人源化抗?TF?抗原抗體的制作方法

本申請(qǐng)要求于2014年4月18日提交的申請(qǐng)?zhí)枮?1/981,240的美國臨時(shí)申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，將其公開內(nèi)容通過引用并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開內(nèi)容總體上涉及識(shí)別Thomsen-Friedenreich(TF)人腫瘤抗原的人源化抗體，以及利用該單克隆抗體的方法。
背景技術(shù)：
：在癌病變期間，在細(xì)胞表面上的糖類結(jié)構(gòu)的生物合成中發(fā)生變化，并且連接至蛋白質(zhì)或連接至脂質(zhì)的若干不同糖類已被識(shí)別是腫瘤相關(guān)的抗原。Thomsen-Friedenreich(TF)二糖(Galβ1-3GalNAcα)被典型地發(fā)現(xiàn)O-連接至絲氨酸或蘇氨酸殘基。TF-Ag(也稱為T抗原)已與若干人類腫瘤相關(guān)，包括在胰腺、結(jié)腸和乳腺中發(fā)現(xiàn)的那些，并且基于此已被稱為泛癌標(biāo)記(pan-carcinomamarker)。TF-Ag通過用較大的聚糖鏈延伸而從正常成人組織中的免疫系統(tǒng)被隱蔽起來。在癌中，細(xì)胞糖基化系統(tǒng)可以被破壞，這導(dǎo)致這些鏈的截短和TF抗原的暴露?？梢园邢騎F-Ag的新單克隆抗體及其抗體片段是期望的，并且由本公開內(nèi)容提供。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本公開內(nèi)容在多個(gè)實(shí)施方案中包括用于治療TF+癌癥的組合物和方法。在實(shí)施方案中，公開內(nèi)容包括特異性地結(jié)合至TF-Ag的部分人源化單克隆抗體(mAbs)或其片段。該mAb或其片段包含重鏈和輕鏈，其中所述重鏈包含選自由以下各項(xiàng)組成的組中的序列：EVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMHWVRQAPGQGLEWMGFISPNTDYTEYNQKFRDRVTMTADTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSFIGYNFDFWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:7)(H1)；EVQLLESGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMHWVRQAPGQGLEWMGFISPNTDYTEYNQKFRDRVTLTADKSSSTAYMELSSLTSEDTAVYYCARSFIGYNFDFWGQGTTVTVSS(SEQIDNO:8)(H2)；和EVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMHWVKQAPGQGLEWIGFISPNTDYTEYNQKFRDKATMTADTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSFIGYNFDFWGQGTTLTVSS(SEQIDNO:9)(H3)，和它們的組合。所述輕鏈包含選自由以下各項(xiàng)組成的組中的序列：DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQTIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK(SEQIDNO:10)(L1)；L2DIVMTQTPLSLPVTLGQPASISRSSQTIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK(SEQIDNO:11)(L2)；和DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQTIVYSNGNTYLEWYLQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK(SEQIDNO:12)(L3)；和它們的組合。制備和測(cè)試了另外的形式H2、H3、L2和L3。這些包括以下：重鏈可變區(qū)H2a：QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYWMHWVRQAPGQGLEWMGFISPNTDYTEYNQKFRDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSFIGYNFDFWGQGTTVTVS(SEQIDNO:13)重鏈可變區(qū)H3a：EGQLLESGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTTYWMHWVKKRPGQGLEWIGFISPNTDYTEYNQKFRDKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSDDSAVYYCARSFIGYNFDFWGQGTTLTVSS(SEQIDNO:14)輕鏈可變區(qū)L2a：DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKVDIK(SEQIDNO:15)輕鏈可變區(qū)L3a：ELVMTQTPLSLPVNLGDQASISCRSSQTIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEADDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK(SEQIDNO:16).在本公開內(nèi)容中包括的重和輕可變鏈的組合為：H1-L1；H1-L2；H1-L2a；H1-L3；H1-L3a；H2-L1；H2-L2；H2-L2a；H2-L3；H2-L3a；H3-L1；H3-L2；H3-L2a；H3-L3；H3-L3a；H2a-L1；H2a-L2；H2a-L2a；H2a-L3；H2a-L3a；H3a-L1；H3a-L2；H3a-L2a；H3a-L3；和H3a-L3a。在實(shí)施方案中，所述mAb包含人IgG恒定區(qū)。在實(shí)施方案中，所述mAb或其TF-Ag結(jié)合片段綴合至選自由化學(xué)治療藥物、毒素和放射性同位素組成的組中的試劑。在另一方面，本公開內(nèi)容包括用于預(yù)防和/或治療個(gè)體中的癌癥的方法，其中所述癌癥包含表達(dá)TF-Ag的癌細(xì)胞。所述方法包括向個(gè)體施用(給藥，administer)一種或多種如上所述的mAb或片段，其中所述個(gè)體中的癌細(xì)胞的生長、或存活、或轉(zhuǎn)移、或它們的組合在所述施用之后被抑制。在另一方面，提供了包含部分人源化mAb或其片段的藥物組合物。在另一方面，本公開內(nèi)容提供體外細(xì)胞培養(yǎng)物，其中該細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞表達(dá)所述部分人源化mAb或其片段。在另一方面，本公開內(nèi)容提供編碼所述mAb及其TF-Ag結(jié)合片段的多核苷酸序列，包含這樣的多核苷酸的表達(dá)載體和包含這樣的表達(dá)載體的體外細(xì)胞培養(yǎng)物。在實(shí)施方案中，所述mAb或其TF-Ag結(jié)合片段由多于一種的表達(dá)載體編碼。在實(shí)施方案中，提供了制備所述mAb及其TF-Ag結(jié)合片段的方法，并且通常包括在體外細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)所述mAb或TF-Ag結(jié)合片段、或它們的組合，和從所述細(xì)胞培養(yǎng)物分離所述mAb或TF-Ag結(jié)合片段、或它們的組合。還提供了包含所述mAb及其TF-Ag結(jié)合片段的試劑盒。附圖說明圖1提供了包含在本公開內(nèi)容中的JAA-F11重鏈可變區(qū)和三個(gè)VH變體區(qū)(H1、H2和H3)的氨基酸序列比對(duì)。黑體指示在JAA-F11和所設(shè)計(jì)的人源化H鏈之間的相同氨基酸；黑體和加陰影的氨基酸指示所設(shè)計(jì)的人源化鏈和小鼠JAA-F11之間的區(qū)別。以黑體和斜體顯示的在位置72的丙氨酸是被保留以避免空間位阻的小鼠殘基。互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)以斜體排列。編號(hào)根據(jù)Kabat系統(tǒng)。mJAAF11序列是SEQIDNO:17。H1序列是SEQIDNO:7；H2序列是SEQIDNO:8；H3序列是SEQIDNO:9。圖2描繪了mJAA-F11輕鏈可變區(qū)(JAA-F11VH)和三個(gè)VL變體區(qū)(L1、L2和L3)的氨基酸序列比對(duì)。黑體指示小鼠氨基酸或與小鼠序列相同的氨基酸，黑體和加陰影的氨基酸是所設(shè)計(jì)的人源化JAA-F11變體和小鼠JAA-F11之間的區(qū)別。以黑體和斜體顯示的在位置51的亮氨酸是被保留以避免空間位阻的小鼠殘基。mJAAF11序列是SEQIDNO:17。L1序列是SEQIDNO:10；L2序列是SEQIDNO:11；L3序列是SEQIDNO:12。圖3.通過ELISA利用mJAA-F11抑制來確定相對(duì)親和力以評(píng)估各個(gè)hJAA-F11和嵌合抗體與TF-Ag-BSA的結(jié)合。誤差棒代表±1標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖4.hJAA-F11、嵌合和小鼠JAA-F11(50μg/mL)與10個(gè)乳腺癌細(xì)胞系的結(jié)合。細(xì)胞系包括三陰性(HCC70、BT549、MDA-MB-231、MDA-MB-468、DU4475)、ER/PR-陽性(HCC1419、AU565、MDA-kb2)和HER2-陽性(CAMA-1、HCC1428)。對(duì)于以上測(cè)試的所有細(xì)胞系，與hJAA-F11、嵌合或小鼠JAA-F11(在50μg/mL)的結(jié)合顯著高于(p≤0.05)(學(xué)生T-檢驗(yàn))TF-Ag陰性對(duì)照骨髓瘤的那些。各個(gè)誤差棒代表±1標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖5.嵌合抗體和人源化JAA-F11抗體(除了H3L3)引起腫瘤細(xì)胞生長的小(～6-11％)但統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的抑制。沒有看到細(xì)胞增殖的增強(qiáng)。對(duì)于在2或1ug/ml的任何抗體都沒有看到顯著性結(jié)果。圖6A.小鼠、嵌合和4個(gè)hJAA-F11構(gòu)建體針對(duì)TF-Ag陽性人乳腺癌細(xì)胞系(BT549)的ADCC活性。結(jié)果呈現(xiàn)為相比于細(xì)胞的100％溶解在抗體處理的細(xì)胞中的百分比細(xì)胞溶解。在人細(xì)胞系中的所有情況下，H2L2和H3L3顯示比嵌合或小鼠抗體統(tǒng)計(jì)學(xué)更大的ADCC活性(p<0.05)。這是來自供體#1和供體#2的PBMC上的所有實(shí)驗(yàn)的代表性平均值(多于3個(gè)的獨(dú)立實(shí)驗(yàn))。誤差棒表示±1標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖6B.在來自供體#1的PBMC上，小鼠、嵌合和4個(gè)hJAA-F11構(gòu)建體針對(duì)TF-Ag陽性人乳腺癌細(xì)胞系(BT549)的ADCC活性。結(jié)果呈現(xiàn)為相比于細(xì)胞的100％溶解在抗體處理的細(xì)胞中的百分比細(xì)胞溶解。在人細(xì)胞系中的所有情況下，H2L2和H3L3顯示比嵌合或小鼠抗體統(tǒng)計(jì)學(xué)更大的ADCC活性(p<0.05)。這是至少3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。誤差棒表示±1標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖6C.在來自供體#2的PBMC上，小鼠、嵌合和4個(gè)hJAA-F11構(gòu)建體針對(duì)TF-Ag陽性人乳腺癌細(xì)胞系(BT549)的ADCC活性。結(jié)果呈現(xiàn)為相比于細(xì)胞的100％溶解在抗體處理的細(xì)胞中的百分比細(xì)胞溶解。在人細(xì)胞系中的所有情況下，H2L2和H3L3顯示比嵌合或小鼠抗體統(tǒng)計(jì)學(xué)更大的ADCC活性(p<0.05)。這是至少3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。誤差棒表示±1標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖6D.小鼠、嵌合和3個(gè)hJAA-F11構(gòu)建體針對(duì)4T1TF-Ag陽性小鼠乳腺癌細(xì)胞系的ADCC活性。結(jié)果呈現(xiàn)為相比于細(xì)胞的100％溶解在抗體處理的細(xì)胞中的百分比細(xì)胞溶解。H3L3和嵌合顯示比小鼠抗體統(tǒng)計(jì)學(xué)更大的ADCC活性(p<0.05)。誤差棒表示±1標(biāo)準(zhǔn)誤差。ADCC僅利用來自供體#3的PBMC進(jìn)行一次。圖7.人源化、嵌合和小鼠JAA-F11不誘導(dǎo)補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性(CDC)。測(cè)試了小鼠、嵌合和2個(gè)hJAA-F11構(gòu)建體針對(duì)人HCC1428乳腺癌細(xì)胞系的CDC活性。結(jié)果呈現(xiàn)為相比于細(xì)胞的100％溶解在抗體處理的細(xì)胞中的百分比細(xì)胞溶解。陽性對(duì)照：試劑盒中包括的LDH陽性細(xì)胞顯示溶解。誤差棒表示±1標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖8.小鼠、嵌合和4個(gè)hJAA-F11抗體利用酶免疫測(cè)定的內(nèi)化以測(cè)量表面結(jié)合。內(nèi)化通過在37℃或4℃用抗體孵育小鼠4T1乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行分析。如預(yù)期的，分布圖(pattern)與圖20中對(duì)于H3L3所示的ADCC分布圖相反，但對(duì)于H2L2是出乎意料的，其誘導(dǎo)ADCC并且內(nèi)化。小鼠、H2L2、嵌合Ab、H2L3和H1L1顯著性地內(nèi)化(p<0.05)。誤差棒表示±1標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖9.顯示hJAA-F11抗體在攜帶4T1腫瘤的小鼠中的免疫定位的MicroPET圖像。圖10.顯示游離124碘向在攜帶4T1腫瘤的小鼠中的甲狀腺的定位的MicroPET圖像。具體實(shí)施方式本公開內(nèi)容包括特異性地識(shí)別TF-Ag的不同的人源化單克隆抗體(mAb)及其片段、制備該mAb的方法和使用該mAb用于預(yù)防和/或治療目的的方法，以及用于診斷成像的方法。由本公開內(nèi)容提供的mAb的氨基酸序列利用新穎方式開發(fā)以改變以ATCCC目錄號(hào)CRL-2381保藏的雜交瘤所產(chǎn)生的mAb中的氨基酸序列，使得mAb的框架區(qū)以保持特異性和降低免疫原性的引導(dǎo)方式結(jié)合鼠類和人類免疫球蛋白(Ig)序列二者。所述雜交瘤產(chǎn)生稱為JAA-F11的mAb。在鼠類框架區(qū)的情形中引入到JAA-F11序列中的變化導(dǎo)致三個(gè)不同重和三個(gè)不同輕可變鏈的系綜物(ensemble)，這些鏈可以組合以產(chǎn)生二十五個(gè)不同的mAb，其適于抗擊各種各樣的癌癥(包含表達(dá)TF-Ag的癌細(xì)胞)中的任一種。此外，所述mAb具有所需的特性，使得它們特別適合于在個(gè)體中優(yōu)先誘導(dǎo)不同的抗癌機(jī)制。例如，取決于重鏈和輕鏈的選擇，本公開內(nèi)容包括提供用于刺激增強(qiáng)的抗體-依賴性細(xì)胞毒性或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性，或所述mAb的內(nèi)化。本公開內(nèi)容的實(shí)施方案包括來自JAA-F11mAb的CDR序列。這些是：VH鏈：CDR1：SGYTFTTYWMH；(SEQIDNO:1)；CDR2：FISPNTDYTEYNQKFRD；(SEQIDNO:2)；CDR3：RSFIGYNFDFWGQGT；(SEQIDNO:3)；和VL鏈：CDR1：CRSSQTIVYSNGNTYLEW；(SEQIDNO:4)；CDR2：KVSNRFSGVPD；(SEQIDNO:5)；和CDR3：CFQGSHVPFTGSG；(SEQIDNO:6)。CDR序列放置于修飾的框架序列的情形中。因而，所述mAb及其TF-Ag結(jié)合片段包含選自以下的重鏈：H1-EVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMHWVRQAPGQGLEWMGFISPNTDYTEYNQKFRDRVTMTADTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSFIGYNFDFWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:7)；H2-EVQLLESGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMHWVRQAPGQGLEWMGFISPNTDYTEYNQKFRDRVTLTADKSSSTAYMELSSLTSEDTAVYYCARSFIGYNFDFWGQGTTVTVSS(SEQIDNO:8)；H3-EVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMHWVKQAPGQGLEWIGFISPNTDYTEYNQKFRDKATMTADTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSFIGYNFDFWGQGTTLTVSS(SEQIDNO:9)和它們的組合；和選自由以下各項(xiàng)組成的組中的輕鏈：L1-DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQTIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK(SEQIDNO:10)；L2-DIVMTQTPLSLPVTLGQPASISCRSSQTIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK(SEQIDNO:11)；L3-DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQTIVYSNGNTYLEWYLQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK(SEQIDNO:12)和它們的組合。除了前述序列之外，以某些組合制備和測(cè)試以下重鏈和輕鏈：重鏈可變區(qū)H2a:QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYWMHWVRQAPGQGLEWMGFISPNTDYTEYNQKFRDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSFIGYNFDFWGQGTTVTVS(SEQIDNO:13)重鏈可變區(qū)H3a：EGQLLESGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTTYWMHWVKKRPGQGLEWIGFISPNTDYTEYNQKFRDKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSDDSAVYYCARSFIGYNFDFWGQGTTLTVSS(SEQIDNO:14)輕鏈可變區(qū)L2a：DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKVDIK(SEQIDNO:15)輕鏈可變區(qū)L3a：ELVMTQTPLSLPVNLGDQASISCRSSQTIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEADDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK(SEQIDNO:16).本公開內(nèi)容涵蓋包含包括前述序列或由前述序列組成的氨基酸序列的mAb及其TF-Ag結(jié)合片段。在實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容包括mAb及其TF-Ag結(jié)合片段，其中框架和CDR序列由以下各項(xiàng)組成：SEQIDNO:7，SEQIDNO:8，SEQIDNO:9，SEQIDNO:10，SEQIDNO:11，SEQIDNO:12，SEQNO:13，SEQIDNO:14，SEQIDNO:15和SEQIDNO:16。因此，以下25個(gè)重鏈和輕鏈組合被此公開內(nèi)容涵蓋：H1-L1；H1-L2；H1-L2a；H1-L3；H1-L3a；H2-L1；H2-L2；H2-L2a；H2-L3；H2-L3a；H3-L1；H3-L2；H3-L2a；H3-L3；H3-L3a；H2a-L1；H2a-L2；H2a-L2a；H2a-L3；H2a-L3a；H3a-L1；H3a-L2；H3a-L2a；H3a-L3；和H3a-L3a。在實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容包括包含H1L1、H2L2、H3L3、H2L3、H2a和L2a，以及H3a和L3a的組合的mAb及其TF-Ag結(jié)合片段。在此公開內(nèi)容中，除了對(duì)于以下描述的H和L鏈的組合的結(jié)果之外，還制備和測(cè)試了H2a-L2a和H3aL3a，并且對(duì)于這兩個(gè)組合的結(jié)果分別類似于對(duì)于H2-L2和H3-L3報(bào)告的那些結(jié)果。H2a-L2a和H3a-L3a組合作為亞克隆程序的結(jié)果制備，允許選擇對(duì)于TF-Ag具有進(jìn)一步增強(qiáng)的結(jié)合特性的額外亞克隆體(如通過在酶免疫測(cè)定(EIA)中的最高反應(yīng)性確定的)。這些之中，對(duì)于內(nèi)化最佳的是H2L2和H2aL2a，而對(duì)于ADCC最佳的是H2L2、H2aL2a、H3L3和H3aL3a。代表性的VH和VL序列經(jīng)由附圖1和2進(jìn)一步描述。具體地，圖1提供包括在此公開內(nèi)容中的JAA-F11重鏈可變區(qū)和三個(gè)VH變體區(qū)(H1、H2和H3)的氨基酸序列比對(duì)。黑體指示在JAA-F11和所設(shè)計(jì)的人源化H鏈之間的相同氨基酸；黑體和加陰影的氨基酸指示所設(shè)計(jì)的人源化鏈和小鼠JAA-F11之間的區(qū)別。以黑體和斜體顯示的在位置72的丙氨酸是被保留以避免空間位阻的小鼠殘基。CDR以斜體排列。編號(hào)根據(jù)Kabat系統(tǒng)。因此將理解，雖然本文中描述的mAb稱為“人源化”，但它們確實(shí)包含某些鼠類殘基，并且因此可以被認(rèn)為是部分人源化的。圖2描繪了mJAA-F11輕鏈可變區(qū)(JAA-F11VH)和三個(gè)VL變體區(qū)(L1、L2和L3)的氨基酸序列比對(duì)。黑體指示小鼠氨基酸或與小鼠序列相同的氨基酸，黑體和加陰影的氨基酸是所設(shè)計(jì)的人源化JAA-F11變體和小鼠JAA-F11之間的區(qū)別。以黑體和斜體顯示的在位置51的亮氨酸是被保留以避免空間位阻的小鼠殘基。根據(jù)圖1和2明顯的是，盡管本發(fā)明提供的人源化H和L鏈包括與JAA-F11小鼠抗體的區(qū)別和它們本身之間的區(qū)別，但是某些鼠類氨基酸已被保留以維持該人源化mAb的特異性。本文描述的人源化mAb的片段也包括在本發(fā)明中。合適的抗體片段的實(shí)例包括Fab、Fab'、F(ab')2、ScFv和Fv片段。多種技術(shù)已被開發(fā)用于生產(chǎn)抗體片段并且包括此公開內(nèi)容的范圍內(nèi)。在實(shí)施方案中，所述mAb或其片段經(jīng)由重組表達(dá)載體生產(chǎn)宿主細(xì)胞。本公開內(nèi)容包括編碼本文描述的氨基酸序列的所有多核苷酸序列、包含這樣的多核苷酸序列的表達(dá)載體和包含這樣的表達(dá)載體的體外細(xì)胞培養(yǎng)物。在實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物是真核細(xì)胞。在實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在實(shí)施方案中，細(xì)胞是CHO細(xì)胞。包含所述mAb和/或其TF-Ag結(jié)合片段的試劑盒、和/或表達(dá)所述mAb和/或其TF-Ag結(jié)合片段的細(xì)胞培養(yǎng)物由此公開內(nèi)容提供。通常，試劑盒包括一個(gè)以上容納所述mAb和/或其TF-Ag結(jié)合片段、或表達(dá)它們的細(xì)胞的密封容器。使用所述mAb和/或TF-Ag結(jié)合片段用于治療和/或成像目的說明書可以包括在試劑盒中。在實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容包括制備所述mAb或其TF-Ag結(jié)合片段的方法，包括培養(yǎng)包含表達(dá)載體或編碼所述mAb或其TF-Ag結(jié)合片段的其它多核苷酸序列的細(xì)胞，允許所述mAb或其TF-Ag結(jié)合片段表達(dá)，和從細(xì)胞培養(yǎng)物分離所述mAb或其TF-Ag結(jié)合片段。編碼所述mAb或其TF-Ag結(jié)合片段的核苷酸序列可以利用任何合適的表達(dá)載體表達(dá)，許多表達(dá)載體在本領(lǐng)域是已知的和/或可商購獲得。在一個(gè)實(shí)施方案中，重鏈和輕鏈在單個(gè)表達(dá)載體如質(zhì)粒上表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重鏈和輕鏈在同一細(xì)胞中的不同質(zhì)粒上表達(dá)，之后該表達(dá)的重鏈和輕鏈形成常規(guī)mAb結(jié)構(gòu)。得益于本公開內(nèi)容，所述mAb或其TF-Ag結(jié)合片段可以利用常規(guī)技術(shù)分離和/或純化。在另一方面，本公開內(nèi)容提供了抑制個(gè)體中的癌細(xì)胞的生長和/或抑制個(gè)體中的癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移的方法，該癌細(xì)胞表達(dá)TF-Ag分子。所述方法包括向個(gè)體施用治療量的人源化mAb和/或其片段，其中所述施用抑制表達(dá)TF-Ag的癌細(xì)胞的生長和/或抑制其轉(zhuǎn)移。在實(shí)施方案中，實(shí)施本發(fā)明的方法減小了腫瘤的體積，和/或減少了轉(zhuǎn)移灶或繼發(fā)腫瘤的形成。在實(shí)施方案中，所述方法對(duì)需要其的個(gè)體提供。在實(shí)施方案中，有需要的個(gè)體已被診斷患有或被懷疑具有發(fā)展或癌癥復(fù)發(fā)或者處于發(fā)展或具有癌癥復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。在實(shí)施方案中，使用治療有效量的mAb或其TF-Ag結(jié)合片段。如本文使用的，術(shù)語“治療有效”意指施用的mAb或其TF-Ag結(jié)合片段的量為足以抑制TF+癌細(xì)胞的生長、存活和/或轉(zhuǎn)移的量。在多個(gè)實(shí)施方案中，人源化mAb和/或其片段可以綴合至化學(xué)治療劑以能夠經(jīng)由結(jié)合至表達(dá)TF-Ag的細(xì)胞將該化學(xué)治療劑定位至癌細(xì)胞。在這樣的抗體綴合物的產(chǎn)生中可用的化學(xué)治療劑包括酶活性毒素及其片段。合適的酶活性毒素包括白喉A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌)、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α八疊球菌、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻風(fēng)樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制劑、白樹毒素、邁托毒素、局限曲霉素、酚霉素、新霉素和單端孢霉烯?；瘜W(xué)治療劑可以通過任何合適的化學(xué)綴合方式共價(jià)地連接至所述mAb或其TF-Ag結(jié)合片段。在實(shí)施方案中，化學(xué)治療劑可以包含具有所述mAb或TF-Ag結(jié)合片段的融合蛋白的節(jié)段。在另一方面，本公開內(nèi)容提供了用于在個(gè)體中鑒別轉(zhuǎn)移灶、腫瘤或其組合的方法，其中所述轉(zhuǎn)移灶或腫瘤包含表達(dá)TF-Ag的細(xì)胞。所述方法包括以下步驟：向個(gè)體施用人源化mAb和/或其片段，其中人源化mAb和/或其片段已被綴合至可檢測(cè)標(biāo)記，和檢測(cè)所述可檢測(cè)標(biāo)記以鑒別轉(zhuǎn)移灶、腫瘤或其組合。因此，可將人源化mAb和/或其片段開綴合至可檢測(cè)標(biāo)記如放射活性劑。各種各樣的放射活性同位素可用于綴合至JAA-F11mAb，使得JAA-F11mAb結(jié)合的細(xì)胞可以被成像或選擇性地破壞。對(duì)于表達(dá)TF-Ag的細(xì)胞的選擇性破壞，JAA-F11mAb可以綴合至高度放射活性原子如In111、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212以及Lu的放射活性同位素。當(dāng)人源化mAb和/或其片段用于鑒別轉(zhuǎn)移灶中或腫瘤中表達(dá)TF-Ag的細(xì)胞時(shí)，它們可以包含用于核素研究的放射活性原子例如Tc99m(亞穩(wěn)锝-99)、I123，或者用于核磁共振(NMR)成像(也稱為磁共振成像或“MRI”)的自旋標(biāo)記，如I123、I131、I124、F19、C13、N15、O17或釓(III)或錳(II)。標(biāo)記的人源化mAb和/或其片段可以注射入被診斷患有或懷疑具有轉(zhuǎn)移性疾病的患者中以鑒別轉(zhuǎn)移灶和/或腫瘤。來自這樣的成像的信息可以用于患者的疾病狀態(tài)的診斷或分期。使用的標(biāo)記可以根據(jù)要使用的成像系統(tǒng)進(jìn)行選擇。例如，銦111、锝99或碘131可以用于平面掃描或單光子發(fā)射計(jì)算斷層攝像(SPECT)。發(fā)射正電子的標(biāo)記如氟19、碘123和碘124可以用于正電子發(fā)射斷層造影術(shù)。順磁離子如釓(III)或錳(II)可以用于磁共振成像(MRI)。標(biāo)記在個(gè)體的特定組織內(nèi)的定位允許包含表達(dá)TF-Ag的細(xì)胞的轉(zhuǎn)移灶或腫瘤的定位。在特定位置大于背景的標(biāo)記的濃度允許鑒別轉(zhuǎn)移細(xì)胞的存在。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在施用標(biāo)記的人源化mAb和/或其片段之后，允許合適時(shí)間期過去使得未結(jié)合的人源化mAb和/或其片段從個(gè)體被清除，使得背景標(biāo)記大大地減少。包含綴合或未綴合的人源化mAb和/或其片段的治療制劑可以通過與藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(雷明頓制藥科學(xué)第16版Osol，A.Ed.(1980))混合，以凍干制劑或水溶液的形式制備。可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度下對(duì)受體無毒，并且包括緩沖液如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化六烴季銨；氯化苯甲烴銨；芐索氯銨；苯酚，丁醇或芐醇；對(duì)羥基苯甲酸烷基酯如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲苯酚)；低分子量(小于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、白明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它糖類，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽反離子如鈉；金屬復(fù)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。人源化mAb和/或其片段可以與藥物組合物中的其它化學(xué)治療劑組合。所述人源化mAb和/或其TF-結(jié)合片段可以通過任何合適方式施用，包括腸胃外、皮下、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)和鼻內(nèi)。腸胃外輸注包括肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、淋巴管內(nèi)或皮下施用。另外，人源化mAb和/或其片段可以合適地通過脈沖輸注，例如在減少抗體劑量的情況下施用。優(yōu)選地，用藥通過注射，最優(yōu)選靜脈內(nèi)或皮下注射給予，這部分地取決于施用是否短暫或漫長。在某些實(shí)施方案中，人源化mAb和/或其片段施用至被診斷患有或懷疑具有乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌或其它TFAg+癌的個(gè)體以抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移或抑制其生長。也可以施用其它化合物如化學(xué)治療劑、免疫抑制劑和/或細(xì)胞因子。聯(lián)合施用可以包括同時(shí)施用，使用單獨(dú)的制劑或單個(gè)藥物制劑，并且還可以包括以任意順序的連續(xù)施用，其中優(yōu)選地在兩種(或所有)活性劑同時(shí)地發(fā)揮它們的生物活性期間存在一個(gè)時(shí)間期。人源化mAb和/或其片段可以根據(jù)前述治療方法以足以抑制表達(dá)TF-Ag的細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和/或生長的量施用至人或其它動(dòng)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的形式和特性由與其要組合的活性成分的量、施用途徑和其它熟知變量如個(gè)體大小和疾病階段支配。實(shí)施例1以下實(shí)施例描述了制備和使用此公開內(nèi)容的人源化mAb，以及所述mAb的物理和功能性質(zhì)。人源化JAA-F11的設(shè)計(jì)和構(gòu)建在驗(yàn)證小鼠JAA-F11可變區(qū)的序列之后，定義CDR以保持對(duì)于TF-Ag的特異性和親和力。包含的CDR分別基于序列和結(jié)構(gòu)變化性根據(jù)Kabat等[139]和Chothia等[141]二者定義。如果兩個(gè)氨基酸含有一對(duì)分隔開以下的原子，則認(rèn)為它們二者在蛋白結(jié)構(gòu)中彼此接觸[138]。關(guān)于小鼠JAA-F11的X射線晶體學(xué)和計(jì)算碳水化合物線程研究[142]鑒別出在距離結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)的氨基酸殘基。這些氨基酸以及對(duì)于構(gòu)象結(jié)構(gòu)重要的在輕鏈的位置L23和L88處的兩個(gè)半胱氨酸殘基包括在JAA-F11人源化中使用的CDR的最后包容性定義中。人類框架的選擇應(yīng)用三種不同方式來選擇用于重鏈和輕鏈JAAF11可變區(qū)鏈的人類受體抗體框架。設(shè)計(jì)了重鏈的三個(gè)變體(H1、H2、H3)和輕鏈的3個(gè)變體(L1、L2、L3)。所述3個(gè)重鏈(VH)中的任一個(gè)可以與所述3個(gè)輕鏈(VL)中的任一個(gè)配對(duì)以生成總計(jì)9個(gè)可能的hJAA-F11VH/VL組合變體。為了生成這些變體，單獨(dú)地進(jìn)行BLAST檢索，以針對(duì)人類免疫球蛋白序列比較mJAA-F11(小鼠抗體)的VH和VL序列。使用Seaview序列比對(duì)程序，將前10個(gè)最同源的人類VH和VL序列與mJAA-F11的對(duì)應(yīng)可變區(qū)進(jìn)行比對(duì)。對(duì)于第一個(gè)變體H1和L1，框架區(qū)的氨基酸序列基于在前10個(gè)最同源的人類IgG可變序列中的各個(gè)位置處最經(jīng)?？吹降陌被徇M(jìn)行選擇。對(duì)于變體H2和L2，框架區(qū)的氨基酸序列按如下進(jìn)行選擇：如果在前10個(gè)人類序列的任一個(gè)中的氨基酸與小鼠免疫球蛋白中的對(duì)應(yīng)氨基酸匹配，則選擇該氨基酸，在剩余位置中，選擇在人類序列中最經(jīng)常看到的氨基酸。對(duì)于第三個(gè)變體H3和L3，框架區(qū)的氨基酸序列在各個(gè)CDR的任一側(cè)上含有3個(gè)小鼠氨基酸，而該序列的剩余部分由在前10個(gè)人類序列中最經(jīng)?？吹降陌被峤M成。還構(gòu)建了嵌合JAA-F11，其由連接至人類恒定區(qū)的整個(gè)小鼠JAA-F11可變區(qū)構(gòu)成。制備該嵌合體以驗(yàn)證正確的小鼠可變區(qū)已被克隆和測(cè)序并且還在評(píng)價(jià)人源化JAA-F11抗體時(shí)用作陽性對(duì)照。預(yù)期該嵌合體保持與小鼠JAA-F11相同的結(jié)合特性，同時(shí)具有人類恒定區(qū)。hJAA-F11的模型的評(píng)估對(duì)最初提出的hJAA-F11構(gòu)建體評(píng)估對(duì)結(jié)合位點(diǎn)的構(gòu)象影響。三個(gè)重鏈變體(H1、H2、H3)在位置72處具有對(duì)于丙氨酸的精氨酸的替代，其可以潛在地引起與周圍氨基酸的嚴(yán)重空間相互作用。對(duì)于輕鏈變體(L1、L2、L3)，在位置51的亮氨酸被精氨酸替代，這可以導(dǎo)致與周圍氨基酸側(cè)鏈的空間位阻。該精氨酸殘基被移除并被原始小鼠JAA-F11框架殘基丙氨酸72(VH)和亮氨酸51(VL)替代，如圖1和2所示。小鼠JAA-F11重鏈和輕鏈可變氨基酸序列與hJAA-F11構(gòu)建體之間的比對(duì)比較如圖1和2所示。當(dāng)相比于其它H和L序列時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員還將識(shí)別在H2a、H3a、L2a和L3a中提供的氨基酸序列中的不同。hJAA-F11變體的免疫原性預(yù)測(cè)利用我們的人源化變體(CDR移植的)的T20評(píng)分預(yù)測(cè)的免疫原性被預(yù)測(cè)為極低(表1)。使用T20評(píng)分來測(cè)量單克隆抗體可變區(qū)序列的“人性”。這種評(píng)分系統(tǒng)由Gao等人開發(fā)[Monoclonalantibodyhumannessscoreanditsapplications.2013.BMCBiotechnology，13:55]，利用超過38,000個(gè)人類抗體序列的數(shù)據(jù)庫。在這種方法中，進(jìn)行此數(shù)據(jù)庫的蛋白質(zhì)BLAST并且試驗(yàn)人源化Ab針對(duì)這些人類序列進(jìn)行比較。將人源化抗體與前20個(gè)人類AbBLAST匹配進(jìn)行比較并且對(duì)與這些序列的相似性進(jìn)行評(píng)分。最高的可能評(píng)分為100(與人類最相似的)。當(dāng)Gao等人在已在臨床上用于人類的超過90個(gè)抗體上測(cè)試此免疫原性評(píng)分方法，并且發(fā)現(xiàn)具有高于80的FR&CDR的T20評(píng)分的抗體不是免疫原性的，同時(shí)僅對(duì)于FR序列的T20評(píng)分(其高于85)不是免疫原性的時(shí)，證實(shí)了此方法有效。利用當(dāng)前hJAA-F11變體的T20值，在患者中預(yù)期了極低的免疫原性。這證實(shí)該CDR-移植的抗體更加人性并且預(yù)期比嵌合體是更低免疫原性的，H1L1變體是CDR-移植的變體中最具人性的，并且所有hJAA-F11變體被預(yù)期具有低的免于原性。表1.hJAA-F11構(gòu)建體的免疫原性的評(píng)估。*對(duì)于FR和CDR序列，評(píng)分>80在人類不是免疫原性的。**僅對(duì)于FR序列，評(píng)分>85在人類不是免疫原性的。人源化和嵌合JAA-F11變體的表達(dá)和生產(chǎn)將hJAA-F11與嵌合的VH和VL基因克隆入兩個(gè)不同的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，其分別含有人IgG1重鏈恒定區(qū)(6307pAH)和人κ輕鏈恒定區(qū)(6714pAN)以生產(chǎn)含有完整IgG1和κ基因的質(zhì)粒。正確的序列以及在6307pAH和6714pAN表達(dá)載體中的克隆VH和VL區(qū)各自的取向通過測(cè)序確認(rèn)。在將兩個(gè)載體穩(wěn)定共轉(zhuǎn)染入CHO-K1細(xì)胞之后，利用抗生素G418和嵌合或hJAA-F11的表達(dá)，基于新霉素抗性，選擇表達(dá)hJAA-F11或嵌合體的穩(wěn)定克隆體。hJAA-F11候選物的篩選如利用已形成技術(shù)，使用用于抗-TF-Ag抗體的ELISA進(jìn)行。來自對(duì)TF-Ag顯示最高反應(yīng)性的各個(gè)人源化JAA-F11H/L組合變體和嵌合JAA-F11的共轉(zhuǎn)染的克隆體被選擇用于如本文所述的表征。人源化JAA-F11構(gòu)建體和嵌合JAA-F11個(gè)體地通過蛋白A柱色譜從培養(yǎng)上清而被純化。已經(jīng)生產(chǎn)了嵌合抗體以及H1L1、H2L2、H3L3和H2L3、H2aL3a和H3aL3a。在獲益于本公開內(nèi)容下，技術(shù)人員可以容易地生產(chǎn)涵蓋在本發(fā)明中的剩余抗體H和L鏈組合。通過聚糖陣列的化學(xué)特異性分析在初始篩選之后，利用功能糖組學(xué)協(xié)會(huì)的聚糖陣列確定hJAA-F11和嵌合JAA-F11變體的化學(xué)特異性。將這些數(shù)據(jù)與對(duì)于小鼠JAA-F11獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。聚糖陣列分析是一種間接免疫熒光法以確定凝集素和抗體的聚糖結(jié)合反應(yīng)性。利用早期聚糖陣列來證實(shí)小鼠JAA-F11的化學(xué)特異性。利用這種方法在610個(gè)不同聚糖下來分析抗體候選物的反應(yīng)性。hJAA-F11、H1L1、H2L2、H3L3和嵌合抗體顯示與小鼠抗體相同的良好的結(jié)合特異性，包括與Galβ1-3GalNAc-α(TF-Ag)連接結(jié)構(gòu)的結(jié)合的限制，以及與α2-3唾液酸化結(jié)構(gòu)的結(jié)合的缺乏。聚糖陣列顯示在610個(gè)聚糖之中，人源化抗體、嵌合和小鼠JAA-F11僅結(jié)合TF-Ag和四個(gè)其它含有TF-Ag的糖結(jié)構(gòu)。所測(cè)試的440或610糖之中，小鼠JAA-F11、嵌合和hJAA-F11構(gòu)建體結(jié)合的四個(gè)另外的糖對(duì)于用JAA-F11的腫瘤靶向應(yīng)該不是生物學(xué)有問題的。Neu5Acα2-6(Galβ1-3GalNAcβ、GlcNAcβ1-6(Galβ1-3)GalNAcβ和Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-3)GalNAcβ未取代的僅在分泌流體、癌癥或其它疾病狀態(tài)中發(fā)現(xiàn)。Neu5Acβ2-6Galβ1-3GalNAc不是天然結(jié)構(gòu)并且不在人類中。當(dāng)相比于嵌合和小鼠抗體時(shí)，人源化JAA-F11構(gòu)建體的特異性看起來相同或甚至提高。例如，H2L3顯示在任何添加至TF-Ag下的統(tǒng)計(jì)學(xué)(p<0.05，通過ANOVA)更少結(jié)合，并且H1L1和H2L2不允許二糖被添加至GalNAc的C-6羥基，且這與其它抗體是統(tǒng)計(jì)學(xué)不同的(p<0.05)。與陣列上超過600個(gè)負(fù)糖的結(jié)合的缺乏表明對(duì)于所有這些抗體的可能的靶向能力。不結(jié)合的密切相關(guān)糖類的重要實(shí)例是Galβ1-3GalNAc-β連接結(jié)構(gòu)，表明所述抗體將結(jié)合至腫瘤組織并且不結(jié)合至中樞神經(jīng)系統(tǒng)GM1神經(jīng)節(jié)苷脂、NK細(xì)胞的無唾液酸-GM1、糖脂的GD1或至外周神經(jīng)組織的無唾液酸GM1(這些是β-連接的)。熟知的TF-Ag在正常組織上的伸長通過β1-3N-乙?；咸前坊?轉(zhuǎn)移酶在Gal上添加GlcNAcβ1-3形成GlcNAcβ1-3Galβ1-3GalNAcα-Sp8，或通過2-3唾液酸轉(zhuǎn)移酶形成Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAc(唾液酸-TF)或利用第二唾液酸轉(zhuǎn)移酶形成Neu5Ac2-3Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAc(二唾液酸-TF)進(jìn)行，所有這些不結(jié)合小鼠、嵌合或人源化JAA-F11。因此對(duì)于JAA-F11或hJAA-F11構(gòu)建體，不預(yù)期正常組織結(jié)合。相對(duì)親和力分析四種hJAA-F11和嵌合抗體與TF-Ag的相對(duì)結(jié)合親和力通過比較小鼠抗體在酶免疫測(cè)定中與人源化抗體競爭的能力來確定。在此測(cè)定中，將3μg的各個(gè)人源化Ab與小鼠抗TF-Ag抗體(mJAA-F11)的系列稀釋液混合。人抗-TF-Ag與TF-Ag涂覆板的結(jié)合利用特異性抗-人IgG物種測(cè)量。將用來抑制1μg的hJAA-F11至50％所需的小鼠mJAA-F11的量外推并用作相對(duì)親和力的量度。用于抑制所需的小鼠抗體的量越高，抗體的相對(duì)親和力越高。結(jié)果概括在圖3以及表2和3中。表2顯示由不同抗體與1μg的此人源化抗體競爭所需的小鼠JAA-F11的半數(shù)最大抑制濃度(IC50)。H2L2顯示在抗體中對(duì)TF-Ag具有最高相對(duì)親和力，小鼠抗體的IC50為2.31μg。表7顯示針對(duì)彼此ANOVA–Tukey事后檢驗(yàn)對(duì)于各個(gè)抗體計(jì)算的p-值?？梢钥闯?，當(dāng)相比于hJAA-F11和嵌合抗體的每一個(gè)(除了H2L3，其中其達(dá)到顯著性(p＝0.057))，H2L2抗體的這種提高的親和力差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的(p<0.05)(表3)。H2L3與H1L1、H2L2、H3L3和嵌合抗體不是顯著性地不同的。H1L1、H3L3和嵌合抗體的相對(duì)親和力彼此不是顯著性不同的。表2.hJAA-F11和嵌合JAA-F11抗體對(duì)于TF-Ag的相對(duì)親和力a顯示三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±1SD。表3.對(duì)重復(fù)的IC50測(cè)定進(jìn)行ANOVA分析以比較不同抗體的IC50之間的差異。P<0.05顯著性的(加陰影的).P-值(Tukey)H2L2H2L3H3L3H1L1H2L20.0570.0020.00H2L30.0570.3300.071H3L30.0020.330.908H1L10.000.0710.908嵌合體0.000.0930.9481.00hJAA-F11的生物反應(yīng)性、特異性和活性的分析3hJAA-F11和嵌合JAA-F11抗體結(jié)合至人腫瘤細(xì)胞系。hJAA-F11和嵌合JAA-F11抗體與多種人乳腺腫瘤細(xì)胞系的結(jié)合利用全細(xì)胞ELISA評(píng)估。TF-Ag陽性小鼠哺乳動(dòng)物腫瘤4T1細(xì)胞系用作陽性對(duì)照而P3-X63-Ag8骨髓瘤細(xì)胞系用作TF-Ag陰性對(duì)照。在不同的三天進(jìn)行測(cè)定并利用對(duì)照細(xì)胞系一次一式四份地測(cè)定3至4中細(xì)胞系。如果由于hJAA-F11或嵌合JAA-F11(在50μg/mL)所致的相對(duì)結(jié)合顯著高于(p≤0.05)TF-Ag陰性對(duì)照骨髓瘤的相對(duì)結(jié)合，則認(rèn)為該細(xì)胞系是陽性的。結(jié)果顯示在圖4中。測(cè)試的癌細(xì)胞系由乳腺癌的不同亞組(激素受體陽性或陰性、Her2-陽性或陰性和三陰性)組成。測(cè)試的雌激素受體(ER)和孕酮受體(PR)陽性細(xì)胞系是CAMA-1和HCC-1428。測(cè)試了兩個(gè)Her2/neu受體陽性細(xì)胞系HCC-1419和AU-565。測(cè)試的三陰性乳腺癌(TNBC)細(xì)胞系是HCC-70、MDA-MB-231、MDA-MB-468、DU-4475和BT-549。一個(gè)細(xì)胞系MDA-kb2表達(dá)雄激素受體但是雌激素受體陰性的。這些乳腺癌細(xì)胞系之前已使用小鼠JAA-F11考察并且全部對(duì)于TF-Ag表達(dá)是陽性的。在此公開內(nèi)容中，結(jié)果顯示hJAA-F11和嵌合JAA-F11抗體結(jié)合至考察的全部10個(gè)乳腺癌細(xì)胞系，確認(rèn)TF-Ag在這些細(xì)胞系上的表達(dá)。在不同乳腺癌亞組之中，目前還沒有用于治療TNBC患者的靶向療法。獲得的數(shù)據(jù)表明TF-Ag在靶向侵襲性TNBC的治療作用以及hJAA-F11抗體治療和增加乳腺癌患者的存活(而不管受體狀態(tài))的用途。表4概述了乳腺癌的類型以及所測(cè)試的各個(gè)細(xì)胞系的TF-Ag的表達(dá)。表4.在全細(xì)胞ELISA中測(cè)試的乳腺癌細(xì)胞系的表格。表格顯示了激素受體、Her2/neu受體和TF-Ag的表達(dá)。三陰性(黑體)、ER/PR陽性(斜體)和HER2-陽性(黑體且斜體)。MDA-kb2*對(duì)于雌激素受體是陰性的但表達(dá)雄激素受體。細(xì)胞系雌激素受體孕酮受體Her2/neu受體TF-Ag表達(dá)HCC-70---+BT-549---+MDA-MB-231---+MDA-MB-468---+DU-4475---+CAMA-1++-+HCC-1428++-+HCC-1419--++AU565--++MDA-kb2*---+人源化JAA-F11在體外抑制癌細(xì)胞的增殖由于一些抗-TF-Ag抗體已顯示引起腫瘤細(xì)胞增殖，所以確定不同構(gòu)建體對(duì)細(xì)胞增殖的影響很重要。選取測(cè)量代謝活性的MTT測(cè)定作為用于氚標(biāo)記的胸腺嘧啶脫氧核苷直接增殖測(cè)定的代用品。相比于沒有抗體的對(duì)照，人源化、嵌合和小鼠JAA-F11抗體對(duì)癌細(xì)胞生長的影響通過已知的方法在4ug/ml的抗體得到確定。數(shù)據(jù)顯示在圖5中。嵌合抗體和人源化JAA-F11抗體(除了H3L3)引起了腫瘤細(xì)胞生長的小(～6-11％)但統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性抑制。沒有看到細(xì)胞增殖的增強(qiáng)。人源化JAA-F11誘導(dǎo)ADCC在以下改變下根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，基于乳酸脫氫酶(LDH)釋放測(cè)定，利用CytoTox96(非放射活性細(xì)胞毒性測(cè)定；Promega，Madison，WI)，在人乳腺腫瘤細(xì)胞系上進(jìn)行抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)。從EDTA抗-凝固全血分離新鮮人外周血單核細(xì)胞用于以效應(yīng)器與靶標(biāo)比率為100:1與人源化抗體和4T1小鼠乳腺癌細(xì)胞一起使用。利用LDH的釋放來定量細(xì)胞毒性。圖6A顯示在人乳腺癌細(xì)胞系BT549上比較的由小鼠、嵌合、H1L1和H3L3抗體促進(jìn)的ADCC的量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)多于三次。在所有實(shí)驗(yàn)中，H2L2和H3L3顯示比人細(xì)胞系中的嵌合或小鼠抗體顯著更大的(p<0.5)ADCC。超過20％的帶有TF-Ag的BT549和HCC70靶細(xì)胞由在200μg/mL的H2L2和H3L3抗體以100:1效應(yīng)器對(duì)靶標(biāo)(E:T)比率溶解。同樣，在小鼠4T1細(xì)胞系上的所有實(shí)驗(yàn)中，盡管測(cè)試的所有抗體誘導(dǎo)小于10％的ADCC，但H3L3抗體顯示比嵌合或小鼠抗體顯著更大的(p<0.05)ADCC。這表明當(dāng)前H2L2和H3L3抗體對(duì)于免疫治療是最佳選擇。相反，小鼠JAA-F11在任何試驗(yàn)中都不顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的ADCC能力。來自三個(gè)單個(gè)PBMC供體的ADCC結(jié)果顯示在圖6B、6C和6D中。人源化JAA-F11不誘導(dǎo)CDC使用人乳腺癌細(xì)胞HCC-1428細(xì)胞作為靶細(xì)胞，通過乳酸脫氫酶(LDH)釋放測(cè)定來確定hJAA-F11和嵌合抗體介導(dǎo)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)的能力。提供有試劑盒的LDH陽性對(duì)照用作陽性對(duì)照并顯示溶解。小鼠JAA-F11、嵌合體、H1L1、H3L3、H2L3抗體不誘導(dǎo)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性，因?yàn)闆]有發(fā)現(xiàn)溶解，如圖7中所示。人源化JAA-F11內(nèi)化入癌細(xì)胞人源化和嵌合JAA-F11到4T1乳腺腫瘤細(xì)胞中的內(nèi)化通過兩種方法確定，即利用在將細(xì)胞在4℃或37℃孵育之后測(cè)量和比較表面結(jié)合的酶免疫測(cè)定，和利用LAMP-1(溶酶體相關(guān)膜蛋白，一種溶酶體標(biāo)記物)和用于核染色的DAPI染色的免疫熒光顯微鏡法。在酶免疫測(cè)定中，如圖8所示，小鼠、H2L2、嵌合體、H2L3和H1L1抗體顯著地內(nèi)化，具有的p-值分別為0.001、0.002、0.001、0.002和0.014。然而，H3L3抗體沒有顯示顯著內(nèi)化(p＝0.16)并且這是預(yù)期的，因?yàn)镠3L3顯示比嵌合或小鼠JAA-F11顯著更大的(p<0.5)ADCC。在免疫熒光實(shí)驗(yàn)中，與酶免疫測(cè)定一致，小鼠、嵌合、H2L2、H2L3抗體顯示內(nèi)化并且與LAMP-1和H3L3的共定位顯示沒有內(nèi)化的膜染色。此數(shù)據(jù)證實(shí)了利用表面酶免疫測(cè)定獲得的結(jié)果。將預(yù)期，顯示較高ADCC活性的抗體將顯示較低的內(nèi)化，因?yàn)榧?xì)胞表面上的抗體存在對(duì)于ADCC功能是需要的。內(nèi)化測(cè)定已在hJAA-F11、嵌合體和mJAA-F11上進(jìn)行。H3L3顯示與此預(yù)期的一致，具有低量的內(nèi)化但相對(duì)高的ADCC。H1L1、H2L3、嵌合體和mJAA-F11都顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性內(nèi)化并且沒有良好進(jìn)行ADCC。對(duì)于HEL2抗體觀察到未預(yù)期的結(jié)果，其類似于H3L3誘導(dǎo)高ADCC，但相比于嵌合體和其它人源化抗體顯示最高的內(nèi)化百分比活性。免疫熒光內(nèi)化實(shí)驗(yàn)開始使用5μg/mL的抗體進(jìn)行并使用在0.1μg/ml的抗體濃度重復(fù)，內(nèi)化的抗體甚至在此低濃度如此做。以上數(shù)據(jù)表明，由于高百分比的內(nèi)化，以及此內(nèi)化的快速速率，所以嵌合體、H2L2和H2L3構(gòu)建體具有被用作抗體-藥物綴合物的潛能。聚糖特異性、相對(duì)親和力/內(nèi)化、ADCC和CDC數(shù)據(jù)概括在下表5中。表5.小鼠、人源化和嵌合JAA-F11的內(nèi)化、ADCC和聚糖特異性的概括。MicroPET成像MicroPET成像在一只小鼠上系列地進(jìn)行，各個(gè)小鼠注射有124碘-hJAA-F11H2L2抗體以及游離124碘。在24、48、72、96、168和192小時(shí)進(jìn)行成像。圖9顯示在不同時(shí)間點(diǎn)注射有124碘-hJAA-F11H2L2抗體的小鼠的冠狀圖，而圖10是注射游離124碘的對(duì)照小鼠。放射標(biāo)記的抗體由腫瘤的攝取在注射后24/48/72和96小時(shí)進(jìn)行觀察?？贵w的攝取還在48小時(shí)在脾臟中看到(圖9)。帶有4T1TF-Ag陽性腫瘤的陰性對(duì)照小鼠(其僅接受游離124碘)顯示，在整個(gè)研究中，除了定位至甲狀腺，沒有定位至任何器官或腫瘤(圖10)。完全鼠類JAA-F11對(duì)于乳腺癌患者中的被動(dòng)體液免疫療法和藥物綴合物療法具有潛力。然而，由于在人中小鼠抗體的使用已顯示受人抗-鼠類抗體(HAMA)響應(yīng)的形成和患者體內(nèi)短暫半衰期的限制，所以人源化是期望的以降低小鼠JAA-F11抗體的免疫原性而且還允許其在循環(huán)中保持較長時(shí)間。從前述結(jié)果的描述將認(rèn)識(shí)到，此公開內(nèi)容尤其提供了一種用于小鼠JAA-F11mAb的人源化以及在小鼠、嵌合和人源化JAA-F11抗體之間的比較和對(duì)比的新方式。mJAA-F11部分地通過CDR移植人源化。如將有本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到的，傳統(tǒng)上，通過CDR移植的人源化利用單個(gè)人抗體受體框架[Jones等人.Replacingthecomplementarity-determiningregionsinahumanantibodywiththosefromamouse.1986.Nature321：522–525]。因此，人框架序列選自現(xiàn)有人胚系基因。相反，在本公開內(nèi)容中，使用三種新的且不同的方式來選擇人受體抗體框架，用于重鏈和輕鏈JAAF11可變區(qū)鏈，產(chǎn)生重鏈的三個(gè)變體(H1、H2、H3)和輕鏈的三個(gè)變體(L1、L2、L3)。如以上討論的，三個(gè)重鏈中的任一個(gè)(VH)可以與3個(gè)輕鏈中的任一個(gè)(VL)配對(duì)而生成總計(jì)9個(gè)可能的hJAA-F11VH/VL組合變體。還產(chǎn)生了具有完全小鼠可變區(qū)以及人IgG1和κ恒定區(qū)的嵌合JAA-F11，并用作對(duì)照。一個(gè)問題是在定義CDR和FR區(qū)中使用的方式是否將降低人源化抗體的免疫原性。使用由Gao等人開發(fā)[Monocolonalantibodyhumannessscoreanditsapplications.2013.BMCBiotechnology，13:55]且用已經(jīng)在患者中應(yīng)用的90個(gè)抗體的分析驗(yàn)證的T20評(píng)分方法來預(yù)測(cè)人源化JAA-F11變體的免疫原性。人源化JAA-F11變體的T20評(píng)分全都高于(被提高)(>85)嵌合JAA-F11(<85)，表明重和輕可變鏈通過所有三種本發(fā)明方法的人源化生成將比嵌合變體更低免疫原性的hJAA-F11變體。我們?nèi)嗽椿∈驤AA-F11并且五個(gè)抗體已使用CHO-K1細(xì)胞生產(chǎn)，嵌合體和4個(gè)hJAA-F11構(gòu)建體H1L1、H2L2、H3L3和H2L3。因此，在獲益于本公開內(nèi)容下，技術(shù)人員可以制備任何可用的其它四種可能的VH和VL組合。通過CDR移植的抗體人源化可以引起親和力下降或者抗原結(jié)合的喪失，這可能是由于CDR構(gòu)象和抗原結(jié)合位點(diǎn)受人源化抗體中的一些框架氨基酸殘基的變化負(fù)面影響所致。CDR由與框架區(qū)和其它CDR相互作用的殘基組成。除了CDR氨基酸與順序地附近的氨基酸的相互作用之外，可以直接或間接影響抗原結(jié)合的一些框架殘基包括Vernier區(qū)域殘基和在VL/VH界面處的殘基。Vernier區(qū)殘基是在CDR下方的β-片框架中的殘基，其提供用于環(huán)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象的基礎(chǔ)。在輕鏈上的Vernier殘基在位置2、4、35、36、46、48、49、64、67、69和71處，而在重鏈上，它們被鑒別在位置2、27、28、29、30、47、48、49、67、69、71、73、78、93、94和103處。在VL/VH界面處的殘基已由Chothia和同事鑒別出來[ChothiaC等人，可變結(jié)構(gòu)域的包裝。1989.J.Mol.Biol.186:651-63]，并且在輕鏈的位置34、36、38、44、46、87、89、91、96和98處，以及在重鏈的位置35、37、39、45、47、91、93、95、100-100K和103處。我們顯示了在本公開內(nèi)容中使用的用于選擇人FR和CDR的方式相對(duì)于嵌合和小鼠JAA-F11，不會(huì)負(fù)面地改變?nèi)嗽椿疛AA-F11對(duì)于TF-Ag的親和力。當(dāng)定義CDR時(shí)，已包括了結(jié)合位點(diǎn)的至內(nèi)的殘基以確保對(duì)于TF-Ag的親和力和特異性被保持。這些殘基在重鏈上的位置H31、H32、H33、H35、H50、H52、H53、H54、H95、H96、H97、H98和H100處，以及在輕鏈上的位置L27d、L28、L30、L32、L34、L50、L89、L91、L92和L96處。然而，根據(jù)相對(duì)親和力研究，雖然所有的人源化抗體保持對(duì)于TF-Ag的親和力，但我們觀察到在抗體之間的親和力方面的差異。相對(duì)親和力研究揭示H2L2抗體是具有最高親和力的抗體，接著是H2L3抗體。在抗體之中，H2L2抗體對(duì)于TF-Ag具有最高相對(duì)親和力，需要超過2mg的小鼠抗體用于抑制1mg的H2L2抗體。H2L3抗體還具有比H1L1和嵌合抗體更高的親和力，盡管不是顯著性的，而H1L1、H3L3和嵌合抗體對(duì)于TF-Ag的相對(duì)親和力彼此之間不是顯著性不同的。這些在親和力方面的提高可以歸屬于不同人源化變體之間的一些殘基的變化。變體之間的差異在以下列于表6和6B中。表6A.重鏈可變H1、H2、H3和小鼠序列之間的差異。**指示Vernier區(qū)域位置。*指示此位置在我們修飾的CDR的4個(gè)氨基酸內(nèi)。表6B.輕鏈可變L1、L2、L3和小鼠序列之間的差異位置L1L2L3小鼠1天冬氨酸天冬氨酸天冬氨酸谷氨酸2**纈氨酸纈氨酸纈氨酸亮氨酸7絲氨酸蘇氨酸絲氨酸蘇氨酸14蘇氨酸蘇氨酸蘇氨酸天冬酰胺17谷氨酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺天冬氨酸18脯氨酸脯氨酸脯氨酸谷氨酰胺36***苯丙氨酸苯丙氨酸酪氨酸酪氨酸37*谷氨酰胺谷氨酰胺亮氨酸亮氨酸39*精氨酸精氨酸精氨酸賴氨酸45精氨酸精氨酸精氨酸賴氨酸81谷氨酸谷氨酸谷氨酸天冬氨酸83纈氨酸纈氨酸纈氨酸亮氨酸**指示Vernier區(qū)域位置。*指示此位置在我們修飾的CDR的4個(gè)氨基酸內(nèi)。如以上提及的，影響抗原結(jié)合的框架殘基包括Vernier區(qū)域和VL/VH界面殘基。當(dāng)比較人源化構(gòu)建體時(shí)，本公開內(nèi)容的mAb保留大多數(shù)的Vernier區(qū)域和VL/VH界面殘基，其對(duì)于結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)象可能很重要，然而形成了一些變化以生成較低免疫原性的人源化變體而發(fā)生。改變的氨基酸在Vernier區(qū)域中或在VH/VL界面中，并且已對(duì)CDR的4個(gè)氨基酸(順序地)內(nèi)的氨基酸形成變化，如通過星號(hào)指示的。在三個(gè)構(gòu)建體之間不同的重鏈序列上有四個(gè)Vernier區(qū)域位置，即位置48、67、69和73。H2保留小鼠殘基但在八個(gè)位置5、11、69、73、75、82b、83和85處在H1和H3構(gòu)建體之間不同。在這八個(gè)殘基中，兩個(gè)是Vernier區(qū)域殘基，在位置69和73處。同時(shí)，H2和H1在兩個(gè)Vernier區(qū)域位置處(即在殘基48和67處)具有替代，其在H3上保持為小鼠殘基。由于在H1L1和H3L3之間的親和力方面沒有差異，所以這表明在48和67處的Vernier區(qū)域位置會(huì)不可能對(duì)于親和力差異有貢獻(xiàn)，因?yàn)樗鼈冊(cè)贖3中保持，但在H1中改變。然而，與H1和H3不同，H2保留在位置69和73處的小鼠Vernier區(qū)域殘基，表明在這兩個(gè)Vernier區(qū)域位置處的變化對(duì)親和力方面的差異有貢獻(xiàn)。相比于H1和H3，在CDR2下方的這兩個(gè)Vernier區(qū)域殘基可能具有增強(qiáng)的H2結(jié)合。在人源化構(gòu)建體之間不同的氨基酸之中，位置69和108與結(jié)合位點(diǎn)最接近。在H2中的位置69的氨基酸(如同在小鼠抗體中)是亮氨酸，而其它人源化構(gòu)建體二者都具有蛋氨酸。在H2和小鼠抗體之間的差異之中，在氨基酸38、48、66、67和109處的變化與CDR最接近并還可能影響親和力。由于H2L2具有比H2L3更高的親和力，所以L2和L3的比較可以進(jìn)一步有助于描述對(duì)于此差異的原因。對(duì)于VL/VH殘基沒有變化并且在輕鏈上的大多數(shù)Vernier區(qū)域殘基在3個(gè)人源化構(gòu)建體之間保持，除了Vernier位置2和36。與L3不同，但與小鼠抗體一樣，較高親和力L2在Vernier位置36具有苯丙氨酸而不是酪氨酸。在位置36和37處的氨基酸可以以有利方式影響構(gòu)象，因?yàn)樗鼈冊(cè)诮Y(jié)合位點(diǎn)的內(nèi)，并且是位置24-35中的部分氨基酸，其被發(fā)現(xiàn)在GalNAc的還原端處的α連接需要的保持中很重要。許多正常組織具有與TF-Ag不相同但非常相似的結(jié)構(gòu)如Galβ1-3GalNAc-β連接結(jié)構(gòu)，其通常存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(在NK細(xì)胞上)和外周神經(jīng)組織中，因此良好特異性的保持是在此人源化中的關(guān)鍵特征。相比于小鼠抗體，hJAA-F11H1L1、H2L2、H3L3和嵌合抗體保留相同或提高的抗原結(jié)合的良好特異性，包括與Galβ1-3GalNAc-α(TF-Ag)連接結(jié)構(gòu)的結(jié)合的限制，以及基于聚糖陣列與α2-3唾液酸化結(jié)構(gòu)的結(jié)合的缺乏。當(dāng)針對(duì)超過600個(gè)不同糖進(jìn)行測(cè)試時(shí)，人源化JAA-F11構(gòu)建體的特異性看起來相同甚至提高。小鼠JAA-F11和所有人源化構(gòu)建體僅與5個(gè)糖反應(yīng)，即TF-Ag和3個(gè)具有連接至GlcNAc的一個(gè)額外的糖1-6(在2個(gè)中NeuAc，和在第三個(gè)中的GlcNAc)的三糖或與具有連接1-6至GlcNAc的2個(gè)額外的糖GalGlcNAc的糖反應(yīng)。例如，當(dāng)相比于嵌合和小鼠抗體時(shí)，H2L3顯示在所有4個(gè)結(jié)合至JAA-F11的其它糖上較少的結(jié)合，而H1L1和H2L2與結(jié)合至JAA-F11的四糖沒有結(jié)合。盡管這4個(gè)結(jié)合至JAA-F11的其它糖還不知曉在正常組織上被表達(dá)，但是對(duì)于靶標(biāo)結(jié)構(gòu)增加的特異性總是期望的。這證實(shí)在人治療中對(duì)于所有這些抗體的可能的靶向能力。由于相比于其它構(gòu)建體，H2L3具有增加的結(jié)合特異性，如通過與所述4個(gè)糖中的3個(gè)的較少結(jié)合顯示的，所以H2和H3之間差異可能引起此差異。已經(jīng)在親和力部分討論的變體之間的差異可能是對(duì)于此提高的特異性的原因。H2L3與H2L2的不同在于其與NeuAcalpha2-6(TF-Ag)和GlcNAcβ2-6(TF-Ag)降低的結(jié)合。在沒有意圖受理論限制的情況下，據(jù)信當(dāng)相比于H3L3和小鼠抗體時(shí)，H1L1和H2L2根本不結(jié)合至四糖的原因可能不得不處理這些抗體之間的共有差異。H1和H2都具有在位置48處的蛋氨酸，其是Vernier區(qū)域位置并且順序地在CDR的4個(gè)氨基酸內(nèi)。此蛋氨酸不是小鼠和H3抗體的異亮氨酸。在本公開內(nèi)容中，全細(xì)胞EIA結(jié)果突顯了hJAA-F11和嵌合JAA-F11抗體結(jié)合三陰性乳腺癌細(xì)胞系的能力。獲得的數(shù)據(jù)表明TF-Ag在靶向所有乳腺癌而尤其是侵襲性三陰性乳腺癌(TNBC)中的潛在治療作用，因?yàn)樵谀壳皩?duì)于這些類型的癌癥還沒有靶向療法。結(jié)合TF-Ag的一些凝集素和抗體引起表達(dá)TF-Ag的腫瘤細(xì)胞的增加的增殖。這被認(rèn)為通常與凝集素或抗體是否結(jié)合在還原端的α和β異頭物二者(增殖引起的)或僅α異頭物(抑制性的)。而小鼠JAA-F11僅結(jié)合α異頭物并且不會(huì)引起腫瘤細(xì)胞的增殖，確定人源化構(gòu)建體是否對(duì)腫瘤細(xì)胞具有此作用很重要。人源化JAA-F11和嵌合抗體在體外不會(huì)引起癌細(xì)胞的增殖，相反，類似于小鼠JAA-F11的作用，觀察到小鼠4T1和人癌細(xì)胞生長的小(～6–11％)但顯著的抑制。由于ADCC是抗體消除腫瘤細(xì)胞的主要機(jī)制之一，并且對(duì)于抗體被用于癌癥治療是很重要的，所以考察了人源化JAA-F11變體誘導(dǎo)ADCC的能力。利用一些但不是全部的人源化構(gòu)建體，觀察到了ADCC活性，并且在三個(gè)個(gè)體的PBMC下觀察到。H2L2和H3L3抗體二者誘導(dǎo)比小鼠4T1和人乳腺癌細(xì)胞系二者的嵌合或小鼠抗體顯著更大的ADCC，表明當(dāng)前H2L2和H3L3抗體可以是用于直接被動(dòng)免疫療法的優(yōu)選選擇。小鼠JAA-F11在任一試驗(yàn)中不顯示任何統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性ADCC能力?？贵w用于殺死腫瘤細(xì)胞的另一種效應(yīng)器功能是CDC。人源化、嵌合和小鼠JAA-F11抗體都不誘導(dǎo)CDC，但這種CDC活性的缺乏不排除其作為免疫治療劑的用途，事實(shí)上已發(fā)現(xiàn)Herceptin僅誘導(dǎo)微不足道量的CDC，并且這不是其作用模式中的一種。利用Rituxan的數(shù)據(jù)實(shí)際上顯示補(bǔ)體結(jié)合抑制NK細(xì)胞結(jié)合并降低功效?？贵w可以潛在地用來以抗體-藥物綴合物的形式將藥物或毒素?cái)y帶入細(xì)胞。因此，我們?cè)u(píng)估了人源化JAA-F11變體在結(jié)合至癌細(xì)胞上的TF-Ag后內(nèi)化的能力。小鼠JAA-F11之前已顯示在1小時(shí)內(nèi)內(nèi)化。利用酶免疫測(cè)定，我們證實(shí)了小鼠、H2L2、嵌合、H2L3和H1L1抗體顯著地內(nèi)化到小鼠4T1乳腺癌細(xì)胞中而H3L3抗體不顯示顯著內(nèi)化。活細(xì)胞熒光顯微鏡法確認(rèn)了從酶免疫測(cè)定獲得的結(jié)果。我們預(yù)期顯示較高ADCC活性的抗體將顯示較低的內(nèi)化并且來自兩個(gè)內(nèi)化測(cè)定的結(jié)果顯示與此預(yù)期一致，因?yàn)镠3L3抗體表現(xiàn)出比小鼠或嵌合抗體更大的ADCC但不顯著內(nèi)化。然而，H2L2，即使它在ADCC測(cè)定中良好進(jìn)行，但內(nèi)化好。這兩者如何可以在相同抗體下發(fā)生的機(jī)制還未被理解，但一種可能性在于在CHO細(xì)胞中不同生產(chǎn)速率可以導(dǎo)致不同的巖藻糖基化率，所以如果H2L2較低巖藻糖基化，則它可能在該時(shí)間期間在ADCC更好進(jìn)行，其在細(xì)胞表面，即使它被內(nèi)化。這些結(jié)果顯示嵌合、H2L2和H2L3構(gòu)建體具有被用作抗體-藥物綴合物的潛力。小鼠124I-JAA-F11抗體已顯示在小鼠中定位至TF-Ag乳腺腫瘤。標(biāo)記的JAA-F11抗體保持結(jié)合至4T1腫瘤持續(xù)至少20天和對(duì)于人三陰性乳腺腫瘤持續(xù)24天，暗示JAA-F11可以用來發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移和治療帶有TF-Ag的腫瘤。為了測(cè)試碘-124標(biāo)記的人源化抗體是否將在小鼠中定位至人乳腺腫瘤，利用具有最高親和力的人源化抗體，H2L2變體(其內(nèi)化和進(jìn)行ADCC)。成像顯示優(yōu)先腫瘤攝取，其中在甲狀腺和在脾臟中的攝取在后一個(gè)實(shí)驗(yàn)中利用冷兔免疫球蛋白阻斷。MicroPET成像顯示放射標(biāo)記的人源化抗體在24小時(shí)內(nèi)被腫瘤吸收并且直至96小時(shí)可以看到。這樣的在患者中的放射定位可以用來發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移并且還用來在直接被動(dòng)免疫療法或抗體-藥物綴合物療法之前確定在具體患者中是否存在任何脫靶結(jié)合。Thomsen-Friedenreich抗原(TF-Ag)存在于多于80％的若干人癌瘤(包括乳腺癌)。其在腫瘤粘附和轉(zhuǎn)移中具有功能作用，所以抗體靶向TF-Ag的能力表明作為免疫治療劑、作為用于殺死癌細(xì)胞和用于抑制轉(zhuǎn)移的抗體-藥物綴合物的可能用途。對(duì)于TF-Ag具有其獨(dú)特高特異性的JAA-F11抗體保持作為用于治療乳腺癌和其它癌癥的被動(dòng)抗TF-Ag反應(yīng)的巨大潛力。在我們的人源化方式中，我們保持了此獨(dú)特特異性并且已利用人源化JAA-F11變體可能使其增強(qiáng)。實(shí)施例2此實(shí)施例提供用來獲得本文中描述的結(jié)果的材料和方法的描述。JAA-F11CDR之前已被預(yù)測(cè)。我們進(jìn)行了小鼠JAA-F11抗體的克隆和測(cè)序以確認(rèn)重鏈和輕鏈可變區(qū)二者的氨基酸序列。為了在人中具有治療益處，抗體應(yīng)保持其對(duì)于其靶抗原的特異性同時(shí)不產(chǎn)生抗-小鼠免疫反應(yīng)。我們選擇了CDR移植方式以保留小鼠JAA-F11的CDR以便保持對(duì)于TF-Agα的特異性和親和力。使用Chothia和Kabat方法以及X射線晶體結(jié)構(gòu)和計(jì)算碳水化合物線程來選擇CDR。為了選擇用于重鏈和輕鏈JAAF-11可變區(qū)鏈中的每一個(gè)的人受體抗體框架，針對(duì)整個(gè)非冗余人(智人)Genbank數(shù)據(jù)庫，在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PAGE＝Proteins進(jìn)行了蛋白(BLASTP)檢索，以鑒別與小鼠JAA-F11最同源的人抗體。將所有非智人蛋白序列、人源化抗體和噬菌體展示序列從BLASTP結(jié)果消除。所得的前十個(gè)與JAA-F11的重和輕可變鏈序列中的每一個(gè)最同源的序列被選擇作為用于人源化JAA-F11(hJAA-F11)的潛在人受體抗體框架。使用SeaView序列比對(duì)程序來比對(duì)所述十個(gè)潛在人受體可變重鏈或輕鏈框架序列與小鼠JAA-F11可變重鏈或輕鏈區(qū)序列。從所述10個(gè)最相似人免疫球蛋白序列的蛋白BLAST選擇構(gòu)建三個(gè)重鏈(H1、H2和H3)和三個(gè)輕鏈(L1、L2和L3)可變區(qū)。然后將來自小鼠JAA-F11的最后CDR通過三種不同方法中的一種移植到人框架區(qū)上，生成3個(gè)不同重鏈和3個(gè)不同輕鏈。在第一種方法中，(a)重鏈H1和輕鏈L1FR序列設(shè)計(jì)成含有在前十個(gè)所選人FR序列之中的各個(gè)位點(diǎn)中的最經(jīng)常出現(xiàn)的人氨基酸。在第二種方法中，(b)重鏈H2和輕鏈L2設(shè)計(jì)成含有在各個(gè)位點(diǎn)中在所述前十個(gè)所選人FR序列之中最經(jīng)常出現(xiàn)的人氨基酸，除非氨基酸存在于在小鼠JAA-F11中看到的所匹配的前十個(gè)人FR的任一個(gè)中，然后將該氨基酸保持為與在小鼠JAA-F11中一樣。在第三中方法中，(c)在重鏈H3或輕鏈L3中，保持在小鼠JAA-F11的CDR1、CDR2和CD3之前和之后的三個(gè)FR殘基并且剩余的殘基是如在變體H1或L1中的在人序列中最經(jīng)常出現(xiàn)看到的氨基酸。這些設(shè)計(jì)的重可變鏈中的任一個(gè)可以與類似地設(shè)計(jì)的輕可變鏈配對(duì)，例如H1/L1、H1/L2、H1L3、H2L1、H2L3等。還構(gòu)建了嵌合JAA-F11，其中整個(gè)小鼠JAA-F11可變區(qū)連接至人IgG1恒定區(qū)。這是提供應(yīng)具有小鼠抗體的原始特異性和親和力同時(shí)具有人恒定區(qū)的基線，以用作用于評(píng)價(jià)人源化變體的陽性對(duì)照。hJAA-F11的模型的評(píng)估評(píng)估多種hJAA-F11構(gòu)建體的構(gòu)象效應(yīng)。簡言之，將提出的多種hJAA-F11構(gòu)建體的重和輕可變鏈序列與JAA-F11序列進(jìn)行比對(duì)。將對(duì)于可以潛在地引起與周圍氨基酸的嚴(yán)重空間相互作用的各個(gè)人源化變體的框架中的任何氨基酸殘基移除并用原始小鼠JAA-F11框架殘基替代。使用T20評(píng)分預(yù)測(cè)hJAA-F11變體的免疫原性盡管人源化和完全人抗體被認(rèn)為是非免疫原性的并且對(duì)于人使用是安全的，但是完全人和人源化抗體的免疫原性已在患者中報(bào)道。為了確定所選擇的序列是否具有低免疫原性，通過T20評(píng)分方法進(jìn)行免疫原性分析。利用超過38,000人抗體序列的數(shù)據(jù)庫，由Gao等人開發(fā)的T20評(píng)分分析儀計(jì)算單克隆抗體可變區(qū)序列的“人性”。在此方法中，進(jìn)行蛋白BLAST檢索并且將試驗(yàn)人源化Ab首先針對(duì)所有這些人序列進(jìn)行比較。然后將人源化抗體與前20個(gè)人AbBLAST匹配進(jìn)行比較并對(duì)與這些序列的相似性進(jìn)行評(píng)分。對(duì)于人源化抗體的T20評(píng)分從前20個(gè)匹配人序列的百分比同一性的平均值獲得。最高的可能評(píng)分為100(與人最相同的)。作為用于此方法與患者中的免疫原性的關(guān)系的構(gòu)思的證據(jù)，Gao等人利用T20評(píng)分比較了要么被批準(zhǔn)用于臨床使用要么處于臨床開發(fā)(小鼠、嵌合(來自小鼠)、人源化(n＝22)和全人抗體序列)的多個(gè)階段的超過90個(gè)抗體的在患者體內(nèi)的免疫原性結(jié)果，并且發(fā)現(xiàn)具有高于80的FR&CDR序列的T20評(píng)分的Ab不是免疫原性的，并且利用僅對(duì)于FR序列的T20評(píng)分，高于85的那些不是免疫原性的。對(duì)于人源化JAA-F11變體的T20評(píng)分使用在abanalyzer.lakepharma.com/的T20Cutoff人數(shù)據(jù)庫計(jì)算。密碼子優(yōu)化和基因合成。在設(shè)計(jì)人源化JAA-F11VH和VL變體氨基酸序列之后，手動(dòng)地選擇對(duì)應(yīng)核苷酸序列用于灰倉鼠(Cricetulusgriseus)(CHO)細(xì)胞蛋白生產(chǎn)最佳的密碼子使用并且合成和插入pUC57質(zhì)粒(一種常用克隆載體)。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中的hJAA-F11和嵌合JAA-F11可變重鏈(VH)和輕鏈(VL)基因的亞克隆和測(cè)序。在人巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子和氨比西林(Amp)和組氨醇脫氫酶(hisD)盒的控制下，將hJAA-F11VH基因亞克隆和插入含有人IgG1重鏈引導(dǎo)子/恒定區(qū)的表達(dá)載體(pAH6307)。在人CMV啟動(dòng)子和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neoR)盒的控制下，將VL基因插入到含有人κ輕鏈引導(dǎo)子/恒定區(qū)的表達(dá)載體(pAN6714)。類似地，使嵌合JAA-F11VH和VL表達(dá)并且在隨后分析中用作陽性對(duì)照。人源化和嵌合JAA-F11變體的表達(dá)和生產(chǎn)。共轉(zhuǎn)染入CHO-K1細(xì)胞。將粘附性中華倉鼠卵巢(CHO-K1；ATCC#CCL-61，Manassas，VA)細(xì)胞培養(yǎng)18小時(shí)，然后在加濕空氣中在37℃和5％二氧化碳(CO2)在補(bǔ)充有10％胎牛血清(FCS；Hyclone)的Ham’sF12培養(yǎng)基(CorningCellgro，Manassas，VA)中轉(zhuǎn)染，并在50-80％融合率時(shí)收獲。將哺乳動(dòng)物6307pAH(VH)和6714pAN(VL)表達(dá)載體通過電穿孔(GenePulserSystem(Bio-Rad，Hercules，CA)共轉(zhuǎn)染入CHO-K1細(xì)胞。簡言之，使用PvuI限制酶(Promega，Madison，WI)將各個(gè)質(zhì)粒線性化并將5μg的各個(gè)質(zhì)粒加入至在0.4cm電穿孔池(Bio-Rad，Hercules，CA)中500μL總體積的冷Ham’sF12培養(yǎng)基(CorningCellgro，Manassas，VA)中的5x106CHO-K1細(xì)胞。容納混合物的池在960μF和250mV電穿孔。然后轉(zhuǎn)染混合物用預(yù)溫?zé)岱沁x擇性培養(yǎng)基(Ham’sF12，補(bǔ)充有10％FCS)稀釋至1x105個(gè)細(xì)胞/mL的濃度。然后將兩百微升以1x104個(gè)細(xì)胞/孔的密度鋪板到96-孔組織培養(yǎng)板(BDBioscience，SanJose，California)中。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在組織培養(yǎng)孵育器中在37℃和5％CO2孵育。在72小時(shí)，從96-孔組織培養(yǎng)板移除非選擇性培養(yǎng)基并用200μl的含有700μg/mlG418(Gibco，LifeTechologies，GrandIsland，NY)、5mM的組氨醇(Sigma-Aldrich，StLouis，MO)和10mMofHEPES緩沖液(CorningCellgro，Manassas，VA)的Ham’sF12(加10％FCS)選擇性培養(yǎng)基替代，并且允許克隆體生長多至3周。用質(zhì)粒6307pAH和6714pAN轉(zhuǎn)染的CHO-K1細(xì)胞將繼續(xù)生長，而未轉(zhuǎn)染的CHO-K1細(xì)胞將不生長。對(duì)于接下來的14至21天，每2-4天，替換所述選擇性培養(yǎng)基以除去死亡細(xì)胞的碎片并且允許抗性細(xì)胞的克隆體在選擇性培養(yǎng)基中生長。培養(yǎng)上清通過酶聯(lián)免疫測(cè)定(ELISA)的分析在選擇之后的14-21天之間，收集來自96-孔板的CHO-K1培養(yǎng)上清并通過酶聯(lián)免疫測(cè)定(ELISA)對(duì)抗體進(jìn)行分析。簡言之，將100μL的培養(yǎng)上清加入至Immulon1B-介質(zhì)結(jié)合96-孔微滴定板(ThermoScientific，Milford，MA)，該板已用在包被緩沖液(0.1MNa2CO3，在pH9.6)中的1.25μg/mL的TF-Ag-BSA綴合物包被并用TBS-brij(pH7.2)洗滌五次。還將在無菌PBS中的凈化的小鼠JAA-F11(1mg/mL)的1:500稀釋液加入到在各個(gè)板上的2-3個(gè)孔以用作陽性對(duì)照。在37℃的2小時(shí)孵育之后，將板洗滌五次并將在1％BSA-PBST緩沖液(1:10,000)中的100μL的抗-人IgG-堿性磷酸酶綴合物二抗(Sigma-Aldrich，StLouis，MO)加入到用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的各個(gè)孔中，而將在1％BSA-PBST緩沖液中的抗-小鼠IgG-堿性磷酸酶綴合物二抗(Sigma-Aldrich，StLouis，MO)的1:1000稀釋液用于小鼠JAA-F11對(duì)照孔。在室溫孵育1小時(shí)之后，將板洗滌五次，然后將100μL的磷酸酶底物(磷酸對(duì)硝基苯酯(pNPP))(Sigma-Aldrich，StLouis，MO)加入至各個(gè)孔。在室溫的一小時(shí)孵育之后，使用板讀數(shù)器在405nm對(duì)板進(jìn)行讀數(shù)，以篩選對(duì)于TF-Ag的IgG抗體的存在。作為空白，在一抗孵育接著二抗孵育和底物孵育期間使用HAM’sF12(加10％FCS)培養(yǎng)基。穩(wěn)定克隆體的傳代和生產(chǎn)在開始選擇后14-21天，對(duì)于抗-TF-Ag抗體的初始篩選之后，選擇具有最高吸光度讀數(shù)的10-12個(gè)克隆體并轉(zhuǎn)移到24-孔組織培養(yǎng)板中用于擴(kuò)展。來自這些克隆體的培養(yǎng)上清然后通過ELISA分析。將給出最高吸光度讀數(shù)的4個(gè)克隆體轉(zhuǎn)移至T25組織培養(yǎng)瓶，擴(kuò)展并通過ELISA再次對(duì)于抗-TF-Ag抗體進(jìn)行篩選以確保這些克隆體仍然生產(chǎn)對(duì)于TF-Ag反應(yīng)性的抗體。然后將這4個(gè)克隆體轉(zhuǎn)移至T75組織培養(yǎng)瓶、擴(kuò)展、對(duì)于抗-TF-Ag抗體再篩選并將細(xì)胞儲(chǔ)存冷凍在液氮中。然后將具有最高抗-TF-Ag結(jié)果的克隆體進(jìn)一步擴(kuò)展并傳代2-3次以確保該細(xì)胞系是穩(wěn)定的。來自以上獲得的最佳克隆體的用于各個(gè)hJAA-F11重鏈和輕鏈組合的穩(wěn)定個(gè)體細(xì)胞克隆體通過有限稀釋的亞克隆而產(chǎn)生。簡言之，細(xì)胞在T75組織培養(yǎng)瓶中生長至匯合，收獲并計(jì)數(shù)并且以0.3個(gè)細(xì)胞/孔接種到在選擇性培養(yǎng)基中的96-孔板的各個(gè)孔中。7-10天后在顯微鏡下仔細(xì)檢查這些板并且標(biāo)記顯示細(xì)胞的單個(gè)焦點(diǎn)的孔并進(jìn)行監(jiān)控直至看到足夠的生長密度。來自這些標(biāo)記孔的上清通過ELISA測(cè)試抗-TF-Ag抗體。給出最高吸光度讀數(shù)的4個(gè)克隆體如上所述進(jìn)行擴(kuò)展以獲得親本克隆體。對(duì)給出最高吸光度的亞克隆體進(jìn)行擴(kuò)展并用于在T200NuncTM細(xì)胞培養(yǎng)Tripleflask(ThermoFisherScientific，Inc.)中生產(chǎn)上清。對(duì)于各個(gè)人源化變體JAA-F11在Tripleflask培養(yǎng)瓶中的生產(chǎn)，將細(xì)胞培養(yǎng)3周，之后收獲1升的培養(yǎng)上清。生產(chǎn)嵌合JAA-F11的克隆體如所述人源化JAA-F11變體的相同方式進(jìn)行處理。人源化和嵌合JAA-F11變體的純化人源化和嵌合JAA-F11變體上清使用蛋白4B、快速流動(dòng)親和柱(Sigma-Aldrich，StLouis，MO)純化。為了制備蛋白A柱，將在緩沖液A(0.02MNaH2PO4，0.15MNaCl，pH至8.0)中的樹脂的1:1懸浮液倒入柱中。裝好柱之后，將其用20柱體積(CV)的緩沖液A洗滌。將一升的CHO-K1細(xì)胞培養(yǎng)上清以3500rpm離心30分鐘從而清除死細(xì)胞或碎片，然后過濾。將過濾的上清上樣到ProteinA柱上并允許以1mL/min的流速通過重力滴落。然后該柱用10CV的緩沖液A洗滌。抗體使用3CV的緩沖液B(0.2MNa2HPO4，0.1M檸檬酸，pH3.9)從蛋白A柱洗脫。將洗出液用0.1MNaOH小心地中和以最小化低pH對(duì)抗體的影響。蛋白A柱用20-30CV的緩沖液A再平衡并在2-8℃儲(chǔ)存。各個(gè)柱對(duì)于同一抗體使用多達(dá)五次。如后續(xù)測(cè)定所需的，在有或沒有苯酚紅的情況下，針對(duì)1X磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或RPMI培養(yǎng)基，將純化的抗體在4℃透析過夜(Slide-A-LyzerDialysisCassette；ThermoScientific)。在透析之后，將抗體用0.22μm濾器(Corning)過濾并且蛋白濃度通過如以下詳述的Bio-Rad蛋白測(cè)定來確定。將抗體儲(chǔ)存在4℃并使用ELISA檢查與TF-Ag的結(jié)合。Bio-Rad蛋白測(cè)定抗體濃度使用Bio-Rad蛋白測(cè)定來確定，該Bio-Rad蛋白測(cè)定基于Bradford染料結(jié)合方法。簡言之，將染料試劑用蒸餾水以1:4比率稀釋并使用Whatman濾紙#1過濾。使用1XPBS緩沖液制備已知蛋白標(biāo)準(zhǔn)物(1.44mg/mLγ球蛋白，Bio-Rad，Hercules，CA)和人源化抗體樣品的系列稀釋液。將10μL的各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物和樣品溶液一式三份地置于微滴定板的孔中。然后將兩百微升的稀釋染料試劑使用多通道移液管加入至所有孔，并在沒有形成氣泡的情況下通過上下吸移充分混合。將該板在室溫孵育指示5分鐘至1小時(shí)。然后在板讀數(shù)器(Bio-TekInstruments)上在595nm讀出吸光度。人源化和嵌合JAA-F11抗體的化學(xué)特異性和親和力的分析化學(xué)特異性的確定多種hJAA-F11構(gòu)建體和嵌合JAA-F11的化學(xué)特異性使用印刷聚糖陣列確定。將此與之前對(duì)于小鼠JAA-F11獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。所述聚糖陣列是一種間接免疫熒光方法，描述于功能糖組學(xué)協(xié)會(huì)(ConsortiumforFunctionalGlycomics)網(wǎng)站。分析各個(gè)構(gòu)建體與610個(gè)不同聚糖的反應(yīng)性。簡言之，將印刷陣列用抗體連續(xù)孵育，洗滌，并用FITC標(biāo)記的二抗孵育。在洗滌之后，在PerkinElmerMicroscanarrayXL4000中讀出圖像并儲(chǔ)存tiff文件圖像并且使用ImageneV.6圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析。各個(gè)結(jié)合聚糖的相對(duì)結(jié)合被表示并歸一化至原始聚糖TF-Ag的結(jié)合。使用ANOVA進(jìn)行相對(duì)結(jié)合能力的比較和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。相對(duì)親和力的確定hJAA-F11與TF-Ag的相對(duì)親和力結(jié)合使用與小鼠JAA-F11抗體和嵌合JAA-F11抗體的競爭性抑制ELISA進(jìn)行分析。簡言之，在1.25ug/mLTF-Ag包埋的96-孔板(ThermoScientific，Milford，MA)上，將3μg/mLhJAA-F11或嵌合JAA-F11在不同濃度的小鼠JAA-F11(10、8、6、4、2ug/mL)存在下孵育。結(jié)合的抗體通過用抗-人IgG二抗和底物的孵育進(jìn)行檢測(cè)并且吸光度讀數(shù)如在這些材料和方法中所述獲得。確定并比較抑制3μg/mL人源化或嵌合抗體的結(jié)合達(dá)50％所需的小鼠抗體的量。抑制所需的小鼠抗體的量越高，抗體的相對(duì)親和力越高。使用ANOVA來比較各個(gè)人源化抗體和嵌合抗體的相對(duì)親和力。hJAA-F11的生物效能的分析與人類乳腺腫瘤細(xì)胞系的結(jié)合的評(píng)估hJAA-F11與多種人類乳腺腫瘤細(xì)胞系的結(jié)合使用全細(xì)胞ELISA分析。帶有TF-Ag的小鼠乳房腫瘤4T1細(xì)胞系用作陽性對(duì)照，而作為用于生產(chǎn)JAAF11雜交瘤的融合伴侶的P3-X63-Ag8骨髓瘤(ATCC號(hào)：CRL-1580)細(xì)胞系用作TF-抗原陰性對(duì)照。通過使用學(xué)生T檢驗(yàn)將各個(gè)抗體與各個(gè)細(xì)胞系的反應(yīng)性與該抗體與骨髓瘤細(xì)胞的反應(yīng)性進(jìn)行比較來確定陽性結(jié)合。為了標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)，通過用骨髓瘤細(xì)胞的吸光度讀數(shù)除試驗(yàn)細(xì)胞系的吸光度讀數(shù)來表示與各個(gè)細(xì)胞系的結(jié)合。細(xì)胞制備使用非酶細(xì)胞傾卸裝置(Mediatech，Inc.VA，USA)收獲4T1乳腺腫瘤和骨髓瘤細(xì)胞系。為了防止細(xì)胞成團(tuán)，將培養(yǎng)基、緩沖液和試劑在使用之前預(yù)先溫?zé)?。?duì)于粘附性細(xì)胞，將培養(yǎng)基從培養(yǎng)皿移除并將細(xì)胞用沒有鈣和鎂的1XDulbecco磷酸鹽緩沖鹽水(DPBS)(MediatechInc.，Cellgro)漂洗。將五毫升的細(xì)胞裂解液加入至各個(gè)瓶，然后在37℃孵育10分鐘。從這些瓶汲取液體以去除細(xì)胞。對(duì)于非粘附性骨髓瘤細(xì)胞，也從這些瓶汲取液體并將培養(yǎng)上清以1000xG離心10min。將細(xì)胞團(tuán)粒再懸浮在細(xì)胞裂解液中并在37℃孵育10min。在孵育之后，將20mL的1XDPBS加入至細(xì)胞中并反覆地吸移以除去團(tuán)塊。然后將細(xì)胞懸浮液以1000xG離心10分鐘。將上清倒出并將團(tuán)粒再懸浮在5mLDPBS中。細(xì)胞使用臺(tái)盼藍(lán)染色和血球計(jì)進(jìn)行計(jì)數(shù)。將細(xì)胞稀釋以獲得1×106個(gè)存活細(xì)胞/ml。將兩百微升的細(xì)胞懸浮液(2×105個(gè)細(xì)胞)置于5ml聚苯乙烯四管中。將兩百微升的4％甲醛溶液加入至各個(gè)管并在室溫孵育20min，之后以1500xG離心10min。將上清一次性小心地倒出，細(xì)胞在DPBS中洗滌，接著離心和倒出。將兩百微升的PBS-吐溫1％BSA(w/v)加入至各個(gè)管并在4℃儲(chǔ)存過夜或直至兩周。在細(xì)胞上的酶免疫測(cè)定將兩百微升的50μg/mL的小鼠JAA-F11、hJAA-F11或嵌合JAA-F11抗體加入至容納以一式四份測(cè)試的不同細(xì)胞系的管并在37℃孵育兩小時(shí)。用200μL的1XPBS-0.1％吐溫20-1％BSA處理的一組管用作用于所測(cè)試的各個(gè)細(xì)胞系的陰性對(duì)照。將這些管用3mL的洗滌緩沖液(1XPBS吐溫，無疊氮化物)洗滌三次，然后以1500xG離心10分鐘。在各個(gè)清洗之間將上清小心地倒出。將兩百微升的在PBS-吐溫-1％BSA中的抗-小鼠IgG(γ-鏈-特異的)辣根過氧化物酶二抗(1:1000，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)或抗-人IgG(γ-鏈-特異的)辣根過氧化物酶二抗(1:2000，SigmaAldrich，St.Louis，MO)加入至相應(yīng)管，然后在室溫(RT)孵育1小時(shí)。在孵育之后，傾倒管并洗滌三次，并在洗滌之間以1500xG離心。然后將兩百微升的鄰苯二胺二鹽酸鹽底物(OPD；Sigma，St.Louis，MO)溶液加入至各個(gè)管并在室溫孵育1小時(shí)。在孵育之后，通過加入100μL的終止液(1NH2SO4)使反應(yīng)終止并以1500xG離心10分鐘。接下來，從各個(gè)管移出200μL的上清并轉(zhuǎn)移至微滴定板中相應(yīng)孔。使用微板讀數(shù)器(MicroplateAutoreader，型號(hào)EL311，Bio-TekInstruments，Inc.)在490nm讀出吸光度并且未反應(yīng)的OPD底物用作空白。對(duì)于不同的細(xì)胞系，各個(gè)相應(yīng)平均空白(僅具有PBS-吐溫-1％BSA的管)從它們的相應(yīng)平均OD扣除從而得到最終的光學(xué)讀數(shù)。各個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。hJAA-F11對(duì)于體外癌細(xì)胞增殖的影響為了考察人源化和嵌合JAA-F11抗體對(duì)癌細(xì)胞生長的影響，進(jìn)行體外3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基溴化四唑(噻唑藍(lán)，MTT)增殖分析。將4T1小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞和人乳腺腫瘤細(xì)胞在變化量的JAA-F11、人源化和嵌合JAA-F11(4、2和1μg/mL)存在下以10次重復(fù)地以1x104個(gè)細(xì)胞/孔接種到96-孔板中。當(dāng)以此細(xì)胞密度鋪板時(shí)，細(xì)胞在它們?cè)?2小時(shí)的生長曲線的線性部分。在沒有抗體的培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞用作正常生長對(duì)照。單獨(dú)的培養(yǎng)基用作空白。在37℃的細(xì)胞生長68小時(shí)之后，將10μL的四唑鹽MTT(5mg/ml)加入至各個(gè)孔，并將這些板返回至孵育器持續(xù)另外的4小時(shí)。在孵育結(jié)束時(shí)，在各個(gè)孔中所得的甲瓚產(chǎn)物通過添加120μL的二甲亞砜(DMSO，F(xiàn)isherScientific)溶解，然后在570nm測(cè)量各個(gè)孔的吸光度(MicroplateAutoreader，型號(hào)EL311，Bio-TekInstruments，Inc.)。抗體依賴性細(xì)胞毒性測(cè)定為了考察hJAA-F11抗體的效應(yīng)器功能，進(jìn)行抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)分析。使用人外周血單核細(xì)胞(PBMC)作為效應(yīng)器細(xì)胞和人乳腺腫瘤細(xì)胞系作為靶細(xì)胞，以效應(yīng)器與靶(E:T)比率為100:1，通過乳酸脫氫酶(LDH)釋放測(cè)定(CytoTox96非放射活性細(xì)胞毒性測(cè)定；Promega，Madison，WI)來確定ADCC。使用Ficoll-Paque，通過密度梯度離心，從全血制備PBMC。將在紫頂病EDTA真空抽血管(purple-topEDTAvacutainer)中收集的全血與等體積的預(yù)溫?zé)釤o菌DPBS混合。然后將二十毫升稀釋的血液輕輕地成層到在50mL圓錐管中的15mL的Ficoll-PaquePlus(GEHealthcare)。將樣品在室溫下不間斷地以1300rpm離心30-40min。接下來，收集PBMC層并將無菌的PBS加入至該P(yáng)BMC至總體積為40mL。然后將該混合物在18°至22℃以1000rpm離心10min以除去任何污染Ficoll和血小板/血漿蛋白。拋棄上清，將細(xì)胞重新懸浮在新鮮的無菌PBS中，并且重復(fù)離心步驟。將細(xì)胞重新懸浮在RPMI1640培養(yǎng)基(10％FCS)中并使用血球計(jì)和臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)。將靶細(xì)胞(1x104；30μl)和PBMC(1x106；30μl)加入到96-孔U形底板中并在組織培養(yǎng)孵育器中在37℃用hJAA-F11或嵌合抗體(200μg/mL；30μL)孵育17小時(shí)。在完成所述17小時(shí)孵育之前的四十五分鐘，將10μL的裂解液(x10)加入至容納靶細(xì)胞最大LDH釋放對(duì)照(靶細(xì)胞和培養(yǎng)基)和體積校正對(duì)照(僅培養(yǎng)基)的孔。在孵育結(jié)束時(shí)，將板以1000rpm離心4分鐘。然后將五十微升等分試樣從所有孔轉(zhuǎn)移至新的平底96-孔板。接下來，將50μL的重構(gòu)底物混合物加入至這些孔的每一個(gè)。將板用金屬箔覆蓋并在室溫孵育30分鐘。反應(yīng)利用向各個(gè)孔添加50μL的終止液而終止，并使用微板讀數(shù)器(MicroplateAutoreader，型號(hào)EL311，Bio-TekInstruments，Inc.)記錄在490nm的吸光度。細(xì)胞毒性利用以下公式計(jì)算：細(xì)胞毒性(％)＝100×[(E-SE)]/[(M-SE)]，其中對(duì)于各個(gè)條件，測(cè)量底物的吸光度。條件為如下；E是實(shí)驗(yàn)孔，SE是在沒有抗體對(duì)照(用效應(yīng)器細(xì)胞和PBS孵育的靶細(xì)胞)的情況下的自發(fā)釋放，M是通過用10X裂解液溶解的靶細(xì)胞確定的最大釋放。補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)測(cè)定使用HCC1428乳腺腫瘤細(xì)胞(CRL-2327，Manassas，VA)作為靶細(xì)胞種群，通過乳酸脫氫酶(LDH)釋放測(cè)定(CytoTox96非放射性細(xì)胞毒性測(cè)定；Promega，Madison，WI)來確定CDC。以試劑盒提供的含有牛心臟LDH的LDH陽性樣品用作陽性對(duì)照。在比較兔、幼兔和豚鼠補(bǔ)體的細(xì)胞毒性的背景水平之后，將凍干的豚鼠血清(CL3112，CedarlaneLaboratories，Burlington，NC)用作補(bǔ)體的來源并根據(jù)制造商說明書重構(gòu)。在測(cè)定中使用的最佳細(xì)胞濃度為1x104個(gè)細(xì)胞/50μL/孔。使用的抗體針對(duì)無苯酚紅的RPMI培養(yǎng)基透析。對(duì)于實(shí)驗(yàn)孔，在圓底96-孔培養(yǎng)板中，在四個(gè)組中將50μl的HCC1428細(xì)胞懸浮液、20μl的補(bǔ)體稀釋液(以1:20的最終稀釋液)和30μL的抗體(最終濃度在100μg/ml)在各個(gè)孔中混合。包括了容納靶細(xì)胞和沒有抗體的補(bǔ)體的對(duì)照孔以控制由用作補(bǔ)體來源的血清介導(dǎo)的任何細(xì)胞毒性以及LDH的自發(fā)釋放。將板以1000rpm離心4分鐘，然后在37℃用5％二氧化碳孵育2小時(shí)。在完成所述2小時(shí)孵育之前的四十五分鐘，將10μL的裂解液(x10)加入至容納靶細(xì)胞最大LDH釋放對(duì)照和體積校正對(duì)照的孔。在孵育結(jié)束時(shí)，將板以1000rpm離心4分鐘。然后將五十微升等分試樣從所有孔轉(zhuǎn)移至新的平底96-孔板。接下來，將50μL的重構(gòu)底物混合物加入至各個(gè)孔。將板用金屬箔覆蓋并在室溫孵育30分鐘。利用向每個(gè)孔添加50μl的終止液使反應(yīng)終止，然后使用微板讀數(shù)器(MicroplateAutoreader，型號(hào)EL311，Bio-TekInstruments，Inc.)記錄在490nm的吸光度。細(xì)胞毒性利用以下公式計(jì)算：細(xì)胞毒性(％)＝100×[(E-SE)]/[(M–SE)]，其中對(duì)于各個(gè)條件，測(cè)量底物的吸光度。條件為如下；E是實(shí)驗(yàn)孔的吸光度，SE是在有補(bǔ)體但沒有抗體(用補(bǔ)體和培養(yǎng)基孵育靶細(xì)胞)的情況下的自發(fā)釋放，并且M是用10X裂解液裂解的靶細(xì)胞的釋放。細(xì)胞內(nèi)化測(cè)定人源化和嵌合JAA-F11到4T1乳腺腫瘤細(xì)胞中的內(nèi)化通過兩種方法分析，即利用在2個(gè)孵育溫度4℃和37℃測(cè)量的表面結(jié)合的酶免疫測(cè)定和免疫熒光顯微鏡法。內(nèi)化的酶免疫測(cè)定法測(cè)試小鼠4T1乳腺癌細(xì)胞系對(duì)于JAA-F11、hJAA-F11或嵌合JAA-F11的內(nèi)化。將五十萬(5x105)個(gè)細(xì)胞接種到6-孔板的全部六個(gè)孔中并生長至匯合。對(duì)于所測(cè)試的各個(gè)抗體，準(zhǔn)備兩個(gè)板。從各個(gè)板移除培養(yǎng)基并將1mL的抗體(200μg/mL)加入至各個(gè)板的3個(gè)孔，并將1mL的PBS稀釋液加入至剩余的3個(gè)孔。將一組板在37℃孵育以允許內(nèi)化并且另一個(gè)板在4℃孵育。在1小時(shí)孵育之后，移除培養(yǎng)基并將這些孔用1mL的無苯酚紅的RPMI培養(yǎng)基洗滌4次。接下來，將1mL的2％低聚甲醛加入至各個(gè)孔并將這些板在室溫孵育20分鐘以固定細(xì)胞。然后這些板用無苯酚紅的RPMI培養(yǎng)基洗滌4次。接下來，加入1mL在1％BSA/PBS中的抗-小鼠或抗-人類IgG(γ-鏈-特異的)堿性磷酸酶二抗(1:5000，Sigma，St.Louis，MO)并將板在37℃孵育1小時(shí)。然后將板無苯酚紅的RPMI培養(yǎng)基洗滌4次并加入1mL的磷酸對(duì)硝基苯酯底物(pNPP)并在黑暗中孵育1小時(shí)。在1小時(shí)孵育之后，將來自各個(gè)孔的200μL轉(zhuǎn)移至96-孔板的相應(yīng)孔并使用微板讀數(shù)器(MicroplateAutoreader，型號(hào)EL311，Bio-TekInstruments，Inc.)在405nm記錄吸光度。未反應(yīng)的底物用作空白。對(duì)一式三份的孔求平均值，并將單獨(dú)培養(yǎng)基空白的平均光密度從含有抗體的孔減去。百分比內(nèi)化使用以下公式計(jì)算：％內(nèi)化＝100*[1-(37℃樣品-37℃空白)/(4℃樣品-4℃空白)]免疫熒光顯微鏡法在此方法中，在10％FCSRPMI1640培養(yǎng)基中，以3x105個(gè)細(xì)胞的密度，在兩個(gè)6-孔組織培養(yǎng)板的孔中，將4T1乳腺癌細(xì)胞接種到蓋玻片上，并在37℃和5％CO2培養(yǎng)24小時(shí)。從板移除培養(yǎng)基并將1.5mL的在無血清的RPMI1640培養(yǎng)基中稀釋的試驗(yàn)抗體(5μg/mL)加入至相應(yīng)孔。將兩個(gè)板在4℃放置20分鐘以允許用于抗體的表面結(jié)合。在20分鐘孵育之后，將蓋玻片從所述板中的一個(gè)轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的6-孔板中。從第二個(gè)板移出抗體稀釋液并加入預(yù)溫?zé)岬臒o血清RPMI1640培養(yǎng)基并將該板在組織培養(yǎng)孵育器中在37℃孵育1小時(shí)。將來自第一板的蓋玻片用冰冷5％BSA/PBS洗滌兩次，用1XPBS漂洗一次，然后用4％低聚甲醛溶液(Affymetrix)在室溫固定15min。在37℃孵育1小時(shí)之后，將來自第二板的蓋玻片轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的6-孔板，洗滌，漂洗和固定。在1XPBS中三次洗滌之后，將兩個(gè)板中的細(xì)胞用在PBS中的0.1％TritonX-100、0.1％脫氧膽酸鈉在室溫滲透10min。接下來，細(xì)胞用1XPBS漂洗三次，然后在室溫在5％BSA/PBS孵育30分鐘。然后在室溫，蓋玻片用以在5％BSA/PBS中的1μg/mL的稀釋液的兔抗-溶酶體膜蛋白1(LAMP1；Abcam，24170)抗體孵育1小時(shí)。然后蓋玻片用1XPBS漂洗三次并用在5％BSA/PBS中以1:500的稀釋的抗-小鼠IgG-Alexa647和抗-兔IgGAlexa488(小鼠JAA-F11蓋玻片)以及抗-人IgG-Alexa647和抗-兔IgGAlexa488(嵌合和hJAA-F11)二抗(MolecularProbes，Invitrogen)孵育。使用抗-兔IgGAlexa488二抗以檢測(cè)抗-LAMP1抗體。將蓋玻片在黑暗中在室溫孵育1小時(shí)。在孵育后，將細(xì)胞在黑暗中用1XPBS漂洗三次。將蓋玻片在細(xì)胞面朝下地放置在顯微鏡載玻片上的具有DAPI培養(yǎng)基的SlowfadeGold試劑(MolecularProbes，LifeTechnologies)上，并用指甲油密封。細(xì)胞用AxioImager熒光顯微鏡(Zeiss)分析。捕獲圖像并利用AxioVisionRelease4.8.2軟件分析。用來測(cè)試人源化JAA-F11檢測(cè)帶有TF-Ag的乳腺腫瘤的功效的體內(nèi)研究利用從上述體外生物學(xué)研究獲得的H2L2人源化JAA-F11抗體，在小鼠中進(jìn)行免疫定位研究以測(cè)試碘-124標(biāo)記的人源化抗體是否將定位至小鼠中的TF-Ag乳腺腫瘤。hJAA-F11(H2L2)抗體的[124]碘標(biāo)記人源化JAA-F11抗體的[124]碘標(biāo)記使用BoltonHunter方法進(jìn)行。在碘化之前，將人源化抗體首先使用水溶性BoltonHunter試劑(Sulfo-SHPP)(ThermoScientific，RockfordIL，USA)修飾。簡言之，將1.9mg的hJAA-F11抗體溶解于修飾緩沖液(200mM硼酸鹽緩沖液，pH9.0)。將5mg的水溶性BoltonHunter試劑在使用前立即溶解于1mL修飾緩沖液。然后將100μL的水溶性BoltonHunter試劑溶液加入至抗體樣品并在定期混合下在冰上孵育3小時(shí)。未反應(yīng)的水溶性BoltonHunter試劑通過針對(duì)磷酸鹽緩沖鹽水(PBS：0.1M磷酸鈉，150mM氯化鈉)透析而除去。在此中間步驟，人源化抗體含有連接至該抗體的一些賴氨酸的連接基團(tuán)，并且其穩(wěn)定達(dá)2周。然后將修飾的hJAA-F11抗體使用Chizzonite間接標(biāo)記法[158]進(jìn)行標(biāo)記。簡言之，將Pierce預(yù)包埋的碘化管(ThermoFisher，Rockford，IL，USA)用1mL的高Tris碘化緩沖液(0.125MTris-HCl，pH6.8，0.15MNaCl)預(yù)潤濕。將緩沖液倒出然后將100μL的高Tris碘化緩沖液直接加入至該管的底部，隨后加入280μL的(4.59milliCurie)在0.02MNaOH溶液中的124I碘化鈉(IBAMolecular，Richmond，VA)。使用放射性同位素校準(zhǔn)器CRC12(Capintec)得到初始計(jì)數(shù)。測(cè)量混合物的pH以確保其處于pH7中性。在室溫的6分鐘活化之后，將活化的碘化物加入至之前修飾的huJAA-F11溶液。在9分鐘孵育期之后，加入50μL的清除緩沖液(在Tris碘化緩沖液中的10mg酪氨酸/mL；25mMTris，pH7.5，0.4MNaCl)并將混合物孵育5分鐘。清除緩沖液的目的是除去與緩沖液中的酪氨酸反應(yīng)的游離碘。然后，將1mL的Tris/NaCl/EDTA緩沖液(25mMTris-HCl，pH7.5，0.4MNaCl，5mMEDTA，0.05％疊氮化鈉)加入至反應(yīng)混合物。然后將樣品加入至已用Tris/NaCl/EDTA緩沖液預(yù)先平衡的10mL脫鹽柱。樣品管用0.5mLTris/NaCl/EDTA緩沖液洗滌并將洗液加入至柱。樣品以500μL的十五個(gè)餾分洗脫，各自使用Tris/NaCl/EDTA緩沖液，并對(duì)放射活性進(jìn)行測(cè)試。放射標(biāo)記有效性在具有最高活性的餾分上通過高效液相色譜(HPLC)確定。將放射標(biāo)記的抗體在標(biāo)記的2小時(shí)內(nèi)注入動(dòng)物。為了確保標(biāo)記的人源化JAA-F11保持其TF-Ag反應(yīng)性，還進(jìn)行放射免疫測(cè)定。動(dòng)物和腫瘤模型這個(gè)研究中的動(dòng)物依照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)(IACUC)條例安置和利用。所有方案由布法羅大學(xué)的IACUC批準(zhǔn)。通過在右乳頭之一下方皮下地注入在0.1mLD-PBS中的5x104個(gè)細(xì)胞，將4T1小鼠乳腺癌細(xì)胞移植到7-8周齡雌性Balb/C小鼠中。將小鼠分成2個(gè)組并在腫瘤移植后10-14天通過尾靜脈注射[124I]-hJAA-F11(n＝13)和游離124124(n＝7)，然后經(jīng)過生物分布研究和顯微-PET成像。對(duì)來自2個(gè)組的每一個(gè)的一只小鼠成像并在整個(gè)研究中跟蹤。在注射標(biāo)記的抗體后所有小鼠接受0.2g/L碘化鉀水溶液并在整個(gè)研究中作為甲狀腺阻斷方案。生物分布研究通過在注射放射標(biāo)記的抗體后72、96、168和192小時(shí)腹膜內(nèi)地注射0.1mL戊巴比妥鈉(FatalPlus)處死小鼠。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，處死接受標(biāo)記的抗體的三只小鼠和具有游離碘的兩只小鼠。收獲血液、肌肉、脾臟、肺、腎、心臟、肝、小腸和大腸、胃、腦、皮膚、腫瘤組織、骨、尾、食管、甲狀腺和卵巢，并放入到預(yù)稱重的5ml聚丙烯管中。將這些管再稱重以獲得各個(gè)組織/器官的實(shí)際重量。將所有管加蓋并使用γ計(jì)數(shù)器測(cè)量放射活性。對(duì)于各個(gè)組織的放射性攝取根據(jù)如在附件2中的以下公式計(jì)算為注射劑量/克組織(％ID/g)：Micro-PET成像在使用已知的技術(shù)注射之后24、48、72、96、168和192小時(shí)，標(biāo)記的抗體在一只小鼠(各自來自兩個(gè)組)中的定位使用microPET照相機(jī)Focus(SiemensConcordeMicrosystems)通過microPET成像確定。簡言之，在掃描之前，將小鼠用O2/異氟醚(1％-3％異氟醚)麻醉，然后在microPET掃描儀的臺(tái)架中以臥姿成像。將發(fā)射掃描窗口設(shè)置在350至750keV之間。對(duì)于每只小鼠進(jìn)行30分鐘的掃描。放射免疫測(cè)定為了確定放射標(biāo)記抗體的免疫反應(yīng)性，進(jìn)行放射免疫測(cè)定(RIA)。將微滴定板用在包埋緩沖液中的100μL的1.25μg/mLTF-Ag-BSA綴合物包埋。將緩沖液從孔移除并用1％BSA/PBS-吐溫洗滌。將一百微升的放射標(biāo)記的hJAA-F11在1％BSA/PBS-吐溫中的系列稀釋液加入至孔并允許在室溫結(jié)合1小時(shí)。在孵育之后，使用多通道移液管，通過手動(dòng)地用1％BSA/PBS-吐溫將孔洗滌三次而移除未結(jié)合的抗體。通過在室溫用200μL的1M乙酸/0.15MNaCl緩沖液(pH2.4)孵育30分鐘而從板除去結(jié)合的hJAA-F11。在孵育之后，將來自各個(gè)孔的100μL溶液加入到單獨(dú)的聚丙烯試管中并使用γ計(jì)數(shù)器測(cè)量放射活性。盡管本發(fā)明已通過具體實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但是對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說常規(guī)改變將是明顯的并且這樣的改變也預(yù)計(jì)在本發(fā)明的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3