近年來(lái)，肽和蛋白質(zhì)偶聯(lián)已經(jīng)在具有治療作用的重要活性化合物的提供、在疾病過(guò)程的診斷以及在生化機(jī)理的闡述方面取得了重大成果[Flygare等，2013；Jones等，2013]。本質(zhì)上，通過(guò)偶聯(lián)可改變或調(diào)節(jié)肽和蛋白質(zhì)的性質(zhì)。治療相關(guān)的肽和蛋白質(zhì)能夠例如與生物相容性聚合物偶聯(lián)，以延長(zhǎng)所討論的肽或蛋白質(zhì)在血漿循環(huán)中的半衰期從而延長(zhǎng)其作用持續(xù)時(shí)間，或抵抗可能的免疫原性[Veronese和Maro，2008；Roberts等，2002]。此外，肽和蛋白質(zhì)能夠與生化標(biāo)記、染料或反應(yīng)性基團(tuán)偶聯(lián)，在給藥后，這些生化標(biāo)記、染料或反應(yīng)性基團(tuán)可用于深入觀察某些器官或細(xì)胞區(qū)域中的結(jié)合過(guò)程。引起廣泛研究興趣的另一領(lǐng)域?yàn)殡暮偷鞍踪|(zhì)與活性化合物的偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物在某些細(xì)胞或器官區(qū)域中以靶向的方式將這些活性化合物引導(dǎo)至預(yù)期的作用部位(藥物靶向)。突出的實(shí)例為抗體藥物偶聯(lián)物(ADC)，其以靶向的方式與某些結(jié)構(gòu)域/抗原結(jié)合，并在內(nèi)化至細(xì)胞和后續(xù)處理后(例如在溶酶體中)，在作用部位的腔室中釋放出活性化合物[Garnett，2011；Wu和Senter，2005；Sapra等，2011；Chari等，2014；Klinguer-Hamour等，2014；Tian等，2014]。有很多用于肽或蛋白質(zhì)偶聯(lián)的方法。因此，可以通過(guò)多種方法提供具有反應(yīng)性基團(tuán)的肽和蛋白質(zhì)，這些反應(yīng)性基團(tuán)隨后用作活性化合物或診斷劑的連接點(diǎn)[Ramil和Lin，2013]。此外，肽和蛋白質(zhì)可以通過(guò)其氨基酸的官能團(tuán)來(lái)偶聯(lián)[Widdison等，2006]。在本文中，挑戰(zhàn)在于提供在其他通常未保護(hù)的(游離)氨基酸基團(tuán)的存在下，使肽或蛋白質(zhì)中期望的官能團(tuán)進(jìn)行選擇性反應(yīng)的方法。另一種可能性在于，通過(guò)生物化學(xué)轉(zhuǎn)化而生成可進(jìn)行后續(xù)偶聯(lián)的反應(yīng)性基團(tuán)。突出的實(shí)例為將肽或蛋白質(zhì)中由半胱氨酸形成的一個(gè)或多個(gè)二硫鍵還原，以使得由此釋放的硫醇基進(jìn)行后續(xù)的偶聯(lián)。這可以通過(guò)單個(gè)硫醇優(yōu)選與馬來(lái)酰亞胺的偶聯(lián)而進(jìn)行[Ghosh等，1990]，或通過(guò)使前述二硫鍵的兩個(gè)硫醇基的橋聯(lián)而進(jìn)行。已描述了例如雙Michael受體用于這種硫醇的橋聯(lián)，其引起C1或C3橋聯(lián)[Liberatore等，1990；Godwin等，Int.Pat.Appl.WO2005/007197-A2，WO2010/100430-A1]，以及雙官能團(tuán)親電子馬來(lái)酰亞胺，其引起C2橋聯(lián)[Schumacher等，2013]：方案1a：方案1b：方案1；雙反應(yīng)性偶聯(lián)試劑：a)用于二硫C3橋聯(lián)的“平衡轉(zhuǎn)移烷基化交聯(lián)”(ETAC)試劑；b)用于二硫C2橋聯(lián)的雙官能團(tuán)馬來(lái)酰亞胺。方案1a和1b所概述的方法已成功用于提供抗體藥物偶聯(lián)物(ADC)。在本文中，將所討論的抗體的鏈間二硫橋還原成游離的硫醇基，然后以橋聯(lián)的方式進(jìn)行偶聯(lián)。在本發(fā)明的上下文中，我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)開(kāi)啟得到C2橋聯(lián)的肽和蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的新途徑的方法。在該方法中，在將由半胱氨酸形成的二硫橋還原后，使兩個(gè)硫醇在所謂的硫醇-炔(thiol-yne)反應(yīng)中與炔烴選擇性地反應(yīng)：方案2：方案2：用于肽和蛋白質(zhì)中被還原的二硫鍵的C2橋聯(lián)的硫醇-炔反應(yīng)。肽和蛋白質(zhì)的硫醇-炔反應(yīng)[硫醇-炔偶合(TYC)]本身是已知的。然而，它們迄今并未應(yīng)用于與具有游離硫醇基的半胱氨酸進(jìn)行C2橋聯(lián)偶聯(lián)，而是使各硫醇基單獨(dú)地而非以橋聯(lián)的方式進(jìn)行偶聯(lián)[LoConte等，2011；LoConte等，2010；Massi和Nanni，2012；Minozzi等，2011；Krannig等，2013；Aimetti等，2010]。同樣已知對(duì)于肽的硫醇-炔反應(yīng)，該反應(yīng)通過(guò)采用炔基對(duì)直鏈前體肽的合適位置進(jìn)行取代，然后使該炔基與所述肽的游離半胱氨酸反應(yīng)，而用于合成環(huán)肽[Aimetti等，Int.Pat.Appl.WO2011/156686-A2]。此反應(yīng)中形成的乙烯基硫化物可在后續(xù)反應(yīng)步驟中與其他(不同的)硫醇反應(yīng)。然而，與本文所述的本發(fā)明的方法相比，其并非使肽或蛋白質(zhì)的兩個(gè)游離半胱氨酸彼此橋聯(lián)的情況，而是在每種情況下使與肽或蛋白質(zhì)連接的炔烴與該肽或蛋白質(zhì)的半胱氨酸反應(yīng)。文獻(xiàn)中還記載了兩個(gè)連接的具有游離硫醇基的巰基乙酸酯的橋聯(lián)硫醇-炔反應(yīng)，其用于合成大環(huán)冠醚和輪烷結(jié)構(gòu)[Zhou等，2010]。此外，記載了與肽和蛋白質(zhì)的硫醇-炔反應(yīng)，所述反應(yīng)用于構(gòu)造三維網(wǎng)絡(luò)例如水凝膠[Anseth等，國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO2012/103445-A2；Kazantsev等，美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)US2014/0273153-A1]。與本文所述的本發(fā)明的方法相比，該方法得到的并非均質(zhì)的偶聯(lián)物，而是非均質(zhì)的聚合物網(wǎng)絡(luò)。上述半胱氨酸橋聯(lián)的一個(gè)重要特征是，基本保留了通過(guò)相應(yīng)的二硫橋而預(yù)先提供的肽或蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性或構(gòu)型。此外，在許多情況下，C2橋保留肽或蛋白質(zhì)的官能度，即對(duì)于生物靶標(biāo)的親合性[Jones等，2012；Gerona-Navarro等，2011]。另一方面，已知Michael加合物(例如上述C1橋聯(lián)或C3橋聯(lián)的偶聯(lián)物的情形(參見(jiàn)方案1a))在生理?xiàng)l件下能夠與其他硫醇化合物如谷胱甘肽或血清白蛋白進(jìn)行逆反應(yīng)和交換反應(yīng)，從而在血漿循環(huán)中發(fā)生一定的降解[Baldwin和Kiick，2011；Toda等，2013；Shen等，2012]。為抑制這種通常不期望的性質(zhì)，需要后續(xù)的化學(xué)轉(zhuǎn)化。在通過(guò)馬來(lái)酰亞胺進(jìn)行C2橋聯(lián)的偶聯(lián)物的情況下(參見(jiàn)方案1b)，需要使馬來(lái)酰亞胺或在飽和情況下使琥珀酰亞胺開(kāi)環(huán)以實(shí)現(xiàn)對(duì)硫醇的穩(wěn)定偶聯(lián)[Castaneda等，2013]?？赏ㄟ^(guò)本發(fā)明的方法經(jīng)硫醇-炔反應(yīng)而獲得的化合物并非Michael受體的偶聯(lián)物；因此，在這種情況下，預(yù)期不會(huì)發(fā)生所述逆反應(yīng)和交換反應(yīng)。針對(duì)所表明的
背景技術(shù)：
：：，本發(fā)明的目的是提供一種新的方法，通過(guò)該方法，可以使肽和蛋白質(zhì)通過(guò)其半胱氨酸基團(tuán)選擇性地偶聯(lián)并呈穩(wěn)定形式，從而用于各種限定的肽和蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的制備。為實(shí)現(xiàn)該目的，本發(fā)明提供一種方法，其通過(guò)與炔烴衍生物的選擇性地硫醇-炔反應(yīng)，使肽和蛋白質(zhì)中具有游離硫醇基的半胱氨酸形成偶聯(lián)的C2橋聯(lián)。合適的游離硫醇可以例如通過(guò)還原性二硫鍵而生成。此外，可以以適當(dāng)?shù)姆绞脚c取代基、官能團(tuán)和/或接頭(linker)單元一起提供炔烴衍生物，使得能夠?qū)δ繕?biāo)偶聯(lián)物的分子性質(zhì)進(jìn)行相應(yīng)調(diào)節(jié)。本發(fā)明提供一種用于制備均質(zhì)的肽和蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的方法，該方法的特征在于，將式(II)的肽或蛋白質(zhì)其中S1和S2表示所述肽或蛋白質(zhì)中的以二硫橋鍵合的半胱氨酸硫原子，在還原條件下轉(zhuǎn)化為式(III)的肽或蛋白質(zhì)然后將其與式(IV)的炔烴衍生物在自由基反應(yīng)條件下反應(yīng)其中R1和R2相互獨(dú)立地表示氫、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、羥基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羥基羰基、烷氧基羰基、烷基羰基氨基或烷氧基羰基氨基，其中烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基羰基、烷基羰基氨基和烷氧基羰基氨基自身可被相同或不同的選自以下的取代基單取代或多取代：鹵素、羥基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羥基羰基、烷氧基羰基、烷基羰基氨基和烷氧基羰基氨基，A表示鍵或具有1至100個(gè)碳原子的選自亞烷基、亞環(huán)烷基和/或亞芳基的烴鏈，所述烴鏈可被相同或不同的選自以下的基團(tuán)中斷1次或多于1次：-O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NH-、-N(CH3)-、-C(＝O)-、-NH-C(＝O)-、-C(＝O)-NH-、-O-C(＝O)-、-C(＝O)-O-、-SO2-NH-、-NH-SO2-、-NH-NH-、-SO2-NH-NH-、-NH-NH-SO2-、-C(＝O)-NH-NH-、-NH-NH-C(＝O)-、-NH-C(＝O)-NH-、-O-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝O)-O-和具有最多4個(gè)選自N、O、S、S(＝O)和S(＝O)2的雜原子的4至10元芳族或非芳族雜環(huán)，或者R2和A相互連接，并與位于中間的碳原子一起形成8元碳環(huán)，所述8元碳環(huán)可與3至6元環(huán)烷基環(huán)稠合，其中所述8元碳環(huán)以及任選地所述稠合的環(huán)烷基環(huán)可被相同或不同的選自以下的取代基單取代或多取代：氟、烷基、羥基、羥基烷基和烷氧基，L表示鍵或接頭，X可出現(xiàn)n次，并且表示活性化合物分子、聚合物、生物堿、肽、蛋白質(zhì)、碳水化合物、核苷酸、核苷、類(lèi)固醇、萜、卟啉、二氫卟酚、咕啉、類(lèi)花生酸、信息素、維生素、生物素、染料分子或穴狀配體，或表示氫、羥基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羥基羰基、烷氧基羰基、烷基羰基氨基、烷氧基羰基氨基、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基，其中烷基自身可被相同或不同的選自以下的取代基單取代或多取代：鹵素、羥基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羥基羰基、烷氧基羰基、烷基羰基氨基和烷氧基羰基氨基，以及其中環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基和雜芳基自身可被相同或不同的選自以下的取代基單取代或多取代：鹵素、烷基、羥基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羥基羰基、烷氧基羰基、烷基羰基氨基和烷氧基羰基氨基，以及n表示1至10范圍內(nèi)且包括1和10的整數(shù)，其中在存在多于一個(gè)X基團(tuán)的情況下，它們各自的含義可相同或不同，以生成式(I)的肽或蛋白質(zhì)偶聯(lián)物其中R1、R2、A、L、X和n具有以上所給出的含義。本發(fā)明的方法概括為以下反應(yīng)方案：方案3[a)：還原；b)：硫醇-炔反應(yīng)]。方案3所示的反應(yīng)步驟a)和b)可以開(kāi)進(jìn)行(包括中間體(III)的中間體分離)，或在同一反應(yīng)容器中連續(xù)進(jìn)行。優(yōu)選地，通過(guò)后者的“一鍋法”進(jìn)行反應(yīng)。優(yōu)選使用三(2-羧乙基)膦(TCEP)進(jìn)行二硫化物(II)至游離二硫醇(III)的還原。二硫醇(III)與式(IV)的炔烴衍生物形成式(I)的偶聯(lián)物的硫醇-炔反應(yīng)(其通過(guò)自由基機(jī)理進(jìn)行)，可通過(guò)光化學(xué)自由基引發(fā)劑或氧化生成的基團(tuán)(例如三乙基硼與少量氧氣)來(lái)介導(dǎo)。優(yōu)選使用已知的光化學(xué)自由基引發(fā)劑，如雙(2，4，6-三甲基苯甲?；?苯基氧化膦(819)或苯基-2，4，6-三甲基苯甲?；鶃嗢⑺徜?LAP)[Gong等，2013]。紫外光適合與自由基引發(fā)劑結(jié)合用于光化學(xué)引發(fā)。優(yōu)選波長(zhǎng)在350nm與400nm之間的紫外光，特別優(yōu)選波長(zhǎng)為365nm和385nm。優(yōu)選用于反應(yīng)步驟a)和b)的惰性溶劑為水、水性緩沖溶液或水與水溶性有機(jī)溶劑例如甲醇或乙醇的混合物。反應(yīng)通常在0℃至40℃的溫度范圍內(nèi)，優(yōu)選在室溫下進(jìn)行。如果本發(fā)明的待偶聯(lián)的肽或蛋白質(zhì)已經(jīng)以二硫醇的形式(III)存在，則不實(shí)施以上所列的還原步驟a)；在此情況下，本發(fā)明的方法涉及二硫醇(III)與炔烴衍生物(IV)在上述反應(yīng)步驟b)的條件下“直接”反應(yīng)以形成式(I)的偶聯(lián)物。本發(fā)明的方法還包括在式(II)的肽或蛋白質(zhì)中存在多個(gè)可進(jìn)行這種偶聯(lián)的二硫橋的情況下，按照上述反應(yīng)順序來(lái)制備式(II)的肽或蛋白質(zhì)與炔烴衍生物(IV)的多重偶聯(lián)物。此外，本發(fā)明提供通式(I)的肽和蛋白質(zhì)偶聯(lián)物其中S1和S2表示肽或蛋白質(zhì)中的先前以二硫橋鍵合的半胱氨酸硫原子，R1和R2相互獨(dú)立地表示氫、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、羥基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羥基羰基、烷氧基羰基、烷基羰基氨基或烷氧基羰基氨基，其中烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基羰基、烷基羰基氨基和烷氧基羰基氨基自身可被相同或不同的選自以下的取代基單取代或多取代：鹵素、羥基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羥基羰基、烷氧基羰基、烷基羰基氨基和烷氧基羰基氨基，A表示鍵或具有1至100個(gè)碳原子的選自亞烷基、亞環(huán)烷基和/或亞芳基的烴鏈，所述烴鏈可被相同或不同的選自以下的基團(tuán)中斷1次或多于1次：-O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NH-、-N(CH3)-、-C(＝O)-、-NH-C(＝O)-、-C(＝O)-NH-、-O-C(＝O)-、-C(＝O)-O-、-SO2-NH-、-NH-SO2-、-NH-NH-、-SO2-NH-NH-、-NH-NH-SO2-、-C(＝O)-NH-NH-、-NH-NH-C(＝O)-、-NH-C(＝O)-NH-、-O-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝O)-O-和具有最多4個(gè)選自N、O、S、S(＝O)和S(＝O)2的雜原子的4至10元芳族或非芳族雜環(huán)，或者R2和A相互連接，并與位于中間的碳原子一起形成8元碳環(huán)，所述8元碳環(huán)可與3至6元環(huán)烷基環(huán)稠合，其中所述8元碳環(huán)以及任選地所述稠合的環(huán)烷基環(huán)可被相同或不同的選自以下的取代基單取代或多取代：氟、烷基、羥基、羥基烷基和烷氧基，L表示鍵或接頭，X可出現(xiàn)n次，并且表示活性化合物分子、聚合物、生物堿、肽、蛋白質(zhì)、碳水化合物、核苷酸、核苷、類(lèi)固醇、萜、卟啉、二氫卟酚、咕啉、類(lèi)花生酸、信息素、維生素、生物素、染料分子或穴狀配體，或表示氫、羥基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羥基羰基、烷氧基羰基、烷基羰基氨基、烷氧基羰基氨基、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基，其中烷基自身可被相同或不同的選自以下的取代基單取代或多取代：鹵素、羥基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羥基羰基、烷氧基羰基、烷基羰基氨基和烷氧基羰基氨基，以及其中環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基和雜芳基自身可被相同或不同的選自以下的取代基單取代或多取代：鹵素、烷基、羥基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羥基羰基、烷氧基羰基、烷基羰基氨基和烷氧基羰基氨基，n表示1至10范圍內(nèi)且包括1和10的整數(shù)，其中在存在多于一個(gè)X基團(tuán)的情況下，它們各自的含義可相同或不同。在肽或蛋白質(zhì)具有多個(gè)可進(jìn)行本發(fā)明偶聯(lián)方法的二硫橋的情況下，本發(fā)明還包括這種肽或蛋白質(zhì)相應(yīng)的多重偶聯(lián)物，即在所討論的前體肽或蛋白質(zhì)的多個(gè)位置處產(chǎn)生式(I)意義上的成對(duì)C2橋聯(lián)的偶聯(lián)物。在本發(fā)明的上下文中，除非另外指定，取代基和基團(tuán)定義如下：在本發(fā)明的上下文中，烷基表示具有1至10個(gè)、優(yōu)選1至8個(gè)、特別優(yōu)選1至6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基。作為實(shí)例及作為優(yōu)選可提及以下：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、1-乙基丙基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、新戊基、正己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、3，3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、正庚基、正辛基、正壬基和正癸基。在本發(fā)明的上下文中，亞烷基表示具有1至10個(gè)、優(yōu)選1至8個(gè)、特別優(yōu)選1至6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的二價(jià)烷基(烷二基)。作為實(shí)例及作為優(yōu)選可提及以下：亞甲基、乙-1，1-二基、乙-1，2-二基(1，2-亞乙基)、丙-1，1-二基、丙-1，2-二基、丙-2，2-二基、丙-1，3-二基(1，3-亞丙基)、丁-1，2-二基、丁-1，3-二基、丁-2，3-二基、丁-1，4-二基(1，4-亞丁基)、戊-1，5-二基(1，5-亞戊基)、己-1，6-二基(1，6-亞己基)、庚-1，7-二基(1，7-亞庚基)、辛-1，8-二基(1，8-亞辛基)、壬-1，9-二基(1，9-亞壬基)和癸-1，10-二基(1，10-亞癸基)、在本發(fā)明的上下文中，羥基烷基表示在鏈中或末端位置處具有1至6個(gè)、優(yōu)選1至4個(gè)攜帶羥基作為取代基的碳原子的直鏈或支鏈烷基。作為實(shí)例及作為優(yōu)選可提及以下：羥基甲基、1-羥基乙基、2-羥基乙基、1-羥基-1-甲基乙基、1，1-二甲基-2-羥基乙基、1-羥基丙基、2-羥基丙基、3-羥基丙基、1-羥基-2-甲基丙基、2-羥基-1-甲基丙基、2-羥基-2-甲基丙基、1-羥基丁基、2-羥基丁基、3-羥基丁基、4-羥基丁基、5-羥基戊基和6-羥基己基。在本發(fā)明的上下文中，烷氧基表示具有1至6個(gè)、優(yōu)選1至4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷氧基。作為實(shí)例及作為優(yōu)選可提及以下：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、異戊氧基、1-乙基丙氧基、1-甲基丁氧基、2-甲基丁氧基、3-甲基丁氧基和正己氧基。在本發(fā)明的上下文中，烷氧基羰基表示具有1至6個(gè)、優(yōu)選1至4個(gè)碳原子并且通過(guò)與氧原子鍵合的羰基[-C(＝O)-]而與分子其余部分相連的直鏈或支鏈烷氧基。作為實(shí)例及作為優(yōu)選可提及以下：甲氧基羰基、乙氧基羰基、正丙氧基羰基、異丙氧基羰基、正丁氧基羰基和叔丁氧基羰基。在本發(fā)明的上下文中，烷基氨基表示具有含1至6個(gè)、優(yōu)選1至4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基取代基的氨基。作為實(shí)例及作為優(yōu)選可提及以下：甲基氨基、乙基氨基、正丙基氨基、異丙基氨基、正丁基氨基和叔丁基氨基。在本發(fā)明的上下文中，二烷基氨基表示具有兩個(gè)相同或不同的各自含1至6個(gè)、優(yōu)選1至4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基取代基的氨基。作為實(shí)例及作為優(yōu)選可提及以下：N，N-二甲基氨基、N，N-二乙基氨基、N-乙基-N-甲基氨基、N-甲基-N-正丙基氨基、N-異丙基-N-甲基氨基、N-異丙基-N-正丙基氨基、N，N-二異丙基氨基、N-正丁基-N-甲基氨基和N-叔丁基-N-甲基氨基。在本發(fā)明的上下文中，烷氧基羰基氨基表示具有直鏈或支鏈烷氧基羰基取代基的氨基，所述直鏈或支鏈烷氧基羰基取代基在烷氧基中含有1至6個(gè)、優(yōu)選1至4個(gè)碳原子并且通過(guò)羰基與氮原子相連。作為實(shí)例及作為優(yōu)選可提及以下：甲氧基羰基氨基、乙氧基羰基氨基、正丙氧基羰基氨基、異丙氧基羰基氨基、正丁氧基羰基氨基和叔丁氧基羰基氨基。在本發(fā)明的上下文中，烷基羰基表示具有1至6個(gè)、優(yōu)選1至4個(gè)碳原子并且通過(guò)羰基[-C(＝O)-]與分子其余部分相連的直鏈或支鏈烷基。作為實(shí)例及作為優(yōu)選可提及以下：乙?；?、丙酰基、正丁酰基、異丁?；⒄祯；托挛祯；?。在本發(fā)明的上下文中，烷基羰基氨基表示具有直鏈或支鏈烷基羰基取代基的氨基，所述直鏈或支鏈烷基羰基取代基在烷基中含有1至6個(gè)、優(yōu)選1至4個(gè)碳原子并且通過(guò)羰基與氮原子相連。作為實(shí)例及作為優(yōu)選可提及以下：乙酰基氨基、丙?；被?、正丁酰基氨基、異丁酰基氨基、正戊?；被托挛祯；被?。在本發(fā)明的上下文中，環(huán)烷基表示具有3至10個(gè)、優(yōu)選3至8個(gè)、特別優(yōu)選3至6個(gè)環(huán)碳原子的單環(huán)飽和碳環(huán)。作為實(shí)例及作為優(yōu)選可提及以下：環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基、環(huán)壬基和環(huán)癸基。在本發(fā)明的上下文中，亞環(huán)烷基表示具有3至10個(gè)、優(yōu)選3至8個(gè)、特別優(yōu)選3至6個(gè)環(huán)碳原子的單環(huán)飽和二價(jià)環(huán)烷基(環(huán)烷二基)。作為實(shí)例及作為優(yōu)選可提及以下：環(huán)丙-1，1-二基、環(huán)丙-1，2-二基、環(huán)丁-1，1-二基、環(huán)丁-1，2-二基、環(huán)丁-1，3-二基、環(huán)戊-1，1-二基、環(huán)戊-1，2-二基、環(huán)戊-1，3-二基、環(huán)己-1，1-二基、環(huán)己-1，2-二基、環(huán)己-1，3-二基、環(huán)己-1，4-二基、環(huán)庚-1，1-二基、環(huán)庚-1，2-二基、環(huán)庚-1，4-二基、環(huán)辛-1，2-二基、環(huán)辛-1，5-二基、環(huán)壬-1，2-二基、環(huán)壬-1，5-二基、環(huán)癸-1，2-二基和環(huán)癸-1，6-二基。在本發(fā)明的上下文中，雜環(huán)烷基表示飽和或含有雙鍵并且具有總計(jì)4至10個(gè)環(huán)原子的4至10元單環(huán)或任選雙環(huán)的非芳族雜環(huán)，其含有最多四個(gè)選自N、O、S、S(＝O)和/或S(＝O)2的環(huán)雜原子，并且通過(guò)環(huán)碳原子或任選地環(huán)氮原子相連。作為實(shí)例可提及以下：氮雜環(huán)丁基、氧雜環(huán)丁基、硫雜環(huán)丁基、吡咯烷基、吡咯啉基、吡唑烷基、二氫吡唑基、四氫呋喃基、四氫噻吩基、1，1-二氧化四氫噻吩基、1，3-噁唑烷基、1，3-噻唑烷基、哌啶基、四氫吡啶基、哌嗪基、四氫吡喃基、二氫吡喃基、四氫噻喃基、1，3-二噁烷基、1，4-二噁烷基、嗎啉基、硫代嗎啉基、1，1-二氧化硫代嗎啉基、六氫氮雜吖庚因基、六氫-1，4-二氮雜吖庚因基、八氫吖辛因基、八氫吡咯并[3，4-b]吡咯基、八氫異吲哚基、八氫吡咯并[3，4-b]吡啶基、六氫吡咯并[3，4-c]吡啶基、八氫吡咯并[1，2-a]吡嗪基、十氫異喹啉基、八氫吡啶并[1，2-a]吡嗪基、7-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚基、3-氮雜雙環(huán)[3.2.0]庚基、3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛基、8-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛基和8-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛基。優(yōu)選具有總計(jì)4至6個(gè)環(huán)原子的4至6元單環(huán)飽和雜環(huán)，其含有一或兩個(gè)選自N、O和S的環(huán)雜原子，并且通過(guò)環(huán)碳原子或任選地環(huán)氮原子相連。作為實(shí)例可提及以下：氮雜環(huán)丁基、氧雜環(huán)丁基、硫雜環(huán)丁基、吡咯烷基、吡唑烷基、四氫呋喃基、四氫噻吩基、1，3-噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、四氫吡喃基、四氫噻喃基、1，4-二噁烷基、嗎啉基和硫代嗎啉基。在本發(fā)明的上下文中，芳基表示具有6或10個(gè)環(huán)碳原子的芳族碳環(huán)，例如苯基和萘基。在本發(fā)明的上下文中，亞芳基表示二價(jià)芳基，例如1，2-亞苯基、1，3-亞苯基、1，4-亞苯基、萘-2，3-二基、萘-1，4-二基、萘-1，5-二基、萘-2，6-二基和萘-1，8-二基。在本發(fā)明的上下文中，雜芳基表示5至10元單環(huán)或任選雙環(huán)的芳族雜環(huán)(雜芳族)，其具有總計(jì)5至10個(gè)環(huán)原子，含有最多四個(gè)選自N、O和S的環(huán)雜原子，并且通過(guò)環(huán)碳原子或任選地環(huán)氮原子相連。作為實(shí)例可提及以下：呋喃基、吡咯基、噻吩基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、異噁唑基、異噻唑基、三唑基、噁二唑基、噻二唑基、四唑基、吡啶基、嘧啶基、噠嗪基、吡嗪基、三嗪基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并三唑基、吲哚基、吲唑基、喹啉基、異喹啉基、二氮雜萘基、喹唑啉基、喹喔啉基、酞嗪基和吡唑并[3，4-b]吡啶基。優(yōu)選具有總計(jì)5或6個(gè)環(huán)原子的5或6元單環(huán)雜芳基，其含有最多三個(gè)選自N、O和S的環(huán)雜原子，并且通過(guò)環(huán)碳原子或任選地環(huán)氮原子相連。作為實(shí)例可提及以下：呋喃基、噻吩基、噻唑基、噁唑基、異噻唑基、異噁唑基、吡唑基、咪唑基、三唑基、噁二唑基、噻二唑基、吡啶基、嘧啶基、噠嗪基、吡嗪基和三嗪基。在本發(fā)明的上下文中，鹵素包括氟、氯、溴和碘。優(yōu)選氯、氟或溴，特別優(yōu)選氟或氯。在本發(fā)明的上下文中，所有出現(xiàn)多于一次的基團(tuán)被相互獨(dú)立地定義。當(dāng)本發(fā)明的化合物中的基團(tuán)被取代時(shí)，除非另外指定，該基團(tuán)可以被單取代或多取代。優(yōu)選被一個(gè)或兩個(gè)或三個(gè)相同或不同的取代基取代。特別優(yōu)選被一個(gè)或兩個(gè)相同或不同的取代基取代。非常特別優(yōu)選被一個(gè)取代基取代。出于本發(fā)明的目的，“接頭”表示具有1至100個(gè)碳原子的選自亞烷基、亞環(huán)烷基和/或亞芳基的烴鏈，所述烴鏈可被相同或不同的選自以下的基團(tuán)中斷1次或多于1次：-O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NH-、-N(CH3)-、-C(＝O)-、-NH-C(＝O)-、-C(＝O)-NH-、-O-C(＝O)-、-C(＝O)-O-、-SO2-NH-、-NH-SO2-、-NH-NH-、-SO2-NH-NH-、-NH-NH-SO2-、-C(＝O)-NH-NH-、-NH-NH-C(＝O)-、-NH-C(＝O)-NH-、-O-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝O)-O-和具有最多4個(gè)選自N、O、S、S(＝O)和S(＝O)2的雜原子的4至10元芳族或非芳族雜環(huán)，并且可被體內(nèi)可裂解基團(tuán)或體內(nèi)短暫穩(wěn)定的基團(tuán)中斷1次或多于1次。術(shù)語(yǔ)“體內(nèi)可裂解基團(tuán)”可以細(xì)分成可通過(guò)化學(xué)手段(例如通過(guò)酸解或氧化還原方法)在體內(nèi)裂解的基團(tuán)，以及可以通過(guò)酶(即通過(guò)內(nèi)源酶的作用)在體內(nèi)裂解的基團(tuán)。這兩種可裂解基團(tuán)最初在循環(huán)系統(tǒng)中應(yīng)當(dāng)是穩(wěn)定的，并且僅在靶細(xì)胞處或靶細(xì)胞中因化學(xué)環(huán)境或酶環(huán)境不同(例如pH較低、谷胱甘肽濃度升高、存在溶酶體酶如組織蛋白酶或纖溶酶)而在該位置處裂解。適于此目的的通過(guò)化學(xué)方法在體內(nèi)可裂解的結(jié)構(gòu)片段特別地為二硫化物、腙、乙縮醛和縮醛胺類(lèi)。通過(guò)酶在體內(nèi)可裂解的結(jié)構(gòu)片段特別地為2至8個(gè)氨基酸的寡肽單元，并且此處特別地為二肽類(lèi)。文獻(xiàn)中已記載多種這樣指定的肽裂解位點(diǎn)。突出的實(shí)例為二肽單元纈氨酸-丙氨酸、纈氨酸-賴(lài)氨酸、纈氨酸-瓜氨酸、丙氨酸-賴(lài)氨酸和苯丙氨酸-賴(lài)氨酸[參見(jiàn)例如J.J.Petersen和C.F.Meares，BioconjugateChem.9，618-626(1998)；G.M.Dubowchik和R.A.Firestone，Bioorg.Med.Chem.Lett.8，3341-3346(1998)；G.M.Dubowchik等，BioconjugateChem.13，855-869(2002)]。上述接頭也可以包括體內(nèi)短暫穩(wěn)定的基團(tuán)。這種短暫穩(wěn)定的基團(tuán)在例如循環(huán)系統(tǒng)中在延長(zhǎng)的時(shí)間段內(nèi)(幾小時(shí)或幾天)在化學(xué)或酶環(huán)境作用下裂解[參見(jiàn)例如Flamme等，國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO2013/064455-A1]。在上述基團(tuán)X的定義中，合適的活性化合物分子特別地為用于癌癥療法的藥物如細(xì)胞毒素和細(xì)胞抑制劑。詳細(xì)而言，這些活性化合物能夠破壞癌細(xì)胞、引發(fā)細(xì)胞凋亡和/或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞增殖。作為這種用于癌癥療法的活性化合物的實(shí)例，可提及以下：抗代謝藥，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、克拉屈濱(cladribine)、氟達(dá)拉濱(fludarabine)、巰嘌呤(mercaptopurine)、硫鳥(niǎo)嘌呤(tioguanine)、噴司他丁(pentostatin)、阿糖孢苷(cytarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、卡培他濱(capecitabine)和吉西他濱(gemcitabine)；烷化劑，例如環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、絲裂霉素(mitomycin)、曲磷胺(trofosfamide)、噻替派(thiotepa)、白消安(busulfan)、蘇消安(treosulfan)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、丙卡巴肼(procarbazine)、達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)和鉑化合物順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)和奧沙利鉑(oxaliplatin)；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，例如拓?fù)涮婵?topotecan)、伊立替康(irinotecan)、依托泊苷(etoposide)和替尼泊苷(teniposide)；激酶抑制劑，例如索拉非尼(sorafenib)、瑞格非尼(regorafinib)、舒尼替尼(sunitinib)、阿法替尼(afatinib)、埃羅替尼(erlotinib)和吉非替尼(gefitinib)；細(xì)胞有絲分裂抑制劑，例如長(zhǎng)春堿(vinblastine)、長(zhǎng)春新堿(vincristine)、長(zhǎng)春瑞濱(vinorelbine)、紫杉醇(paclitaxel)和多西他賽(docetaxel)；以及抗生素，例如更生霉素(dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、伊達(dá)比星(idarubicin)、表柔比星(epirubicin)、博來(lái)霉素(bleomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)和安吖啶(amsacrine)?；鶊F(tuán)X范圍內(nèi)所包括的其他活性化合物為細(xì)胞毒素化合物和毒素，例如作為特別用于癌癥療法的抗體藥物偶聯(lián)物(ADC)中的“毒性基團(tuán)(toxophore)”而已進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性和臨床研究的那些。此處可提及的實(shí)例特別地為如下物質(zhì)，例如：美坦辛(maytansine)和美登素類(lèi)化合物(maytansinoids)(DM-1，DM-4)、多拉司他汀(dolastatins)、澳瑞他汀(auristatins)(MMAE，MMAF)、卡利奇霉素(calicheamicins)、多米卡星(duocarmycins)、喜樹(shù)堿(camptothecins)(拓?fù)涮婵?、依沙替?exatecan)、依立替康、SN-38)、多柔比星、鵝膏毒素(amatoxins)(鵝膏蕈堿(amanitin))、吡咯并苯并二氮雜卓(pyrrolobenzodiazepines)(PBD)和紡錘體驅(qū)動(dòng)蛋白(kinesinspindleprotein)(KSP)抑制劑。根據(jù)本發(fā)明，式(II)的肽和蛋白質(zhì)含有至少兩個(gè)形成二硫鍵或能夠形成二硫鍵的半胱氨酸氨基酸。這種肽包括例如肽激素，如胰島素、促生長(zhǎng)素抑制素、催產(chǎn)素、特利加壓素、腎上腺髓質(zhì)素、降鈣素或加壓素。這種蛋白質(zhì)可提及的實(shí)例為抗體、細(xì)胞因子(如白細(xì)胞介素)以及白蛋白。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“抗體”應(yīng)以其最廣泛的含義來(lái)理解，并且是指免疫球蛋白分子，例如原生的或改性的單克隆抗體、多克隆抗體或多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及其片段。免疫球蛋白分子優(yōu)選表示具有四條多肽鏈的分子，所述四條多肽鏈由兩條重鏈(H鏈，HC)和兩條輕鏈(L鏈，LC)組成，其通常通過(guò)二硫橋(鏈間二硫橋)相互連接。每條重鏈包括可變區(qū)(縮寫(xiě)為VH)和恒定區(qū)(CH)。對(duì)于重鏈的恒定區(qū)，其可以具有三個(gè)(CH1、CH2、CH3)或四個(gè)子結(jié)構(gòu)域。每條輕鏈也包括可變區(qū)(VL)和恒定區(qū)(CL)。VH和VL區(qū)可以再細(xì)分成具有高變異性的結(jié)構(gòu)域(其也被稱(chēng)作互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR))和具有較低序列變異性的結(jié)構(gòu)域(框架區(qū)，F(xiàn)R)。每個(gè)VH和VL區(qū)通常由三個(gè)CDR和最多四個(gè)FR，按照例如從氨基至羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的順序組成?？贵w可由任何合適的物種，例如猴、豬、兔、小鼠或大鼠獲得。在特定的實(shí)施方案中，所述抗體為人或鼠源的抗體。這種抗體可以例如是人源的、人源化的或嵌合的抗體。此外，本發(fā)明提供式(I)的偶聯(lián)物用于診斷和/或治療疾病——特別是用于診斷和/或治療癌癥和腫瘤疾病——的用途。本發(fā)明還提供式(I)的偶聯(lián)物用于診斷和/或治療疾病——特別是癌癥和腫瘤疾病——的方法中的用途。本發(fā)明還提供用于診斷和/或治療疾病——特別是癌癥和腫瘤疾病——的方法，其使用一種或多種式(I)的偶聯(lián)物。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“治療”包括抑制、延遲、阻止、緩解、減弱、限制、減輕、壓制、抵御或治愈疾病、病癥、紊亂、損傷或健康問(wèn)題，或這種狀態(tài)的發(fā)展、病程或進(jìn)展和/或這種狀態(tài)的癥狀。此處，術(shù)語(yǔ)“療法”應(yīng)理解為與術(shù)語(yǔ)“治療”同義。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“診斷”以通常的含義理解為對(duì)疾病、病癥、紊亂、疾病癥狀、損傷或健康問(wèn)題的(區(qū)分)鑒定、識(shí)別、確定、評(píng)估、分類(lèi)和命名。本發(fā)明還提供藥物組合物及其用于前述目的的用途，所述藥物組合物包含至少一種式(I)的偶聯(lián)物，通常連同一種或多種惰性、無(wú)毒、藥學(xué)上適合的助劑。本發(fā)明的式(I)的偶聯(lián)物可全身和/或局部地發(fā)揮作用。為此，其可以合適的方式，例如通過(guò)口服、腸胃外、肺、鼻、舌下、舌、頰、直腸、真皮、經(jīng)皮、結(jié)膜或耳的途徑，或者作為植入物或支架來(lái)給藥。本發(fā)明的偶聯(lián)物可以適合于這些給藥途徑的給藥形式來(lái)給藥。適于口服給藥的給藥形式為根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)起作用并且迅速和/或以改進(jìn)的方式釋放本發(fā)明的偶聯(lián)物的給藥形式，以及包含結(jié)晶和/或無(wú)定形和/或溶解形式的本發(fā)明的偶聯(lián)物的給藥形式，例如片劑(未包衣或包衣的片劑，如具有抗胃液或延緩溶解或不溶的包衣(其控制本發(fā)明的偶聯(lián)物的釋放)的片劑)、在口腔中迅速崩解的片劑或膜劑/糯米紙囊劑(oblates)、膜劑/凍干劑、膠囊劑(如硬或軟的明膠膠囊)、糖衣片劑、顆粒劑、丸劑、粉劑、乳劑、懸浮劑、氣霧劑或溶液劑。腸胃外給藥可以在避免再吸收步驟(例如通過(guò)靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、心內(nèi)、脊椎內(nèi)或腰椎內(nèi)的途徑)或包括再吸收(例如通過(guò)肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、經(jīng)皮或腹膜內(nèi)的途徑)的情況下完成。適于腸胃外給藥的給藥形式包括呈溶液劑、懸浮劑、乳劑、凍干劑或無(wú)菌粉劑形式的注射劑和輸液制劑。對(duì)于其他的給藥途徑，合適的實(shí)例為吸入藥物(包括粉末吸入劑、噴霧劑)，滴鼻劑，溶液劑或噴霧劑，用于舌、舌下或頰給藥的片劑，膜劑/糯米紙囊劑或膠囊劑，栓劑，耳部或眼部制劑，陰道膠囊劑、水性懸浮劑(洗液、振蕩合劑(shakingmixture))，親脂性懸浮劑，軟膏劑，乳膏劑，透皮治療系統(tǒng)(例如貼劑)，乳劑，糊劑，泡沫劑，灑粉劑(dustingpowder)，植入物或支架。優(yōu)選腸胃外給藥，特別是靜脈給藥。本發(fā)明的偶聯(lián)物可以轉(zhuǎn)化為所提及的給藥形式。這可以以本身已知的方式，通過(guò)與惰性、無(wú)毒、藥學(xué)上適合的賦形劑混合來(lái)實(shí)現(xiàn)。這些賦形劑包括載體(例如微晶纖維素、乳糖、甘露糖醇)、溶劑(例如液態(tài)聚乙二醇)、乳化劑和分散劑或潤(rùn)濕劑(例如十二烷基硫酸鈉、聚氧脫水山梨糖醇油酸酯)、粘合劑(例如聚乙烯吡咯烷酮)、合成和天然聚合物(例如白蛋白)、穩(wěn)定劑(例如抗氧化劑，如抗壞血酸)、著色劑(例如無(wú)機(jī)顏料，如鐵氧化物)以及味道和/或氣味矯味劑。以下工作實(shí)施例用來(lái)舉例說(shuō)明本發(fā)明。本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。A.實(shí)施例縮略語(yǔ)和縮略詞：abs.無(wú)水的，絕對(duì)純的aq.水性的，水溶液Boc叔丁氧羰基c濃度DMFN，N-二甲基甲酰胺DMPA2，2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮DMSO二甲亞砜DPBSDulbecco磷酸鹽緩沖鹽水DTT二硫蘇糖醇ELSD蒸發(fā)光散射檢測(cè)器eq.當(dāng)量ES或ESI電噴霧電離(MS中)FAB抗原結(jié)合片段h小時(shí)HPLC高壓、高效液相色譜法HRMS高分辨質(zhì)譜法819雙(2，4，6-三甲基苯甲?；?苯基氧化膦conc.濃的(在溶液的情況下)LAP苯基-2，4，6-三甲基苯甲?；鶃嗢⑺徜嘗C/MS液相色譜法-質(zhì)譜法聯(lián)用LED發(fā)光二極管lit.文獻(xiàn)(參考文獻(xiàn))m多重峰(在NMR中)m/z質(zhì)量/電荷比(在MS中)min分鐘MPLC中壓液相色譜法(在硅膠上；也稱(chēng)作快速色譜法)MS質(zhì)譜法NMR核磁共振波譜法PBS磷酸鹽緩沖鹽水RP反相(在HPLC中)RT室溫Rt保留時(shí)間(在HPLC、LC/MS中)TCEP-HCl三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽tert叔的TFA三氟乙酸THF四氫呋喃TOF飛行時(shí)間質(zhì)譜法UV紫外光(譜)v/v體積比(溶液的)LC/MS方法：方法1：儀器：WatersAcquitySQDUPLC系統(tǒng)；柱：WatersAcquityHPLCHSST31.8μm，50×1mm；流動(dòng)相A：1l水+0.25ml99％甲酸，流動(dòng)相B：1l乙腈+0.25ml99％甲酸；梯度：0.0min95％A→6.0min5％A→7.5min5％A；柱溫：50℃；流速：0.35ml/min；UV檢測(cè)：210-400nm。方法2：MS儀器類(lèi)型：WatersSynaptG2S；UPLC儀器類(lèi)型：WatersAcquityI-Class；柱：WatersHSST3，2.1×50mm，C181.8μm；流動(dòng)相A：1l水+0.01％甲酸，流動(dòng)相B：1l乙腈+0.01％甲酸；梯度：0.0min2％B→2.0min2％B→13.0min90％B→15.0min90％B；柱溫：50℃；流速：1.20ml/min；UV檢測(cè)：210nm。方法3：MS儀器類(lèi)型：ThermoFisherScientificLTQ-Orbitrap-XL；HPLC儀器類(lèi)型：Agilent1200SL；柱：AgilentPoroshell120SB-C182.7μm，3×150mm；流動(dòng)相A：1l水+0.1％三氟乙酸，流動(dòng)相B：1l乙腈+0.1％三氟乙酸；梯度：0.0min2％B→1.5min2％B→15.5min95％B→18.0min95％B；柱溫：40℃；流速：0.75ml/min；UV檢測(cè)：210nm。起始化合物：化合物AN-(2，5，8，11，14，17，20，23-八氧雜環(huán)二十五烷-25-基)己-5炔酰胺在氬氣氣氛下，首先將27.8μl(0.25mmol)己-5-炔酸和48.3mg(0.25mmol)1，1′-羰基二咪唑加入1ml無(wú)水DMF中。將混合物在室溫下攪拌2小時(shí)。然后，加入溶解于0.5ml無(wú)水DMF的100.0mg(0.25mmol)2，5，8，11，14，17，20，23-八氧雜環(huán)二十五烷-25-胺。將混合物在室溫下攪拌過(guò)夜，然后在減壓下濃縮。將殘余物通過(guò)制備型MPLC純化。將含產(chǎn)物的部分濃縮，向殘余物中加入10ml水，并將混合物用乙酸乙酯萃取三次(每次10ml)。將合并的有機(jī)相經(jīng)硫酸鎂干燥并在減壓下濃縮，并將殘余物在高真空下干燥(產(chǎn)物收率：22mg)。將先前制得的水相凍干，并將凍干物通過(guò)硅膠色譜法純化(流動(dòng)相：首先二氯甲烷/甲醇100∶5，然后二氯甲烷/甲醇9∶1)。這得到37.8mg透明的油?？偸章剩?9.8mg(理論值的51％)1H-NMR(400MHz，CDCl3)：[ppm]＝1.87(quin，J＝7.1Hz，2H)，1.99(t，J＝2.5Hz，1H)，2.26(td，J＝6.9以及2.7Hz，2H)，2.32(t，J＝7.4Hz，2H)，3.38(s，3H)，3.45(q，J＝5.4Hz，2H)，3.55(m，4H)，3.60-3.71(m，26H)，6.18(br.s，1H)。13C-NMR(125.78MHz，CDCl3)：δ[ppm]＝172.21，83.61，71.93，70.60，70.56，70.53，70.51，70.25，69.87，69.12，59.03，39.18，35.00，24.18，17.88?；衔顱4-(己-5-炔-1-基)-4-甲基嗎啉-4-鎓碘鹽將3.0ml(22.7mmol)6-碘己-1-炔滴加至2.5ml(22.7mmol)4-甲基嗎啉中。將混合物在室溫下攪拌5分鐘，然后在54℃下攪拌10分鐘。其后，將該混合物冷卻至室溫并再攪拌16小時(shí)，然后加入少量石油醚、二乙醚以及最后的乙酸乙酯。將沉淀物濾出，并將濾液在減壓下濃縮。將所得沉淀物濾出并用乙酸乙酯洗滌。將白色至米黃色的粉末在高真空下干燥。收率：593.6mg(理論值的9％)。1H-NMR(400MHz，D2O)：[ppm]＝1.62(quin，J＝7.3Hz，2H)，1.95(m，2H)，2.33(td，J＝7以及2.6Hz，2H)，2.41(t，J＝2.6Hz，1H)，3.21(s，3H)，3.46-3.60(m，6H)，4.06(br.s，4H)。13C-NMR(125.78MHz，D2O)：δ[ppm]＝84.64，70.01，66.59，60.42，59.64，59.58，24.23，20.13，17.11。MS(ESpos)：m/z＝182.2。工作實(shí)施例：實(shí)施例1(5R，12R)-12-{[(芐氧基)羰基]氨基}-5-羧基-8-(8-羧辛基)-3-氧代-1-苯基-2-氧雜-7，10-二硫雜-4-氮雜十三烷-13-甲酸在雙頸圓底燒瓶中，首先將100.00mg(0.19mmol)N，N′-雙[(芐氧基)羰基]-L-胱氨酸和79.47mg(277.25μmol)TCEP-HCl在氬氣氣氛下加入1ml水/甲醇(1∶1v/v)中。將混合物在室溫下攪拌2.5小時(shí)。然后，加入33.69mg(0.19mmol)十一碳-10-炔酸和3.87mg(9.24μmol)819。通過(guò)雙頸燒瓶的磨口玻璃接頭，引入(距離反應(yīng)混合物約40mm)LED-UV燈頭(OmnicureLX400，直徑12mm；igb-techGmbH，德國(guó))，并將反應(yīng)混合物用365nm的紫外光照射1小時(shí)。HPLC(流動(dòng)相：梯度乙腈/水+0.1％TFA；ELSD)的轉(zhuǎn)化率是定量的。然后，將反應(yīng)溶液用甲醇稀釋?zhuān)⑼ㄟ^(guò)制備型HPLC(流動(dòng)相：梯度乙腈/水+0.1％TFA)純化。這得到39mg(理論值的27％，根據(jù)LC/MS的純度為88％)目標(biāo)化合物。LC/MS(方法1)：Rt＝3.45min；MS(ESIpos)：m/z＝693[M+H]+1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ[ppm]＝1.24-1.50(m，13H)，1.55-1.60(m，2H)，1.72-1.79(m，1H)，2.66-3.18(m，7H)，4.34-4.40(m，2H)，5.07-5.14(m，4H)，7.26-7.38(m，10H)。實(shí)施例2A和2B2A：5-[(6R，9S，12S，15S，18S，21R)-21-{[({[(氨基乙酰基)氨基]乙?；鶀氨基)乙酰基]氨基}-6-{[(2S)-2-({(2S)-6-氨基-1-[(2-氨基-2-氧代乙基)氨基]-1-氧代己-2-基}氨基甲?；?吡咯烷-1-基]羰基}-9-(2-氨基-2-氧代乙基)-12-(3-氨基-3-氧代丙基)-15-芐基-18-(4-羥基芐基)-8，11，14，17，20-五氧代-1，4-二硫雜-7，10，13，16，19-五氮雜環(huán)二十二烷-3-基]戊酸2B：5-[(6R，9S，12S，15S，18S，21R)-21-{[({[(氨基乙酰基)氨基]乙酰基}氨基)乙?；鵠氨基}-6-{[(2S)-2-({(2S)-6-氨基-1-[(2-氨基-2-氧代乙基)氨基]-1-氧代己-2-基}氨基甲酰基)吡咯烷-1-基]羰基}-9-(2-氨基-2-氧代乙基)-12-(3-氨基-3-氧代丙基)-15-芐基-18-(4-羥基芐基)-8，11，14，17，20-五氧代-1，4-二硫雜-7，10，13，16，19-五氮雜環(huán)二十二烷-2-基]戊酸2A：2B：在氬氣氣氛下，首先將50.17mg(37.23μmol)乙酸特利加壓素(購(gòu)自Bachem，瑞士；序列：H-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2，作為環(huán)狀Cys二硫化物)加入于雙頸燒瓶中的1.1ml水中，并加入16.01mg(55.85μmol)TCEP-HCl。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2小時(shí)，然后加入4.70mg(37.23mmol)庚-6-炔酸于100μl甲醇中的溶液，其后，加入于150μl水中的0.55mg(1.86μmol)LAP[通過(guò)從文獻(xiàn)(Gong等，2013)中獲知的方法制備]。通過(guò)雙頸燒瓶的磨口玻璃接頭，引入(距離反應(yīng)混合物約40mm)LED-UV燈頭(OmnicureLX400，直徑12mm；igb-techGmbH，德國(guó))，并將反應(yīng)混合物用365nm的紫外光照射1小時(shí)。然后，再加入0.55mg(1.86μmol)LAP，并將反應(yīng)混合物用365nm的紫外光再照射1小時(shí)。然后，將反應(yīng)混合物通過(guò)制備型HPLC(柱：WatersX-BridgeBEH130PrepC1810μmOBD，19×250mm；流動(dòng)相A：含0.05％TFA的水，流動(dòng)相B：含0.05％TFA的乙腈；梯度：0.0min5％B→40min40％B)分離同分異構(gòu)產(chǎn)物來(lái)純化。異構(gòu)體1：LC/MS(方法2)：Rt＝3.53min；MS(ESpos)：m/z＝1355[M+H]+。異構(gòu)體2：收率：1.3mg(理論值的2.6％)LC/MS(方法2)：Rt＝3.57min；MS(ESpos)：m/z＝1355[M+H]+13C-NMR(125.78MHz，D2O，δ(1，4-二氧六環(huán))＝67.4ppm)：δ[ppm]＝183.1(S)，182.1(S)，178.5(S)，175.2(3S)，174.7(S)，174.0(S)，173.9(S)，172.7(S)，172.5(S)，171.5(S)，170.9，168.7，155.2(S)，137.0(S)，131.4(S)，130.0(S)，129.7(S)，128.8(S)，128.2(S)，116.3(S)，61.7(D)，57.1(D)，55.6(D)，55.3(D)，54.5(D)，53.4(D)，52.6(D)，50.7(D)，48.8(T)，45.7(D)，43.2(T)，43.0(T)，42.9(T)，41.3(T)，40.1(T)，38.8(T)，37.0(T)，36.6(T)，36.4(2T)，34.0(T)，33.6(T)，31.9(2T)，30.9(T)，30.1(T)，27.0(T)，26.9(T)，26.8(T)，25.6(T)，25.5(T)，22.9(T)[對(duì)應(yīng)閉環(huán)結(jié)構(gòu)，因?yàn)椴荒軝z測(cè)到烯碳原子]。該異構(gòu)體的1HNMR譜圖示于圖1中。實(shí)施例3A和3B3A：(2S)-1-{[(6R，9S，12S，15S，18S，21R)-21-{[({[(氨基乙?；?氨基]乙酰基}氨基)乙?；鵠氨基}-9-(2-氨基-2-氧代乙基)-12-(3-氨基-3-氧代丙基)-15-芐基-18-(4-羥基芐基)-8，11，14，17，20-五氧代-3-(27-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23-八氧雜-26-氮雜三十烷-30基)-1，4-二硫雜-7，10，13，16，19-五氮雜環(huán)二十二烷-6-基]羰基}-N-{(2S)-6-氨基-1-[(2-氨基-2-氧代乙基)氨基]-1-氧代己-2-基}吡咯烷-2-甲酰胺3B：(2S)-1-{[(6R，9S，12S，15S，18S，21R)-21-{[({[(氨基乙?；?氨基]乙?；鶀氨基)乙酰基]氨基}-9-(2-氨基-2-氧代乙基)-12-(3-氨基-3-氧代丙基)-15-芐基-18-(4-羥基芐基)-8，11，14，17，20-五氧代-2-(27-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23-八氧雜-26-氮雜三十烷-30基)-1，4-二硫雜-7，10，13，16，19-五氮雜環(huán)二十二烷-6-基]羰基}-N-{(2S)-6-氨基-1-[(2-氨基-2-氧代乙基)氨基]-1-氧代己-2-基}吡咯烷-2-甲酰胺3A：3B：在氬氣氣氛下，首先將20.64mg(15.32μmol)乙酸特利加壓素(購(gòu)自Bachem，瑞士；序列：H-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2，作為環(huán)狀Cys二硫化物)加入于雙頸燒瓶中的500μlDPBS緩沖液中，并加入13.30mg(46.39μmol)TCEP-HCl。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2小時(shí)，然后加入7.20mg(15.15μmol)N-(2，5，8，11，14，17，20，23-八氧雜二十五烷-25-基)己-5-炔酰胺于150μlDPBS緩沖液中的溶液。其后，將4.4mg(14.95μmol)LAP[通過(guò)從文獻(xiàn)(Gong等，2013)中獲知的方法制備]溶解在500μlDPBS緩沖液中，并將50μl該LAP溶液加入反應(yīng)混合物中。通過(guò)雙頸燒瓶的磨口玻璃接頭，引入(距離反應(yīng)混合物約40mm)LED-UV燈頭(OmnicureLX400，直徑12mm；igb-techGmbH，德國(guó))，并將反應(yīng)混合物用365nm的紫外光照射1小時(shí)。然后，加入50μlLAP溶液并隨后再重復(fù)兩次用365nm的紫外光照射1小時(shí)。然后，將反應(yīng)混合物通過(guò)制備型HPLC(柱：WatersX-BridgeBEH130PrepC1810μmOBD，19×250mm；流動(dòng)相A：含0.1％TFA的水，流動(dòng)相B：含0.1％TFA的乙腈；梯度：0.0min5％B→3min5％B→43min40％B→44.30min95％B→49.30min95％B)分離。產(chǎn)物級(jí)分1：收率：6.20mg(理論值的23％)；根據(jù)LC/MS(方法3)的純度：99％LC/MS(方法3)：Rt＝7.41min；MS(ESpos)：m/z＝853.9101[M+2H]2+HRMS：對(duì)于C75H121O24N17S2[M+2H]2+的計(jì)算值：853.9100，測(cè)量值：853.9100。該產(chǎn)物級(jí)分的1HNMR和13CNMR譜圖示于圖2和圖3中。產(chǎn)物級(jí)分2：收率：1.70mg(理論值的7％)LC/MS(方法2)：Rt＝4.09min；MS(ESpos)：m/z＝853.9149[M+2H]2+HRMS：對(duì)于C75H121O24N17S2[M+2H]2+的計(jì)算值：853.9100，測(cè)量值：853.9095。實(shí)施例4A和4B4A：4-{4-[(6R，9S，12S，15S，18S，21R)-21-{[({[(氨基乙?；?氨基]乙?；鶀氨基)乙?；鵠氨基}-6-{[(2S)-2-({(2S)-6-氨基-1-[(2-氨基-2-氧代乙基)氨基]-1-氧代己-2-基}氨基甲?；?吡咯烷-1-基]羰基}-9-(2-氨基-2-氧代乙基)-12-(3-氨基-3-氧代丙基)-15-芐基-18-(4-羥基芐基)-8，11，14，17，20-五氧代-1，4-二硫雜-7，10，13，16，19-五氮雜環(huán)二十二烷-3-基]丁基}-4-甲基嗎啉-4-鎓三氟乙酸鹽4B：4-{4-[(6R，9S，12S，15S，18S，21R)-21-{[({[(氨基乙酰基)氨基]乙?；鶀氨基)乙酰基]氨基}-6-{[(2S)-2-({(2S)-6-氨基-1-[(2-氨基-2-氧代乙基)氨基]-1-氧代己-2-基}氨基甲?；?吡咯烷-1-基]羰基}-9-(2-氨基-2-氧代乙基)-12-(3-氨基-3-氧代丙基)-15-芐基-18-(4-羥基芐基)-8，11，14，17，20-五氧代-1，4-二硫雜-7，10，13，16，19-五氮雜環(huán)二十二烷-2-基]丁基}-4-甲基嗎啉-4-鎓三氟乙酸鹽4A：4B：在氬氣氣氛下，首先將21.54mg(15.98μmol)乙酸特利加壓素(購(gòu)自Bachem，瑞士；序列：H-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2，作為環(huán)狀Cys二硫化物)加入于雙頸燒瓶中的800μlDPBS緩沖液中，并加入6.50mg(22.68μmol)TCEP-HCl。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2小時(shí)，然后加入4.9mg(15.84μmol)4-(己-5-炔-1-基)-4-甲基嗎啉-4-鎓碘鹽于500μlDPBS緩沖液中的溶液。其后，將4.70mg(15.98μmol)LAP[通過(guò)從文獻(xiàn)(Gong等，2013)中獲知的方法制備]溶解在500μlDPBS緩沖液中，并將50μl該LAP溶液加入反應(yīng)混合物中。通過(guò)雙頸燒瓶的磨口玻璃接頭，引入(距離反應(yīng)混合物約40mm)LED-UV燈頭(OmnicureLX400，直徑12mm；igb-techGmbH，德國(guó))，并將反應(yīng)混合物用365nm的紫外光照射1小時(shí)。然后，加入50μlLAP溶液并隨后再重復(fù)兩次用365nm的紫外光照射1小時(shí)。然后，將反應(yīng)混合物通過(guò)制備型HPLC(柱：PhenomenexKinetexPrep5μmC18AXIAPackedLCColumn，21.2×100mm；流動(dòng)相A：含0.1％TFA的水，流動(dòng)相B：含0.08％TFA的乙腈；梯度：0.0min5％B→3min5％B→63min40％B→64.30min95％B→69.30min95％B)分離。產(chǎn)物級(jí)分1：收率：1.5mg(理論值的4％)；根據(jù)LC/MS(方法3)的純度：65％LC/MS(方法3)：Rt＝6.49min；MS(ESpos)：m/z＝705.8397[M+2H]2+HRMS：對(duì)于C63H97O16N17S2[M+2H]2+的計(jì)算值：705.8365，測(cè)量值：705.8361。該產(chǎn)物級(jí)分的1HNMR譜圖示于圖4中。產(chǎn)物級(jí)分2：收率：2.2mg(理論值的8％)；根據(jù)LC/MS(方法3)的純度：87％LC/MS(方法3)：Rt＝6.48min；MS(ESpos)：m/z＝705.8401[M+2H]2+HRMS：對(duì)于C63H97O16N17S2[M+2H]2+的計(jì)算值：705.8365，測(cè)量值：705.8377。該產(chǎn)物級(jí)分的1HNMR譜圖示于圖5中。實(shí)施例5A和5B5A：(2S)-3-[(6R，9S，12S，15S，18S，21R)-21-{[({[(氨基乙?；?氨基]乙?；鶀氨基)乙?；鵠氨基}-6-{[(2S)-2-({(2S)-6-氨基-1-[(2-氨基-2-氧代乙基)氨基]-1-氧代己-2-基}氨基甲酰基)吡咯烷-1-基]羰基}-9-(2-氨基-2-氧代乙基)-12-(3-氨基-3-氧代丙基)-15-芐基-18-(4-羥基芐基)-8，11，14，17，20-五氧代-1，4-二硫雜-7，10，13，16，19-五氮雜環(huán)二十二烷-3-基]-2-[(叔丁氧羰基)氨基]丙酸5B：(2S)-3-[(6R，9S，12S，15S，18S，21R)-21-{[({[(氨基乙酰基)氨基]乙?；鶀氨基)乙?；鵠氨基}-6-{[(2S)-2-({(2S)-6-氨基-1-[(2-氨基-2-氧代乙基)氨基]-1-氧代己-2-基}氨基甲?；?吡咯烷-1-基]羰基}-9-(2-氨基-2-氧代乙基)-12-(3-氨基-3-氧代丙基)-15-芐基-18-(4-羥基芐基)-8，11，14，17，20-五氧代-1，4-二硫雜-7，10，13，16，19-五氮雜環(huán)二十二烷-2-基]-2-[(叔丁氧羰基)氨基]丙酸5A：5B：在氬氣氣氛下，首先將10.16mg(7.54μmol)乙酸特利加壓素(購(gòu)自Bachem，瑞士；序列：H-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2，作為環(huán)狀Cys二硫化物)加入于雙頸燒瓶中的300μlDPBS緩沖液中，并加入3.20mg(11.17μmol)TCEP-HCl。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1.5小時(shí)，然后加入200μlDPBS緩沖液和1.6mg(7.54μmol)N-叔丁氧羰基-L-炔丙基甘氨酸于100μlDPBS緩沖液中的溶液。其后，將3.20mg(10.87μmol)LAP[通過(guò)從文獻(xiàn)(Gong等，2013)中獲知的方法制備]溶解在500μlDPBS緩沖液中，并將50μl該LAP溶液加入反應(yīng)混合物中。通過(guò)雙頸燒瓶的磨口玻璃接頭，引入(距離反應(yīng)混合物約40mm)LED-UV燈頭(OmnicureLX400，直徑12mm；igb-techGmbH，德國(guó))，并將反應(yīng)混合物用365nm的紫外光照射1小時(shí)。然后，加入50μlLAP溶液并隨后再重復(fù)兩次用365nm的紫外光照射1小時(shí)。然后，將反應(yīng)混合物通過(guò)制備型HPLC(柱：PhenomenexKinetexPrep5μmC18AXIAPackedLCColumn，21.2×100mm；流動(dòng)相A：含0.1％TFA的水，流動(dòng)相B：含0.08％TFA的乙腈；梯度：0.0min5％B→3min5％B→63min40％B→65.3min95％B→70min95％B)分離。產(chǎn)物級(jí)分1：收率：0.4mg(理論值的4％)LC/MS(方法3)：Rt＝7.11min；MS(ESpos)：m/z＝721.8130[M+2H]2+HRMS：對(duì)于C62H93O19N17S2[M+2H]2+的計(jì)算值：721.8132，測(cè)量值：721.8130。該產(chǎn)物級(jí)分的1HNMR譜圖示于圖6中。產(chǎn)物級(jí)分2：收率：1.6mg(理論值的15％)；根據(jù)LC/MS(方法3)的純度：94％LC/MS(方法3)：Rt＝7.36min；MS(ESpos)：m/z＝1442.6134[M+H]+HRMS：對(duì)于C62H93O19N17S2[M+2H]2+的計(jì)算值：721.8132，測(cè)量值：721.8132。該產(chǎn)物級(jí)分的1HNMR譜圖示于圖7中。產(chǎn)物級(jí)分3：收率：0.3mg(理論值的3％)；根據(jù)LC/MS(方法3)的純度：89％LC/MS(方法3)：Rt＝7.34min；MS(ESpos)：m/z＝721.8122[M+2H]2+HRMS：對(duì)于C62H92O19N17S2[M+H]+的計(jì)算值：1442.6191，測(cè)量值：1442.6200。實(shí)施例6A和6B6A：(6R，9S，12S，15S，18S，21R)-21-氨基-9-(2-氨基-2-氧代乙基)-12-(3-氨基-3-氧代丙基)-15-芐基-3-(4-羧基丁基)-18-(4-羥基芐基)-8，11，14，17，20-五氧代-1，4-二硫雜-7，10，13，16，19-五氮雜環(huán)二十二烷-6-甲酸6B：(6R，9S，12S，15S，18S，21R)-21-氨基-9-(2-氨基-2-氧代乙基)-12-(3-氨基-3-氧代丙基)-15-芐基-2-(4-羧基丁基)-18-(4-羥基芐基)-8，11，14，17，20-五氧代-1，4-二硫雜-7，10，13，16，19-五氮雜環(huán)二十二烷-6-甲酸6A：6B：在氬氣氣氛下，首先將15.33mg(19.78μmol)pressinoicacid(購(gòu)自Bachem，瑞士；序列：H-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-OH，作為環(huán)狀Cys二硫化物)加入于雙頸燒瓶中的500μl0.1％乙酸水溶液和500μl乙腈中，并加入8.70mg(30.35μmol)TCEP-HCl。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2.5小時(shí)，然后加入200μl0.1％乙酸水溶液、200μl乙腈和2.5mg(19.82μmol)庚-6-炔酸于100μl0.1％乙酸水溶液中的溶液。其后，將5.8mg(19.72μmol)LAP[通過(guò)從文獻(xiàn)(Gong等，2013)中獲知的方法制備]溶解在500μl0.1％乙酸水溶液中，并將50μl該LAP溶液加入反應(yīng)混合物中。通過(guò)雙頸燒瓶的磨口玻璃接頭，引入(距離反應(yīng)混合物約40mm)LED-UV燈頭(OmnicureLX400，直徑12mm；igb-techGmbH，德國(guó))，并將反應(yīng)混合物用365nm的紫外光照射1小時(shí)。然后，加入50μlLAP溶液并隨后再重復(fù)兩次用365nm的紫外光照射1小時(shí)。然后，將反應(yīng)混合物通過(guò)制備型HPLC(柱：WatersX-BridgeBEH130PrepC1810μmOBD，19×250mm；流動(dòng)相A：含0.1％TFA的水，流動(dòng)相B：含0.08％TFA的乙腈；梯度：0.0min5％B→3min5％B→33min40％B)分離。產(chǎn)物級(jí)分1：收率：1.4mg(理論值的8％)LC/MS(方法1)：Rt＝1.25min；MS(ESpos)：m/z＝903.4[M+H]+。該產(chǎn)物級(jí)分的1HNMR譜圖示于圖8中。產(chǎn)物級(jí)分2：收率：0.6mg(理論值的3％)LC/MS(方法1)：Rt＝1.25min；MS(ESpos)：m/z＝903.4[M+H]+和Rt＝1.27min；MS(ESpos)：m/z＝903.3[M+H]+。HRMS：對(duì)于C40H55O12N8S2[M+H]+的計(jì)算值：903.3375，測(cè)量值：903.3371。產(chǎn)物級(jí)分3：收率：0.7mg(理論值的4％)LC/MS(方法1)：Rt＝1.27min；MS(ESpos)：m/z＝903.3[M+H]+。該產(chǎn)物級(jí)分的1HNMR譜圖示于圖9中。實(shí)施例7A和7B7A：(2S)-1-{[(3R，6S，9S，12S，15S，18R，22aR，23S，23aS)-18-{[({[(氨基乙?；?氨基]乙?；鶀氨基)乙酰基]氨基}-6-(2-氨基-2-氧代乙基)-9-(3-氨基-3-氧代丙基)-12-芐基-15-(4-羥基芐基)-23-(羥基甲基)-5，8，11，14，17-五氧代二十六烷氫化-20aH-環(huán)丙[5，6]環(huán)辛[1，2-b][1，4，7，10，13，16，19]二硫雜五氮雜環(huán)二十二烷-3-基]羰基}-N-{(2S)-6-氨基-1-[(2-氨基-2-氧代乙基)氨基]-1-氧代己-2-基}吡咯烷-2-甲酰胺7B：(2S)-1-{[(3R，6S，9S，12S，15S，18R，22aS，23R，23aR)-18-{[({[(氨基乙?；?氨基]乙?；鶀氨基)乙酰基]氨基}-6-(2-氨基-2-氧代乙基)-9-(3-氨基-3-氧代丙基)-12-芐基-15-(4-羥基芐基)-23-(羥基甲基)-5，8，11，14，17-五氧代二十六烷氫化-20aH-環(huán)丙[5，6]環(huán)辛[1，2-b][1，4，7，10，13，16，19]二硫雜五氮雜環(huán)二十二烷-3-基]羰基}-N-{(2S)-6-氨基-1-[(2-氨基-2-氧代乙基)氨基]-1-氧代己-2-基}吡咯烷-2-甲酰胺7A：7B：在氬氣氣氛下，首先將26.24mg(19.47μmol)乙酸特利加壓素(購(gòu)自Bachem，瑞士；序列：H-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2，作為環(huán)狀Cys二硫化物)和8.4mg(29.31μmol)TCEP-HCl加入于雙頸燒瓶中的1.5mlDPBS緩沖液中。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2.5小時(shí)，然后加入2.9mg(19.32μmol)rel-(1R，8S，9r)-雙環(huán)[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇于200μl甲醇中的溶液。其后，將5.70mg(19.38μmol)LAP[通過(guò)從文獻(xiàn)(Gong等，2013)中獲知的方法制備]溶解在500μlDPBS緩沖液中，并將50μl該LAP溶液加入反應(yīng)混合物中。通過(guò)雙頸燒瓶的磨口玻璃接頭，引入(距離反應(yīng)混合物約40mm)LED-UV燈頭(OmnicureLX400，直徑12mm；igb-techGmbH，德國(guó))，并將反應(yīng)混合物用365nm的紫外光照射1小時(shí)。然后，加入50μlLAP溶液并隨后再重復(fù)兩次用365nm的紫外光照射1小時(shí)。然后，將反應(yīng)混合物通過(guò)制備型HPLC(柱：PhenomenexKinetexPrep5μmC18AXIAPackedLCColumn，21.2×100mm；流動(dòng)相A：含0.1％TFA的水，流動(dòng)相B：含0.08％TFA的乙腈；梯度：0.0min5％B→3min5％B→63min40％B→64.30min95％B→69.30min95％)分離。產(chǎn)物級(jí)分1：收率：3.1mg(理論值的7.5％)；根據(jù)LC/MS(方法3)的純度：65％LC/MS(方法3)：Rt＝6.92min；MS(ESpos)：m/z＝903.3[M+H]+HRMS：對(duì)于C62H91O16N16S2[M+H]+的計(jì)算值：1379.6235，測(cè)量值：1379.6244。該產(chǎn)物級(jí)分的1HNMR譜圖示于圖10中。實(shí)施例8與抗體FAB片段的C2橋聯(lián)硫醇-炔反應(yīng)：在氬氣氣氛下，首先將108.4μlFAB片段M14-G07[記載于Dittmer等，美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)US2014/0050743-A1，第13頁(yè)，第0105、0106和0113段]的溶液加入于雙頸燒瓶中的PBS緩沖液中(c＝46.1mg/ml，0.107μmol)。將4.60mgTCEP-HCl溶解于400μlDPBS緩沖液中，并將4μl該溶液加入FAB片段的溶液中。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1小時(shí)，然后加入1.36μl(10.75μmol)庚-6-炔酸于398μl甲醇中的溶液4μl。其后，將3.10mg(10.53μmol)LAP[通過(guò)從文獻(xiàn)(Gong等，2013)中獲知的方法制備]溶解于500μlDPBS緩沖液中，并將1μl該LAP溶液加入反應(yīng)混合物中。將反應(yīng)燒瓶用冰浴冷卻(5℃＜T＜10℃)。通過(guò)雙頸燒瓶的磨口玻璃接頭，引入(距離反應(yīng)混合物約40mm)LED-UV燈頭(OmnicureLX400，直徑12mm；igb-techGmbH，德國(guó))，并將反應(yīng)混合物用365nm的紫外光照射1小時(shí)。在三個(gè)連續(xù)的時(shí)間段中，每個(gè)時(shí)間段再加入1μlLAP溶液并隨后將反應(yīng)混合物用365nm紫外光照射，每次1小時(shí)。然后，將反應(yīng)混合物用2.384mlDPBS緩沖液稀釋?zhuān)⑼ㄟ^(guò)G-25MPD-10柱(GEHealthcare)進(jìn)行分離，所述柱已預(yù)先用DPBS緩沖液調(diào)整了五次，每次5ml。將所得的級(jí)分離心5分鐘(10℃，4000rpm)。然后，將溶液用移液管移入離心機(jī)過(guò)濾容器(30K-Ultra-4)中并再離心15分鐘。將所得的濃縮物用總共2.5mlDPBS緩沖液反復(fù)地稀釋。共價(jià)連接的FAB片段的證實(shí)和定量：從所得的于DPBS緩沖液中的樣品中，對(duì)FAB片段的共價(jià)連接進(jìn)行定量和鑒定，如下：通過(guò)經(jīng)還原和變性的FAB片段的RP色譜法，對(duì)共價(jià)FAB片段進(jìn)行定量。向樣品溶液(1mg/ml，50μl)中加入鹽酸胍(GuHCl)(28.6mg)和DL-二硫蘇糖醇(DTT)的溶液(500mM，3μl)。將混合物在55℃下溫育1小時(shí)，然后通過(guò)HPLC進(jìn)行分析。通過(guò)Agilent1260HPLC系統(tǒng)在220nm下檢測(cè)而進(jìn)行HPLC分析。使用PolymerLaboratoriesPLRP-S聚合物反相柱(2.1mm×150mm，粒徑8μm，產(chǎn)品編號(hào)PL1912-3802)，流速1ml/min，所述聚合物反相柱具有以下流動(dòng)相體系：流動(dòng)相A：于水中的0.05％三氟乙酸，流動(dòng)相B：于乙腈中的0.05％三氟乙酸；梯度：0min25％B，3min25％B，28min50％B。通過(guò)與非偶聯(lián)FAB片段的輕鏈(L0)和重鏈(VH-CH1＝H0)的保留時(shí)間進(jìn)行比較來(lái)指定所檢測(cè)的峰。將僅在偶聯(lián)樣品中檢測(cè)到的信號(hào)指定為共價(jià)非還原性連接的FAB。由通過(guò)積分確定的信號(hào)面積來(lái)計(jì)算共價(jià)連接的FAB的百分比。為此，作出FAB片段的信號(hào)面積與所有信號(hào)的總面積之商并乘以100。所得的色譜圖和計(jì)算的百分比示于圖11和圖12中。為了證實(shí)共價(jià)連接的FAB片段，在Grom-Sil300Butyl-1St柱(粒度5μm，柱尺寸5mm×500μm)上在線脫鹽之后，使用HPLC-ESI-TOF(ImpactHD，BrukerDaltonik)通過(guò)質(zhì)譜法對(duì)變性的和還原的樣品進(jìn)行分析。流速為5μl/min，流動(dòng)相體系如下：流動(dòng)相A：于水中的0.1％甲酸，流動(dòng)相B：于80％異丙醇、10％乙腈和10％水中的0.1％甲酸；梯度：0min22％B，8min22％B，10min24％B，12min80％B，18min95％B，27min95％B，30min22％B。添加針對(duì)TIC(總離子色譜圖)信號(hào)所獲得的譜圖，并基于MaxEnt去卷積法計(jì)算不同種類(lèi)的分子量。通過(guò)將采用輕鏈和重鏈(VH-CH1)的理論質(zhì)量所得到的質(zhì)量與共價(jià)連接的FAB片段的質(zhì)量進(jìn)行比較，可以明確地證實(shí)期望的FAB片段的共價(jià)連接。所得譜圖示于圖13中。B.參考文獻(xiàn)AIMETTI，A.A.，F(xiàn)EAVER，K.R.&ANSETH，K.S.，2010.Synthesisofcyclic，multivalentArg-Gly-Aspusingsequentialthiol-ene/thiol-y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