本申請(qǐng)要求2014年8月13日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)第62/036,675號(hào)和2014年8月13日提交的第62/036,839號(hào)的優(yōu)先權(quán)，該等臨時(shí)專利申請(qǐng)以引用的方式并入本文中。
背景技術(shù)：
：：向大腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的藥物遞送是困難的，尤其當(dāng)需要向CNS中的特定細(xì)胞進(jìn)行靶向遞送時(shí)較困難。藥物和遞送媒劑必須克服血腦屏障(BBB)，在大腦組織中移動(dòng)，并且定位在目標(biāo)細(xì)胞中。患有神經(jīng)疾病(包括帕金森氏病(Parkinson'sdisease)、阿茲海默氏病(Alzheimer'sdisease)、大腦腫瘤和大多數(shù)神經(jīng)遺傳性病癥的患者受到嚴(yán)重衰弱癥狀困擾并且缺乏提供治愈性治療的治療選項(xiàng)。已經(jīng)研發(fā)出操控或繞過血腦屏障(BBB)的各種策略[杰恩(Jain),納米醫(yī)學(xué)(林德)(Nanomedicine(Lond)),2012.7(8):1225-33；沃爾法特(Wohlfart)等人,控釋雜志(JControlRelease),2012.161(2):264-273.]，該血腦屏障是向大腦進(jìn)行全身性遞送的主要屏障。這些方法包括向CNS局部投藥[帕特爾(Patel)等人,先進(jìn)藥物遞送評(píng)論(AdvancedDrugDeliveryReviews),2012.64(7):701-705]和經(jīng)由聚焦超聲對(duì)BBB進(jìn)行可逆的破壞馬克特(Marquet)等人公共科學(xué)圖書館·綜合(PLoSOne).2011；6(7)；e22598；唐斯(Downs)等人公共科學(xué)圖書館·綜合.2015年5月6日；10(5)；e0125911]或化學(xué)試劑[克羅爾(Kroll)等人,神經(jīng)外科(Neurosurgery),1998.42(5)；1083-1099；討論1099-100.]。然而，一旦到達(dá)BBB的另一邊，已經(jīng)廣泛公認(rèn)見于大腦細(xì)胞之間的各向異性并帶靜電的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是另一個(gè)關(guān)鍵性屏障(索恩(Thorne)等人美國國家科學(xué)院院刊(ProcNatlAcadSciUSA).2006年4月4日；103(14):5567-72；南斯(Nance)等人,科學(xué)·轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)(SciTranslMed),2012.4(149)；149ra119；思科瓦(Sykova)等人,生理學(xué)評(píng)論(PhysiolRev),2008.88(4):1277-1340；查美尼克(Zamecnik),J.,神經(jīng)病理學(xué)學(xué)報(bào)(ActaNeuropathol),2005.110(5):435-442)。不論投藥方法如何，此‘大腦組織屏障’妨礙大分子和納米粒子在大腦中的廣泛分布，因而限制其在整個(gè)神經(jīng)疾病散播性目標(biāo)區(qū)域中的覆蓋性[沃吉斯(Voges),J等人,神經(jīng)病學(xué)年鑒(AnnNeurol)2003.54(4):479-487；南斯,E.A.等人,科學(xué)·轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué),2012.4(149):149ra119；思科瓦等人,生理學(xué)評(píng)論,2008.88(4):1277-340；馬開(MacKay)等人,大腦研究(BrainRes),2005.1035(2):139-153]。ECM富含透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、蛋白多糖、連接蛋白和腱生蛋白，并且可以提供針對(duì)陽離子聚合載劑滲透的帶負(fù)電粘附性屏障[思科瓦等人,生理學(xué)評(píng)論,2008.88(4):1277-1340；齊默爾曼(Zimmermann)等人,組織化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)(HistochemCellBiol),2008.130(4):635-653]。此外，ECM的孔隙大小對(duì)納米粒子在CNS中的移動(dòng)施加立體屏障，其中非粘附性的114nm，而非200nm粒子能夠穿透在大腦組織內(nèi)[南斯,E.A.等人,科學(xué)·轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué),2012.4(149):第149ra119頁；肯尼(Kenny),G.D.等人,生物材料(Biomaterials),2013.34(36):9190-9200。已經(jīng)展示，格外良好地涂布有親水性并且不帶電的聚乙二醇(PEG)的小于100nm的納米粒子在大腦ECM中快速擴(kuò)散，從而允許治療劑的廣泛分布[南斯等人,美國化學(xué)學(xué)會(huì)·納米(ACSNano),2014年10月28日:8(10):10655-64.doi:10.1021/nn504210g,電子版2014年10月8日；南斯,E.A.等人,科學(xué)·轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué),2012.4(149):第149ra119頁]。對(duì)可以改變或逆轉(zhuǎn)CNS疾病自然病史的特定遺傳目標(biāo)的累積知識(shí)已經(jīng)使基因療法成為有吸引力的治療策略[奧馬尼(O'Mahony),A.M.等人,藥學(xué)雜志(JPharmSci),2013.102(10):3469-3484；倫茨(Lentz)等人,神經(jīng)生物學(xué)疾病(NeurobiolDis),2012.48(2):179-188.]。多種臨床前和臨床研究旨在使用特定集中于增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)在整個(gè)大腦組織中的水平和分布的前沿性病毒或非病毒基因載體來改善核酸向CNS中的遞送[奧馬尼等人,藥學(xué)雜志,2013.102(10):3469-3484.；珀勒茲-馬丁尼茲(Perez-Martinez)等人,阿茲海默氏病雜志(JAlzheimersDis),2012.31(4):697-710]。盡管相對(duì)高效，但病毒基因載體已經(jīng)受到一個(gè)或多個(gè)缺點(diǎn)限制，包括低包裝容量，技術(shù)上難以放大規(guī)模、高生產(chǎn)成本[托馬斯(Thomas)等人,自然·遺傳學(xué)評(píng)論(NatRevGenet),2003.4(5):346-358.]和突變形成風(fēng)險(xiǎn)[奧爾森(Olsen)和施泰因(Stein),新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(NEnglJMed),2004.350(21):2167-2179.]。此外，盡管CNS具有免疫特許性質(zhì)，但使免疫反應(yīng)中和可能在重復(fù)投藥或先前暴露之后發(fā)生[倫茨等人,神經(jīng)生物學(xué)疾病,2012.48(2):179-188；肖(Xiao),X.等人,病毒學(xué)雜志(JVirol),1996.70(11):8098-8108；徹繆爾(Chirmule),N等人,病毒學(xué)雜志,2000.74(5):2420-2425；洛溫斯坦(Lowenstein),P.R.等人,當(dāng)今基因療法(CurrGeneTher),2007.7(5):第347-60頁；洛溫斯坦,P.R.等人,神經(jīng)病療法(Neurotherapeutics),2007.4(4):715-724；沃吉斯,J.等人,神經(jīng)病學(xué)年鑒2003.54(4):479-487.]。非病毒基因載體可在沒有許多這些限制的情況下提供有吸引力的用于基因遞送的替代性策略[奧馬尼,A.M.等人,藥學(xué)雜志,2013.102(10):3469-3484]。基于陽離子聚合物的基因載體為活體外和活體內(nèi)的DNA縮合和高效基因轉(zhuǎn)移提供可定制平臺(tái)。其正電荷密度允許穩(wěn)定壓實(shí)帶負(fù)電的核酸[孫(Sun),X.和N.張(Zhang),藥物化學(xué)小評(píng)論(MiniRevMedChem),2010,10(2):108-125；鄧?yán)?Dunlap),D.D.等人,核酸研究(NucleicAcidsRes),1997.25(15):3095-3101]并且保護(hù)其免受酶促降解影響[庫克斯卡-拉塔洛(Kukowska-Latallo),J.F.等人,人類基因療法(HumGeneTher)2000.11(10):1385-1395.]。另外，可質(zhì)子化的胺的數(shù)目提供緩沖能力增加，其經(jīng)由“質(zhì)子海綿效應(yīng)”促進(jìn)內(nèi)體逸出，從而引起高效轉(zhuǎn)染[阿金克(Akinc),A.等人,基因醫(yī)學(xué)雜志(JGeneMed),2005.7(5):657-663]。為此目的已經(jīng)研發(fā)出多種陽離子聚合物，提供具有不同物理化學(xué)概況和活體內(nèi)行為的基因載體[明策爾(Mintzer),M.A.和E.E.塞瑪內(nèi)克(Simanek).化學(xué)評(píng)論(ChemRev),2009.109(2):259-302；帕塔克(Pathak)等人,生物技術(shù)雜志(BiotecholJ),2009.4(11):1559-72.]。然而，非病毒基因載體在到達(dá)大腦中的目標(biāo)細(xì)胞處之前仍面臨多種屏障[奧馬尼等人,藥學(xué)雜志,2013.102(10):3469-3484]?？梢詰?yīng)用對(duì)流增強(qiáng)型遞送(Conventionenhanceddelivery；CED)以通過在顱內(nèi)投藥期間提供壓力梯度來進(jìn)一步增強(qiáng)治療劑分布[阿拉德(Allard)等人,生物材料,2009.30(12):2302-2318.]。然而，如果粒子由于粘附性相互作用和/或立體阻塞而保持截留在大腦實(shí)質(zhì)中，那么CED不太可能提供顯著益處。粒子允許在大腦實(shí)質(zhì)中不受阻礙的擴(kuò)散的物理化學(xué)特性對(duì)于在CED后實(shí)現(xiàn)粒子滲透增強(qiáng)來說仍是關(guān)鍵的[阿拉德等人,生物材料,2009.30(12):2302-18；肯尼等人,生物材料,2013.34(36):9190-9200]。即使在CED后，帶正電粒子與帶負(fù)電ECM之間的相互作用仍將陽離子納米粒子限制于注射點(diǎn)和血管周空間中，并且限制其向大腦實(shí)質(zhì)中的滲透[馬開等人,大腦研究,2005.1035(2):139-153；肯尼等人,生物材料,2013.34(36):9190-9200；萊特(Writer)等人,控釋雜志,2012.162(2)；第340-8頁.]。除克服血腦屏障和在大腦實(shí)質(zhì)中擴(kuò)散以外，關(guān)鍵挑戰(zhàn)是靶向疾病過程中所涉及的特定細(xì)胞，如大腦中免疫過程中所涉及的微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。這在若干神經(jīng)發(fā)炎性、神經(jīng)發(fā)育性和神經(jīng)退化性病癥中變得尤其關(guān)鍵，在該等病癥中擴(kuò)散神經(jīng)炎癥是關(guān)鍵因素并且可能涉及CNS中的若干區(qū)[卡納安(Kannan)S等人,科學(xué)·轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué),2012,18:4(130:130fs8)]?？傊?，因?yàn)锽BB、大腦微環(huán)境和神經(jīng)炎癥的擴(kuò)散性質(zhì)，向大腦的藥物和基因遞送較困難。因此，許多神經(jīng)病癥，尤其神經(jīng)發(fā)育性病癥因此具有有限的治療選項(xiàng)和有限的技術(shù)發(fā)展。瑞特氏癥候群(Rettsyndrome；RTT)是造成衰弱的神經(jīng)發(fā)育性病癥的一個(gè)實(shí)例。RTT通過在最初表現(xiàn)正常的兒童中減緩發(fā)育，接著導(dǎo)致功能突然退化來影響女孩。這些兒童具有手部有意運(yùn)動(dòng)喪失、手部絞擰增加、呼吸困難、大腦生長減少、無法行走/爬行、無法說話、智力殘疾和癲癇。患有RTT的患者展現(xiàn)見于自閉癥中的若干特征，并且可以被視為自閉癥的嚴(yán)重形式。大腦中的炎癥在患有RTT和自閉癥的兒童中的癥狀致病機(jī)制和惡化中起關(guān)鍵作用。不存在可治愈這些病癥的方法。在RTT中，不知道是血腦屏障還是大腦微環(huán)境是治療的主要屏障，或這兩者的組合(如大多數(shù)神經(jīng)疾病的情況)是主要屏障。目前療法包括抗癲癇藥劑和運(yùn)動(dòng)性殘疾的職業(yè)療法。減輕炎癥的靶向療法可以對(duì)瑞特氏病癥和自閉癥譜系障礙(autismspectrumdisorder)具有影響。如果全身性投與的抑制神經(jīng)炎癥中所涉及細(xì)胞的療法可以到達(dá)大腦處，那么其可以對(duì)改善有效性、減少副作用和成本具有顯著影響。因此，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供改善的遞送，如特異性靶向受傷細(xì)胞并且同時(shí)在大腦和CNS中靶向這些細(xì)胞的多個(gè)路徑。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供治療大腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)、神經(jīng)發(fā)育性和神經(jīng)退化性病癥，尤其自閉癥和RTT的手段。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：可以全身性投與包括遞送治療劑、預(yù)防劑和/或診斷劑的樹枝狀聚合物的醫(yī)藥組合物以到達(dá)大腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的目標(biāo)細(xì)胞處。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，樹枝狀聚合物組合物用于治療大腦和CNS的神經(jīng)、神經(jīng)發(fā)育性和神經(jīng)退化性病癥，包括自閉癥譜系障礙和RTT。如使用RTT小鼠模型所展現(xiàn)的；當(dāng)與未經(jīng)治療或游離藥物治療相比較時(shí)，抗炎劑與樹枝狀聚合物的結(jié)合引起運(yùn)動(dòng)性、步態(tài)、腳爪絞擰、腳爪緊握、震顫和呼吸模式的改善。當(dāng)與未經(jīng)治療的動(dòng)物相比較時(shí)，樹枝狀聚合物結(jié)合物在改善死亡率和運(yùn)動(dòng)/行為功能中比單獨(dú)的藥物顯著更好。具有本文所描述的表面特質(zhì)的樹枝狀聚合物克服目前與‘大腦組織屏障’相關(guān)的許多挑戰(zhàn)。在優(yōu)選實(shí)施例中，樹枝狀聚合物呈樹枝狀聚合物納米粒子形式，該等樹枝狀聚合物納米粒子包含共價(jià)連接于至少一種治療劑、預(yù)防劑或診斷劑的羥基封端聚(酰胺基胺)(PAMAM)樹枝狀聚合物。在用于治療RTT或自閉癥譜系障礙的特別優(yōu)選的實(shí)施例中，樹枝狀聚合物納米粒子包括以在個(gè)體中有效治療瑞特氏癥候群或自閉癥譜系障礙的一種或多種癥狀的量存在的共價(jià)連接于生物活性劑的一種或多種羥基封端的乙二胺核心PAMAM4-10級(jí)(≥G4-OH)樹枝狀聚合物。也可以使用相同組合物來治療興奮性毒性病癥。結(jié)果展現(xiàn)，與4級(jí)樹枝狀聚合物相比，使用6級(jí)樹枝狀聚合物觀察到進(jìn)入受損或患病大腦的吸收顯著增強(qiáng)。如實(shí)例中所描述，展示6級(jí)樹枝狀聚合物在大腦損傷的大型動(dòng)物模型中具有非?？扇〉哪X脊髓液(CSF)比血清水平，指示這些組合物對(duì)于將CNS藥物選擇性地遞送到受傷大腦中較優(yōu)越。臨床相關(guān)的大型動(dòng)物模型(在許多方面中類似于人類)中的陽性結(jié)果強(qiáng)調(diào)該等發(fā)現(xiàn)的重要性。這提供用于診斷以及治療的手段。樹枝狀聚合物的另一個(gè)益處是，可以使用相同樹枝狀聚合物來遞送兩種或更多種不同藥劑。這可以是兩種不同治療劑，或一種治療劑與一種或多種診斷劑或預(yù)防劑的組合。附圖說明圖1A是在MeCP2剔除小鼠中進(jìn)行NAC和D-NAC療法后的卡普蘭-邁耶存活率曲線(Kaplan-Meiersurvivalcurve)。在每周兩次NAC或D-NAC療法后對(duì)MeCP2剔除幼鼠評(píng)定存活率。與未治療的動(dòng)物(PBS)相比較，D-NAC不改善存活率。D-NAC改善NAC的安全性。與NAC治療的幼鼠相比較，D-NAC和PBS治療的MeCP2剔除幼鼠具有顯著更好的50％存活率(p＝0.014)，指示NAC在以游離調(diào)配物形式給予時(shí)的潛在毒性。圖1B是在MeCP2剔除小鼠中進(jìn)行D-NAC療法后的神經(jīng)行為結(jié)果線圖。在3周齡時(shí)(PND21)開始用生理鹽水(PBS)、10mgkgNAC或10mgkg(以NAC計(jì))D-NAC治療MeCP2剔除小鼠。每周兩次對(duì)幼鼠進(jìn)行治療。在PND10和PND1時(shí)進(jìn)行行為測試以確定基線，并且在PND21時(shí)開始在每一治療日治療之前進(jìn)行行為測試。使用同窩匹配的T幼鼠作為體重和行為對(duì)照兩者。與NAC和PBS治療相比較，D-NAC療法顯著地改善行為結(jié)果。與未治療的幼鼠相比較，D-NAC改善MeCP2剔除小鼠的整體外觀。未治療的幼鼠消瘦，具有多個(gè)緊握的腳爪、駝背體態(tài)和不良的眼睛條件。圖2A-2F是促炎性和抗炎性mRNA表達(dá)水平在T小鼠(空心條形)和MeCP2剔除小鼠(陰影條形)中的表達(dá)的圖。圖2A，TNF-α圖2B，IL-6圖2C，IL-Iβ圖2D，TGF-β圖2E，IL-10和圖2F，IL-4。圖3A-C是在T小鼠和有癥狀前與有癥狀的MeCP2剔除小鼠的大腦中的發(fā)炎性概況圖。在1、2、3、5和數(shù)周齡時(shí)，在T幼鼠(空心)和MeCP2剔除幼鼠(陰影)的大腦中測量促炎性和抗炎性細(xì)胞激素的mRNA水平。呈現(xiàn)中值2ΔΔCT值，并且誤差條由四分位范圍上限和下限表示。(圖3A)發(fā)炎性概況隨時(shí)間的變化呈現(xiàn)為復(fù)合促炎性評(píng)分(包括TNFα、I-6和I-1β)與復(fù)合抗炎性評(píng)分(包括TGF-β、I-10和I-4)的比率。復(fù)合評(píng)分通過在既定基因分型中取得每一壽命的所有幼鼠在該壽命時(shí)的所有促炎性2ΔΔCT值或所有抗炎性2ΔΔCT值的中值來產(chǎn)生。(圖3B)MeCP2剔除小鼠的促炎性概況傾向于促炎性標(biāo)記物在2周和數(shù)周時(shí)增加。然而，在2周、5周和數(shù)周齡時(shí)，與周齡和同窩匹配的T小鼠相比較，抗炎性mRNA表達(dá)(圖3C)在MeCP2剔除小鼠中展示顯著減少。這表明，MeCP2剔除小鼠中的神經(jīng)發(fā)炎性過程由抗炎性表達(dá)的顯著減少來驅(qū)動(dòng)，而非由促炎性表達(dá)增加的傾向來驅(qū)動(dòng)。圖4是大腦中D-Cy5的量(μg/g)隨大腦損傷嚴(yán)重性(基于復(fù)合行為評(píng)分)而變化的圖。對(duì)吸收與損傷嚴(yán)重性的相關(guān)性的此展現(xiàn)提供診斷損傷程度的手段。圖5是大腦脊髓液中D-Cy5的濃度/血清中D-Cy5的濃度隨時(shí)間(以小時(shí)為單位)變化的圖。圖6是海馬區(qū)、皮質(zhì)和小腦中樹枝狀聚合物積聚(μg/g)的圖。圖7是各種器官和大腦中樹枝狀聚合物積聚(μg/g)的圖。具體實(shí)施方式I.定義術(shù)語“治療劑”是指可以投與以預(yù)防或治療疾病或病癥的一種或多種癥狀的藥劑。實(shí)例包括(但不限于)核酸、核酸類似物、小分子、肽模擬物、蛋白質(zhì)、肽、碳水化合物或糖、脂質(zhì)、或界面活性劑，或其組合。術(shù)語“治療”是指預(yù)防或減輕疾病、病癥或病狀的一種或多種癥狀。治療疾病或病狀包括減輕特定疾病或病狀的至少一種癥狀，即使?jié)撛诓±砩韺W(xué)不受影響；如通過投與鎮(zhèn)痛劑來治療個(gè)體疼痛，盡管此類藥劑不治療該疼痛的原因。短語“藥學(xué)上可接受”是指組合物、聚合物以及其它材料和/或劑型在合理醫(yī)學(xué)判斷的范圍內(nèi)，適合用于與人類和動(dòng)物的組織接觸而不產(chǎn)生過量毒性、刺激、過敏反應(yīng)或其它問題或并發(fā)癥，與合理的益處/風(fēng)險(xiǎn)比相稱。短語“藥學(xué)上可接受的載劑”是指涉及將任何主題組合物從一個(gè)器官或身體部分運(yùn)載或轉(zhuǎn)運(yùn)到另一個(gè)器官或身體部分的藥學(xué)上可接受的材料、組合物或媒劑，如液體或固體填充劑、稀釋劑、溶劑或囊封材料。每一載劑在與主題組合物的其它成分相容并且對(duì)患者無害的意義上必須是“可接受的”。短語“治療有效量”是指以可適用于任何藥物治療的合理益處/風(fēng)險(xiǎn)比產(chǎn)生某種所需效果的治療劑的量。有效量可以取決于如以下的因素而變化：所治療的疾病或病狀、所投與的特定靶向構(gòu)筑體、個(gè)體的身材或疾病或病狀的嚴(yán)重性。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員可以在不必需進(jìn)行過度實(shí)驗(yàn)的情況下憑經(jīng)驗(yàn)確定特定化合物的有效量。II.調(diào)配物A.樹枝狀聚合物如本文所用的術(shù)語“樹枝狀聚合物”包括(但不限于)以下分子架構(gòu)，其具有內(nèi)部核心、規(guī)則地附接到此引發(fā)劑核心上的重復(fù)單元內(nèi)部層(或“級(jí)”)、以及附接到最外級(jí)上的端基外表面。樹枝狀聚合物的實(shí)例包括(但不限于)PAMAM、聚酯、聚賴氨酸和PPI。PAMAM樹枝狀聚合物可以具有羧酸、胺和羥基終端，并且可以是任何級(jí)的樹枝狀聚合物，包括(但不限于)1級(jí)PAMAM樹枝狀聚合物、2級(jí)PAMAM樹枝狀聚合物、3級(jí)PAMAM樹枝狀聚合物、4級(jí)PAMAM樹枝狀聚合物、5級(jí)PAMAM樹枝狀聚合物、6級(jí)PAMAM樹枝狀聚合物、7級(jí)PAMAM樹枝狀聚合物、8級(jí)PAMAM樹枝狀聚合物、9級(jí)PAMAM樹枝狀聚合物或10級(jí)PAMAM樹枝狀聚合物。適合一起使用的樹枝狀聚合物包括(但不限于)聚酰胺基胺(PAMAM)、聚丙胺(POPAM)、聚乙烯亞胺、聚賴氨酸、聚酯、蝶烯(iptycene)、脂肪族聚(醚)和/或芳香族聚醚樹枝狀聚合物。樹枝狀聚合物復(fù)合物的每一樹枝狀聚合物都可以具有與其它樹枝狀聚合物類似或不同的化學(xué)性質(zhì)(例如，第一樹枝狀聚合物可以包括PAMAM樹枝狀聚合物，而第二樹枝狀聚合物可以包含POPAM樹枝狀聚合物)。在一些實(shí)施例中，第一或第二樹枝狀聚合物可以進(jìn)一步包括其它藥劑。多臂PEG聚合物包括具有至少兩個(gè)帶有硫氫基或硫吡啶端基的分支的聚乙二醇；然而，本文所公開的實(shí)施例不限于此類別，并且可以使用帶有其它端基(如琥珀酰亞胺基或馬來酰亞胺終端)的PEG聚合物?？梢允褂梅肿恿?0kDa到80kDa的PEG聚合物。樹枝狀聚合物復(fù)合物包括多個(gè)樹枝狀聚合物。舉例來說，樹枝狀聚合物復(fù)合物可以包括第三樹枝狀聚合物；其中該第三樹枝狀聚合物與至少一種其它樹枝狀聚合物復(fù)合。此外，第三藥劑可以與第三樹枝狀聚合物復(fù)合。在另一個(gè)實(shí)施例中，第一和第二樹枝狀聚合物各自與第三樹枝狀聚合物復(fù)合，其中該第一和第二樹枝狀聚合物是PAMAM樹枝狀聚合物，并且該第三樹枝狀聚合物是POPAM樹枝狀聚合物?？梢栽诓幻撾x本發(fā)明精神的情況下并入其它樹枝狀聚合物。當(dāng)利用多個(gè)樹枝狀聚合物時(shí)，也可以并入多個(gè)藥劑。這不受彼此復(fù)合的樹枝狀聚合物的數(shù)目限制。如本文所用，術(shù)語“PAMAM樹枝狀聚合物”意味著使用酰胺基胺建構(gòu)嵌段的聚(酰胺基胺)樹枝狀聚合物，其可以含有不同核心。用于制造其的方法是所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，并且一般來說，涉及圍繞中央引發(fā)劑核心產(chǎn)生樹枝狀β-丙胺酸單元的同心殼層(級(jí))的兩步反復(fù)(iterative)反應(yīng)程序。此PAMAM核-殼架構(gòu)隨殼層(級(jí))增加而在直徑中線性生長。同時(shí)，表面基團(tuán)在每一級(jí)根據(jù)樹枝狀分支數(shù)學(xué)以指數(shù)方式擴(kuò)增。其可以具有5種不同核心類型和10種表面官能團(tuán)的G0-10級(jí)形式獲得。樹枝狀聚合物分支聚合物可以由聚酰胺基胺(PAMAM)、聚甘油、聚酯、聚醚、聚賴氨酸或聚乙二醇(PEG)、多肽樹枝狀聚合物組成。根據(jù)一些實(shí)施例，所用PAMAM樹枝狀聚合物可以是羥基附接到其表面官能團(tuán)上的4級(jí)或更高級(jí)樹枝狀聚合物。多臂PEG聚合物包含具有2個(gè)和更多個(gè)帶有硫氫基或硫吡啶端基的分支的聚乙二醇；然而，實(shí)施例不限于此類別，并且可以使用帶有其它端基(如琥珀酰亞胺基或馬來酰亞胺終端)的PEG聚合物?？梢允褂梅肿恿?0kDa到80kDa的PEG聚合物。在一些實(shí)施例中，樹枝狀聚合物呈納米粒子形式，并且詳細(xì)地描述于國際專利公開第W02009/046446號(hào)中。制備PAMAM-NAC下文是用于使N-乙?；腚装彼峤Y(jié)合到胺封端的第四級(jí)PAMAM樹枝狀聚合物(PAMAM-NH2)上的合成方案，其使用3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰亞胺酯(SPDP)作為連接子來進(jìn)行。3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰亞胺酯(SPDP)的合成通過兩步程序來進(jìn)行，方案1。首先，使3-巰基丙酸與2,2'-聯(lián)吡啶二硫化物通過硫醇-二硫化物交換反應(yīng)以得到2-羧基乙基2-吡啶基二硫化物。為了促進(jìn)胺封端的樹枝狀聚合物與SPDP的連接，使琥珀酰亞胺基團(tuán)與2-羧基乙基2-吡啶基二硫化物反應(yīng)以獲得3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰亞胺酯，該反應(yīng)通過使用N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺和4-二甲基氨基吡啶來與N-羥基琥珀酰亞胺進(jìn)行酯化來進(jìn)行。方案1為了引入硫氫基反應(yīng)性基團(tuán)，使PAMAM-NH2樹枝狀聚合物與異雙官能性交聯(lián)劑SPDP反應(yīng)，方案2。SPDP的N-琥珀酰亞胺基活化酯與終端伯胺偶合以產(chǎn)生酰胺連接的2-吡啶基二硫基丙酰基(PDP)，方案2。在與SPDP反應(yīng)之后，可以使用RP-HPLC來分析PAMAM-NH-PDP以確定SPDP與樹枝狀聚合物已經(jīng)反應(yīng)的程度。方案2在另一個(gè)實(shí)施例中，可以使用在下文方案4中所描述的合成途徑，以便合成D-NAC直到經(jīng)過吡啶基二硫基(PDP)官能化的樹枝狀聚合物3。接著在室溫下使化合物3與NAC在DMSO中反應(yīng)過夜以獲得D-NAC5。制備樹枝狀聚合物-PEG-丙戊酸結(jié)合物(D-VPA)最初，用硫醇反應(yīng)性基團(tuán)對(duì)丙戊酸進(jìn)行官能化。如方案3中所示，使用DCC作為偶合試劑使具有三個(gè)(CH2)2O-重復(fù)單元的短鏈PEG-SH與丙戊酸。反應(yīng)所獲得的粗PEG-VPA通過柱色譜來純化，并且通過質(zhì)子NMR來表征。在NMR光譜中，存在鄰近PEGOH基團(tuán)的CH2質(zhì)子峰從3.65ppm下移到4.25ppm，確認(rèn)PEG-VPA的形成。盡管硫醇基也可能易于與酸官能團(tuán)反應(yīng)，但NMR光譜并不指示屬于與PEG硫醇基相鄰的CH2質(zhì)子峰的任何下移。這表明硫醇基任意與具有硫醇反應(yīng)性的經(jīng)過官能化的樹枝狀聚合物反應(yīng)。方案3為了使PEG-VPA與PAMAM-OH結(jié)合，在樹枝狀聚合物與丙戊酸之間引入二硫鍵，方案4。首先，通過使樹枝狀聚合物與受芴基甲氧羰基(Fmoc)保護(hù)的γ-氨基丁酸(GABA)反應(yīng)來將樹枝狀聚合物轉(zhuǎn)化成雙功能樹枝狀聚合物1。PEG-VPA與雙功能樹枝狀聚合物的結(jié)合涉及兩步法；第一步驟是使經(jīng)過胺官能化的雙功能樹枝狀聚合物1與3-(2-吡啶基二硫基)-丙酸N-琥珀酰亞胺酯(SPDP)反應(yīng)，并且第二步驟涉及使經(jīng)過硫醇官能化的丙戊酸結(jié)合。使SPDP在N,N'-二異丙基乙胺(DIEA)存在下與中間物2反應(yīng)以獲得經(jīng)過吡啶基二硫基(PDP)官能化的樹枝狀聚合物3。方案4盡管這是原位反應(yīng)過程，但通過1HNMR來確立結(jié)構(gòu)。在光譜中，介于6.7與7.6ppm之間的吡啶基芳香族質(zhì)子的新峰確認(rèn)形成產(chǎn)物。證實(shí)吡啶基的數(shù)目與GABA連接子的數(shù)目相同，其指示大多數(shù)胺基與SPDP反應(yīng)。因?yàn)檫@是使藥物與樹枝狀聚合物結(jié)合的關(guān)鍵步驟，所以每胺基使用的SPDP摩爾當(dāng)量和反應(yīng)所需的時(shí)間得到驗(yàn)證。最后，使PEG-VPA與經(jīng)過PDP官能化原位反應(yīng)以得到樹枝狀聚合物-PEG-丙戊酸(D-VPA)。通過1HNMR來確認(rèn)最終結(jié)合物的形成和VPA的負(fù)載量，并且通過逆相HPLC來評(píng)估結(jié)合物的純度。在NMR光譜中，介于0.85與1.67ppm之間的VPA脂肪族質(zhì)子的多重峰、介于3.53與3.66ppm之間的PEGCH2質(zhì)子的多重峰和吡啶基芳香族質(zhì)子的不存在確認(rèn)結(jié)合物形成。使用質(zhì)子積分法來估計(jì)，VPA的負(fù)載量是約21個(gè)分子，其表明1～2個(gè)胺基保留未反應(yīng)。在HPLC圖中，D-VPA的洗脫時(shí)間(17.2分鐘)與G4-OH的洗脫時(shí)間(9.5分鐘)不同，確認(rèn)結(jié)合物是純的，不具有可測量的痕量VPA(23.4分鐘)和PEG-VPA(39.2分鐘)。VPA負(fù)載量與樹枝狀聚合物的百分比是～12％w/w，并且驗(yàn)證用于分三個(gè)不同批次制造公克級(jí)量的方法。B.偶聯(lián)劑和間隔子樹枝狀聚合物復(fù)合物可以由結(jié)合或附接到樹枝狀聚合物或多臂PEG上的治療活性劑或化合物(在下文中稱為“藥劑”)形成。附接可以經(jīng)由在藥劑與樹枝狀聚合物之間提供二硫橋鍵的適當(dāng)間隔子進(jìn)行。在身體中所見的還原條件下，樹枝狀聚合物復(fù)合物能夠通過硫醇交換反應(yīng)來活體內(nèi)快速釋放藥劑。如本文所用的術(shù)語“間隔子”打算包括用于將治療活性劑連接于樹枝狀聚合物的組合物。間隔子可以是單一化學(xué)實(shí)體或連接在一起以將聚合物與治療劑或成像劑橋連的兩種或更多種化學(xué)實(shí)體。間隔子可以包括具有硫氫基、硫吡啶、琥珀酰亞胺基、馬來酰亞胺、乙烯基砜和碳酸酯終端的任何較小化學(xué)實(shí)體、肽或聚合物。間隔子可以選自用硫氫基、硫吡啶、琥珀酰亞胺基、馬來酰亞胺、乙烯基砜和碳酸酯基團(tuán)封端的一類化合物。間隔子可以包含硫吡啶封端的化合物，如二硫聯(lián)吡啶、3-(2-吡啶基二硫基)-丙酸N-琥珀酰亞胺酯(SPDP)、6-(3-[2-吡啶基二硫基]-丙酰胺基)己酸琥珀酰亞胺酯LC-SPDP或磺基-LC-SPDP。間隔子也可以包括肽，其中該等肽是主要具有硫氫基的直鏈或環(huán)狀肽，如谷胱甘肽、高半胱氨酸、半胱氨酸和其衍生物，arg-gly-asp-cys(RGDC)、環(huán)(Arg-Gly-Asp-d-Phe-Cys)(c(RGDfC))、環(huán)(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Cys)、環(huán)(Arg-Ala-Asp-d-Tyr-Cys)。間隔子可以是巰基酸衍生物，如3巰基丙酸、巰基乙酸、4巰基丁酸、硫雜環(huán)戊-2-酮、6巰基己酸、5巰基戊酸以及其它巰基衍生物，如2巰基乙醇和2巰基乙胺。間隔子可以是硫代水楊酸和其衍生物，(4-琥珀酰亞胺基氧羰基-甲基-α-2-吡啶基硫基)甲苯，(3-[2-吡啶二硫基]丙酰基酰肼。間隔子可以具有馬來酰亞胺終端，其中該間隔子包含聚合物或較小化學(xué)實(shí)體，如雙-馬來酰亞胺基二乙二醇和雙-馬來酰亞胺基三乙二醇、雙-馬來酰亞胺基乙烷、雙馬來酰亞胺基己烷。間隔子可以包含乙烯基砜，如1,6-己烷-雙-乙烯基砜。間隔子可以包含硫代糖苷，如硫代葡萄糖。間隔子可以是經(jīng)過還原的蛋白質(zhì)，如牛血清白蛋白和人類血清白蛋白、能夠形成二硫鍵的任何硫醇封端的化合物。間隔子可以包括具有馬來酰亞胺、琥珀酰亞胺基和硫醇終端的聚乙二醇。C.治療劑、預(yù)防劑和診斷劑如本文所用的術(shù)語“樹枝狀聚合物復(fù)合物”是指樹枝狀聚合物與治療、預(yù)防和/或診斷活性劑的組合。樹枝狀聚合物還可以包括靶向劑，但如由實(shí)例所展現(xiàn)，這些靶向劑對(duì)于向受傷大腦遞送是并必要的。這些樹枝狀聚合物復(fù)合物包括附接或結(jié)合于PAMAM樹枝狀聚合物或多臂PEG的藥劑，其能夠在活體內(nèi)所見的還原條件下優(yōu)先在細(xì)胞內(nèi)釋放藥物。樹枝狀聚合物復(fù)合物在通過靜脈內(nèi)注射投與時(shí)可以僅在患病條件下并且不在正常條件下優(yōu)先通過血腦屏障(BBB)。樹枝狀聚合物復(fù)合物還適用于治療劑在神經(jīng)炎癥、大腦性麻痹、ALS和由對(duì)組織的炎癥和損傷表征的其它CNS疾病中的靶向遞送。藥劑可以共價(jià)附接或分子內(nèi)分散或囊封。樹枝狀聚合物優(yōu)選地是具有羧酸、羥基或胺終端的至多10級(jí)的PAMAM樹枝狀聚合物。PEG聚合物是具有2個(gè)或更多個(gè)臂并且分子量為10kDa到80kDa的星形聚合物。PEG聚合物具有硫氫基、硫吡啶、琥珀酰亞胺基或馬來酰亞胺終端。樹枝狀聚合物經(jīng)由末端為二硫鍵、酯鍵或酰胺鍵的間隔子而連接于藥劑。代表性治療劑(包括前藥)、預(yù)防劑或診斷劑可以是肽、蛋白質(zhì)、碳水化合物、核苷酸或寡核苷酸、小分子或其組合。示例性治療劑包括抗炎性藥物、抗增生劑、化學(xué)治療劑、血管擴(kuò)張劑和抗感染劑。抗生素包括β-內(nèi)酰胺，如青霉素(penicillin)和安比西林(ampicillin)；頭胞菌素，如頭孢呋辛(cefuroxime)、頭孢克洛(cefaclor)、頭孢力新(cephalexin)、頭孢羥氨芐(cephydroxil)、頭孢泊肟(cepfodoxime)和普塞酯(proxetil)；四環(huán)素抗生素，如多西環(huán)素(doxycycline)和二甲胺四環(huán)素(minocycline)；大環(huán)內(nèi)酯(microlide)抗生素，如阿奇霉素(azithromycin)、紅霉素(erythromycin)、雷帕霉素(rapamycin)和克拉霉素(clarithromycin)；氟喹諾酮(fluoroquinolone)，如環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)、恩氟沙星(enrofloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)和諾氟沙星(norfloxacin)；托普霉素(tobramycin)；黏菌素(colistin)或氨曲南(aztreonam)，以及已知具有抗炎活性的抗生素，如紅霉素、阿奇霉素或克拉霉素。優(yōu)選的抗炎劑是包括N-乙?；腚装彼岬目寡趸运幬?。優(yōu)選的NSAIDS包括甲芬那酸(mefenamicacid)、阿司匹林(aspirin)、二氟尼柳雙水楊酸酯(DiflunisalSalsalate)、布洛芬(Ibuprofen)、萘普生(Naproxen)、非諾洛芬(Fenoprofen)、酮洛芬(Ketoprofen)、脫乙?；宸?Deacketoprofen)、氟比洛芬(Flurbiprofen)、噁丙嗪(Oxaprozin)、洛索洛芬(Loxoprofen)、吲哚美辛(Indomethacin)、舒林酸(Sulindac)、依托度酸(Etodolac)、酮洛酸雙氯芬酸(KetorolacDiclofenac)、萘丁美酮(Nabumetone)、吡羅昔康(Piroxicam)、美洛昔康(Meloxicam)、替諾昔康(Tenoxicam)、屈噁昔康(Droxicam)、氯諾昔康(Lornoxicam)、伊索昔康(Isoxicam)、甲氯芬那酸(Meclofenamicacid)、氟芬那酸(Flufenamicacid)、托芬那酸(Tolfenamicacid)、伊萊考昔(elecoxib)、羅非考昔(Rofecoxib)、伐地考昔(Valdecoxib)、帕瑞考昔(Parecoxib)、魯米考昔(Lumiracoxib)、依托考昔(Etoricoxib)、非羅考昔(Firocoxib)、磺苯胺(Sulphonanilides)、尼美舒利(Nimesulids)、氟尼酸(Niflumicacid)和利克飛龍(Licofelone)。代表性小分子包括類固醇，如甲基潑尼松(methylprednisone)、地塞米松(dexamethasone)；非類固醇抗炎劑，包括COX-2抑制劑；皮質(zhì)類固醇抗炎劑；金化合物抗炎劑；免疫抑制、抗炎和抗血管生成劑；抗興奮性毒性劑，如丙戊酸、D-氨基膦?；焖狨?、D-氨基膦?；狨?；谷氨酸酯形成/釋放的抑制劑，巴氯芬；NMDA受體拮抗劑；水楊酸酯抗炎劑；蘭比珠單抗(ranibizumab)；抗VEGF劑，包括阿柏西普(aflibercept)和雷帕霉素。其它抗炎性藥物包括非類固醇藥物，如吲哚美辛(indomethacin)、阿司匹林、乙酰胺苯酚、雙氯芬酸鈉(diclofenacsodium)和布洛芬。皮質(zhì)類固醇可以是氟新諾龍丙酮(fluocinoloneacetonide)和甲基潑尼龍(methylprednisolone)。肽藥物可以是鏈激酶。在一些實(shí)施例中，分子可以包括抗體，包括例如達(dá)利珠單抗(daclizumab)、貝伐單抗(bevacizumab)蘭比珠單抗(ranibizumab)巴利昔單抗(basiliximab)、蘭比珠單抗和哌加他尼鈉(pegaptanibsodium)；或肽，如SN50；和NF拮抗劑。代表性寡核苷酸包括siRNA、微RNA、DNA和RNA。治療劑可以是具有羥基封端胺的PAMAM樹枝狀聚合物。示例性診斷劑包括順磁分子、熒光化合物、磁性分子和放射性核素、x射線顯影劑和造影劑。這些也可以是由前述診斷劑標(biāo)記的配體或抗體，或結(jié)合于可通過所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法檢測的經(jīng)過標(biāo)記的配體或抗體。示例性診斷劑包括染料、熒光染料、近紅外染料、SPECT顯影劑、PET顯影劑和放射性同位素。代表性染料包括羰花青、吲哚羰花青、氧雜羰花青、硫雜羰花青和部花青、聚甲炔、香豆素、若丹明、二苯并哌喃、熒光素、硼-聯(lián)吡咯甲烷(BODIPY)、Cy5、Cy5.5、Cy7、VivoTag-680、VivoTag-S680、VivoTag-S750、AlexaFluor660、AlexaFluor680、AlexaFluor700、AlexaFluor750、AlexaFluor790、Dy677、Dy676、Dy682、Dy752、Dy780、DyLight547、DyLight647、HiLyteFluor647、HiLyteFluor680、HiLyteFluor750、IRDye800CW、IRDye800RS、IRDye700DX、ADS780WS、ADS830WS和ADS832WS。代表性SPEGT或PET顯影劑包括螯合劑，如二-亞乙基三-胺五-乙酸(DTPA)、1,4,7,10-四-氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、二-胺二硫醇、活化的巰基乙酰基-甘氨?；?甘氨?；?甘氨酸(MAG3)和酰肼煙酰胺(HYNIC)。代表性同位素包括Tc-94m、Tc-99m、In-111、Ga-67、Ga-68、Gd3+、Y-86、Y-90、Lu-177、Re-186、Re-188、Cu-64、Cu-67、Co-55、Co-57、F-18、Sc-47、Ac-225、Bi-213、Bi-212、Pb-212、Sm-153、Ho-166和Dy-i66。靶向部分包括葉酸、直鏈或環(huán)狀的RGD肽、TAT肽、LHRH和BH3。在用于治療RTT和自閉癥譜系障礙的一個(gè)實(shí)施例中，樹枝狀聚合物納米粒子由共價(jià)連接于至少一種生物活性劑的羥基封端的PAMAM樹枝狀聚合物形成，該生物活性劑的量在個(gè)體中有效治療瑞特氏癥候群和自閉癥譜系障礙。連接于生物活性化合物或治療活性劑的樹枝狀聚合物復(fù)合物可以用于進(jìn)行若干功能，包括靶向、在患病位點(diǎn)處定位、釋放藥物和成像目的?？梢栽诖嬖诨虿淮嬖诎邢虿糠值那闆r下標(biāo)記樹枝狀聚合物復(fù)合物，以使得在樹枝狀聚合物與藥劑或成像劑之間的二硫鍵經(jīng)由間隔子或連接分子形成。D.裝置和調(diào)配物樹枝狀聚合物可以通過硬膜下、靜脈內(nèi)、羊膜內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下途徑非經(jīng)腸地投與。本文所用的載劑或稀釋劑可以是固體載劑或用于固體調(diào)配物的稀釋劑、液體載劑或用于液體調(diào)配物的稀釋劑、或其混合物。對(duì)于液體調(diào)配物，藥學(xué)上可接受的載劑可以是例如水性或非水性溶液、懸浮液、乳液或油。非經(jīng)腸媒劑(用于皮下、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)或肌肉內(nèi)注射)包括例如氯化鈉溶液、林格氏右旋糖(Ringer'sdextrose)、右旋糖和氯化鈉、乳酸林格氏溶液和不揮發(fā)性油。非水性溶劑的實(shí)例是丙二醇、聚乙二醇和可注射有機(jī)酯(如油酸乙酯)。水性載劑包括例如水、醇/水溶液、環(huán)糊精、乳液或懸浮液，包括生理鹽水和緩沖介質(zhì)。樹枝狀聚合物也可以在乳液，例如油包水中投與。油的實(shí)例是石油、動(dòng)物、植物或合成來源的那些油，例如花生油、大豆油、礦物油、橄欖油、葵花油、魚肝油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄欖、石蠟脂和礦物油。適合用于非經(jīng)腸調(diào)配物中的脂肪酸包括例如油酸、硬脂酸和異硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蔻酸異丙酯是合適的脂肪酸酯的實(shí)例。適合于非經(jīng)腸投藥的調(diào)配物可以包括抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑、和使得調(diào)配物與預(yù)期接受者的血液等張的溶質(zhì)、以及可以包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑的水性和非水性無菌懸浮液。靜脈內(nèi)媒劑可以包括流體和營養(yǎng)補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑，如基于林格氏右旋糖的那些媒劑。一般來說，水、生理鹽水、右旋糖和相關(guān)糖水溶液以及如丙二醇或聚乙二醇的二醇是優(yōu)選的液體載劑，尤其對(duì)于可注射溶液來說。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員熟知用于可注射組合物的可注射醫(yī)藥載劑(參見例如制藥學(xué)和藥學(xué)實(shí)踐(PharmaceuticsandPharmacyPractice),J.B.利平科特公司(LippincottCompany),費(fèi)城(Philadelphia),賓夕法尼亞州(PA),班克(Banker)和查默斯(Chalmers)編,第238-250頁(1982)；和可注射藥物的ASHP手冊(cè)(ASHPHandbookonInjectableDrugs),托塞爾(Toissel),第15版,第622-630頁(2009))。用于對(duì)流增強(qiáng)型遞送(“CED”)的調(diào)配物包括低分子量鹽和如甘露糖醇的糖的溶液。III.治療方法A.向大腦和CNS中的遞送連接于治療劑、預(yù)防劑或診斷劑的樹枝狀聚合物復(fù)合物組合物(包括優(yōu)選為至少四級(jí)樹枝狀聚合物并且更優(yōu)選為至少六級(jí)樹枝狀聚合物的樹枝狀聚合物)可以選擇性地靶向微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，其在若干神經(jīng)變性病(包括大腦性麻痹)的致病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。通過靶向這些細(xì)胞，樹枝狀聚合物特異性地遞送藥劑以治療神經(jīng)炎癥。已經(jīng)充分探究和研究N-乙?；腚装彼?N-acetylcysteine；“NAC”)。還探究與母體胎兒感染相關(guān)的神經(jīng)炎癥。然而，NAC由于高血漿蛋白結(jié)合而幾乎沒有生物可用性。樹枝狀聚合物復(fù)合物組合物克服血漿蛋白結(jié)合而不影響NAC的活性。通過單一靜脈內(nèi)投藥，G4PAMAM-NAC的活體內(nèi)有效性可以是游離藥物NAC的十到一百倍。游離藥物NAC展現(xiàn)極高血漿蛋白結(jié)合，導(dǎo)致生物可用性降低。此樹枝狀聚合物復(fù)合物的主要優(yōu)點(diǎn)之一是，其通過限制不合需要的藥物血漿蛋白質(zhì)相互作用來增強(qiáng)生物可用性，并且選擇性地引起藥物在細(xì)胞內(nèi)的快速釋放以展現(xiàn)所需治療作用。藥物NAC在G4PAMAM-NAC中的高有效負(fù)載需要極小量(～50mg/kg)的載劑，PAMAM樹枝狀聚合物和較小量的藥物(～10mg/kg)，因而減少投與量。相比之下，在動(dòng)物模型中通常以100-300mg/kg日劑量使用游離NAC。藥劑量的減少限制與該藥劑相關(guān)聯(lián)的副作用。因?yàn)樗巹┑纳锟捎眯员３州^高，所以盡管投與較小量的藥劑，但該藥劑的正面效果未降低。包括樹枝狀聚合物-藥物結(jié)合物的樹枝狀聚合物復(fù)合物限制其向組織和器官中的生物分布，并且優(yōu)先在目標(biāo)位點(diǎn)處遞送藥物，因而減少非所要副作用。樹枝狀聚合物復(fù)合物有效跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)，并且因此適用于在神經(jīng)、神經(jīng)發(fā)育性和神經(jīng)退化性病癥以及大腦損傷中進(jìn)行靶向藥物遞送。G4-PAMAM-S-S-NAC結(jié)合物在神經(jīng)發(fā)炎性病癥中特異性地靶向活化的微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。在用脂多糖(LPS)進(jìn)行動(dòng)物治療兩天以在發(fā)育中的兔大腦中誘導(dǎo)白質(zhì)損傷和髓鞘形成不良(大腦性麻痹的動(dòng)物模型)之后，評(píng)估G4-PAMAM-S-S-NAC樹枝狀聚合物結(jié)合物的治療效果。選擇性地由G4-PAMAM-S-S-NAC樹枝狀聚合物復(fù)合物遞送的NAC強(qiáng)有力地遏制促炎性(TNF-α、IL-6mRNA)；發(fā)炎性信號(hào)傳導(dǎo)因子，包括NF.κ.B和硝基酪氨酸，并且增強(qiáng)GSH水平。與游離NAC相比較，發(fā)現(xiàn)G4-PAMAM-S-S-NAC的有效性是十到一百倍。這支持以下結(jié)論：G4-PAMAM-S-S-NAC橫穿跨越BBB。NAC從樹枝狀聚合物復(fù)合物向活化微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的靶向遞送在大腦性麻痹的新生兔模型中改善運(yùn)動(dòng)缺陷和從LPS誘導(dǎo)的大腦損傷的恢復(fù)減弱。在投與G4-PAMAM-S-S-NAC樹枝狀聚合物復(fù)合物后，觀察到促炎性細(xì)胞激素(TNF-α、IL-6mRNA)的顯著減少。當(dāng)與用生理鹽水治療的套組相比較時(shí)，用NAC和G4-PAMAM-S-S-NAC治療的套組展示胎兒炎癥反應(yīng)減少以及運(yùn)動(dòng)缺陷改善。當(dāng)與由于持續(xù)由G4-PAMAM-S-S-NAC結(jié)合物遞送NAC而單獨(dú)接受NAC的套組相比較時(shí)，用G4-PAMAM-S-S-NAC結(jié)合物治療的套組的行為變化較小并且大腦中的微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化較低。結(jié)果指示G4-PAMAM-S-S-NAC結(jié)合物的效果比單獨(dú)NAC更大，這是因?yàn)槠鋬?yōu)先由活化巨噬細(xì)胞和微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞吸收，降低發(fā)炎性和氧化性和亞硝基化效果。用G4-PAMAM-S-S-NAC樹枝狀聚合物復(fù)合物治療減少白質(zhì)損傷和微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化。當(dāng)以G4-PAMAM-S-S-NAC形式投與以引起與對(duì)游離NAC所觀察到的類似的反應(yīng)時(shí)，觀察到NAC劑量顯著減少。濃度100mg/kg的游離NAC和濃度10mg/kg的G4-PAMAM-S-S-NAC10mg都引起相同反應(yīng)，展現(xiàn)在結(jié)合于樹枝狀聚合物后，實(shí)現(xiàn)劑量減少。較低濃度的G4-PAMAM-S-S-NAC展示比游離NAC顯著的針對(duì)LPS誘導(dǎo)的大腦損傷、TNF-α抑制和IL-6活性下調(diào)的保護(hù)效果。樹枝狀聚合物-NAC結(jié)合物的此活性可以歸因于其干擾早期炎性反應(yīng)的能力，該干擾通過阻斷或修改信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子NF.κ.B和硝基酪氨酸，因而調(diào)節(jié)細(xì)胞活化來進(jìn)行。TNF-α和IL-6在海馬區(qū)中的下調(diào)很可能歸因于在大腦中具有微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性細(xì)胞吸收的樹枝狀聚合物復(fù)合物的優(yōu)先生物分布。樹枝狀聚合物-NAC復(fù)合物可以用于治療發(fā)展出與母體感染相關(guān)聯(lián)的臨床癥狀并且在嬰兒中發(fā)展出PVL和CP的風(fēng)險(xiǎn)增加的孕婦。結(jié)果展示，用樹枝狀聚合物-NAC抑制微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞在新生兔大腦中減少白質(zhì)損傷。此外，樹枝狀聚合物展現(xiàn)結(jié)合藥物的持續(xù)釋放，并且在長時(shí)段內(nèi)增強(qiáng)藥物的有效性。在較低劑量下，樹枝狀聚合物-NAC結(jié)合物比單獨(dú)NAC更有效。樹枝狀聚合物-NAC結(jié)合物似乎提供更多優(yōu)點(diǎn)，包括顯著劑量減少、增強(qiáng)的生物可用性和給藥減少。6和8臂PEG-NAC結(jié)合物在2小時(shí)內(nèi)以細(xì)胞內(nèi)GSH濃度(2和10mM)釋放74％的NAC。在介于0.008-0.8mM之間的濃度范圍內(nèi)，結(jié)合物對(duì)微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞無毒性。在等摩爾濃度的NAC(0.5mM)下，6臂PEG-S-S-NAC和8臂PEG-S-S-NAC在抑制GSH消耗中比游離NAC更高效。當(dāng)與等摩爾濃度的游離NAC相比較時(shí)，各自為0.5mM和5Mm濃度的6臂和8臂PEG-S-S-NAC結(jié)合物都展示在ROS生產(chǎn)中的顯著抑制。研究展現(xiàn)，與游離NAC相比，結(jié)合物在抑制NO產(chǎn)生中較優(yōu)越。在最高濃度(5mM)下，游離藥物使H2O2水平和亞硝酸酯水平降低30％-40％，而結(jié)合物使H2O2和亞硝酸酯水平降低超過70％。這展示結(jié)合物能夠?qū)⑺幬镞\(yùn)到細(xì)胞內(nèi)側(cè)，并且釋放游離形式的藥物，并且比游離藥物顯著地更有效。在5mM濃度下，當(dāng)與等濃度的NAC(Pb0.05)相比較時(shí)，6臂PEG-S-S-NAC結(jié)合物(1)展示TNF-α產(chǎn)生的顯著抑制(70％)。在5mM下，當(dāng)與等濃度的NAC(Pb0.05和Pb0.01)相比較時(shí)，8臂PEG-S-S-NAC結(jié)合物(3)展示TNF-α產(chǎn)生的顯著抑制(70％)。PEG化NAC是具有醫(yī)藥工業(yè)效用的樹枝狀聚合物復(fù)合物，因?yàn)榕鷾?zhǔn)PEG用于人類使用并且此裝置解決NAC的限制并提供更大功效。如在實(shí)例中所展現(xiàn)，六級(jí)樹枝狀聚合物提供甚至更大的遞送，尤其向受損大腦組織中的遞送。相應(yīng)地調(diào)節(jié)用四級(jí)樹枝狀聚合物所測定的劑量以補(bǔ)償增加的遞送。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠在不進(jìn)行不當(dāng)實(shí)驗(yàn)的情況下確定相對(duì)劑量。通常，主治醫(yī)生將在考慮到多種因素，如年齡、體重、一般健康狀況、飲食、性別、待投與的化合物、投藥途徑和所治療病狀的嚴(yán)重性的情況下決定用于治療每一個(gè)別個(gè)體的組合物劑量。組合物的劑量可以是每千克待治療個(gè)體的體重約0.0001到約1.000mg、每千克體重約0.01到約100mg、約0.1mg/kg到約10mg/kg和每千克體重約0.5mg到約5mg。一般來說，將調(diào)節(jié)投藥的時(shí)間安排和頻率以使既定治療或診斷時(shí)程的功效與既定遞送系統(tǒng)的副作用平衡。示例性給藥頻率包括連續(xù)輸注；單次和多次投藥，如每小時(shí)、每日、每周、每月或每年給藥。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，在本發(fā)明方法中所用的給藥方案可以是足以在個(gè)體中治療瑞特氏癥候群和/或相關(guān)自閉癥譜系障礙的任何時(shí)間長度。如本文所用的術(shù)語“慢性”意味著給藥方案的時(shí)間長度可以是數(shù)小時(shí)、數(shù)天、數(shù)周、數(shù)月或可能數(shù)年。樹枝狀聚合物復(fù)合物可以與一種或多種其它治療活性劑組合投與，已知該等治療活性劑能夠治療上文所論述的病狀或疾病。B.待治療的病癥或疾病大腦中的炎癥在患有RTT和自閉癥譜系障礙的兒童中的癥狀致病機(jī)制和惡化中起關(guān)鍵作用。如本文所用，術(shù)語“大腦發(fā)炎性疾病”意味著與大腦微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞活化相關(guān)聯(lián)的大腦疾病，包括例如在美國精神病學(xué)會(huì)診斷和統(tǒng)計(jì)學(xué)手冊(cè)V中分類的RTT和自閉癥譜系障礙。瑞特氏癥候群瑞特氏癥候群(RTT)是造成衰弱的神經(jīng)發(fā)育性病癥的一個(gè)實(shí)例，其具有許多與自閉癥譜系障礙共有的方面。RTT通過在最初表現(xiàn)正常的兒童中減緩發(fā)育，接著導(dǎo)致功能突然退化來影響女孩。大腦中的炎癥在患有RTT和自閉癥的兒童中的癥狀致病機(jī)制和惡化中起關(guān)鍵作用。不存在可治愈這些病癥的方法?；加腥鹛厥习Y候群的兒童在早期常常展現(xiàn)自閉癥樣行為。在約6到18月齡出現(xiàn)的瑞特氏癥候群最早癥狀看起來極像自閉癥；兒童遠(yuǎn)離社會(huì)活動(dòng)，失去交流能力并且發(fā)展出重復(fù)運(yùn)動(dòng)，如手部絞擰。谷氨酸酯增加見于患有瑞特氏癥候群的患者的CSF中，并且微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化增加見于患有自閉癥的患者的尸檢樣本中。瑞特氏病的動(dòng)物模型具有與瑞特氏病相關(guān)聯(lián)的最常見遺傳異常，其為MeCP2缺失。小鼠展現(xiàn)如在患有瑞特氏病和自閉癥的患者中所見的特征性腳爪絞擰和扣緊運(yùn)動(dòng)。在此模型中，動(dòng)物從3周時(shí)癥狀發(fā)作快速進(jìn)展到約7周齡死亡。與未治療的動(dòng)物相比較，從1周齡或3周齡開始一周一次用樹枝狀聚合物-抗炎劑(D-NAC10mg/kg)治療引起癥狀改善，癥狀發(fā)作延遲和/或癥狀無進(jìn)展，但這不伴隨有存活率顯著增加。樹枝狀聚合物-NAC治療引起所治療動(dòng)物體重增加的增加。在所治療動(dòng)物的微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和表型中也存在改善。在人類中，改善癥狀將是顯著進(jìn)步。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中樹枝狀聚合物復(fù)合物將用于遞送抗炎劑(D-NAC)和抗興奮性毒性和D-抗谷氨酸酯劑。優(yōu)選的候選物是：MK801、美金剛(Memantine)、氯胺酮、1-MT、JHU-29、抗谷氨酸胺酶抑制劑和GCPH抑制劑，如2-MPPA和2-PMPA。自閉癥譜系障礙自閉癥譜系障礙(ASD)的特征在于：在跨多種情形的社會(huì)交流和社會(huì)互動(dòng)中的持續(xù)性缺陷；受限、重復(fù)的行為、興趣或活動(dòng)模式；癥狀必須在早期發(fā)育時(shí)段中存在(通常在生命的前兩年辨識(shí)出)；和，癥狀在社會(huì)、職業(yè)或其它重要目前活動(dòng)領(lǐng)域中引起臨床上顯著的障礙。術(shù)語“譜系”是指患有ASD的兒童可能具有的廣泛范圍的癥狀、技巧和障礙或殘疾水平。一些兒童因其癥狀而出現(xiàn)輕度障礙，而其它嚴(yán)重殘疾。最新版本的精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)(DSM-5)不再包括埃斯博格氏癥候群(Asperger'ssyndrome)；但在更廣類別的ASD內(nèi)包括埃斯博格氏癥候群的特征。在一些情況下，患有ASD的嬰兒可能在其發(fā)育的極早期似乎不同。甚至在其第一個(gè)生日之前，一些嬰兒變得過度集中于某些物體，很少進(jìn)行眼神接觸，并且未能參加典型的來回游戲和與其父母咿呀學(xué)語。其它兒童可能正常發(fā)育直到生命第二或甚至第三年為止，但接著開始失去對(duì)其它人的興趣并且變得沉默、遠(yuǎn)離或不關(guān)心社會(huì)信號(hào)。正常發(fā)育的喪失或反轉(zhuǎn)稱為退化，并且在一些患有ASD的兒童中發(fā)生。自閉癥譜系障礙(ASD)診斷常常是兩階段過程。第一階段涉及在兒科醫(yī)師或早期兒童醫(yī)療服務(wù)人員對(duì)健康兒童的檢查期間進(jìn)行的一般發(fā)育篩選。對(duì)展示一些發(fā)育問題的兒童進(jìn)行其它評(píng)估。第二階段涉及由具有廣泛范圍專業(yè)的醫(yī)生和其它健康專業(yè)人員的小組進(jìn)行徹底評(píng)估。在此階段，兒童可能診斷為患有ASD或另一種發(fā)育病癥。此時(shí)，由FDA批準(zhǔn)治療ASD各方面的僅有的藥劑是抗精神病劑利培酮(risperidone)(Risperdal)和阿立哌唑(aripripazole)(Abilify)。這些藥劑可以在兒童年齡階段幫助減少易怒，易怒意味著攻擊性、自我傷害行為或壞脾氣?？梢蚤_出處方的未得到官方批準(zhǔn)的一些用于患有ASD的兒童的藥劑包括以下：抗精神病藥劑更常用于治療嚴(yán)重心理病，如精神分裂癥。這些藥品可以幫助在兒童，包括患有ASD的兒童中減少攻擊性和其它嚴(yán)重行為問題。其也可以幫助減少重復(fù)行為、多動(dòng)癥和注意力問題?？箲n郁藥劑(如氟西汀(fluoxetine)或舍曲林(sertraline))通常開出處方以治療抑郁癥和焦慮癥，但有時(shí)開出處方以減少重復(fù)行為。一些抗抑郁劑也可以幫助在患有ASD的兒童中控制攻擊性和焦慮癥。刺激藥劑(如哌醋甲酯(methylphenidate)(Ritalin)在治療患有注意缺陷多動(dòng)病癥(ADHD)的人中安全并有效。已經(jīng)展示哌醋甲酯也在患有ASD的兒童中有效治療多動(dòng)癥。但并沒有許多患有ASD的兒童對(duì)治療有反應(yīng)，并且那些有反應(yīng)的兒童已經(jīng)展示比具有ADHD而非ASD的兒童更多的副作用。本文所描述的樹枝狀聚合物結(jié)合物應(yīng)具有用于治療和診斷此類個(gè)體的功效，確切地說，鑒于最近研究展示，在死后大腦樣本和細(xì)胞激素CSF水平中，患有自閉癥的患者具有由活化的微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞存在增加而見的神經(jīng)炎癥證據(jù)。瓦爾加斯(Vargas)等人,神經(jīng)病學(xué)年鑒(AnnNeurol.)2005年1月；57(1):67-81.糾錯(cuò)于:神經(jīng)病學(xué)年鑒2005年2月；57(2):304中。興奮性毒性病癥興奮性毒性是神經(jīng)細(xì)胞因?yàn)槭艿竭^度刺激而經(jīng)由其變的受損的過程。多種病狀與興奮性毒性相關(guān)，包括中風(fēng)、創(chuàng)傷性腦損傷、多發(fā)性硬化癥、肌肉萎縮性側(cè)索硬化、阿茲海默氏病(Alzheimer'sdisease)和脊椎損傷。對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷引起相對(duì)應(yīng)神經(jīng)癥狀，其可以取決于何種細(xì)胞受損和損傷范圍如何而變化。一旦受損，神經(jīng)細(xì)胞無法修復(fù)，并且患者可能經(jīng)歷永久障礙。興奮性毒性經(jīng)由其發(fā)生的過程開始于谷氨酸酯升高。谷氨酸酯是用以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞之間電學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)的興奮性神經(jīng)傳遞素。然而，當(dāng)谷氨酸酯水平上升太多時(shí)，其基本上堵塞開放位置的神經(jīng)元，允許鈣自由流動(dòng)到細(xì)胞中。鈣損傷細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和DNA，并且隨著細(xì)胞死亡而產(chǎn)生串聯(lián)反應(yīng)并釋放涌進(jìn)鄰近細(xì)胞的谷氨酸酯，造成損傷擴(kuò)展。神經(jīng)細(xì)胞上的若干受體對(duì)谷氨酸酯敏化，包括AMPA和NDMA受體。神經(jīng)元之間的此相互作用可以是興奮性或抑制性的。主要興奮性氨基酸神經(jīng)傳遞質(zhì)是谷氨酸酯和天冬氨酸酯，而GABA(γ-氨基丁酸)、甘氨酸(胺基乙酸)和?；撬崾且种菩缘?。具有挑戰(zhàn)性的神經(jīng)病癥多樣性(包括中風(fēng)、外傷、癲癇癥和甚至神經(jīng)退化性病狀，如亨廷頓氏病(Huntingtondisease)、AIDS癡呆復(fù)合征和肌肉萎縮性側(cè)索硬化)，但通常不認(rèn)為此譜群的疾病共用相同的神經(jīng)元損傷和死亡機(jī)制。外傷是大規(guī)模升高細(xì)胞外谷氨酸酯水平的遲鈍機(jī)制。正常細(xì)胞外谷氨酸酯濃度是約0.6μmol/L。實(shí)質(zhì)性神經(jīng)元興奮性毒性損傷在谷氨酸酯濃度2到5μmol/L的情況下發(fā)生。對(duì)神經(jīng)元的外傷性損傷可能產(chǎn)生將正常細(xì)胞內(nèi)谷氨酸酯濃度約10μmol/L暴露于細(xì)胞外空間中災(zāi)難性后果。因此，對(duì)單個(gè)神經(jīng)元機(jī)械損傷使所有鄰近神經(jīng)元具有風(fēng)險(xiǎn)。由此類型的谷氨酸酯釋放發(fā)生對(duì)周圍神經(jīng)元的顯著間接損傷。一個(gè)最近的治療策略是立即用谷氨酸酯受體阻斷劑治療具有頭部或脊椎柱損傷的個(gè)人以使超出立即物理破壞神經(jīng)元的神經(jīng)元死亡的擴(kuò)展減到最少。過量谷氨酸酯積聚的若干機(jī)制很可能導(dǎo)致出現(xiàn)局部缺血。谷氨酸酯從其在神經(jīng)元囊泡中的儲(chǔ)存位點(diǎn)的異常釋放是至少一個(gè)因素。隨著此釋放谷氨酸酯刺激其它谷氨酸酯釋放，產(chǎn)生反饋環(huán)路。局部缺血也造成損害谷氨酸酯轉(zhuǎn)運(yùn)體再吸收的能量缺乏。這些轉(zhuǎn)運(yùn)體表現(xiàn)為同向轉(zhuǎn)運(yùn)體，其依賴于跨細(xì)胞膜的鈉梯度與谷氨酸酯濃度梯度相反地將谷氨酸酯移動(dòng)到細(xì)胞中。然而，鈉梯度由能量依賴性泵維持，該泵在局部缺血的情況下失效。此類失效不僅影響谷氨酸酯轉(zhuǎn)運(yùn)離開突觸空間，并且還造成轉(zhuǎn)運(yùn)體反向運(yùn)作，成為細(xì)胞外谷氨酸酯的來源而非谷氨酸酯接收器。局部缺血使神經(jīng)元喪失氧和葡萄糖，導(dǎo)致能量缺乏；然而，能量缺乏本身并不對(duì)神經(jīng)元具有特定毒性。神經(jīng)毒性的所得谷氨酸酯受體依賴性機(jī)制的級(jí)聯(lián)活化的情況下發(fā)生。如果這些受體由適當(dāng)拮抗劑阻斷，那么神經(jīng)元可以在喪失氧和代謝底物的時(shí)段內(nèi)存活。這是谷氨酸酯受體阻斷劑治療急性缺血事件的最近發(fā)展與試驗(yàn)的基本原理。雖然無法搶救梗塞區(qū)，但希望預(yù)防具有風(fēng)險(xiǎn)的相鄰半影區(qū)的周圍損傷。這些受體阻斷劑在研發(fā)中的干預(yù)領(lǐng)域和藥理學(xué)上相關(guān)的重新建立向大腦急性缺血區(qū)域灌注的嘗試中也可能是關(guān)鍵的。栽不同時(shí)停止處于受體或細(xì)胞內(nèi)水平的興奮性毒性級(jí)聯(lián)的情況下向缺血區(qū)域進(jìn)行組織灌注和氧濃度增加可以通過提供呈過氧化物陰離子形式的其它自由基以及通過刺激粒線體鈣存儲(chǔ)的釋放增加細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞溶質(zhì)鈣水平來增加而非減少神經(jīng)元損傷。已經(jīng)研發(fā)和使用多種藥物來試圖中斷、影響或暫時(shí)停止引起神經(jīng)元損傷的谷氨酸酯興奮性毒性級(jí)聯(lián)。一種策略是“上游”嘗試以減少谷氨酸酯釋放。此類別的藥物包括利魯唑(riluzole)、拉莫三嗪(lamotrigine)和利法利嗪(lifarizine)，其為鈉通道阻斷劑。常用的尼莫地平(nimodipine)是電壓依賴性通道(L型)阻斷劑。也已經(jīng)進(jìn)行影響偶合的谷氨酸酯受體本身各種位點(diǎn)的嘗試。這些藥物中的一些包括非爾胺酯(felbamate)、艾芬地爾(ifenprodil)、鎂、美金剛和硝化甘油。這些“下游”藥物嘗試影響如以下的細(xì)胞內(nèi)事件：自由基形成、氧化氮形成、蛋白水解、核酸內(nèi)切酶活性和ICE樣蛋白酶形成(在導(dǎo)致漸進(jìn)式細(xì)胞死亡或細(xì)胞凋亡的過程中的重要組分)。將通過參考以下非限制性實(shí)例進(jìn)一步理解本發(fā)明。實(shí)例1：向患有RTT的小鼠全身性投與樹枝狀聚合物-藥物結(jié)合物材料和方法在下文實(shí)驗(yàn)中所用的詳細(xì)材料和方法(包括用于制造樹枝狀聚合物-Cy5和樹枝狀聚合物-藥物結(jié)合物的方案)已經(jīng)由卡納安S等人科學(xué)·轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué),4:130ra46(2012)并且在美國專利案第8,889.101號(hào)中描述。RTT小鼠是可購自杰克遜實(shí)驗(yàn)室(JacksonLaboratory)的阿德里安·伯德型(AdrianBirdmodel)。樹枝狀聚合物注射和動(dòng)物處死。向RTT小鼠靜脈內(nèi)注射樹枝狀聚合物。對(duì)于靜脈內(nèi)注射，在股區(qū)制造小切口之后，經(jīng)由30g針頭將溶解于100μL無菌PBS中的600μgD-Cy5注射到股靜脈中。用游離Cy5和PBS注射的動(dòng)物充當(dāng)此研究的陽性或陰性對(duì)照。在樹枝狀聚合物注射后的適當(dāng)時(shí)間點(diǎn)(24小時(shí)、72小時(shí)和21天，并且最多六周后)，使用氯胺酮/甲苯噻嗪使動(dòng)物麻醉，并且使用致命劑量的戊巴比妥鈉進(jìn)行安樂死。立即取出大腦，并且進(jìn)行加工以用于免疫組織化學(xué)分析。高效液相色譜(HPLC)分析。使用與Empower軟件接合的配備有沃特斯(Waters)線上脫氣裝置、二元泵、光電二極管陣列(PDA)檢測器、多元熒光λ檢測器和自動(dòng)取樣器(維持在4℃下)的沃特斯HPLC儀器(馬薩諸塞州米爾福德的沃特斯公司(WatersCorporation,Milford,Massachusetts))來分析樹枝狀聚合物-Cy5結(jié)合物(D-Cy5)的純度。同時(shí)使用沃特斯2998PDA檢測器對(duì)樹枝狀聚合物監(jiān)測HPLC色譜圖中210nm處吸收并且對(duì)Cy5監(jiān)測650nm處吸收，使用沃特斯2475熒光檢測劑監(jiān)測HPLC色譜圖中645nm處激發(fā)和662nm處發(fā)射的熒光。水/乙腈(0.1％w/wTFA)經(jīng)過新鮮制備、過濾、脫氣，并且用作流動(dòng)相。使用與TSK-Gel保護(hù)柱連接的TSK-GelODS-80Ts(250×4.6mm，25cm長，5μm粒度)。使用以下梯度流：初始條件為90:10(H2O/ACN)，并且接著以1ml/min的流動(dòng)速率在30分鐘內(nèi)逐漸增加乙腈濃度達(dá)到10:90(H2O/ACN)，并且在60分鐘內(nèi)返回原始初始條件90:10(H2O/ACN)。動(dòng)物和炎癥的評(píng)定還評(píng)定體重和行為。使用用于評(píng)定發(fā)炎性標(biāo)記物的標(biāo)準(zhǔn)小鼠引物來測量細(xì)胞激素(卡納安S等人科學(xué)·轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué),4:130ra46(2012))。免疫組織化學(xué)和共聚焦顯微鏡檢查。將大腦切片固定在含2％多聚甲醛(PFA)的PBS中。以1:2比率分別使用含干冰的異戊烷將大腦在具有最優(yōu)切割溫度化合物(OCT)的20％蔗糖(加利福尼亞州托蘭斯的櫻花優(yōu)越技術(shù)美國公司(SakuraFinetekUSAInc.,Torrance,CA))中冷凍。將低溫塊儲(chǔ)存在-80℃下直到切片為止。使用低溫恒溫器從冷凍塊切割8μm切片。在兔抗離子化鈣結(jié)合銜接子1分子(Iba-1)(美國和光化學(xué)品公司(Wakochemicals,USA))(其是微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物)中培育切片，并且施用山羊抗兔Cy3二級(jí)抗體。在蔡司(Zeiss)510共聚焦顯微鏡上分析切片。激發(fā)和發(fā)射波長以及激光設(shè)定與分析IV注射動(dòng)物中的所有組織相同。取得Z形堆疊的切片并且收縮，以得到穿過完整部分深度的圖像。樹枝狀聚合物結(jié)合物的結(jié)合。使用先前報(bào)導(dǎo)的方法來進(jìn)行樹枝狀聚合物與Cy5的結(jié)合(卡納安等人,科學(xué)·轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)(2012年4月)。對(duì)于藥物實(shí)驗(yàn)，使樹枝狀聚合物結(jié)合于N-乙?；?半胱氨酸，并且在不同時(shí)間點(diǎn)以介于2-20mg/kg范圍內(nèi)的劑量投與。每3-4天用D-藥物或PBS對(duì)小鼠進(jìn)行注射。統(tǒng)計(jì)分析。使用斯圖登氏t檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)的再現(xiàn)性以確定兩組之間的顯著性。等于或小于0.05的p值視為顯著的。結(jié)果樹枝狀聚合物結(jié)合物可以在大腦中介導(dǎo)炎癥的活化微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中聚積。在3周齡時(shí)在有癥狀的RTT小鼠中全身性投與經(jīng)過Cy5標(biāo)記的樹枝狀聚合物，并且對(duì)大腦進(jìn)行采集、灌注和固定以查看在微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中定位的樹枝狀聚合物。樹枝狀聚合物定位于先前研究中已展示受傷或損傷的大腦區(qū)中的微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中。健康對(duì)照小鼠未展示大腦中的積聚。當(dāng)在呈現(xiàn)有代表RTT的癥狀的小鼠中全身性投與時(shí)，與具有類似疾病嚴(yán)重程度的未治療小鼠相比較，樹枝狀聚合物-藥物結(jié)合物(D-藥物)展示在8周齡為止時(shí)整體幼鼠健康狀況、外觀和疾病行為標(biāo)志中的顯著改善。在3周齡全身性投與的結(jié)合于Cy5的樹枝狀聚合物在RTT小鼠側(cè)向皮質(zhì)中微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中積聚。當(dāng)在有癥狀的RTT小鼠中從3周齡開始每3-4天全身性投與時(shí)，樹枝狀聚合物-藥物(D-藥物)結(jié)合物提供在8周齡時(shí)整體健康狀況和外觀的顯著改善。PBS治療的小鼠展示嚴(yán)重的腳爪緊握、駝背體態(tài)和失明。與游離藥物相比較，經(jīng)過治療的小鼠展示存活率改善(圖1A)。圖1A是在MeCP2剔除小鼠中進(jìn)行NAC和D-NAC療法后的卡普蘭-邁耶存活率曲線。在每周兩次NAC或D-NAC療法后在MeCP2剔除幼鼠中評(píng)定存活率。與未治療的動(dòng)物相比較，D-NAC不改善存活率。D-NAC改善NAC的安全性。與NAC治療的幼鼠相比較，D-NAC和PBS治療的MeCP2剔除幼鼠具有顯著更好的50％存活率(p＝0.014)，指示NAC在以游離調(diào)配物形式給予時(shí)的潛在毒性。在于樹枝狀聚合物-藥物結(jié)合物(DNAC)上藥物相當(dāng)?shù)膭┝肯?，游離非結(jié)合藥物(NAC)實(shí)際上導(dǎo)致比未治療的瑞特氏小鼠更壞的存活率。與PBS治療的瑞特氏小鼠相比較，用樹枝狀聚合物-藥物結(jié)合物治療維持顯著改善的行為(圖1B)。圖1B是在MeCP2剔除小鼠中進(jìn)行D-NAC療法后的神經(jīng)行為結(jié)果圖。在3周齡時(shí)(PND21)開始用生理鹽水(PBS，黑色虛線)、10mg/kgNAC(紅色線)或10mg/kg(以NAC計(jì))D-NAC(藍(lán)色線)治療MeCP2剔除小鼠。每周兩次對(duì)幼鼠進(jìn)行治療。在PND10和PND17時(shí)進(jìn)行行為測試以確定基線，并且在PND21時(shí)開始在每一治療日治療之前進(jìn)行行為測試。使用同窩匹配的WT幼鼠作為體重和行為對(duì)照兩者。與NAC和PBS治療相比較，D-NAC療法顯著地改善行為結(jié)果。與未治療的幼鼠相比較，D-NAC改善MeCP2剔除小鼠的整體外觀。未治療的幼鼠顯著消瘦，具有多個(gè)緊握的腳爪、駝背體態(tài)和不良的眼睛條件。在治療之前每3-4天對(duì)動(dòng)物進(jìn)行錄像，并且按照0-3的等級(jí)對(duì)所有運(yùn)動(dòng)性、步態(tài)、震顫、腳爪緊握、腳爪緊握時(shí)間、腳爪絞擰和呼吸進(jìn)行評(píng)分，其中‘0’指示最壞評(píng)分并且‘3’是最佳或正常。產(chǎn)生復(fù)合評(píng)分(0-21的范圍，其中正常、健康小鼠的評(píng)分為20-21)并且在組間比較，其中較低評(píng)分指示惡化的行為。對(duì)展現(xiàn)類似存活率的研究中所有小鼠的評(píng)分進(jìn)行平均(66天齡，或6周治療)。確定并且比較T小鼠與MeCP2剔除小鼠中的大腦吸收和細(xì)胞定位。在有癥狀前的時(shí)段(1周齡)，樹枝狀聚合物(D-Cy5，紅色)定位主要在室上性區(qū)中的微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(Iba)中而不在星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)中。在充分進(jìn)入有癥狀時(shí)段的數(shù)周齡時(shí)沒D-Cy5定位于皮質(zhì)中的微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中和室上性區(qū)中的星形膠質(zhì)細(xì)胞中。D-Cy5保持定位于兩個(gè)年齡的T小鼠的血管中。在T小鼠和MeCP2剔除小鼠中評(píng)定微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)。在MeCP2剔除小鼠(KO)中，微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(Iba)在1周齡時(shí)在圍繞腦室的區(qū)中是變形蟲樣(amoevoid)。2周和5周齡的KO小鼠中的微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞具有較少并且較薄突起(processes)，并且在數(shù)周齡時(shí)具有較多突起，但與數(shù)周時(shí)的T微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞相比較連接較少。在T小鼠和有癥狀前與有癥狀的MeCP2剔除小鼠的大腦中測量發(fā)炎性概況(圖2A-2F)。在1、2、3、5和數(shù)周齡時(shí)，在T幼鼠和MeCP2剔除幼鼠的大腦中測量促炎性和抗炎性細(xì)胞激素的mRNA水平。呈現(xiàn)中值2ΔΔCT值，并且誤差條由四分位范圍上限和下限表示。(圖3A)發(fā)炎性概況隨時(shí)間的變化呈現(xiàn)為復(fù)合促炎性評(píng)分(包括TNFα、I-6和I-1β)與復(fù)合抗炎性評(píng)分(包括TGF-β、I-10和I-4)的比率。復(fù)合評(píng)分通過在既定基因分型中取得每一壽命的所有幼鼠在該壽命時(shí)的所有促炎性2ΔΔCT值或所有抗炎性2ΔΔCT值的中值來產(chǎn)生。(圖3B)MeCP2剔除小鼠的促炎性概況傾向于促炎性標(biāo)記物在2周和數(shù)周時(shí)增加。然而，在2周、5周和數(shù)周齡時(shí)，與周齡和同窩匹配的T小鼠相比較，抗炎性mRNA表達(dá)(圖3C)在MeCP2剔除小鼠中展示顯著減少。這表明，MeCP2剔除小鼠中的神經(jīng)發(fā)炎性過程由抗炎性表達(dá)的減少來驅(qū)動(dòng)，而非由促炎性表達(dá)的增加來驅(qū)動(dòng)。圖4是大腦中D-Cy5的量(μg/g)隨大腦損傷嚴(yán)重性(基于復(fù)合行為評(píng)分)而變化的圖。對(duì)吸收與損傷嚴(yán)重性的相關(guān)性的此展現(xiàn)提供診斷損傷程度的手段。實(shí)例2：在犬類模型中治療大腦損傷材料和方法用于低溫循環(huán)驟停的犬類動(dòng)物模型中大腦損傷的樹枝狀聚合物大腦吸收和靶向療法由馬努基(Manoj)等人,美國化學(xué)學(xué)會(huì)·納米,2014,8(3),第2134-2147頁描述。在這些研究中使用具有乙二胺(EDA)核心的6級(jí)的伯羥基官能化PAMAM樹枝狀聚合物。制備結(jié)合物如上文所描述來制備結(jié)合物。犬類HCA模型和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所有實(shí)驗(yàn)都是用由鮑姆加特納實(shí)驗(yàn)室(Baumgartnerlaboratory)研發(fā)的HCA犬類模型。(雷德蒙德(Redmond)等人,胸外科年鑒(Ann.Thorac.Surg.)1995,59,579-584；雷德蒙德等人,胸與心血管外科(Thorac.Cardiovasc.Surg),1994,107,776-786)。此大動(dòng)物模型利用人類與犬類之間的某些固有生理類似性來研發(fā)可容易轉(zhuǎn)譯的治療模型以解決與低溫循環(huán)驟停相關(guān)聯(lián)的神經(jīng)損傷。因?yàn)檫@是大動(dòng)物模型，所以人們能夠復(fù)制與在人類手術(shù)室中所經(jīng)歷的具有驚人保真度的外科手術(shù)，并且能夠復(fù)制與最壞人類情況中所見類似的神經(jīng)損傷程度。所有實(shí)驗(yàn)使用經(jīng)過適應(yīng)的犬惡絲蟲陰性的6-12月齡雄性A類犬(大致30kg)(紐約州北羅斯的馬歇爾生物資源公司(MarshalBioresources,NorthRose,NY))。實(shí)驗(yàn)由約翰·霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物照護(hù)與使用委員會(huì)批準(zhǔn)比較宮崎駿額遵守“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物照護(hù)與使用指南”(1996,美國國家衛(wèi)生研究院)。向犬投與美索比妥鈉(12mg/kgIV，分次給藥)，氣管內(nèi)插管，并且維持異氟烷吸入麻醉(0.5％-2.0％)，100％氧氣和IV芬太尼(fentanyl)(150-200微克/劑量)和咪達(dá)唑侖(midazolam)(2.5毫克/劑量)。鼓室膜、食道和直腸探針監(jiān)測整個(gè)實(shí)驗(yàn)中的溫度。在起始CPB之前放置左股動(dòng)脈導(dǎo)管以監(jiān)測血壓并對(duì)動(dòng)脈血液氣體進(jìn)行取樣。連續(xù)地監(jiān)測EKG。對(duì)右股動(dòng)脈插管，并且導(dǎo)管前進(jìn)到下行胸主動(dòng)脈。靜脈導(dǎo)管從右股靜脈和右外頸靜脈前進(jìn)到右心房。開始胸外CPB，并且使動(dòng)物冷卻。60-100mL/kg/min的泵送流動(dòng)維持60-80mmHg的平均動(dòng)脈壓。一旦鼓室溫度達(dá)到18℃，中止泵送并且通過重力使血液排干到儲(chǔ)集器中。犬在標(biāo)準(zhǔn)血液稀釋和動(dòng)脈血液氣體α-stat調(diào)節(jié)的情況下經(jīng)歷2小時(shí)HCA。在HCA之后，重新開始CPB，并且歷經(jīng)2小時(shí)時(shí)程使動(dòng)物再升溫到37℃核心溫度。如果竇性節(jié)律未自發(fā)地返回，那么在32℃下對(duì)心臟進(jìn)行除纖顫。取得連續(xù)血液氣體水平以確保恰當(dāng)?shù)膒H并檢驗(yàn)電解質(zhì)濃度，并且使用動(dòng)脈導(dǎo)管記錄連續(xù)血流動(dòng)力學(xué)測量結(jié)果。在37℃下，使每一只狗脫離CPB并且去除導(dǎo)管。在插管時(shí)使犬從麻醉恢復(fù)，同時(shí)頻繁監(jiān)測生命體征、動(dòng)脈血液氣體和尿排出量。一些動(dòng)物在此階段需要血流動(dòng)力學(xué)支撐物和酸中毒修正以能夠成功脫離搭橋。一旦在血液動(dòng)力學(xué)和臨床上穩(wěn)定，對(duì)犬進(jìn)行拔管并且將其轉(zhuǎn)移到其籠中以用于恢復(fù)和存活，其中以24小時(shí)間隔進(jìn)行神經(jīng)評(píng)定直到所需終點(diǎn)(在搭橋之后24或72小時(shí))為止。樹枝狀聚合物投藥(用于生物分布研究)在低溫循環(huán)驟停之后24小時(shí)時(shí)以單次推注形式注射樹枝狀聚合物-熒光團(tuán)結(jié)合物。并行用D-FITC靜脈內(nèi)輸注(每動(dòng)物140mg，大致5mg/kg)和D-Cy5的腦大池內(nèi)(ICM，“進(jìn)入大腦”)注射(每動(dòng)物5mg，0.17mg/kg)來治療三只犬，并且在結(jié)合物投藥后48小時(shí)時(shí)安樂死。隨后在處死(投藥之后48小時(shí))時(shí)測量組織吸收和生物分布。因?yàn)镕ITC和Cy5在其不同特征波長下加以分析，所以可以同時(shí)評(píng)定其生物分布。樹枝狀聚合物投藥(用于功效研究)在HCA前后靜脈內(nèi)投與游離藥物(VPA和NAC)或樹枝狀聚合物-藥物結(jié)合物。游離藥物投與的劑量是基于我們用VPA實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)的先前研究，并且是基于游離N-乙酰基半胱氨酸的文獻(xiàn)。先前研究已經(jīng)報(bào)導(dǎo)，用NAC治療理在心跳驟停模型中具有保護(hù)性。樹枝狀聚合物-藥物結(jié)合物的劑量設(shè)定為游離藥物劑量的1/10(VPA)或1/30(NAC)，這是基于先前發(fā)現(xiàn)在此類劑量比率下在兔CP模型中的驚人神經(jīng)保護(hù)。對(duì)于游離藥物，用100mg/kg的VPA和300mg/kg的NAC治療動(dòng)物，其中一半劑量在驟停前靜脈內(nèi)投與并且其余在驟停后投與。對(duì)于樹枝狀聚合物-藥物結(jié)合物，用含有10mg/kgNAC的D-NAC和/或具有10mg/kgVPA的D-VPA對(duì)犬進(jìn)行靜脈內(nèi)治療。在HCA之前以25％推注形式靜脈內(nèi)投與D-VPA，繼而在HCA完成之后歷經(jīng)2小時(shí)進(jìn)行75％輸注。在HCA前以50％推注形式靜脈內(nèi)投與D-NAC，并且在HCA完成之后歷經(jīng)2小時(shí)進(jìn)行50％輸注。這些療程與游離藥物所用的類似。安樂死通過放血對(duì)動(dòng)物進(jìn)行安樂死。在鎮(zhèn)靜和插管之后，動(dòng)物經(jīng)歷中胸骨切開術(shù)，并且使用22-French導(dǎo)管對(duì)升主動(dòng)脈進(jìn)行套管插入。起始CPB，改變下行主動(dòng)脈夾持以確保大腦在60mmHg下灌注有12L冰冷生理鹽水(4℃)。橫切右心房附體，并且允許靜脈回流排干。在灌注之后立即采集大腦，分離半球，并且將一個(gè)半球固定在10％中性緩沖福爾馬林中(用于免疫組織化學(xué)評(píng)估和成像)，而將另一個(gè)半球切割成1cm冠狀面切片并且快速冷凍(用于生物分布量化)。熒光顯微鏡檢查用抗熒光衰減培養(yǎng)基(具有DAPI的ProLongGold，俄勒岡州尤金的分子探針公司(MolecularProbes,Inc.,Eugene,OR))安裝海馬區(qū)和小腦的低溫恒溫器切片。在對(duì)每一大腦區(qū)的所有樣品暴露時(shí)間相等的情況下，使用蔡司AxiolmagerM2獲得熒光影像。為了使圖像對(duì)比度和亮度最優(yōu)，在每一組圖像內(nèi)同等調(diào)節(jié)顯示器設(shè)定。神經(jīng)評(píng)估每24小時(shí)對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行臨床神經(jīng)評(píng)定直到處死為止。在本研究中所用的犬特異性行為等級(jí)在匹茲堡大學(xué)醫(yī)學(xué)院國際復(fù)蘇和研究中心得到驗(yàn)證。所評(píng)估的神經(jīng)功能存在五個(gè)組件：意識(shí)水平、呼吸道模式、顱側(cè)神經(jīng)功能、運(yùn)動(dòng)和感覺功能以及行為。兩個(gè)研究員獨(dú)立地在0(正常)與100(嚴(yán)重?fù)p傷)之間對(duì)每一組分指定評(píng)分，并且這些評(píng)分經(jīng)過平均和求和以獲得總評(píng)分，其可能值介于0(正常)到500(大腦死亡)范圍內(nèi)。結(jié)果如在低溫循環(huán)心跳驟停誘導(dǎo)的大腦損傷的犬類模型中所展現(xiàn)的，對(duì)于遞送藥物跨越受傷BBB，G6PAMAM樹枝狀聚合物優(yōu)于G4樹枝狀聚合物。G6樹枝狀聚合物在持續(xù)時(shí)間段內(nèi)維持較高的大腦脊髓液(CSF)與血清比率。維持此類高CSF/血清比率是用于許多CNS藥物關(guān)鍵性障礙。參見圖5。受傷大腦中所見的高CSF水平是關(guān)鍵性新特征。基于展示G6樹枝狀聚合物由活化的微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和受傷神經(jīng)元內(nèi)化的研究，樹枝狀聚合物的積聚依賴于損傷程度(參見圖4)(美國化學(xué)學(xué)會(huì)·納米.2014年3月25日:8(3):2134-47。)如圖5所示，G6樹枝狀聚合物在腦脊髓液(CSF)中分配較高，其中到24小時(shí)為止，GSF/血清比率比犬592和593高10％，并且在72小時(shí)時(shí)～4％-5％。在輸注時(shí)間期間和之后不久，取決于損傷程度，比率可變成高達(dá)40％。如圖6中所示，G6樹枝狀聚合物的大腦積聚是區(qū)依賴性的，其中最高積聚在海馬區(qū)中，接著是小腦和皮質(zhì)，與損傷模式一致。在樹枝狀聚合物投藥后48小時(shí)時(shí)，在大腦的所有區(qū)中，G6樹枝狀聚合物都展示比G4樹枝狀聚合物顯著更高的大腦積聚(低于檢測限)。參見圖6。即使在投藥之后48小時(shí)時(shí)，G6樹枝狀聚合物在受傷區(qū)中的水平仍是G4樹枝狀聚合物在6小時(shí)較早時(shí)間時(shí)的許多倍。在海馬區(qū)中，G6樹枝狀聚合物在齒狀回中展示比CA1和CA3區(qū)中更高的積聚。在海馬區(qū)中，G6樹枝狀聚合物展示不同類型的細(xì)胞定位，其中主要由活化的微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和受傷神經(jīng)元吸收。如圖7所示，在第2次推注給藥后48小時(shí)時(shí)，G6樹枝狀聚合物主要積聚在腎臟皮質(zhì)和肝臟中，表明腎和肝清除率對(duì)于從循環(huán)中去除樹枝狀聚合物都是重要的。與G4樹枝狀聚合物相比較，G6樹枝狀聚合物展示較低腎臟水平，與較高血清水平一致。結(jié)果展現(xiàn)，G4和G6樹枝狀聚合物在500倍更高劑量下都不具有毒性，并且經(jīng)由腎臟完整清除。本文所描述的方法和材料的修改和變化對(duì)于所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將是顯而易知的，并且意圖涵蓋于權(quán)利要求書內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 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