行3倍濃縮(由3毫升濃縮至1毫升)。將500微升的濃縮tdp-43蛋白液注入superdex20010/300gl管柱，并以包含30mmtris(ph8.0)及50mmnacl的沖提緩沖液以每分鐘0.3毫升的流速進(jìn)行沖提。以500微升為單位，分別收集包含tdp-43寡聚體及單體的沖提液。利用微bca蛋白分析試劑盒(thermo)定量蛋白濃度。取300奈克的tdp-43單體或寡聚體，將其涂布于elisa的96-孔洞盤(nuncmaxisorp)。依上述的間接elisa試驗(yàn)，以100微升的取自tdp-o融合細(xì)胞的調(diào)件培養(yǎng)液(稀釋比例為1:1,000)來偵測tdp-43寡聚體的表達(dá)。確認(rèn)抗體的同型(isotypes)藉由一用于elisa試驗(yàn)的小鼠單克隆抗體同型試劑盒(thermo)來確認(rèn)mtdp-o的同型。在該試驗(yàn)中，分別將抗-小鼠重鏈的捕捉抗體(captureantibody，抗-igg1、igg2a、igg2b、igg3、iga及igm)或抗-小鼠輕鏈的捕捉抗體(κ或λ)涂布于elisa盤。簡言之，將取自tdp-o的調(diào)件培養(yǎng)液以50倍比例稀釋于tbs溶液中，將稀釋好的樣品加入elisa盤。之后，加入50微升的以hrp接合的抗-小鼠igg+iga+igm抗體，于室溫反應(yīng)1小時(shí)。經(jīng)3次洗滌后，每孔洞加入75微升的tmb受質(zhì)，于室溫避光反應(yīng)10分鐘。接著，加入75微升的0.18m硫酸以中止反應(yīng)。藉由spectramaxm5(moleculardevices)讀取各孔洞于波長450納米時(shí)的吸光值。將ig可變區(qū)基因進(jìn)行克隆及測序以genejetrna純化試劑盒(genejetrnapurificationkit,thermo)萃取2×106雜交瘤細(xì)胞的rna。利用極大第一股cdna合成試劑盒(maximafirststrandcdnasynthesiskit,thermo)合成cdna。之后，藉由小鼠ig-引物組(ig-primersets,novagen)及g2綠色擴(kuò)增反應(yīng)混合劑(g2greenmastermix,promega)來放大ig重鏈及κ基因。將所得的放大產(chǎn)物以ta試劑盒(invitrogen)進(jìn)行轉(zhuǎn)殖。最終產(chǎn)物的dna序列是以missionbiotech進(jìn)行測序。細(xì)胞毒性試驗(yàn)利用mtt試驗(yàn)來檢測單克隆tdp-o抗體對(duì)由tdp-43寡聚體所引發(fā)的細(xì)胞毒性的抑制功效。將人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤be(2)-c細(xì)胞(atcc#crl-2268)培養(yǎng)于包含10％胎牛血清的rpmi細(xì)胞培養(yǎng)液中，并放置于37℃、5％co2環(huán)境培養(yǎng)。將細(xì)胞以每孔洞40,000個(gè)細(xì)胞的密度種植于96孔盤后，培養(yǎng)24小時(shí)。以dulbecco的磷酸鹽緩沖液以0倍、2倍或4倍稀釋單克隆抗體tdp-o-3(每毫升5毫克)。移除細(xì)胞培養(yǎng)液后，以不含胎牛血清的rpmi細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌一次。每孔洞加入40微升的rpmi細(xì)胞培養(yǎng)液，之后加入20微升的1.5μmtdp-43寡聚體及1微升的每毫升5、2.5或1.25毫克的tdp-o抗體溶液。培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)后，加入7微升的每毫升5毫克的mtt溶液，放置3小時(shí)。移除細(xì)胞培養(yǎng)液，利用dmso分解結(jié)晶體。以elisa微盤讀數(shù)器spectramaxm5(moleculardevices)檢測570及690納米波長下的吸光值。重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，減去不含細(xì)胞的背景值后，計(jì)算平均介于570及690納米之間吸光值差異。以緩沖液對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)化各組數(shù)據(jù)。利用單因子變異數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)施例1全長tdp-43易于形成寡聚體在本實(shí)施例中，將探討tdp-43的病理機(jī)制。依照“材料及方法”所述的步驟，分別由大腸桿菌及hek293細(xì)胞純化出重組的全長人類tdp-43(其n端帶有一組氨酸標(biāo)志，分子量為mw47,145da)及tdp-43蛋白。將所得的tdp-43蛋白進(jìn)行粒徑篩析層析分析。如圖1a所示，沖提體積包含至少86％的沖提t(yī)dp-43，而隙縫印跡法則證實(shí)兩種來源的重組全長tdp-43蛋白皆易于形成寡聚體。有鑒于tdp蛋白病變與包涵體(inclusionbody,ib)的形成相關(guān)，而重組全長tdp-43會(huì)形成高分子量寡聚體，故推測tdp-43可能會(huì)形成與淀粉樣變性病(amyloidosis)的淀粉樣寡聚體相似的寡聚體。因此，利用一種針對(duì)aβ寡聚體擬態(tài)所制備，且與構(gòu)型相關(guān)的抗-淀粉樣專一抗體(即a11)來檢測tdp-43寡聚體；結(jié)果顯示兩種tdp-43蛋白樣品皆能與a11產(chǎn)生免疫反應(yīng)，而其相對(duì)應(yīng)的緩沖液則不會(huì)(圖1b)。包含稀釋tdp-43的寡聚體分液具有較弱的訊號(hào)強(qiáng)度。為確認(rèn)該抗體及抗原間的辨識(shí)是與構(gòu)型相關(guān)，在利用a11、抗-n端的tdp-43抗體及抗-c端的tdp-43抗體進(jìn)行斑點(diǎn)雜交法分析前，先以不同變性方法來破壞tdp-43寡聚體的構(gòu)型(圖1c)。將蛋白培養(yǎng)于不同的緩沖液，即，有或無9m尿素、7.2m鹽酸胍或2％十二烷基硫酸鈉的緩沖液，再置于90℃處理1小時(shí)。發(fā)現(xiàn)在偵測a11的表達(dá)時(shí)，加熱與否并不會(huì)顯著地影響原緩沖液的訊號(hào)量。然而，加入高濃度的尿素或鹽酸胍會(huì)減少偵測的訊號(hào)量，再加熱處理則會(huì)大幅減少訊號(hào)量。不論加熱與否，加入2％十二烷基硫酸鈉皆無法偵測到任何訊號(hào)。相對(duì)地，抗-n端的抗體不論在何處理下，皆能辨識(shí)tdp-43的表達(dá)；此結(jié)果亦印證了點(diǎn)漬于膜上的蛋白為等量。加入尿素并加熱處理或加入鹽酸胍(不論加熱與否)皆會(huì)部份或完全減少抗-c端抗體對(duì)于抗原的辨識(shí)。該些結(jié)果指出，抗-c端的tdp-43抗體對(duì)于抗體的辨識(shí)度會(huì)隨著不同變型條件而改變。整體來說，上述結(jié)果指出重組的全長tdp-43易于形成高分子量蛋白；該些高分子蛋白與淀粉樣寡聚體具有共同的抗原決定位置。該些高分子蛋白對(duì)十二烷基硫酸鈉以外的化學(xué)變型處理皆相當(dāng)穩(wěn)定。實(shí)施例2全長tdp-43會(huì)形成非均質(zhì)的球形寡聚體在本實(shí)施例中，利用穿透式電子顯微鏡(transmissionelectronmicroscope，tem，圖1d)及原子力顯微鏡(atomicforcemicroscope，afm，圖1e)來觀察寡聚體的形態(tài)。穿透式電子顯微鏡顯示該些非均質(zhì)的球形蛋白具有數(shù)個(gè)球形及環(huán)形的結(jié)構(gòu)特征，而原子力顯微鏡則顯示多數(shù)球形蛋白呈現(xiàn)球形結(jié)構(gòu)特征，僅有極少數(shù)具有環(huán)形的結(jié)構(gòu)特征(圖1e的插圖)。利用穿透式電子顯微鏡來計(jì)算顆粒大小分布。多數(shù)的球形顆粒具有約40到60納米的粒徑(結(jié)果未顯示)。經(jīng)原子力顯微鏡分析，環(huán)形寡聚體的高度約為6納米(結(jié)果未顯示)。此外，經(jīng)動(dòng)態(tài)光散射(dynamiclightscattering,dls)分析顯示，由粒徑篩析層析所得的寡聚體蛋白呈現(xiàn)一非均質(zhì)的分布，其顆粒的粒徑大小約為40到400納米(圖1f)。大多數(shù)的顆粒粒徑約為50到60納米(圖1g)，穿透式電子顯微鏡亦呈現(xiàn)相同的分析結(jié)果。若結(jié)合影像及粒徑分布結(jié)果可知，全長tdp-43會(huì)形成具有球形超結(jié)構(gòu)的非均質(zhì)顆粒。該些結(jié)果符合之前的研究觀察，即野生型tdp-43及與肌肉萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥相關(guān)的tdp-43突變皆會(huì)形成寡聚體(johnsonetal.,j.biol.chem(2009)284,20329-20339)。整體而言，本研究結(jié)果指出，tdp-43蛋白不論是在結(jié)構(gòu)上或是免疫分析上，皆與球形淀粉樣寡聚體相似，而該球形淀粉樣寡聚體具有神經(jīng)毒性，且會(huì)表達(dá)于不同的神經(jīng)退化性疾病。實(shí)施例3tdp-43寡聚體具有明確的構(gòu)型及功能為進(jìn)一步檢測tdp-43寡聚體的構(gòu)型，利用遠(yuǎn)紫外光旋光儀光譜來分析tdp-43寡聚體的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示于圖2a。分別于接近210及222納米出現(xiàn)可能為α-螺旋結(jié)構(gòu)的二個(gè)極小值。該光譜分析與短式小鼠tdp-43(殘基101-265，圖中簡記為tdp-43s)的光譜分析不同，其中該短式小鼠tdp-43在晶體結(jié)構(gòu)上包含二個(gè)多為β-股的rrm(kuoetal.,nucleicacidsres(2009)37,1799-1808)。由內(nèi)源性芳香族殘基激發(fā)所得的熒光光譜顯示，在光波約為340納米時(shí)可偵測到發(fā)散最大值，該結(jié)果指出tdp-43的酪氨酸及色氨酸殘基為溶劑暴露殘基(結(jié)果未顯示)。此外，亦利用外源性熒光染劑bis-ans來偵測該些暴露的疏水性蛋白表面，其中熒光染劑bis-ans為一種常用以偵測蛋白折疊時(shí)部分尚未折疊的中間產(chǎn)物的染劑。如圖2b所示，相較于短式tdp-43，全長tdp-43會(huì)與熒光染劑bis-ans反應(yīng)而產(chǎn)生更高的熒光量，顯示全長tdp-43寡聚體具有與短式tdp-43不一樣的疏水性暴露表面。另外，亦使用傳統(tǒng)淀粉樣染劑硫代黃素t(thioflavint,tht)來檢測全長tdp-43是否會(huì)與硫代黃素t結(jié)合，結(jié)果顯示于圖2c。不論是全長或短式tdp-43，皆偵測不到硫代黃素t結(jié)合所發(fā)散的熒光發(fā)散波峰。相較之下，相同濃度的aβ纖維(1μm)則具有顯著的熒光發(fā)散(圖2c)，此結(jié)果與以硫代黃素t分析的病理檢驗(yàn)結(jié)果相符合。相似地，tdp-43寡聚體亦不會(huì)與剛果紅及抗-纖維抗體oc結(jié)合反應(yīng)(結(jié)果未顯示)。該些結(jié)果指出，tdp-43寡聚體應(yīng)無與β褶板(βsheet)交聯(lián)的結(jié)構(gòu)。然而，關(guān)于原子能階的結(jié)構(gòu)尚需進(jìn)一步研究確認(rèn)。有鑒于正常且具有功能性的tdp-43會(huì)與一特殊的核酸序列結(jié)合，接下來將探討tdp-43寡聚體是否會(huì)干擾dna的結(jié)合能力。利用熒光滴定來觀察蛋白與dna結(jié)合后的構(gòu)型改變，結(jié)果顯示于圖2d。簡單來說，以單股tardna-a位或-b位滴定分析tdp-43寡聚體，并將所得結(jié)果與短式tdp-43的滴定分析結(jié)果比較，已知短式tdp-43會(huì)以亞微摩爾(submicromolar)的親和度與單股dna結(jié)合(kuoetal.,nucleicacidsres(2009)37,1799-1808)。如圖2d所示，在低單股dna濃度時(shí)，tardna-a位及-b位皆會(huì)減少短式tdp-43的熒光量，而加入全長tdp-43則會(huì)顯著地降低該反應(yīng)。該結(jié)果符合“材料與方法”所述的單一抗體與配體的結(jié)合公式，并指出tdp-43及單股dna的化學(xué)計(jì)量為1:1。由該公式可得出全長tdp-43與tar-a、全長tdp-43與tar-b、短式tdp-43與tar-a及短式tdp-43與tar-b的解離常數(shù)(dissociationconstant,kd)分別為7.05±0.82、6.27±0.68、0.20±0.09及0.38±0.10μm。該些結(jié)果指出，單股dna與短式tdp-43的結(jié)合強(qiáng)度約為與全長tdp-43結(jié)合強(qiáng)度的15倍，其中tar-a及-b位對(duì)于全長tdp-43具有相似的親和力。該些發(fā)現(xiàn)顯示，全長tdp-43寡聚體的rrms可能具有不正常的構(gòu)型，因而造成與dna結(jié)合能力的下降，或是與dna結(jié)合的區(qū)域受到遮蔽而無法與dna結(jié)合。全長tdp-43的發(fā)散值的改變有可能是因樣品中存有少量的tdp-43單體所致。總結(jié)來說，該些結(jié)果證實(shí)tdp-43寡聚體具有與短式tdp-43不同的生物物理及生物化學(xué)特性，亦即，二者的構(gòu)型不相同。實(shí)施例4tdp-43寡聚體將aβ轉(zhuǎn)換為淀粉樣蛋白寡聚體在本實(shí)施例中，將以交聯(lián)實(shí)驗(yàn)來探討tdp-43是否會(huì)影響aβ纖維化反應(yīng)。首先，利用硫代黃素t試驗(yàn)來檢測在有或無0.4到4％的tdp-43寡聚體時(shí)，aβ40的纖維化反應(yīng)，結(jié)果顯示于圖3a。分析指出，tdp-43可有效抑制aβ的纖維化反應(yīng)，且該抑制效果會(huì)隨著tdp-43濃度的增加而增加(圖3a)。在將近180小時(shí)的實(shí)驗(yàn)觀察期中，4％的tdp-43可完全抑制aβ的纖維化反應(yīng)。再利用光致交聯(lián)反應(yīng)(photo-inducedcross-linking,picup)來檢驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)初始時(shí)，短暫出現(xiàn)的aβ蛋白；結(jié)果指出在交聯(lián)后，aβ主要會(huì)形成單體、雙聚體、三聚體及四聚體，而tdp-43寡聚體會(huì)造成具有更高分子量的aβ蛋白產(chǎn)生(圖3b)。加入tdp-43可觀察到aβ五聚體，且表達(dá)量與tdp-43加入的量呈正常相關(guān)。另外，亦觀察到二個(gè)具有較大分子量的組合，分別位于～55kda及分布于～105至>210kda之間。除了對(duì)十二烷基硫酸鈉不具抗性的tdp-43單體，亦發(fā)現(xiàn)一分子量約～55kda蛋白及數(shù)個(gè)分布于～80至>210kda的蛋白。若進(jìn)一步利用穿透式電子顯微鏡分析可發(fā)現(xiàn)，在加入4％的tdp-43后，aβ并不會(huì)形成纖維，而是會(huì)變性為一具有<10納米粒徑的球形寡聚體；該aβ在不含tdp-43仍會(huì)形成成熟的淀粉樣纖維(圖3c)。tdp-43寡聚體交聯(lián)具有>50納米的粒徑，該粒徑大于aβ寡聚體的粒徑大小(數(shù)據(jù)未顯示)。該些數(shù)據(jù)顯示tdp-43寡聚體可以引發(fā)aβ寡聚體的形成，且tdp-43與淀粉樣蛋白具有共同的特性。實(shí)施例5tdp-43寡聚體引發(fā)軸突退化及毒性在本實(shí)施例中，將進(jìn)一步探討tdp-43寡聚體是否會(huì)造成神經(jīng)毒性及軸突的退化。簡單來說，以連續(xù)稀釋的主要包含寡聚體的tdp-43樣品來處理人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤be(2)-c細(xì)胞，再以mtt及l(fā)dh試驗(yàn)來檢測所產(chǎn)生的細(xì)胞毒性；結(jié)果顯示于圖4a到圖4c。mtt試驗(yàn)指出，相較于緩沖液對(duì)照組，加入0.44μm的tdp-43會(huì)減少約20％的細(xì)胞存活率(圖4a)。有鑒于重組tdp-43的低溶解度，無法以更高濃度的tdp-43進(jìn)行該毒性試驗(yàn)。ldh試驗(yàn)亦呈現(xiàn)類似的結(jié)果，加入0.44μm的tdp-43會(huì)顯著地引發(fā)細(xì)胞死亡(圖4b)。tdp-43亦會(huì)于小鼠的初代皮質(zhì)神經(jīng)元產(chǎn)生與劑量呈正相關(guān)的神經(jīng)毒性，其中，投予0.6μm的tdp-43會(huì)減少約20％的細(xì)胞存活率(圖4c)。此外，該些小鼠皮膚神經(jīng)元的免疫組織化學(xué)染色法顯示，0.6μm的tdp-43會(huì)造成軸突的萎縮，并減少神經(jīng)元的密度及數(shù)量(圖4d)。為進(jìn)一步測試tdp-43寡聚體于活體內(nèi)的神經(jīng)毒性，將2微升的2.2μm的tdp-43注射至小鼠的海馬回組織，再利用免疫熒光染色分析神經(jīng)元的存活。以神經(jīng)元特定標(biāo)志neun及核特定染劑dapi進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色可發(fā)現(xiàn)，相較于以緩沖液處理的小鼠，接受tdp-43注射的小鼠的ca1層中具有較少量的神經(jīng)元(圖4e)。該結(jié)果指出，注射全長的tdp-43寡聚體至海馬回會(huì)引起細(xì)胞毒性。實(shí)施例6制備及確認(rèn)對(duì)tdp-43寡聚體具有專一性的多克隆抗體有鑒于抗-淀粉樣蛋白寡聚體抗體a11會(huì)交聯(lián)至不同的淀粉樣蛋白，依照“材料及方法”所述的方法，利用重組tdp-43寡聚體做為免疫原后，免疫刺激兔子以產(chǎn)生一多克隆抗體tdp-o，藉以了解tdp-43寡聚體是否會(huì)影響疾病的產(chǎn)生。依照“材料及方法”所述的方法，在不同的變性調(diào)件下，利用斑點(diǎn)雜交法來分析tdp-o抗體對(duì)全長tdp-43寡聚體構(gòu)型的專一性；結(jié)果顯示于圖5a。不論加熱(90℃，1小時(shí))與否，以1:125,000比例稀釋于原緩沖液的tdp-o皆可與全長tdp-43反應(yīng)；然而，2％十二烷基硫酸鈉會(huì)破壞抗體與tdp-43寡聚體間的反應(yīng)，而不論是否予以加熱處理。另外，加入7.2m的鹽酸胍或9m的尿素，并于室溫作用超過1小時(shí)，并不會(huì)影響全長tdp-43的反應(yīng)，該結(jié)果指出在高濃度化學(xué)變性劑的處理下，蛋白依舊相當(dāng)穩(wěn)定；然而，額外予以加熱處理則會(huì)減少反應(yīng)訊號(hào)量，亦即，tdp-o為一構(gòu)型相關(guān)的抗體?？偨Y(jié)上述，tdp-o的斑點(diǎn)雜交法定性分析結(jié)果與a11一致(圖5a與圖1c)。利用a11及/或tdp-o抗體來檢測抗體對(duì)aβ寡聚體的專一性，以了解tdp-o是否為一對(duì)tdp-43具有專一性的抗體，而非如a11為一對(duì)淀粉樣寡聚體具有廣用性的抗體。如圖5b所示，tdp-o無法辨識(shí)aβ寡聚體，證明了該抗體為對(duì)tdp-43寡聚體具有專一性的抗體。亦利用elisa來定量分析tdp-o抗體與tdp-43寡聚體及單體間的反應(yīng)；在這個(gè)部份，會(huì)辨識(shí)n端殘基1-260(n1-260)的tdp-43抗體亦同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)分析，做為比對(duì)之用。將約1μm的全長tdp-43或3倍濃縮的tdp-43樣品進(jìn)行粒徑篩析層析，并收集1毫升沖提液，藉此制備全長tdp-43的寡聚體及單體(圖5c)。取第1至18分液中的濃縮tdp-43，以tdp-o或n1-260抗體進(jìn)行斑點(diǎn)雜交法分析，結(jié)果繪示于圖5d。該結(jié)果顯示，tdp-o對(duì)于第5至7分液中的濃縮tdp-43具有較強(qiáng)的反應(yīng)，該些樣品乃對(duì)應(yīng)于沖提至沖提體積中的tdp-43寡聚體。相較之下，n1-260則是對(duì)于第6分液及第15至18分液中的濃縮tdp-43具有較強(qiáng)的反應(yīng)；亦即，該抗體可辨識(shí)tdp-43的寡聚體及單體。此外，利用elisa來定量tdp-43寡聚體與tdp-o的專一性，n1-260抗體在此做為對(duì)照組。在以微bca試驗(yàn)定量后，將連續(xù)稀釋的包含tdp-43寡聚體及單體的分液分別涂布至elisa盤。依elisa的標(biāo)準(zhǔn)操作流程，利用tdp-o及n1-260抗體進(jìn)行偵測。圖5e的結(jié)果顯示，相較于tdp-43單體，tdp-o抗體對(duì)tdp-43寡聚體具有較高的反應(yīng)度(ec50<每毫升0.5微克)；而n1-260抗體則對(duì)tdp-43寡聚體或單體具有相似的反應(yīng)度(圖5e)。另外，亦將由tdp-43的rrm2區(qū)第5β-股所制備的β5纖維點(diǎn)漬于膜上，以確認(rèn)tdp-o僅會(huì)辨識(shí)tdp-43寡聚體，而非如先前技術(shù)所述的纖維(wangetal.,jbiolchem(2013)288,9049-9057)(結(jié)果未顯示)；結(jié)果清楚地指出tdp-o僅能辨識(shí)tdp-43寡聚體，而不會(huì)辨識(shí)β5纖維。故，本發(fā)明的多克隆抗體tdp-o可專一性地辨識(shí)tdp-43寡聚體的構(gòu)型，而不會(huì)交聯(lián)至aβ蛋白。實(shí)施例7tdp-43寡聚體存在于轉(zhuǎn)基因鼠的腦部將取自6及12周的野生型小鼠及ftld-tdp-43轉(zhuǎn)基因鼠的腦部切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，以檢測tdp-43寡聚體是否存在于活體體內(nèi)；結(jié)果顯示于圖6a及圖6b。已知會(huì)于前腦表達(dá)全長tdp-43的ftld-tdp-43轉(zhuǎn)基因鼠具有與ftld-tdp病患相似的病狀(tsaietal.,jexpmed(2010)207,1661-1673)。隨著年齡增長，該tdp-43轉(zhuǎn)基因鼠的學(xué)習(xí)/記憶力及運(yùn)動(dòng)能力會(huì)逐漸下降。腦部切片以抗-tdp-43及tdp-o進(jìn)行免疫熒光染色，并以dapi進(jìn)行復(fù)染?？深A(yù)期地，在野生型小鼠腦部切片中，tdp-43主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)。相較之下，ftld-tdp轉(zhuǎn)基因鼠的腦部切片則顯示，tdp-43主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，且可偵測到tdp-o的訊號(hào)。在細(xì)胞中可發(fā)現(xiàn)大量共存的tdp-43及tdp-o訊號(hào)，且具有雙染的細(xì)胞量會(huì)隨著年齡的增加而增加。該些共存訊號(hào)指出，與淀粉樣相似的tdp-43寡聚體會(huì)存在于ftld-tdp轉(zhuǎn)基因鼠腦部，且表達(dá)量會(huì)隨著年紀(jì)的增長而增加。實(shí)施例8tdp-43寡聚體會(huì)表達(dá)于ftld-tdp病患的腦部為評(píng)估tdp-43寡聚體在人類疾病所扮演的角色，進(jìn)一步利用帶有tdp-43免疫反應(yīng)包涵體的ftld病患來研究寡聚體于ftld-tdp病患的表達(dá)。利用tdp-o多克隆抗體來對(duì)病患的海馬回及前皮質(zhì)區(qū)進(jìn)行免疫染色，其中該病患包含3名經(jīng)病理確認(rèn)的ftld-tdp病患、3名年齡相仿而不具失智病征的對(duì)照個(gè)體，以及3名經(jīng)病理確認(rèn)已罹患阿爾茨海默癥卻不具tdp-43病征的病患(做為疾病對(duì)照個(gè)體)。tdp-o抗體可辨識(shí)不同的神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)包涵體(圖7的a及c)及在ftld-tdp病患腦部中與tdp-43包涵體相似的營養(yǎng)不良的軸突(圖7的a)。在某些區(qū)域，神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)會(huì)深染為粗顆粒狀(圖7的e)。相較之下，除了神經(jīng)元脂褐質(zhì)(lipofuscin)所產(chǎn)生的非專一性反應(yīng)，tdp-o并不會(huì)對(duì)對(duì)照個(gè)體的腦部(圖7的圖b、d及f)及罹患阿爾茨海默癥卻不具tdp-43病征的病患的腦部(結(jié)果未顯示)產(chǎn)生顯著的免疫反應(yīng)。tdp-o多克隆抗體及tdp-43單克隆抗體皆無法染到正常組織的細(xì)胞核。此外，為了解可被tdp-o多克隆抗體辨識(shí)的tdp-43形態(tài)，利用tdp-o對(duì)對(duì)照個(gè)體及病患的海馬回組織進(jìn)行免疫沉淀分析試驗(yàn)(immunoprecipitation,ip)。將海馬回的采酮(triton)可溶分液與光交聯(lián)的tdp-o多克隆抗體進(jìn)行免疫沉淀分析試驗(yàn)。再將沖提產(chǎn)物以n端tdp-43抗體(n1-260)免疫標(biāo)記后，進(jìn)行電子顯微鏡分析(圖8a及圖8b)。結(jié)果指出，于病患樣品可觀察到粒徑約為50納米的圓球形tdp-43寡聚體，在對(duì)照個(gè)體的樣品則無；該些寡聚體可被n1-260抗體辨識(shí)，亦即，該些寡聚體并非n端截?cái)嗟鞍住Ｕw來說，利用本發(fā)明的tdp-o多克隆抗體可證實(shí)tdp-43寡聚體會(huì)存在于ftld-tdp病患的腦部。實(shí)施例9制備及確認(rèn)對(duì)tdp-43寡聚體具有專一性的單克隆抗體在本實(shí)施例中，利用elisa試驗(yàn)來檢測由tdp-o-3、-5、-8、-9及-10雜交瘤細(xì)胞所制備的單克隆抗體，在有或無十二烷基硫酸鈉處理時(shí)，對(duì)tdp-43寡聚體的專一性。如圖9所示，相較于變性的tdp-43蛋白，由5株雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體對(duì)未變性的tdp-43寡聚體具有較高的結(jié)合活性。該些數(shù)據(jù)指出，該些單克隆抗體對(duì)于tdp-43寡聚體具有專一性，是為構(gòu)型相關(guān)的抗體。為確認(rèn)各單克隆抗體的結(jié)合專一性，先以膠體過濾來純化tdp-43寡聚體及單體(圖10a)，再分別將各產(chǎn)物涂布于elisa盤以確認(rèn)各單克隆抗體的專一性。圖10b的結(jié)果指出，由tdp-o-3、-5、-8、-9及-10雜交瘤細(xì)胞所制備的單克隆抗體可具專一性地辨識(shí)tdp-43寡聚體。亦利用elisa小鼠單克隆抗體同型試劑盒(thermo)來決定各tdp-o單克隆體的同型。結(jié)果總結(jié)于表1。表1tdp-o單克隆抗體的亞型od450nmtdp-o-3tdp-o-5tdp-o-8tdp-o-9tdp-o-10igg10.21010.22610.12710.17170.2299igg2a1.05231.24300.92701.03331.1781igg2b0.05650.05200.05090.05640.0755igg30.05810.05390.05090.05560.0757iga0.05630.04980.05330.05330.0680igm0.05650.05020.04900.05190.0710kappa2.18702.66052.28631.93132.3966lamda0.05740.06030.05130.05720.0801依據(jù)表1的結(jié)果，由tdp-o-3、-5、-8、-9及-10雜交瘤細(xì)胞所制備的單克隆抗體對(duì)于igg2a及κ輕鏈具有較高的反應(yīng)性。因此，該些單克隆抗體為igg2a及κ輕鏈亞型。將5株單克隆抗體進(jìn)行測序分析，以決定一致性的序列；結(jié)果表述于圖11。實(shí)施例10對(duì)tdp-43寡聚體具有專一性的單克隆抗體可抑制由tdp-43寡聚體所引發(fā)的細(xì)胞毒殺反應(yīng)為檢測tdp-o抗體是否可抑制由tdp-43寡聚體所引發(fā)的細(xì)胞毒殺反應(yīng)，如本揭示內(nèi)容的“材料及方法”所述，分別對(duì)人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤be(2)-c細(xì)胞投予或不投予單克隆tdp-o抗體(即tdp-o-3)處理。之后利用mtt試驗(yàn)來分析細(xì)胞的存活率。結(jié)果指出，tdp-43寡聚體會(huì)顯著引發(fā)be(2)-c細(xì)胞死亡，而投予tdp-o抗體可成功抑制該毒殺現(xiàn)象(圖12)?？偨Y(jié)上述，本揭示內(nèi)容意外地發(fā)現(xiàn)致病性tdp-43，其會(huì)與aβ交聯(lián)形成淀粉樣蛋白寡聚體，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)退化性疾病。據(jù)此，本揭示內(nèi)容提供一種可用以抑制tdp-43蛋白病變的抗體。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明抗-tdp-43抗體可專一結(jié)合至致病性tdp-43，并抑制由tdp-43所引發(fā)的細(xì)胞毒殺反應(yīng)；因此，本發(fā)明抗體可用以預(yù)防及/或治療與tdp-43相關(guān)的神經(jīng)退化性疾病。當(dāng)可理解上述實(shí)施方式與實(shí)施例僅為例示，且本領(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)齊進(jìn)行各種修飾。上文提出的說明書、實(shí)施例與數(shù)據(jù)的目的在于使本說明書的結(jié)構(gòu)完備，并做為實(shí)作本發(fā)明的例示。雖然本揭示內(nèi)容已以實(shí)施方式揭露如上，然其并非用以限定本揭示內(nèi)容，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員，在不脫離本揭示內(nèi)容的精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可作各種的更動(dòng)與潤飾，因此本揭示內(nèi)容的保護(hù)范圍當(dāng)視后附的權(quán)利要求范圍所界定者為準(zhǔn)。序列表<110>中央研究院<120>可辨識(shí)致病性tdp-43的抗體及其用途<130>172344pwcn<160>10<170>bissap1.3<210>1<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>vhregion-cdr1<220><221>變異<222>3,5,6<223>xaa可以是任何氨基酸<400>1glytyrxaaphexaaxaatyrtrp15<210>2<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>vhregion-cdr2<220><221>變異<222>4,6,7,8<223>xaa可以是任何氨基酸<400>2ileasnproxaathrxaaxaaxaa15<210>3<211>13<212>prt<213>人工序列<220><223>vhregion-cdr3<220><221>變異<222>1,7<223>xaa可以是任何氨基酸<400>3xaaargglyglylystyrxaaglyglyalametasptyr1510<210>4<211>109<212>prt<213>人工序列<220><223>vhregion<220><221>變異<222>18,23,24,25,28,30,31,37,54,56,57,58,60,63,67,69,74,77,81,84,95,97,103<223>xaa可以是任何氨基酸<400>4glnvalglnleuglnglnserglyalagluleualalysproglyala151015serxaalysmetsercysxaaxaaxaaglytyrxaaphexaaxaatyr202530trpmethistrpxaalysglnargproglyglnglyleuglutrpile354045glytyrileasnproxaathrxaaxaaxaagluxaaasnglnxaaphe505560lysaspxaaalaxaaleuthralaaspxaaserserxaathralatyr65707580xaaglnleuxaaserleuthrsergluaspseralavaltyrxaacys859095xaaargglyglylystyrxaaglyglyalametasptyr100105<210>5<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>vlregion-cdr1<220><221>變異<222>4<223>xaa可以是任何氨基酸<400>5serservalxaatyr15<210>6<211>3<212>prt<213>人工序列<220><223>vlregion-cdr-2<220><221>變異<222>1<223>xaa可以是任何氨基酸<400>6xaathrser1<210>7<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>vlregion-cdr-3<400>7glnglnargsersertyrproleuthr15<210>8<211>96<212>prt<213>人工序列<220><223>vlregion<220><221>變異<222>6,9,10,11,18,21,26,30,35,36,48,49,74,80<223>xaa可以是任何氨基酸<400>8glnilevalleuthrxaaserproxaaxaaxaaseralaserprogly151015gluxaavalthrxaathrcysseralaxaaserservalxaatyrmet202530histrpxaaxaaglnlysproglythrserprolysleutrpilexaa354045xaathrserasnleualaserglyvalproalaargpheserglyser505560glyserglythrsertyrserleuthrxaaserargmetglualaxaa65707580aspalaalathrtyrtyrcysglnglnargsersertyrproleuthr859095<210>9<211>12<212>dna<213>人工序列<220><223>tardnaa-site<400>9ctttttgcctgt12<210>10<211>12<212>dna<213>人工序列<220><223>tardnab-site<400>10tgggtctctctg12當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12