用于再生骨組織的個性化基因活化植入物的生成方法與流程

在創(chuàng)傷和骨科、上頜面和口腔手術(shù)的實踐中，治療骨缺損或骨萎縮患者的難題是高度迫切的[1-3]。存在多種骨替代物(成骨材料)用于治療小尺寸骨缺損，這里存在通過與自體骨組織、富含血小板的血漿、富含生長因子的血漿等混合而優(yōu)化它們的方法[1]。

然而，特別迫切和社會性重要的是與先天性畸形和發(fā)育異常、創(chuàng)傷、炎性疾病、腫瘤病理和它們手術(shù)治療的第一階段相關(guān)的大的骨缺損(超過1cm³)患者的有效治療的未解決難題。在起到身體器官作用的骨受到相當程度的損傷或完全喪失的這些臨床情況下，使用市售的骨替代物來重建骨連續(xù)性是不可能的，得到顯著的成骨不全。只有自體骨，不論游離或血管化的，骨移植的“金標準”，在這些情況下才可能是有效的[4，5]。

使用自體移植物的骨移植與引起進一步的損傷，擴展或產(chǎn)生一個新的手術(shù)方法，手術(shù)時間、并發(fā)癥發(fā)生率和供體部位發(fā)病率的顯著增加是相關(guān)的。此外，使用微血管技術(shù)的自體骨移植僅可以由高度熟練的專業(yè)人員在具有必需設(shè)備的專業(yè)醫(yī)療機構(gòu)的環(huán)境中進行，所述設(shè)備不僅實施這種操作，而且還能夠用來控制血管吻合的兼容性和再現(xiàn)程序的及時實施。與此同時，即使不管存在各種困難，消耗的資源和資金，也還存在引起自體移植物損失的血栓形成和血管吻合失敗的高可能性[6]。

即使在對于自體骨移植，移植物保留和其完全整合到接受部位的絕對適應(yīng)癥情況下，治療的長期結(jié)果也并不總是成功的。首先，這可以通過移植材料的高度后續(xù)生物再吸收(高達40％和甚至更高)而解釋。其次，當骨缺損或骨萎縮區(qū)域具有不規(guī)則形狀時，不可能精確地模擬自體移植物(腓骨，肋骨，肩胛骨，顱骨)為待替代的缺損形狀，即為了在植入材料的所有表面和骨缺損的壁(骨接受部位)之間的分離(diastasis)不超過1mm。這導致移植物在受體床區(qū)域的固定不充分以及還導致手術(shù)后骨變形，骨不連或自體移植物的過度生物再吸收的發(fā)生。

因此，盡管是骨替代物材料的“金標準”，但骨自體移植物是有限使用的，并不總是有效的，并且與高并發(fā)癥發(fā)生率相關(guān)。它們應(yīng)用的關(guān)鍵性缺點之一和它們效率不足的原因之一是它們不能精確地模擬骨缺損的形狀和尺寸。與此同時，任何骨替代物在骨缺損或骨萎縮區(qū)域的整個表面的緊密接觸和完全固定是骨移植的基本原理[1]。當自體骨移植是不完全或變?yōu)闊o效時，醫(yī)生必須使用牽拉成骨術(shù)，修復術(shù)或放棄這種治療，其極大地降低了患者的生活質(zhì)量。

在這個方面，開發(fā)一種新的更有效的骨替代物是高度迫切的，所述骨替代物能夠替代或至少在效率方面成為包括血管化骨自體移植物的骨自體移植物應(yīng)用的替代。根據(jù)發(fā)明人研究的發(fā)現(xiàn)，這個難題可以通過構(gòu)建基因活化的多孔生物相容性和生物降解性材料來解決，所述材料的特征在于與用于替代的骨缺損的形狀和尺寸精確擬合，其中它們是使用任何有效的三維(3D)打印技術(shù)而制造的。

背景技術(shù)：

眾多的常規(guī)骨替代物是已知的，如來自各種加工技術(shù)(去礦物質(zhì)的，脫蛋白的，等)的同種異體和異種骨基質(zhì)、磷酸鈣陶瓷、硅酸鹽、有機酸聚合物以及骨基質(zhì)材料有機和無機物質(zhì)的合成的類似物或天然的組分。然而，它們都僅具有骨傳導性作用，因為其中不含有生物活性成分。在這個方面，它們僅用于替代小尺寸骨缺損(小體積)，因為僅能夠優(yōu)化修復性骨形成而不能提供其誘導作用[7]。對于大的骨缺損修復的個性化塊的形式的所述組的產(chǎn)品幾乎不用于臨床實踐中。

另一類是活化的骨替代物，其可以被分為含有生長因子(蛋白質(zhì))、活細胞或基因構(gòu)建體(核酸)的材料組。

含有生長因子的骨替代物具有適度的骨誘導作用，其能夠激活修復性骨形成。然而，由于生長因子是短活性和短距離的，并且已知在手術(shù)傷口的炎癥條件下迅速被降解，因此產(chǎn)品的總效率似乎不足以替代大的骨缺損。在這種情況下，有不多的研究使用三維打印技術(shù)構(gòu)建具有生長因子的一個預(yù)定尺寸和形狀的骨替代物，并且在所有情況下均只生產(chǎn)遠非最優(yōu)功效的小尺寸(約1cm³)產(chǎn)品[8]。

另一種更有效方法的實例與個性化組織工程化骨移植物的發(fā)展相關(guān)。使用各種技術(shù)構(gòu)建具有預(yù)定尺寸和形狀的支架，研究人員已經(jīng)制造了隨后與活細胞組合的個性化基質(zhì)。通過這種方式，預(yù)定尺寸和形狀的支架獲得一些成骨能力并且理論上能夠提供明顯的修復性成骨誘導。然而，形成個性化骨移植物的一部分活細胞的治療潛力受到氧合需求的限制。換而言之，許多研究已經(jīng)證明與常規(guī)材料相比，這種3D打印的小尺寸(最大為1cm³)組織工程化骨移植物的效率更高。然而，在大的骨缺損替代的情況下，即使在支架形狀和尺寸對缺陷幾何形狀的理想模擬中也沒有獲得效果，因為細胞在沒有足夠的血液供應(yīng)情況下不可避免的死亡。

所要求保護的本發(fā)明最接近的現(xiàn)有技術(shù)是由支架和核酸組成的基因活化骨替代物，所述核酸即編碼生長因子的基因構(gòu)建體[9]。

基因活化的骨替代物包括“支架-核酸”復合物，其組分通過各種技術(shù)被組合：化學鍵合[7]，使用佐劑(例如，凝膠生物聚合物)[11]，在其合成過程中核酸直接納入到支架中，等。

這些產(chǎn)品具有骨誘導作用，不受氧合需求限制，因為其中不含有活細胞。然而，許多研究人員認為它們骨誘導作用的強度，以及作為結(jié)果，當用于替代骨缺損時它們的效率，是低于組織工程化骨移植物的。原因是基因構(gòu)建體對受體位點細胞的轉(zhuǎn)染效率較低，以及使用了僅由基因構(gòu)建體編碼的一個或兩個因子以誘導修復過程的“治療強度”，而組織工程化材料的細胞具有更廣泛的作用機制。

由于上述提及的技術(shù)方法的低效性和缺點，許多研究小組已經(jīng)采取了通過生產(chǎn)包含復合載體和生物活性組分組合的骨替代物而使產(chǎn)物復雜化的道路，所述生物活性組分為基因構(gòu)建體和細胞、細胞和生長因子、生長因子和基因構(gòu)建體、甚至在單個項目中的生長因子、基因構(gòu)建體和細胞。然而，這類材料的生產(chǎn)過于昂貴，并且它們在替代大的骨缺損方面的效率仍然不足。

附圖簡述

圖1示意性地顯示了適用于替代兔顱骨骨缺損的個性化基因活化材料：A-俯視圖；B-通過正面中心的橫截面圖。

圖2顯示了適用于替代兔顱骨骨缺損的構(gòu)建的個性化基因活化材料。

圖3顯示了個性化基因活化材料替代骨缺損；在植入后6.5個月：1-植入物；2-新形成的骨組織；A-計算機斷層掃描；3D重建；B-組織學圖像(染色：蘇木精、曙紅)。

圖4顯示了未經(jīng)由基因構(gòu)建體活化的個性化材料替代骨缺損；在植入后6.5個月：1-植入物；2-新形成的骨組織。組織學圖像(染色：蘇木精、曙紅)。

圖5示意性地顯示了具有定位固定物的個性化基因活化材料，其適合于替代兔脛骨的大缺損。

圖6顯示了個性化基因活化植入物用微型接骨板和微螺釘固定在骨缺損中。

圖7顯示了具有定位固定物的個性化基因活化材料替代骨缺損；在植入后3個月：1-植入物，2-新形成的骨組織。組織學圖像(染色：蘇木精、曙紅)。

本發(fā)明的詳細描述

考慮到其他研究者的經(jīng)驗和現(xiàn)有技術(shù)，由于上面提及的產(chǎn)品作用機制和在替代小的和中等尺寸的缺損中無法預(yù)測的效率方面，可以合乎邏輯地假設(shè)包括生長因子或細胞或基因構(gòu)建體的常規(guī)和活化的材料都不能有效地修復大的骨缺損。

然而，盡管在開發(fā)中有共同的看法和趨勢(針對生產(chǎn)更復雜的和多組分的成骨材料)，我們的研究團隊已經(jīng)采取了不同的方式結(jié)合手術(shù)和生物醫(yī)學方法以獲得最佳的結(jié)果。

本發(fā)明中所提出的產(chǎn)品及其制造方法的要點是構(gòu)建生物相容性和生物可再吸收材料的個性化基質(zhì)，并且將其與生物活性成分組合，所述生物活性成分是基因構(gòu)建體。本發(fā)明區(qū)分其與最接近的現(xiàn)有技術(shù)[9]的一個關(guān)鍵方面是使用3D打印方法以生產(chǎn)完全適合于接受部位的形狀和尺寸的個性化產(chǎn)品，所述接受部位即骨缺損或骨萎縮的區(qū)域。換而言之，產(chǎn)品的生產(chǎn)方式是在植入到接受區(qū)域之后，材料和對應(yīng)骨壁之間的分離不超過1mm。3D打印方法被用于實現(xiàn)個性化參數(shù)以及尺寸和形狀的精確對應(yīng)。附加的產(chǎn)品部件可以是在制造植入物的一些階段結(jié)合到材料中的固定結(jié)構(gòu)(重建板、螺釘、微型接骨板、微螺釘、線、銷，等)。如果具有不足機械特性的生物可再吸收材料被選擇作為基因構(gòu)建體的支架，其阻礙了使用任意標準技術(shù)(金屬結(jié)構(gòu)，等)在接受部位的可靠固定，則該部件的存在是強制性的。

用于構(gòu)建個性化基因活化材料的推薦方法包括下列步驟，其順序可以改變：

1.確定骨缺損或骨萎縮區(qū)域的確切形狀和尺寸。為此，可以使用標準的放射學方法如計算機斷層掃描、X-射線檢測、射線照相術(shù)等。

2.使用包括立體平版印刷、光聚合等的任何3D打印方法，從生物可再吸收材料中生產(chǎn)預(yù)定形狀和尺寸的個性化支架。

3.在生產(chǎn)個性化支架的任何階段或在生產(chǎn)之后將支架與基因構(gòu)建體組合。

第一個步驟涉及規(guī)劃所要制造的產(chǎn)品的形態(tài)測量參數(shù)，并且需要在手術(shù)干預(yù)規(guī)劃中通常使用的那些相同的研究方法。最優(yōu)選的選擇是計算機斷層掃描，其是提供用于骨修復程序規(guī)劃數(shù)據(jù)的骨骼病理學診斷的一個必要部分?？梢允褂脤ｉT配置的軟件(例如，從美國NHI獲得的“3D切片機”)，在標準的計算機斷層掃描過程中獲得的信息被用于模擬骨缺損的形狀和尺寸，和相應(yīng)的個性化基因活化植入物的形狀和尺寸。

基于所獲得的形態(tài)測量信息，形成用于3D-打印機或能夠從所需的生物可再吸收材料中產(chǎn)生具有預(yù)定參數(shù)的三維植入物的任何其它裝置的主文件?？紤]到骨組織的形態(tài)和功能組織以及再生，用于構(gòu)建支架的最優(yōu)選材料可以包括磷酸鈣、羥基磷灰石、膠原蛋白、生物活性玻璃陶瓷、有機酸聚合物和包括它們組合的其它材料。選擇用于構(gòu)建個性化基因活化植入物的生物可再吸收材料可以具有僅影響特定3D打印方法的選擇的任何聚集狀態(tài)和物理性質(zhì)。

支架的3D打印可以通過兩種完全不同的方法實現(xiàn)。第一種是從所選擇的材料直接打印支架。第二種方法涉及成形元件、引導件(從適當?shù)牟牧?的打印，以及隨后將它們作為模具用于“鑄造，，(合成)預(yù)定形狀和尺寸的支架。

生產(chǎn)個性化基因活化材料的一個關(guān)鍵步驟是組合支架和基因構(gòu)建體(例如，質(zhì)粒DNA)。該方法的這一部分還可以通過多種方法實施，所述方法部分地可以經(jīng)由選擇用于生產(chǎn)支架的生物可再吸收材料的性質(zhì)所限定。如果載體是由液體材料(凝膠、溶膠、溶液)或暫時處于液相的材料所制備，則基因構(gòu)建體可以在3D打印之前或期間被導入到其中。如果使用固體材料(例如，顆?；?，則基因構(gòu)建體可以在3D打印之前或期間被添加到液體溶液中或作為包含它們的任何凝膠材料的一部分。在大多數(shù)情況下最簡單和最可行的方法是在3D打印之后組合所產(chǎn)生的個性化支架和基因構(gòu)建體。為此目的，可以在不同條件(溫度、暴露時間、機械沖擊)下將以溶液或作為凝膠一部分的形式的各種濃度的基因構(gòu)建體與“打印的”支架進行溫育。

如果基因構(gòu)建體在3D打印之前或期間與支架組合，優(yōu)選的是在無菌條件下進行3D打印，即在A或B類潔凈室中。然而，如果基因構(gòu)建體在其已經(jīng)產(chǎn)生之后與支架組合，則3D打印可以在任何類別的房間中進行，所獲得的與基因構(gòu)建體組合的個性化支架隨后在無菌條件下滅菌。

已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在我們的研究中在實施例中部分描述了，甚至在大的骨缺損修復情況下，也可以使用經(jīng)由3D打印方法產(chǎn)生的個性化基因活化材料以實現(xiàn)優(yōu)選的結(jié)果。換而言之，恰恰是基因活化材料與受體部位所有表面的一致性和緊密粘附才使得實現(xiàn)其效率。與此同時，沒有基因構(gòu)建體的相同的個性化支架是完全沒有效率的，并且由相同材料制備和具有標準尺寸和形狀的非個性化基因活化植入物是沒有足夠效率的。

由本發(fā)明人所獲得的有益效果是很可能通過這樣的事實所解釋，一旦植入到大的骨缺損區(qū)域中，標準形狀和尺寸的非個性化基因活化材料的基因構(gòu)建體不直接接觸受體床細胞并且不能到達靶細胞。此外，在骨壁和基因活化材料之間大于1mm的分離使得大多數(shù)釋放的基因構(gòu)建體經(jīng)由充斥該空間的血凝塊酶和炎性液體而被破壞和快速消除。與此同時，由于在產(chǎn)品表面和骨缺損壁之間的顯著空間，駐留細胞遷移到植入物中是沒有足夠活性的。因此，考慮到低轉(zhuǎn)染效率，特別是在質(zhì)粒DNA的情況下，核酸已經(jīng)沒有以足夠的數(shù)量進入到細胞中而能夠提供治療效應(yīng)。

與此相反，個性化基因活化材料緊密地附著到具有小于1mm長度“游離空間”的受體床的所有表面。這一方面促進了細胞更快和更大規(guī)模地遷移到產(chǎn)物結(jié)構(gòu)中，另一方面，縮短了在到達靶細胞的路徑中基因構(gòu)建體必須覆蓋的距離。由于在基因活化材料和骨缺損壁之間空間不足，這種距離的縮短提供了更多的基因構(gòu)建體的保留，這對于實現(xiàn)治療效果是極其重要的。

因此，在基因活化材料的情況下，產(chǎn)品的形狀和尺寸與受體床參數(shù)之間精確的完全一致性對于實現(xiàn)產(chǎn)品的治療效果是至關(guān)重要的。發(fā)現(xiàn)這個事實已經(jīng)成為一種發(fā)現(xiàn)，其允許我們能夠開發(fā)用于大的(大于1CM³)骨缺損修復有效的骨替代物。然而，精確的個性化基因活化材料發(fā)現(xiàn)效率的詳細機制需要進一步的研究和闡述。

已經(jīng)部分解決了在生物醫(yī)學方法方面中大的骨缺損替代難題，我們面臨著另一個難題，外科手術(shù)。該難題是實現(xiàn)其骨誘導作用的基因活化材料不僅在植入后立即緊密地粘附于所有受體床表面，而且在所有時候保持在這樣的位置直到與周圍的骨組織完全整合。換而言之，個性化骨移植物必須被牢固地固定在接受部位中，否則其將不可避免的移動并且在植入物和受體區(qū)域之間將形成空間，其可能損害生物活性，導致運動性和甚至脫落。在支架是由允許標準固定物(螺釘、微螺釘、微型螺釘、銷、針)的機械強度高的材料組成的情況下-在手術(shù)期間任何固定物可以被直接擰入或插入其中而沒有損壞植入物，這個難題是很容易解決的。然而，正如它在我們進行的一些研究中，支架材料經(jīng)常是易碎的和不夠堅固的。例如，在嘗試鉆孔固定時，磷酸鈣的多孔基質(zhì)是很容易破裂的。在手術(shù)期間直接固定這類材料是極其困難的或者根本不可能的。

對于這一點，我們開發(fā)了缺乏機械強度的支架制備的個性化基因活化材料的額外的處理步驟和變體。該解決方案是將固定元件定位在可以以兩種方式實施的支架制造步驟內(nèi)的個性化基因活化的骨移植物中。第一種在于將由金屬或堅固的生物可再吸收材料制成的特殊核心引入至可以具有用于固定元件(螺釘、微螺釘、微型螺釘、銷、針等)的孔的內(nèi)部支架結(jié)構(gòu)中。通向核心(或核心中的孔)的通道將在植入物表面處形成，所述產(chǎn)品應(yīng)該在該處固定。第二種選擇是將外部固定系統(tǒng)(例如，具有微螺釘?shù)奈⑿徒庸前?安裝在預(yù)定位置和制造已經(jīng)具有固定元件的預(yù)定形狀和尺寸的支架。因此，個性化基因活化材料可以包括內(nèi)部的(核心)或外部的固定物。

重要的是，基于醫(yī)生提出的手術(shù)方案，固定元件必須在個性化基因活化植入物生產(chǎn)的第一步驟已經(jīng)被選擇。對于這一點，可以首先生產(chǎn)具有缺陷、萎縮或病理部位的區(qū)域的3D-骨模型，所述區(qū)域的校正需要骨缺損的形成。這個模型必須對計劃手術(shù)的醫(yī)生是可獲得的。醫(yī)生將重現(xiàn)計劃的操作(骨片段的切除，骨缺損壁的研磨，等)，并且在模型上定位固定元件(由金屬或堅固的生物可再吸收材料制成的結(jié)構(gòu))用于固定骨片段和個性化基因活化植入物。在其上正確位置處具有定位固定物的模型被用于計算個性化基因活化植入物制造的形態(tài)測量參數(shù)。

實施例

實施例1

沒有“嵌入式”固定元件的個性化基因活化材料

在通過本文提出的方法制造沒有固定物的個性化基因活化材料的變體之一之前，必須限定具有關(guān)鍵尺寸的骨缺損的適當生物模型。我們在選擇研究模型時遵循以下標準：1)骨缺損必須具有最大尺寸；2)允許塊在植入?yún)^(qū)域不使用任何金屬結(jié)構(gòu)而被可靠地固定?？紤]到上述標準，我們開發(fā)了一種具有20mm直徑的兔顱骨骨缺損的實驗?zāi)Ｐ汀Ｓ勉@頭實施顱骨截骨以形成骨缺損，其沒有損傷大腦的硬腦膜并且保留1mm寬的內(nèi)部皮質(zhì)板的碎片，在1、5、7和11點鐘方向投影處向缺損中心突出1mm。這些骨碎片段在所述位置作為支撐點與骨缺損尺寸的組合的保留已經(jīng)成為該模型的獨特特征。這種模型允許將個性化基因活化植入物固定在骨缺損區(qū)域而無需使用額外的固定技術(shù)。

在手術(shù)前進行兔子顱骨的多層螺旋計算機斷層掃描。使用3D切片機軟件(NHI，USA)，我們手動分割了所計劃的骨缺損，其中心位于與額頂骨和頂枕的縫合等距的矢狀縫合突出部?？紤]到計劃的骨缺損計算的形態(tài)測量參數(shù)，實施磷酸八鈣塊狀物的3D打印。該塊狀物被成型為厚度1.3mm，直徑20mm的凸盤形式，并且在顱骨替代后提供用于腦減壓術(shù)的17個穿孔(圖1，圖2)。

根據(jù)基于化學連接核酸至支架鈣的在先定義的實驗室規(guī)程，將通過3D打印生成的支架與基因構(gòu)建體(具有編碼血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因的質(zhì)粒DNA)相組合：

1)洗滌支架(在5-ml體積的0.5M磷酸鹽緩沖液中在37℃下持續(xù)振蕩12小時溫育)；

2)平衡(在5-ml體積的10mM磷酸鹽緩沖液中在37℃下持續(xù)振蕩處理，處理3次，每次10分鐘)；

3)干燥支架(在37℃下溫育直到完全干燥3小時)；

4)應(yīng)用基因構(gòu)建體(用在10mM磷酸鹽緩沖液中以1μg/μL的濃度的質(zhì)粒DNA溶液在37℃下持續(xù)振蕩12小時而溫育)；

5)從產(chǎn)品上洗掉未結(jié)合的質(zhì)粒DNA(用5-ml體積的5mM磷酸鹽溶液處理3次)；

6)干燥(在37℃下溫育直到完全干燥3小時)。

在用個性化基因活化替代物骨移植6.5個月之后，兔子顱骨的完整性已經(jīng)被完全修復。植入物沒有再吸收，但是其周邊區(qū)域與周圍的骨組織已經(jīng)完全整合。此外，沿著個性化基因活化移植物的內(nèi)部和外部表面形成了一個3-6mm長的新形成的骨組織。根據(jù)計算機斷層掃描和組織學研究，檢測到新形成的骨組織緊密地粘附到植入物上并且沒有形成任何結(jié)締組織夾層或密閉空間(圖3)。

在基因活化構(gòu)建體缺乏的情況下，新形成的骨組織體積是顯著較少的并且來自周邊的骨進展不超過1-2mm(圖4)。

實施例2

具有“嵌入式”固定元件的個性化基因活化材料

為了研究個性化基因活化材料的這個變體，我們開發(fā)了另一個模型：具有階梯式邊緣的近端和遠端骨片段的36mm長的兔子脛骨缺損。

使用本發(fā)明的方法創(chuàng)建個性化基因活化植入物(圖5)。

在第一個步驟中，實施3D打印以制造形態(tài)元件，其中將意欲固定植入物的微型接骨板和微螺釘定位。使用所得的模具，從磷酸三鈣中合成完全匹配模型參數(shù)和包含固定元件的支架。根據(jù)上述方案，將植入物與基因構(gòu)建體(具有vegf和sdf基因的質(zhì)粒DNA(編碼基質(zhì)細胞生長因子))組合。具有“嵌入式”固定系統(tǒng)的所得的個性化基因活化替代物被植入到完全匹配植入物參數(shù)的兔子脛骨缺損中(圖6)。

3個月后，肢體的支撐能力得到完全恢復。植入物在這個時間結(jié)束時沒有被再吸收，但是其周邊區(qū)域與骨碎片段完全整合(圖7)。

因此，我們開發(fā)的用于構(gòu)建個性化基因活化材料及其變體的方法，使制造對于包括大的骨缺損替代物的骨缺損替代物有效的醫(yī)療產(chǎn)品成為可能。

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