p97?多核苷酸結(jié)合物的制作方法

本申請案根據(jù)35U.S.C.§119(e)要求2014年4月8日申請的美國申請案第62/144,598號；2014年8月6日申請的美國申請案第62/033,903號；以及2014年5月1日申請的美國申請案第61/987,228號的權(quán)利，所述申請案各自以全文引用的方式并入。

序列表

以文本格式代替紙張拷貝提供與本申請案相關(guān)的序列表，并且在此以引用的方式并入本說明書中。含有序列表的文本文件的名稱為BIOA_010_03WO_ST25.txt。所述文本文件約42KB，創(chuàng)建于2015年5月1日，并且以電子方式經(jīng)EFS-Web提交。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及p97(黑色素轉(zhuǎn)鐵蛋白)與例如小干擾RNA(siRNA)分子之間的多核苷酸的結(jié)合物，以及相關(guān)組合物和其使用方法，例如促進(jìn)siRNA試劑跨越血腦屏障(BBB)傳遞和/或提高其在CNS和/或周圍組織中的滲透，并且由此治療和/或診斷多種疾病，包括具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)組分的那些疾病。

背景技術(shù)：

RNA干擾(RNAi)為RNA分子抑制基因表達(dá)的生物過程，通常通過導(dǎo)致具體mRNA分子的破壞進(jìn)行。療法中可采用RNA干擾。但由于干擾素反應(yīng)而難以向哺乳動(dòng)物細(xì)胞中引入長dsRNA股，因此短干擾RNA(siRNA)的使用更成功。

然而，siRNA分子的治療性用途在向例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)組織的所要組織中存在挑戰(zhàn)。一個(gè)問題是血腦屏障(BBB)阻斷許多試劑從血液向腦部自由轉(zhuǎn)移。因此，存在嚴(yán)重神經(jīng)方面問題的疾病預(yù)期不會(huì)對常規(guī)投予途徑(例如IV或皮下投予)起反應(yīng)。對于這類和其它疾病，改良siRNA分子跨越BBB傳遞的方法將非常合意。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的實(shí)施例包括p97(黑色素轉(zhuǎn)鐵蛋白)與例如小干擾RNA(siRNA)分子的多核苷酸之間的結(jié)合物，以及相關(guān)組合物和其使用方法。因此，某些實(shí)施例包括p97結(jié)合物，其包含p97多肽，所述多肽共價(jià)連接至長度為約15-40個(gè)核苷酸的第一多核苷酸，中間有任選的連接子(L)，和長度為約15-40個(gè)核苷酸的第二多核苷酸，其與第一多核苷酸大體上互補(bǔ)和雜交，其中所述第一或第二多核苷酸為與目標(biāo)mRNA序列大體上互補(bǔ)的反義股。

在一些實(shí)施例中，第一和第二多核苷酸在反義股的3'端、反義股的5'端或這兩處形成1-3個(gè)核苷酸懸垂物。在某些實(shí)施例中，第一多核苷酸為反義股且第二多核苷酸為有義股。在某些實(shí)施例中，第二多核苷酸為反義股且第一多核苷酸為有義股。

在某些實(shí)施例中，第一和第二多核苷酸長度為約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施例中，反義股與選自表2的基因的目標(biāo)mRNA序列大體上或完全互補(bǔ)。

在某些實(shí)施例中，基因?yàn)槿祟怤OX基因。在一些實(shí)施例中，人類NOX基因?yàn)镹OX1、NOX2或NOX4中的一個(gè)或多個(gè)。在具體實(shí)施例中，人類NOX基因?yàn)镹OX4且其中第一和第二多核苷酸選自5'-A UGU UCA CAA AGU CAG GUC TT-3'(SEQ ID NO:31)和5'-GAC CUG ACU UUG UGA ACA UTT-3'(SEQ ID NO:32)。

在某些實(shí)施例中，p97多肽包含(a)SEQ ID NO:1-30或表1或表B中闡述的氨基酸序列；(b)與(a)的序列至少90％相同的氨基酸序列；(c)通過添加、取代、插入或缺失約1-50個(gè)氨基酸與(a)的序列不同的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，p97多肽為約10-50個(gè)氨基酸長。在某些實(shí)施例中，p97多肽為約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)氨基酸長。

在具體實(shí)施例中，p97多肽包含DSSHAFTLDELR(SEQ ID NO:14)或DSSHAFTLDELRYC(SEQ ID NO:29)或DSSHAFTLDELRC(SEQ ID NO:30)、由它們組成或基本上由它們組成。在某些實(shí)施例中，p97多肽在C端、N端或這兩處具有半胱氨酸殘基。在一些實(shí)施例中，結(jié)合物中間包含連接子(L)。

還包括藥物組合物，其包含藥學(xué)上可接受的載劑和本文所述的p97結(jié)合物，其中所述藥物組合物無菌且無熱原。

還包括用于治療有需要的個(gè)體的疾病的方法，其包含向個(gè)體投予本文所述的p97結(jié)合物或藥物組合物。在某些實(shí)施例中，目標(biāo)基因?yàn)槿祟怤OX基因，任選地NOX1、NOX2或NOX4，且其中個(gè)體患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的NOX相關(guān)疾病或病況。在一些實(shí)施例中，CNS的NOX相關(guān)疾病或病況為神經(jīng)退化性疾病、精神疾病、缺血、中風(fēng)、CNS損傷或神經(jīng)痛。

在某些實(shí)施例中，p97結(jié)合物或藥物組合物通過靜脈內(nèi)(IV)輸注或皮下注射投予。

附圖說明

圖1A-1L示出了具有p97(黑色素轉(zhuǎn)鐵蛋白)多肽的示范性結(jié)合物的通式結(jié)構(gòu)，所述多肽共價(jià)連接siRNA分子或shRNA分子的至少一股和任選地連接子(L)。

圖2示出了示范性p97-siRNA結(jié)合物(參看實(shí)例1)的結(jié)構(gòu)。

圖3示出了所分析的腦部區(qū)段的四個(gè)視場的位置(參看實(shí)例1)。

圖4A-4D示出了靜脈內(nèi)投予測試試劑后小鼠腦部組織的免疫熒光成像。僅對照測試試劑PBS(4A)和未結(jié)合的siRNA(4B)顯示腦部組織中無AF680(紅色)染色。相比之下，p97-siRNA結(jié)合物(4C-4D)顯示腦部組織中顯著AF680(紅色)染色，證明與p97多肽的結(jié)合可提高siRNA分子向例如腦實(shí)質(zhì)的CNS組織的傳遞。

圖5A-5B示出了siRNA分子的糖(5A)和核堿基(5B)化學(xué)性質(zhì)的示范性改良。

圖6示出了p97多肽與siRNA分子的多核苷酸股結(jié)合形成p97-siRNA結(jié)合物的反應(yīng)流程。

圖7示出了腦部組織中的siRNA和p97-siRNA結(jié)合物相對于PBS對照的體積分?jǐn)?shù)。

圖8示出了所測試的七只不同小鼠的RT-PCR結(jié)果(如所指示，一個(gè)PBS對照和三個(gè)各siRNA測試分子)。相對于GAPDH對照顯示NOX4 mRNA的含量。

圖9A-9C示出了使用ΔΔCT方法分析的RT-PCR數(shù)據(jù)：＝(CT(目標(biāo)，未經(jīng)處理)-CT(參考，未經(jīng)處理))-(CT(目標(biāo)，處理)-CT(參考，處理))。圖9A示出了用p97-siRNA結(jié)合物處理的小鼠的腦部組織中的NOX4 mRNA相對于對照(PBS和未結(jié)合的siRNA)顯著下調(diào)。圖9B示出了用p97-siRNA結(jié)合物處理的小鼠的腦部組織中內(nèi)源性NOX4表達(dá)相對于未結(jié)合的siRNA的降低百分比。圖9C示出了用p97-siRNA結(jié)合物處理的小鼠的腦部組織中的NOX4表達(dá)相對于未結(jié)合的siRNA的降低倍數(shù)(約1.8倍)。

圖10示出了用p97-siRNA結(jié)合物(MTfp-siRNA)預(yù)處理且罹患大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)誘發(fā)的局部缺血性中風(fēng)的小鼠相對于PBS和僅siRNA組具有顯著較小的梗塞面積。

圖11示出了在中風(fēng)誘發(fā)后0.5小時(shí)用MTfp-siRNA結(jié)合物預(yù)處理相對于用PBS或僅siRNA預(yù)處理改良動(dòng)物的神經(jīng)功能缺損。

圖12A-12B示出了預(yù)處理和中風(fēng)誘發(fā)后NOX4 mRNA含量的RT-PCR分析結(jié)果。圖12A示出了MTfp-siRNA預(yù)處理相對于PBS或僅siRNA導(dǎo)致腦部的中風(fēng)誘發(fā)部分中較低Nox4誘發(fā)(ΔCt＝Ct(nox4,PBS-假處理組)-Ct(B-肌動(dòng)蛋白,PBS-假處理組))。圖12B同樣示出了MTfp-siRNA預(yù)處理相對于PBS或僅siRNA降低中風(fēng)誘發(fā)的腦部中的NOX4 mRNA表達(dá)(ΔΔCT＝(CT(Nox4,PBS-假處理組)-CT(B-肌動(dòng)蛋白,PBS-假處理組))-(CT(Nox4,MTfp-siRNA-中風(fēng))-CT(B-肌動(dòng)蛋白,MTfp-siRNA-中風(fēng)))。

具體實(shí)施方式

除非明確指示為相反，否則本發(fā)明的實(shí)踐將采用所屬領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的分子生物學(xué)和重組DNA技術(shù)的常規(guī)方法，下文中出于說明的目的對其中許多進(jìn)行了描述。在文獻(xiàn)中全面解釋了此類技術(shù)。參看例如Sambrook等人,《分子克?。簩?shí)驗(yàn)指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》(第3版,2000)；《DNA克?。簩?shí)用方法(DNA Cloning:A Practical Approach)》,第I卷和第II卷(D.Glover編)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(N.Gait編,1984)；《寡核苷酸合成：方法和應(yīng)用(Oligonucleotide Synthesis:Methods and Applications)》(P.Herdewijn編,2004)；《核酸雜交(Nucleic Acid Hybridization)》(B.Hames和S.Higgins編,1985)；《核酸雜交：現(xiàn)代應(yīng)用(Nucleic Acid Hybridization:Modern Applications)》(Buzdin和Lukyanov編,2009)；《轉(zhuǎn)錄與翻譯(Transcription and Translation)》(B.Hames和S.Higgins編,1984)；《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(Animal Cell Culture)》(R.Freshney編,1986)；Freshney,R.I.(2005)《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，基礎(chǔ)技術(shù)手冊(Culture of Animal Cells,a Manual of Basic Technique)》,第5版.Hoboken NJ,約翰·威利父子公司(John Wiley&Sons)；B.Perbal,《分子克隆實(shí)踐指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)》(第3版2010)；Farrell,R.,《RNA方法：分離和表征的實(shí)驗(yàn)室指導(dǎo)(RNA Methodologies:A Laboratory Guide for Isolation and Characterization)》(第3版2005)。《聚(乙二醇)，化學(xué)和生物學(xué)應(yīng)用(Poly(ethylene glycol),Chemistry and Biological Applications)》,ACS,華盛頓(Washington),1997；Veronese,F.和J.M.Harris編,肽和蛋白質(zhì)PEG化(Peptide and protein PEGylation),《先進(jìn)藥物輸送評論(Advanced Drug Delivery Reviews)》,54(4)453-609(2002)；Zalipsky,S.等人,《聚乙二醇化學(xué)方法：生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用(Polyethylene Glycol Chemistry:Biotechnical and Biomedical Applications)》中的“使用官能化聚(乙二醇)修飾多肽(Use of functionalized Poly(Ethylene Glycols)for modification of polypeptides)”。

本文中引用的全部公開案、專利和專利申請案都以全文引用的方式并入本文中。

定義

除非另外規(guī)定，否則本文中所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員通常所了解相同的含義。盡管在本發(fā)明的實(shí)踐或測試中也可以使用與本文中描述的方法和材料類似或等效的任何方法和材料，但現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法和材料。為了本發(fā)明的目的，下文定義以下術(shù)語。

本文中使用冠詞“一(a/an)”是指所述冠詞的一個(gè)或超過一個(gè)(即至少一個(gè))語法賓語。舉例來說，“一要素”意味著一個(gè)要素或超過一個(gè)要素。

“約”意指量、含量、值、數(shù)目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度相對于參考量、含量、值、數(shù)目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度變化多達(dá)30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％。

如本文所用，術(shù)語“氨基酸”打算意指天然存在和非天然存在的氨基酸以及氨基酸類似物和模擬物。天然存在的氨基酸包括蛋白質(zhì)生物合成期間使用的20種(L)-氨基酸，以及其他氨基酸，例如4-羥基脯氨酸、羥基賴氨酸、鎖鏈賴氨酸、異鎖鏈賴氨酸、高半胱氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸。非天然存在的氨基酸包括例如(D)-氨基酸、正白氨酸、正纈氨酸、對氟苯丙氨酸、乙硫氨酸等，其為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知。氨基酸類似物包括天然和非天然存在的氨基酸的改性形式。此類改良可包括例如取代或置換氨基酸上的化學(xué)基團(tuán)和部分或通過氨基酸的衍生作用進(jìn)行。氨基酸模擬物包括例如呈現(xiàn)功能上類似特性(例如參考氨基酸的電荷和電荷間距特征)的有機(jī)結(jié)構(gòu)。舉例來說，模擬精氨酸(Arg或R)的有機(jī)結(jié)構(gòu)將具有以類似分子間距定位且具有與天然存在的Arg氨基酸的側(cè)鏈的e-氨基相同的移動(dòng)程度的正電荷部分。模擬物還包括限制結(jié)構(gòu)從而維持氨基酸或氨基酸官能團(tuán)的最佳間距和電荷相互作用。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知或可測定哪些結(jié)構(gòu)構(gòu)成功能上等效氨基酸類似物和氨基酸模擬物。

在本說明書通篇中，除非上下文另外要求，否則措辭“包含(comprise/comprises/comprising)”應(yīng)理解成暗示包括所陳述的步驟或要素或步驟或要素的群組，但不排除任何其它步驟或要素或步驟或要素的群組?！坝伞M成”打算包括并且限于短語“由……組成”之后的任何事物。因此，短語“由……組成”指示所列要素為需要或必需的，并且不能存在其它要素?！盎旧嫌伞M成”打算包括短語后所列的任何要素，并且限于不干擾或影響本發(fā)明中規(guī)定的所列要素的活性或作用的其它要素。因此，短語“基本上由……組成”指示所列要素為需要或必需的，但其它要素是任選的并且可視其是否顯著影響所列要素的活性或作用而定存在或不存在。

術(shù)語“結(jié)合物”打算指由于將試劑或其它分子(例如生物活性分子)共價(jià)或非共價(jià)連接或鍵連到p97多肽形成的實(shí)體。

如本文所用，術(shù)語“功能”和“功能性”等是指生物學(xué)、酶促或治療性功能。

“同源性”是指相同或構(gòu)成保守取代的氨基酸的數(shù)目百分比。同源性可使用序列比較程序測定，例如GAP(Deveraux等人,《核酸研究(Nucleic Acids Research)》.12,387-395,1984)，其以引用的方式并入本文中。以此方式，與本文列舉的那些序列具有類似或大體上不同長度的序列可以通過向比對中插入間隙來比較，此類間隙例如通過GAP使用的比較算法測定。

“分離”意指使材料大體上或基本上不含其原生狀態(tài)時(shí)通常伴隨的組分。舉例來說，如本文所用，“經(jīng)分離的肽”或“經(jīng)分離的多肽”等包括體外分離和/或純化肽或多肽分子與其天然細(xì)胞環(huán)境，以及失去與細(xì)胞的其它組分的關(guān)聯(lián)性；即與體內(nèi)物質(zhì)不顯著關(guān)聯(lián)。

術(shù)語“調(diào)節(jié)”和“更改”包括通常相對于對照組統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著或生理學(xué)上顯著的量或程度的“增加”、“提高”或“刺激”以及“降低”或“減少”?！霸黾印?、“促進(jìn)”或“提高”的量通常為“統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著”的量，且可包括無組合物(例如不存在本發(fā)明的結(jié)合物)或?qū)φ战M合物、樣品或測試個(gè)體產(chǎn)生的量的1.1、1.2、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍或更多倍(例如500、1000倍)(包括全部整數(shù)和與1之間或大于1的小數(shù)點(diǎn)，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的增加?！皽p少”或“降低”的量通常為“統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著”的量，并且可包括無組合物或?qū)φ战M合物產(chǎn)生的量中1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％(包括中間的全部整數(shù))降低。作為一個(gè)非限制性實(shí)例，對照可比較p97-siRNA結(jié)合物相對于單獨(dú)siRNA分子的活性(例如跨越血腦屏障傳輸/傳遞的量或速率)、分布到中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織的速率和/或水平，和/或針對血漿、中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織或任何其它全身或周圍非中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織的C_max、或減弱目標(biāo)基因(例如在CNS組織中)表達(dá)的能力。本文描述了其它比較和“統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著”的量的實(shí)例。

如本文所用的涉及基因或mRNA的短語“減毒表達(dá)”意指投予或表達(dá)一定量的siRNA以通過mRNA裂解或通過直接抑制轉(zhuǎn)譯減少目標(biāo)mRNA轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì)。如本文所用的術(shù)語“抑制”、“沉默”和“減毒”是指目標(biāo)mRNA或相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)相比于目標(biāo)mRNA或相應(yīng)蛋白質(zhì)在無本發(fā)明的干擾RNA存在的情況下可測量的減少。目標(biāo)mRNA或相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)的減少可相對于投予或表達(dá)非靶向?qū)φ誷iRNA和/或未結(jié)合的siRNA之后存在的水平比較來評估。在某些實(shí)施例中，p97-siRNA結(jié)合物在CNS組織(例如體內(nèi)周圍投予時(shí))中具有相對于相應(yīng)未結(jié)合的siRNA的目標(biāo)基因表達(dá)“增加的”削弱。

除非另外規(guī)定，否則術(shù)語“核苷酸”是指核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或其修飾形式，以及其類似物。核苷酸包括包含嘌呤(例如腺嘌呤、次黃嘌呤、鳥嘌呤)和其衍生物和類似物，以及嘧啶(例如胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶)和其衍生物和類似物的物質(zhì)。在一些實(shí)施例中，全部核苷酸選自經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾的A、C、G或U的群組。

術(shù)語核苷酸還打算包括經(jīng)修飾堿基和通用堿基。舉例來說，通用堿基包括(但不限于)3-硝基吡咯、5-硝基吲哚或水粉蕈素。術(shù)語“核苷酸”還打算包括用氨基取代核糖基3'氧產(chǎn)生的N3'到P5'氨基磷酸酯。

另外，術(shù)語核苷酸亦包括具有可檢測標(biāo)記(例如放射性或熒光部分)或連接到核苷酸的質(zhì)量標(biāo)記的那些物質(zhì)。

在某些實(shí)施例中，組合物中任何指定試劑(例如p97結(jié)合物)的“純度”可以具體定義。舉例來說，特定組合物可包含例如(但不限于)通過高壓液相色譜(HPLC)測量的至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％純(包括中間的所有小數(shù))的試劑，高壓液相色譜是通常在生物化學(xué)和分析化學(xué)中用于分離、鑒別和定量化合物的眾所周知的柱色譜形式。

術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換地用于指氨基酸殘基的聚合物和其變異體和合成類似物。因此，這些術(shù)語應(yīng)用于一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基為合成非天然存在的氨基酸的氨基酸聚合物(例如相應(yīng)天然存在的氨基酸的化學(xué)類似物)以及天然存在的氨基酸聚合物。本文所述的多肽不限于具體長度的產(chǎn)物；因此，肽、寡肽和蛋白質(zhì)包括于多肽的定義內(nèi)，并且除非另外明確說明，此類術(shù)語在本文中可互換使用。本文所述的多肽還可以包含表達(dá)后修飾，例如糖基化、乙?；⒘姿峄?，以及所屬領(lǐng)域中已知的其它修飾(天然存在的和非天然存在的)。多肽可以是整個(gè)蛋白質(zhì)，或其子序列、片段、變異體或衍生物。

“生理學(xué)上可裂解”或“可水解”或“可降解”連接子或鍵是在生理?xiàng)l件下與水反應(yīng)(即水解)的鍵。鍵在水中水解的趨勢將不僅取決于連接兩個(gè)中心原子的鍵的通用類型，而且取決于連接到這些中心原子的取代基。適當(dāng)水解不穩(wěn)定或弱鍵包括(但不限于)：羧酸酯、磷酸酯、酸酐、縮醛、縮酮、酰氧基烷基醚、亞胺、原酸酯、硫酯、硫醇酯、碳酸根，和腙、肽和寡核苷酸。

“可釋放連接子”包括(但不限于)生理學(xué)上可裂解連接子和酶可降解連接子。因此，“可釋放連接子”為在生理?xiàng)l件下可發(fā)生自發(fā)水解或通過一些其它機(jī)制(例如酶催化、酸催化、堿催化等)裂解的連接子。舉例來說，“可釋放連接子”可涉及具有堿提取質(zhì)子(例如可電離氫原子Hα)作為驅(qū)動(dòng)力的消除反應(yīng)。出于本文的目的，“可釋放連接子”與“可降解連接子”同義?！懊缚山到怄I”包括例如通過一種或多種酶(例如肽酶或蛋白酶)發(fā)生降解的氨基酸序列的鍵。在具體實(shí)施例中，可釋放或以其它方式可降解的連接子在pH7.4，25℃(例如生理pH，人體溫度(例如體內(nèi)))的半衰期為約30分鐘、約1小時(shí)、約2小時(shí)、約3小時(shí)、約4小時(shí)、約5小時(shí)、約6小時(shí)、約12小時(shí)、約18小時(shí)、約24小時(shí)、約36小時(shí)、約48小時(shí)、約72小時(shí)或約96小時(shí)或更低。

術(shù)語“參考序列”一般是指倍另一序列比較的核酸編碼序列或氨基酸序列。本文所述的全部多肽和多核苷酸序列作為參考序列包括在內(nèi)，包括通過名稱描述的那些和序列表中描述的那些。

如本文所用，術(shù)語“序列一致性”或例如包含“50％一致性的序列”是指比較窗口上逐核苷酸計(jì)或逐氨基酸計(jì)的序列相同程度。因此，“序列一致性百分比”可以通過以下方式計(jì)算：在比較窗口上比較兩個(gè)最佳比對序列，測定兩個(gè)序列中相同核酸堿基(例如A、T、C、G、I)或相同氨基酸殘基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置數(shù)獲得匹配位置數(shù)，將匹配位置數(shù)除以比較窗口中的位置總數(shù)(即窗口大小)，并且將結(jié)果乘以100獲得序列一致性百分比。包括與本文所述的參考序列中的任一個(gè)具有至少約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列一致性的核苷酸和多肽(參看例如序列表)，通常其中多肽變異體保持參考多肽的至少一種生物活性。

用于描述兩個(gè)或更多個(gè)多核苷酸或多肽的序列關(guān)系的術(shù)語包括“參考序列”、“比較窗口”、“序列一致性”、“序列一致性百分比”和“大體一致性”。“參考序列”的長度為至少12，但通常15到18并且通常至少25個(gè)單體單元，包括核苷酸和氨基酸殘基。因?yàn)閮蓚€(gè)多核苷酸可各自包含(1)兩個(gè)多核苷酸之間類似的序列(即完全多核苷酸序列的僅一部分)，和(2)在兩個(gè)多核苷酸之間相異的序列，兩個(gè)(或更多個(gè))多核苷酸之間的序列比較通常通過在“比較窗口”上比較兩個(gè)多核苷酸的序列以鑒別和比較局部區(qū)域的序列相似性來進(jìn)行?！氨容^窗口”是指至少6個(gè)，通常約50到約100個(gè)，更通常約100到約150個(gè)連續(xù)位置的概念性區(qū)段，其中在將兩個(gè)序列最佳比對后，將序列與具有相同數(shù)目的連續(xù)位置的參考序列比較。對于最佳比對的兩個(gè)序列，比較窗口可包含相較于參考序列(其不包含添加或缺失)約20％或更少添加或缺失(即間隙)。用于比對比較窗口的序列最佳比對可以通過計(jì)算機(jī)化執(zhí)行算法(美國威斯康星州的威斯康星州遺傳學(xué)軟件包7.0版本，遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組，575科學(xué)驅(qū)動(dòng)麥迪遜(Wisconsin Genetics Software Package Release7.0,Genetics Computer Group,575Science Drive Madison,WI,USA)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通過多種選擇方法中的任一個(gè)產(chǎn)生的檢查和最佳比對(即在比較窗口上導(dǎo)致最高同源性百分比)來進(jìn)行。還可以參考例如Altschul等人,《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》25:3389,1997披露的BLAST程序家族。序列分析的具體論述可見于Ausubel等人,“最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法匯編(Current Protocols in Molecular Biology),”約翰·威利父子公司(John Wiley&Sons Inc),1994-1998,第15章的19.3單元。

“統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著”意指結(jié)果不太可能偶然發(fā)生。統(tǒng)計(jì)顯著性可以通過所屬領(lǐng)域中已知的任何方法來測定。顯著性的常用測量值包括p值，其是如果零假設(shè)為真那么所觀測事件將發(fā)生的頻率或機(jī)率。如果所獲得的p值小于顯著性水平，那么駁回零假設(shè)。在簡單情況下，顯著性水平定義為p值為0.05或更小。

術(shù)語“溶解度”是指蛋白質(zhì)或結(jié)合物溶解于液體溶劑中并且形成均質(zhì)溶液的特性。溶解度通常表示為濃度，按每單位體積溶劑的溶質(zhì)質(zhì)量計(jì)(g溶質(zhì)/kg溶劑、g/dL(100mL)、mg/ml等)、摩爾濃度、重量摩爾濃度、摩爾分?jǐn)?shù)或其它類似濃度描述。每一溶劑量可溶解的溶質(zhì)的最大平衡量為指定條件(包括溫度、壓力、pH和溶劑性質(zhì))下，所述溶質(zhì)在所述溶劑中的溶解度。在某些實(shí)施例中，在生理pH或其它pH下，例如在pH 5.0、pH6.0、pH 7.0或pH 7.4下測量溶解度。在某些實(shí)施例中，在水或生理學(xué)緩沖劑(例如PBS或NaCl(具有或不具有NaP))中測量溶解度。在具體實(shí)施例中，在相對較低pH(例如pH 6.0)和相對較高鹽(例如500mM NaCl和10mM NaP)下測量溶解度。在某些實(shí)施例中，在例如血液或血清的生物流體(溶劑)中測量溶解度。在某些實(shí)施例中，溫度可以大致是室溫(例如約20、21、22、23、24、25℃)或大致是體溫(約37℃)。在某些實(shí)施例中，在室溫下或約37℃下，p97結(jié)合物的溶解度為至少約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30mg/mL。

如本文所用，“個(gè)體”包括呈現(xiàn)可以使用本發(fā)明的p97結(jié)合物治療或診斷的癥狀或處于呈現(xiàn)所述癥狀風(fēng)險(xiǎn)中的任何動(dòng)物。適合個(gè)體(患者)包括實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、兔或天竺鼠)、農(nóng)畜和家畜或?qū)櫸?例如貓或狗)。包括非人類靈長類動(dòng)物，并且優(yōu)選地人類患者。

“大體上”或“基本上”意指一些指定量的幾乎全部或所有，例如95％、96％、97％、98％、99％或更高。

“大體上不含”是指幾乎完全或完全不存在指定量，例如一些指定量的小于約10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或更少。舉例來說，特定組合物可以“大體上不含”細(xì)胞蛋白質(zhì)、膜、核酸、內(nèi)毒素或其它污染物。

術(shù)語“目標(biāo)”以多種不同形式在本文通篇中使用且由其使用情境定義。“目標(biāo)mRNA”是指指定siRNA針對的信使RNA。“目標(biāo)序列”和“目標(biāo)位點(diǎn)”是指siRNA的有義股顯示不同程度一致性并且反義股呈現(xiàn)不同程度互補(bǔ)性的mRNA內(nèi)的序列。短語“siRNA目標(biāo)”可以是指siRNA針對的基因、mRNA或蛋白質(zhì)。類似地，“目標(biāo)沉默”可以是指基因或相應(yīng)mRNA或蛋白質(zhì)的狀態(tài)。

如本文所用，“治療(Treatment/treating)”包括對疾病或病況的癥狀或病變的任何理想作用，并且可包括所治療疾病或病況的一個(gè)或多個(gè)可測量標(biāo)記中的甚至最小改變或改進(jìn)。“治療(Treatment/treating)”并非必須指示完全根除或治愈疾病或病況或其相關(guān)癥狀。接收這一治療的個(gè)體為有需要的任何個(gè)體。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將顯而易知臨床改良的示范性標(biāo)記。

術(shù)語“野生型”是指基因或基因產(chǎn)物具有從天然存在的來源分離的所述基因或基因產(chǎn)物的特征。野生型基因或基因產(chǎn)物(例如多肽)為種群中最通常觀測到的那些并且因此任意設(shè)計(jì)基因的“正?！被颉耙吧汀毙问?。

p97-多核苷酸結(jié)合物

本發(fā)明的實(shí)施例大體上涉及包含p97(黑色素轉(zhuǎn)鐵蛋白；MTf)多肽的結(jié)合物，所述多肽共價(jià)或可操作地連接到至少一個(gè)多核苷酸，例如雙股小干擾RNA(siRNA)分子的至少一個(gè)股；以及相關(guān)組合物和其使用方法。本文描述了示范性p97多肽序列(例如表1)和siRNA目標(biāo)基因(例如表2)。在某些實(shí)施例中，p97結(jié)合物在p97多肽和核酸分子之間包含一個(gè)或多個(gè)連接子(L)，本文提供了其實(shí)例。本文還包括和描述了前述任一個(gè)的變異體和片段。

在某些實(shí)施例中，p97結(jié)合物包含圖1A-1H或2A中所示的示范性非限制性構(gòu)形中的至少一個(gè)，或由其組成或基本上由其組成。舉例來說，在某些實(shí)施例中，siRNA分子的多核苷酸股結(jié)合到p97多肽的N端。在一些實(shí)施例中，siRNA分子的多核苷酸股結(jié)合到p97多肽的C端。在具體實(shí)施例中，siRNA分子的多核苷酸股結(jié)合到p97多肽的內(nèi)部氨基酸，例如含S氨基酸，例如甲硫氨酸或半胱氨酸。在這些和相關(guān)實(shí)施例的一些中，siRNA分子的多核苷酸股經(jīng)連接子結(jié)合到p97多肽。

在某些實(shí)施例中，p97多肽結(jié)合到siRNA分子的多核苷酸股的3'端。在某些實(shí)施例中，p97多肽結(jié)合到siRNA分子的多核苷酸股的5'端。在具體實(shí)施例中，p97多肽結(jié)合到siRNA分子的多核苷酸股的內(nèi)部核堿基。在這些和相關(guān)實(shí)施例的一些中，p97多肽經(jīng)連接子結(jié)合到siRNA分子的多核苷酸。

在一些實(shí)施例中，如本文所述，p97多肽結(jié)合到siRNA分子的有義多核苷酸股。在某些實(shí)施例中，如本文所述，p97多肽結(jié)合到siRNA分子的反義多核苷酸股。

某些結(jié)合物可采用超過一種p97多肽。舉例來說，在一些實(shí)施例中，第一p97多肽結(jié)合到有義股且第二p97多肽(相同或不同)結(jié)合到反義股。在一些實(shí)施例中，1、2、3、4或5種p97多肽結(jié)合到siRNA分子的多核苷酸股。

一些結(jié)合物可采用超過一種siRNA分子。舉例來說，在某些實(shí)施例中，p97多肽結(jié)合到siRNA分子的1、2、3、4或5個(gè)多核苷酸股。一些方面，p97多肽結(jié)合到siRNA分子的1、2、3、4或5個(gè)有義股。在某些方面，p97多肽結(jié)合到siRNA分子的1、2、3、4或5個(gè)反義股。在特定方面，p97多肽結(jié)合到有義股和反義的混合物，例如siRNA分子的1、2、3、4或5個(gè)有義股和1、2、3、4或5個(gè)反義股。

還包括前述任一個(gè)的組合。

可以根據(jù)所屬領(lǐng)域的多種技術(shù)制備p97多肽和siRNA分子的多核苷酸股之間的結(jié)合物。舉例來說，某些實(shí)施例可利用含有硫醇的siRNA(參看Muratovska和Eccles,《歐洲生物化學(xué)學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)快報(bào)(FEBS Lett.)》558:63-68,2004)或其它方法(參看Jeong等人,《生物結(jié)合物化學(xué)(Bioconjugate Chem.)》20:5-14,2009)。在一些實(shí)施例中，siRNA股的5'端、內(nèi)部核堿基或3'端可以使用一個(gè)或多個(gè)具有存在于多肽和多核苷酸中的官能團(tuán)的預(yù)活化小分子(例如胺、硫醇、羧酸酯、羥基、醛和酮、活性氫、光化學(xué)和環(huán)加成反應(yīng))并且通過經(jīng)多種不同結(jié)合化學(xué)物質(zhì)(包括穩(wěn)定、可裂解或不穩(wěn)定鍵)彼此交聯(lián)從而共價(jià)連接到肽的N端、內(nèi)部殘基或C端。在一些方面，聚合物結(jié)合物可以例如通過借助于基因編碼的對乙?；奖彼?pAcF)將氨氧基衍生的陽離子嵌段共聚物結(jié)合到p97多肽(參看Lu等人,《美國化學(xué)會(huì)志(J Am Chem Soc.)》135:13885-91,2013)，接著將siRNA分子的多核苷酸股結(jié)合到共聚物來制備。用于將例如多核苷酸的復(fù)雜分子連接到p97多肽的方法的另一實(shí)例為SATA/磺基-SMCC交聯(lián)反應(yīng)(Pierce(Rockford,IL))。圖6中說明一種示范性方法。

結(jié)合物可以使用本文所述的p97、L或siRNA分子(包括其官能性或活性變異體和片段)建構(gòu)。

在某些實(shí)施例中，如根據(jù)所所屬領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)所測量，結(jié)合物具有至少約90％的純度。在某些實(shí)施例中，例如診斷組合物或特定治療性組合物，結(jié)合物具有至少約95％的純度。在具體實(shí)施例中，例如治療性或藥物組合物，結(jié)合物具有至少約97％或98％或99％的純度。在其它實(shí)施例中，例如當(dāng)用作參考或研究試劑時(shí)，結(jié)合物可以是較小純度，并且可具有至少約50％、60％、70％或80％的純度。純度(例如按蛋白質(zhì)計(jì)的純度)可以整體測量或相對于所選定組分(例如其它蛋白質(zhì))測量。

在某些實(shí)施例中，如上文所述，本文所述的結(jié)合物和/或組合物為約大體上不含內(nèi)毒素，包括例如約95％不含內(nèi)毒素，優(yōu)選地約99％不含內(nèi)毒素，并且更優(yōu)選地約99.99％不含內(nèi)毒素。如本文所述，可以根據(jù)所屬領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)檢測內(nèi)毒素的存在。

p97多肽.在某些實(shí)施例中，結(jié)合物中所用的p97多肽序列包含下表1中提供的人類p97參考序列，基本上由其組成或由其組成。還包括其變異體和片段。

在一些實(shí)施例中，p97多肽序列包含沿其長度與表1中的人類p97序列或其片段具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性或同源性的序列。

在具體實(shí)施例中，p97多肽序列包含表1中的人類p97序列的片段。在某些實(shí)施例中，p97多肽片段長度為約、至少約或高達(dá)約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、700、710、720、730個(gè)或更多個(gè)氨基酸，包括中間的全部整數(shù)和范圍，并且其可包括p97參考序列的全部或一部分序列，包括如SEQ ID NO:1所定義的參考p97片段的任何相鄰N端和/或C端序列。

在某些實(shí)施例中，p97多肽片段的長度為約5-700、5-600、5-500、5-400、5-300、5-200、5-100、5-50、5-40、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10、10-700、10-600、10-500、10-400、10-300、10-200、10-100、10-50、10-40、10-30、10-25、10-20、10-15、20-700、20-600、20-500、20-400、20-300、20-200、20-100、20-50、20-40、20-30、20-25、30-700、30-600、30-500、30-400、30-300、30-200、30-100、30-50、30-40、40-700、40-600、40-500、40-400、40-300、40-200、40-100、40-50、50-700、50-600、50-500、50-400、50-300、50-200、50-100、60-700、60-600、60-500、60-400、60-300、60-200、60-100、60-70、70-700、70-600、70-500、70-400、70-300、70-200、70-100、70-80、80-700、80-600、80-500、80-400、80-300、80-200、80-100、80-90、90-700、90-600、90-500、90-400、90-300、90-200、90-100、100-700、100-600、100-500、100-400、100-300、100-250、100-200、100-150、200-700、200-600、200-500、200-400、200-300或200-250個(gè)氨基酸，并且包含p97參考序列的全部或一部分序列，包括如SEQ ID NO:1所定義的參考p97片段的任何相鄰N端和/或C端序列。

某些實(shí)施例包含一個(gè)或多個(gè)p97多肽，例如2、3、4或5個(gè)多肽，如式[X]_n所示，其中X為本文所述的p97多肽并且n為整數(shù)1-5。在具體實(shí)施例中，X為DSSHAFTLDELR(SEQ ID NO:14)。

在一些實(shí)施例中，p97多肽具有一個(gè)或多個(gè)末端(例如N端、C端)半胱氨酸和/或酪氨酸，其可以添加分別用于結(jié)合和碘化。在一些方面，半胱氨酸殘基提供游離巰基以允許p97多肽直接或經(jīng)例如PEG類連接子的連接子結(jié)合到siRNA分子的多核苷酸股。

在某些實(shí)施例中，所關(guān)注的p97多肽序列包括p97氨基酸序列、p97的子序列和/或變異體，其有效傳輸所關(guān)注的試劑跨越血腦屏障并且進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)。在具體實(shí)施例中，變異體或片段包含人類p97的N-凸起部(SEQ ID NO:1的殘基20-361)。在特定方面，變異體或片段包含完整和官能性Fe³⁺結(jié)合位點(diǎn)。

在一些實(shí)施例中，p97多肽序列為p97多肽的可溶形式(參看Yang等人,《蛋白質(zhì)表達(dá)和純化(Prot Exp Purif.)》34:28-48,2004)或其片段或變體。在一些方面，可溶性p97多肽單獨(dú)或與缺失信號肽的全部或一部分(SEQ ID NO:1的殘基1-19)組合的缺失疏水性結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1的殘基710-738)的全部或一部分。在特定方面，可溶性p97多肽包含SEQ ID NO:2(SEQ ID NO:1的殘基20-711)，包括其變異體和片段，或由其組成。

在某些實(shí)施例中，例如采用脂質(zhì)體的那些，p97多肽序列為p97多肽的脂溶性形式。舉例來說，這些和相關(guān)實(shí)施例中的某些包括p97多肽，所述多肽包含疏水性結(jié)構(gòu)域的全部或一部分，任選地具有或不具有信號肽。

在特定其它實(shí)施例中，p97片段或變異體能夠特異性結(jié)合到p97受體、LRP1受體和/或LRP1B受體。

在一些實(shí)施例中，p97多肽為例如從細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或真核細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物或人類細(xì)胞)產(chǎn)生的重組多肽。在一些實(shí)施例中，重組p97多肽在大體上或完全無血清培養(yǎng)基中產(chǎn)生。在一些實(shí)施例中，p97多肽為合成多肽。

下文更詳細(xì)地描述參考p97多肽和其它參考多肽的變異體和片段。

siRNA分子和其它多核苷酸.如上文所述，本發(fā)明的實(shí)施例包括共價(jià)或以其它方式連接到至少一個(gè)多核苷酸的p97多肽。在具體實(shí)施例中，多核苷酸為siRNA分子的至少一個(gè)股。術(shù)語“siRNA分子”或“siRNA”是指誘發(fā)RNA干擾(RNAi)路徑的小抑制RNA雙螺旋體。如本文所用，這些分子的長度可變化(一般15-30個(gè)堿基對加任選地懸垂物)并且反義股中含有與其目標(biāo)mRNA的不同互補(bǔ)程度。一些(而非全部)siRNA在有義股和/或反義股的5'或3'端上具有不成對懸垂堿基。

術(shù)語“siRNA”包括具有兩個(gè)獨(dú)立股的雙螺旋體，并且除非另外規(guī)定，否則還包括可形式包含雙螺旋體區(qū)域的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈，例如短發(fā)夾RNA(“shRNA”)。因此，在一些實(shí)施例中，多核苷酸為shRNA分子，并且p97多肽共價(jià)或以其它方式連接到包含雙螺旋體區(qū)域的單股多核苷酸(參看例如圖1I-1L)。在具體實(shí)施例中，單股發(fā)夾shRNA分子包含約、至少約或不超過約19-29個(gè)堿基對(即約19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29bp)的主干，約、至少約或不超過約4、5、6、7或8個(gè)核苷酸的環(huán)，和任選地在3′端處的二核苷酸懸垂物，由其組成，或基本上由其組成。

還包括作為多核苷酸的CRISPR(成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列)RNA寡核苷酸和TALEN(轉(zhuǎn)錄活化因子樣效應(yīng)子核酸酶)RNA寡核苷酸，包括形成CRISPR RNA引導(dǎo)的監(jiān)視絡(luò)合物，例如Cas9-crRNA絡(luò)合物等的部分的RNA(參看例如WO 2013/142578；以及美國申請案第2010/0076057號；第2011/018977號；第2013/0011828號；以及第20130330778號，其以引用的方式并入本文中)。

術(shù)語“有義股”是指包含與目標(biāo)核酸序列(例如信使RNA或DNA序列)完全或部分相同的序列。術(shù)語“反義股”是指包含與目標(biāo)核酸序列(例如信使RNA或DNA序列)完全或部分互補(bǔ)的序列的多核苷酸。

有義股和/或反義股的長度的實(shí)例包括約15-40個(gè)堿基，約19-36個(gè)堿基，約19-30個(gè)堿基，約19-25個(gè)堿基和約19-23個(gè)堿基。在具體實(shí)施例中，siRNA-結(jié)合物的第一和/或第二單股多核苷酸長度為約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個(gè)堿基或核苷酸，包括中間的全部范圍。這些股長度包括可能懸垂物區(qū)域。因此，在具體實(shí)施例中，siRNA分子的第一和第二多核苷酸在反義股的3'端、反義股的5'端或這兩處形成1、2或3個(gè)核苷酸懸垂物。

當(dāng)提供siRNA的序列時(shí)，按照慣例，除非另外指示，否則其為有義股，并且互補(bǔ)反義股隱含。在雙螺旋體siRNA(由兩個(gè)獨(dú)立股形成)中，一個(gè)股可以是有義股，且另一股可以是反義股。如果存在懸垂物，那么短語“有義區(qū)域”可以指除懸垂物區(qū)域之外的有義股的核苷酸序列部分。類似地，短語“反義區(qū)域”可以指除懸垂物區(qū)域之外的反義股的核苷酸序列部分。如果siRNA為shRNA，那么不存在兩個(gè)獨(dú)立股，并且“有義區(qū)域”為雙螺旋體區(qū)域具有與目標(biāo)序列完全或部分相同的序列的部分，并且“反義區(qū)域”為與目標(biāo)序列和有義區(qū)域完全或部分互補(bǔ)的核苷酸序列。

通常，siRNA、shRNA或miRNA分子構(gòu)成或形成雙螺旋體區(qū)域。術(shù)語“雙螺旋體區(qū)域”是指通過沃森-克里克堿基配對(Watson-Crick base pairing)或允許互補(bǔ)或大體上互補(bǔ)的多核苷酸股之間形成穩(wěn)定雙螺旋體的任何其它方式彼此形成堿基對的兩個(gè)互補(bǔ)或大體上互補(bǔ)多核苷酸的區(qū)域。雙螺旋體區(qū)域的尺寸的實(shí)例包括(但不限于)約17-30個(gè)堿基對、17-25個(gè)堿基對、17-23個(gè)堿基對、18-30個(gè)堿基對、18-25個(gè)堿基對、18-23個(gè)堿基對、19-30個(gè)堿基對、19-25個(gè)堿基對和19-23個(gè)堿基對。雙螺旋體區(qū)域可以由堿基對的長度以及所述范圍上的互補(bǔ)程度限定。

因此，當(dāng)雙螺旋體區(qū)域由兩個(gè)獨(dú)立核苷酸股形成時(shí)，反義股和有義股的各股可在5'端或3'端含有為雙螺旋體的部分的核苷酸和不為雙螺旋體的部分的核苷酸。siRNA可以設(shè)計(jì)成在反義股上，與目標(biāo)互補(bǔ)的全部核苷酸為雙螺旋體區(qū)域的部分，并且因此在有義股上具有互補(bǔ)核苷酸。然而，siRNA還可以設(shè)計(jì)成盡管有義股上不具有互補(bǔ)核苷酸，但反義股在其3'端和/或其5'端也含有在具有目標(biāo)的互補(bǔ)核苷酸的反義股內(nèi)的連續(xù)核苷酸鏈段的部分的核苷酸。

舉例來說，有義股可含有19個(gè)核苷酸并且反義股可含有21個(gè)核苷酸。反義股的全部核苷酸(但兩個(gè)最3'核苷酸除外)可以與有義股上的19個(gè)核苷酸互補(bǔ)，而反義股的21個(gè)核苷酸的全部鏈段可以與目標(biāo)的21個(gè)核苷酸的鏈段互補(bǔ)?；蛘?，反義股的兩個(gè)最3'核苷酸可以選擇以便與目標(biāo)的一部分互補(bǔ)，或隨機(jī)選擇或促進(jìn)處理使得一個(gè)或兩個(gè)可能與或不與目標(biāo)的如下兩個(gè)核苷酸互補(bǔ)，所述兩個(gè)核苷酸與反義股的其它19個(gè)核苷酸與所互補(bǔ)的核苷酸相鄰。在一些實(shí)施例中，雙螺旋體區(qū)域內(nèi)可能例如不存在錯(cuò)配、存在一個(gè)錯(cuò)配、兩個(gè)錯(cuò)配、三個(gè)錯(cuò)配、四個(gè)錯(cuò)配或五個(gè)錯(cuò)配。

術(shù)語“錯(cuò)配”包括有義股的核苷酸與反義股的核苷酸之間不進(jìn)行沃森-克里克堿基配對的情境。錯(cuò)配的實(shí)例包括(但不限于)A與G正對面、C與A正對面、U與C正對面、U與G正對面、A與A正對面、G與G正對面、C與C正對面以及U與U正對面。

通常，siRNA分子的第一和第二多核苷酸股彼此完全或基本上互補(bǔ)。術(shù)語“互補(bǔ)”是指多核苷酸彼此形成堿基對的能力。堿基對通常通過反向平行的多核苷酸股中的核苷酸單元之間的氫鍵形成?；パa(bǔ)多核苷酸股可以用沃森-克里克方式(例如A與T、A與U、C與G)或以允許形成雙螺旋體的任何其它方式堿基配對。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員了解，當(dāng)使用RNA而非DNA時(shí)，尿嘧啶而非胸腺嘧啶是認(rèn)為與腺苷互補(bǔ)的堿基。然而，除非另外規(guī)定，否則當(dāng)在本發(fā)明的情形下標(biāo)示U時(shí)，暗示取代T的能力。完美互補(bǔ)或100％互補(bǔ)是指一個(gè)多核苷酸股的各核苷酸單元可以與第二多核苷酸股的核苷酸單元?dú)滏I結(jié)的情境。欠完美互補(bǔ)是指兩個(gè)股的一些而非全部核苷酸單元可以彼此氫鍵結(jié)的情境。舉例來說，對于兩個(gè)20-mer，如果各股上僅兩個(gè)堿基對可以彼此氫鍵結(jié)，那么多核苷酸股呈現(xiàn)10％互補(bǔ)。在同一實(shí)例中，如果各股上的18個(gè)堿基對可彼此氫鍵結(jié)，那么多核苷酸股呈現(xiàn)90％互補(bǔ)。在一些實(shí)施例中，在雙螺旋體區(qū)域內(nèi)，存在至少75％互補(bǔ)、至少80％互補(bǔ)、至少90％互補(bǔ)、至少95％互補(bǔ)或100％互補(bǔ)。

在某些實(shí)施例中，siRNA分子的反義股完全或大體上與目標(biāo)基因中的目標(biāo)mRNA序列互補(bǔ)。在一些實(shí)施例中，目標(biāo)mRNA序列為包括內(nèi)含子和外顯子的預(yù)-信使RNA(經(jīng)預(yù)處理的或預(yù)-mRNA)序列，或通常僅包括外顯子序列的經(jīng)加工mRNA序列。在一些實(shí)施例中，反義股與目標(biāo)基因中的目標(biāo)mRNA序列至少75％互補(bǔ)、至少80％互補(bǔ)、至少90％互補(bǔ)、至少95％互補(bǔ)或100％互補(bǔ)。在具體實(shí)施例中，反義股完全或大體上與選自下表2的目標(biāo)基因的目標(biāo)mRNA序列互補(bǔ)。同樣，在一些實(shí)施例中，siRNA分子的有義股完全或大體上與目標(biāo)基因中的目標(biāo)mRNA序列一致。在一些實(shí)施例中，有義股與目標(biāo)基因中的目標(biāo)mRNA序列具有至少75％一致性、至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性或100％一致性。在具體實(shí)施例中，反義股完全或基本上與選自下表2的目標(biāo)基因的目標(biāo)mRNA序列一致。

考慮到目標(biāo)基因，例如表2中的目標(biāo)基因，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可根據(jù)所屬領(lǐng)域的多種技術(shù)選擇或設(shè)計(jì)siRNA分子的特定多核苷酸序列。作為一個(gè)實(shí)例，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可掃描AA二核苷酸序列并且選擇各AA和3'相鄰19個(gè)核苷酸作為潛在siRNA目標(biāo)位點(diǎn)。這一選擇siRNA目標(biāo)位點(diǎn)的策略是基于Elbashir等人的觀測(《歐洲分子生物學(xué)雜志(EMBO J)》20:6877-6888,2001)，其中具有3'懸垂UU二核苷酸的siRNA分子是高效的。接著可選擇具體目標(biāo)序列，例如通過鑒別具有30-50％GC含量的siRNA，和/或通過比較潛在目標(biāo)位點(diǎn)與適當(dāng)基因組數(shù)據(jù)庫(人類、小鼠、大鼠等)并且從考慮消除與其它編碼序列具有超過16-17個(gè)連續(xù)堿基對同源性的任何目標(biāo)序列。還可使用多種軟件工具在任何指定基因中產(chǎn)生特定siRNA目標(biāo)位點(diǎn)。還參看Birmingham等人,《自然實(shí)驗(yàn)手冊(Nat Protoc.)》2:2068-78,2007；以及美國專利第7,056,704號；第7,078,196號；第8,101,348號；第8,394,628號；第8,420,391號；第8,445,237號；以及第8,552,171號，其全部內(nèi)容以引用的方式并入。

在具體實(shí)施例中，目標(biāo)基因?yàn)镹OX(NADPH氧化酶)基因，例如NOX1(NADPH氧化酶1)、NOX2(NADPH氧化酶2；細(xì)胞色素b-245重鏈)和/或NOX4(NADPH氧化酶4)。NOX酶為產(chǎn)生跨膜蛋白的過氧化物。NOX酶在許多細(xì)胞類型和組織中表達(dá)。然而，增加的跡象表面過度活化NOX酶可能造成CNS相關(guān)和其它疾病。因此，特定結(jié)合物包含siRNA分子，其中反義股完全或大體上與NOX1序列(參看例如登錄號：AJ438989.1；登錄號：NM_007052.4；登錄號：NM_013955.2；登錄號：NM_001271815.1)、NOX2序列(參看例如登錄號：NM_000397.3)和/或NOX4目標(biāo)序列(參看例如登錄號：NM_001143837.1；登錄號：NM_001143836.1；登錄號：NM_016931.3；登錄號：AY288918.1)互補(bǔ)。在具體實(shí)施例中，siRNA分子包含5'-A UGU UCA CAA AGU CAG GUC TT-3'(SEQ ID NO:31)和/或5'-GAC CUG ACU UUG UGA ACA UTT-3'(SEQ ID NO:32)或由其組成(參看實(shí)例1)。

在具體實(shí)施例中，目標(biāo)為微RNA(miRNA)。miRNA目標(biāo)的非限制性實(shí)例包括miRNA-132，其抑制預(yù)防卵巢和乳癌原位小鼠模型中的血管生成，以及miRNA-21，其抑制導(dǎo)致惡性pre-B-淋巴性腫瘤消退。在一些實(shí)施例中，反義股與目標(biāo)miRNA序列至少75％互補(bǔ)、至少80％互補(bǔ)、至少90％互補(bǔ)、至少95％互補(bǔ)或100％互補(bǔ)。在具體實(shí)施例中，反義股完全或大體上與目標(biāo)miRNA序列互補(bǔ)。同樣，在一些實(shí)施例中，siRNA分子的有義股完全或大體上與目標(biāo)miRNA序列一致。在一些實(shí)施例中，有義股具有與目標(biāo)miRNA序列至少75％一致性、至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性或100％一致性。

在某些實(shí)施例中，siRNA分子或siRNA的多核苷酸股中的一個(gè)或兩個(gè)是合成寡核苷酸。

某些實(shí)施例采用經(jīng)修飾的siRNA分子。實(shí)例包括在堿基、糖和/或磷酸鹽的化學(xué)結(jié)構(gòu)中并入具有修飾的核苷酸類似物(參看例如圖5)，包括(但不限于)5-位嘧啶修飾、8-位嘌呤修飾、胞嘧啶環(huán)外胺處的修飾以及5-溴-尿嘧啶的取代；以及2'-位糖修飾，包括(但不限于)糖修飾的核糖核苷酸，其中2'-OH置換為例如H、OR、R、鹵基、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂或CN的基團(tuán)，其中R為烷基部分。核苷酸類似物還打算包括具有以下的核苷酸：例如肌苷、Q核苷、黃嘌呤的堿基、例如2'-甲基核糖的糖、例如甲基磷酸酯的非天然磷酸二酯鍵、硫代磷酸酯和肽。

還包括2'-氟、2'-氨基和/或2'-硫基修飾。具體實(shí)例包括2'-氟-胞苷、2'-氟-尿苷、2'-氟-腺苷、2'-氟-鳥苷、2'-氨基-胞苷,2'-氨基-尿苷、2'-氨基-腺苷、2'-氨基-鳥苷、2,6-二氨基嘌呤、4-硫基-尿苷；和/或5-氨基-烯丙基-尿苷。額外示范性修飾包括5-溴-尿苷、5-碘-尿苷、5-甲基-胞苷、核糖-胸苷、2-氨基嘌呤、2'-氨基-丁酰基-芘-尿苷、5-氟-胞苷以及5-氟-尿苷。本發(fā)明的經(jīng)修飾siRNA內(nèi)可使用2'-脫氧-核苷酸，但優(yōu)選包括于siRNA雙螺旋體的有義股內(nèi)。額外經(jīng)修飾殘基在所屬領(lǐng)域中已描述且市場有售，包括脫氧-無堿基、肌苷、N3-甲基-尿苷、N6,N6-二甲基-腺苷、假尿苷、嘌呤核苷和利巴韋林(ribavirin)。

經(jīng)修飾的堿基是指已經(jīng)通過置換或添加一個(gè)或多個(gè)原子或基團(tuán)進(jìn)行修飾的核苷酸堿基，例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黃嘌呤、肌苷和Q核苷?？砂P(guān)于堿基部分進(jìn)行修飾的核苷酸的修飾類型的一些實(shí)例包括(但不限于)獨(dú)立地或組合的烷基化、鹵化、硫醇化、氨化、酰胺化或乙酰化堿基。更多特定實(shí)例包括例如5-丙炔基尿苷、5-丙炔基胞苷、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鳥嘌呤、N,N,-二甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-丙基鳥嘌呤、2-氨基腺嘌呤、1-甲基肌苷、3-甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷和在5位置具有修飾的其它核苷酸、5-(2-氨基)丙基尿苷、5-鹵基胞苷、5-鹵基尿苷、4-乙?；铡?-甲基腺苷、2-甲基腺苷、3-甲基胞苷、6-甲基尿苷、2-甲基鳥苷、7-甲基鳥苷、2,2-二甲基鳥苷、5-甲基氨基乙基尿苷、5-甲基氧基尿苷、脫氮核苷酸(例如7-脫氮-腺苷)、6-氮尿苷、6-氮胞苷、6-氮胸苷、5-甲基-2-硫尿苷、其它硫堿基(例如2-硫尿苷和4-硫尿苷和2-硫胞苷)、二氫尿苷、假尿苷、Q核苷、古嘌苷、萘基和經(jīng)取代的萘基、任何O-和N-烷基化的嘌呤和嘧啶，例如N6-甲基腺苷、5-甲基羰基甲基尿苷、尿苷5-氧基乙酸、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基和經(jīng)改性苯基(例如氨基苯酚或2,4,6-三甲氧基苯)、用作G-固定核苷酸的經(jīng)修飾胞嘧啶、8-經(jīng)取代的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-經(jīng)取代的尿嘧啶和胸腺嘧啶、氮雜嘧啶、羧基羥基烷基核苷酸、羧基烷基氨基烷基核苷酸以及烷基羰基烷基化核苷酸。經(jīng)修飾的核苷酸還包括關(guān)于糖部分經(jīng)修飾的那些核苷酸，以及具有糖的核苷酸或其不為核糖基的類似物。舉例來說，糖部分可以是或基于甘露糖、樹膠醛醣、吡喃葡萄糖、吡喃半乳糖、4'-硫代核糖和其它糖、雜環(huán)或碳環(huán)。

修飾包括例如用烷基、烷氧基、氨基、脫氮、鹵基、羥基、硫醇基或其組合取代。核苷酸可以經(jīng)具有更高穩(wěn)定性的類似物取代，例如用脫氧核糖核苷酸置換核糖核苷酸，或具有糖修飾，例如2'氨基、2'O-甲基、2'甲氧基乙基或2'-O,4'-C亞甲基橋置換2'-OH基團(tuán)。核苷酸的嘌呤或嘧啶類似物的實(shí)例包括黃嘌呤、次黃嘌呤、氮雜嘌呤、甲基硫代腺嘌呤、7-脫氮-腺苷以及O-和N-修飾的核苷酸。

核苷酸或核苷酸類似物之間的鍵的修飾也優(yōu)選，例如磷酸二酯鍵取代硫代磷酸酯鍵。核苷酸的磷酸基可以通過用氮或硫(硫代磷酸酯)取代磷酸基的一個(gè)或多個(gè)氧來修飾。修飾例如適用于提高功能、改良穩(wěn)定性或滲透率，或直接定位或靶向。

連接子.如上所述，特定結(jié)合物可采用一個(gè)或多個(gè)連接基團(tuán)。本文所用的術(shù)語“鍵”、“連接子”、“連接部分”或“L”是指可用于分離p97多肽與試劑(例如siRNA分子的一個(gè)股)，或分離第一試劑與另一試劑或標(biāo)簽(熒光標(biāo)記)(例如其中兩種或更多種試劑連接形成p97結(jié)合物)的連接子。連接子可以是生理學(xué)上穩(wěn)定的并且可包括可釋放連接子(例如不穩(wěn)定連接子)或酶可降解連接子(例如蛋白水解可裂解連接子)。在某些方面，連接子可以是肽連接子。在一些方面，連接子可以是非肽連接子或非蛋白質(zhì)連接子。在一些方面，連接子可以是粒子，例如納米粒子。

連接子可以電中性的或可攜帶正電荷或負(fù)電荷?？赡婊虿环€(wěn)定連接子含有可逆或不穩(wěn)定鍵。連接子可任選地包括間隔子來增加兩個(gè)接合的原子之間的距離。間隔子可進(jìn)一步增加連接子的柔韌性和/或長度。間隔子可包括(但不限于)烷基、烯基、炔基、芳香基、芳烷基、芳烯基、芳炔基；其各自可含有一個(gè)或多個(gè)雜原子、雜環(huán)、氨基酸、核苷酸和糖。

不穩(wěn)定鍵為除了能夠在斷裂或裂解同一分子中的其它共價(jià)鍵的條件下選擇性斷裂或裂解的到氫原子的共價(jià)鍵以外的共價(jià)鍵。更具體來說，不穩(wěn)定鍵為在適當(dāng)條件下比同一分子中的其它非不穩(wěn)定共價(jià)鍵更不穩(wěn)定(熱力學(xué))或更快速破裂(動(dòng)力學(xué))的共價(jià)鍵。分子內(nèi)不穩(wěn)定鍵的裂解可導(dǎo)致形成兩個(gè)分子。對于所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員，一般根據(jù)鍵裂解的半衰期(t_1/2)(一半鍵裂解所需的時(shí)間)論述鍵的裂解或不穩(wěn)定性。因此，不穩(wěn)定鍵涵蓋可比鍵結(jié)分子的其它鍵更快速選擇性裂解的鍵。

適當(dāng)條件可通過不穩(wěn)定鍵的類型決定并且在有機(jī)化學(xué)中眾所周知。不穩(wěn)定鍵可能對pH、氧化性或還原性條件或試劑、溫度、鹽濃度、酶(例如酯酶，包括核酸酶和蛋白酶)的存在，或所添加試劑的存在敏感。舉例來說，增加或降低的pH為針對pH不穩(wěn)定鍵的適當(dāng)條件，

在一些實(shí)施例中，連接子為經(jīng)建構(gòu)以含有烷基、芳香基和/或氨基酸主鏈，并且含有酰胺、醚、酯、腙、二硫鍵或其任何組合的有機(jī)部分。含有氨基酸、醚和酰胺結(jié)合組分的鍵在生理pH(在血清中通常為7.4)的條件下穩(wěn)定。如上所述，還包括含有酯或腙并且在血清pH下穩(wěn)定的鍵，但其在暴露于溶酶體pH時(shí)水解釋放siRNA分子。還包括二硫鍵，至少部分因?yàn)槠鋵€原性裂解敏感。另外，氨基酸連接子可以設(shè)計(jì)成對所要目標(biāo)器官中或例如溶酶體中的特定酶裂解敏感。示范性連接子描述于Blattler等人(19S5)《生物化學(xué)(Biochem.)》24:1517-1524；King等人(1986)《生物化學(xué)》25:5774-5779；Srinivasachar和Nevill(1989)《生物化學(xué)》28:2501-2509以及別處(也參看圖2)中。

在一些實(shí)施例中，連接子的長度為約1到約30個(gè)原子，或長度為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、0、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)原子，包括中間的全部范圍。在某些實(shí)施例中，連接子長度為約1到30個(gè)原子，碳鏈原子可以經(jīng)獨(dú)立地選自由O、N或S組成的群組的雜原子取代。在一些實(shí)施例中，1到4個(gè)或5到15個(gè)C原子經(jīng)獨(dú)立地選自O(shè)、N、S的雜原子取代。

在某些實(shí)施例中，連接子包含選自以下的結(jié)構(gòu)或由其組成：-O-、-NH-、-S-、-C(O)-、C(O)-NH、NH-C(O)-NH、O-C(O)-NH、-C(S)-、-CH₂-、-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-、-O-CH₂-、-CH₂-O-、-O-CH₂-CH₂-、-CH₂-O-CH₂-、-CH₂-CH₂-O-、-O-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-O-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-O-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-O-、-O-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-O-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-O-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-O-、-C(O)-NH-CH₂-、-C(O)-NH-CH₂-CH₂-、-CH₂-C(O)-NH-CH₂-、-CH₂-CH₂-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH₂-、-CH₂-NH-C(O)-CH₂-、-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-、-NH-C(O)-CH₂-CH₂-、-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂、-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂、-C(O)-NH-CH₂-、-C(O)-NH-CH₂-CH₂-、-O-C(O)-NH-CH₂-、-O-C(O)-NH-CH₂-CH₂-、-NH-CH₂-、-NH-CH₂-CH₂-、-CH₂-NH-CH₂-、-CH₂-CH₂-NH-CH₂-、-C(O)-CH₂-、-C(O)-CH₂-CH₂-、-CH₂-C(O)-CH₂-、-CH₂-CH₂-C(O)-CH₂-、-CH₂-CH₂-C(O)-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-C(O)-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-，二價(jià)環(huán)烷基、-N(R⁶)-，R⁶為H或選自由以下組成的群組的有機(jī)基團(tuán)：烷基、經(jīng)取代的烷基、烯基、經(jīng)取代的烯基、炔基、經(jīng)取代的炔基、芳香基和經(jīng)取代的芳香基。

在一些實(shí)施例中，連接子包含可釋放連接子。在一些實(shí)施例中，可釋放連接子選自由以下組成的群組：羧酸酯、磷酸酯、酸酐、縮醛、縮酮、酰氧基烷基醚、亞胺、原酸酯、硫酯、硫醇酯、碳酸鹽和腙。在某些實(shí)施例中，連接子含有當(dāng)傳遞到溶酶體環(huán)境時(shí)發(fā)生水解的部分(例如在溶酶體pH下或當(dāng)與溶酶體酶接觸時(shí)容易發(fā)生水解)。

在一些實(shí)施例中，連接子包含穩(wěn)定連接子。在一些實(shí)施例中，穩(wěn)定鍵選自由以下組成的群組：丁二酰亞胺、丙酸、羧基甲醇化物鍵、醚、氨基甲酸酯、酰胺、胺、碳酰二胺、酰亞胺、脂肪族C-C鍵和硫醚。

在一些實(shí)施例中，連接子包含例如聚乙二醇或聚丙二醇的聚合物或由其組成。如本文所用，術(shù)語“PEG”、“聚乙二醇”和“聚(乙二醇)”可互換并且打算涵蓋任何水溶性聚(氧化乙烯)衍生物。PEG為在許多水溶液和有機(jī)溶劑中具有良好溶解度的眾所周知的聚合物，其呈現(xiàn)低毒性、缺乏免疫原性并且澄清、無色、無臭和穩(wěn)定。如本文所述，可使用其它水溶性聚合物獲得類似產(chǎn)品，包括(但不限于)；聚乙烯醇、其它聚(氧化烯)(例如聚(丙二醇)等)、聚(乙氧基化多元醇)(例如聚(乙氧基化丙三醇)等)、羧甲基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧雜環(huán)戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐和聚氨基酸。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠基于所要?jiǎng)┝?、循環(huán)時(shí)間、蛋白分解抗性和其它考慮因素選擇所要聚合物。

通常，根據(jù)本文所述的結(jié)合物使用的PEG包含以下結(jié)構(gòu)“-(OCH2CH2)n-”，其中(n)為約1到4000，約20到1400，或約20-800。在具體實(shí)施例中，視是否已置換末端氧而定，PEG還包括“-O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-”和“-(OCH2CH2)n-O-”。術(shù)語“PEG”包括具有多個(gè)末端或“封端”基團(tuán)的結(jié)構(gòu)。術(shù)語“PEG”還包括一種聚合物，這種聚合物含有大部分(也就是說大于50％)的-OCH₂CH₂-重復(fù)子單元。關(guān)于特定形式，PEG可采取多種不同分子量，以及例如“分支鏈”、“直鏈”、“分叉”、“多官能”PEG分子的結(jié)構(gòu)或幾何結(jié)構(gòu)。

使此類聚合物與活性部分結(jié)合的代表性聚合試劑和方法描述于Harris,J.M.和Zalipsky,S.編,聚(乙二醇)(Poly(ethylene glycol)),《化學(xué)和生物學(xué)應(yīng)用(Chemistry and Biological Applications)》,ACS,華盛頓(Washington),1997；Veronese,F.和J.M.Harris編,肽和蛋白質(zhì)聚乙二醇化(Peptide and Protein PEGylation),《先進(jìn)藥物輸送評論》,54(4)；453-609(2002)；Zalipsky,S.等人,《聚乙二醇化學(xué)方法：生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用(Polyethylene Glycol Chemistry:Biotechnical and Biomedical Applications)》中的“使用官能化聚(乙二醇)修飾多肽(Use of Functionalized Poly Ethylene Glycols)for Modification of Polypeptides)”,J.M.Harris編,普倫紐斯出版社(Plenus Press),紐約(New York)(1992)；Zalipsky(1995)《先進(jìn)藥物評論(Advanced Drug Reviews)》16:157-182；以及Roberts等人,《先進(jìn)藥物輸送評論》,54,459-476(2002)中。

多種PEG衍生物都市場有售并且適用于制備本發(fā)明的PEG結(jié)合物。舉例來說，NOF Corp.'s系列提供許多PEG衍生物，包括甲氧基聚乙二醇和經(jīng)活化的PEG衍生物(例如丁二酰亞胺酯、甲氧基-PEG胺、順丁烯二酰亞胺和羧酸)，用于通過多種方法偶合到多肽和多核苷酸，并且Nektar治療性先進(jìn)聚乙二醇化技術(shù)還提供不同PEG偶合技術(shù)來提高療法的安全性和功效。用于形成p97-siRNA結(jié)合物的額外PEG包括獲自Polypure(挪威(Norway))、QuantaBioDesign LTD(俄亥俄州(Ohio))JenKem Technology、Nanocs Corporation和新日生物技術(shù)公司(Sunbio,Inc)(南韓)的那些。適用于形成結(jié)合物的其它PEG試劑和結(jié)合方法描述于例如Pasut等人,《治療術(shù)專利專家評論(Expert Opin.Ther.Patents.)》14(6)859-893,2004。

直鏈或分支鏈PEG聚合物和其衍生物或結(jié)合物的制備描述于例如美國專利第4,904,584號；第5,428,128號；第5,621,039號；第5,622,986號；第5,643,575號；第5,728,560號；第5,730,990號；第5,738,846號；第5,811,076號；第5,824,701號；第5,840,900號；第5,880,131號；第5,900,402號；第5,902,588號；第5,919,455號；第5,951,974號；第5,965,119號；第5,965,566號；第5,969,040號；第5,981,709號；第6,011,042號；第6,042,822號；第6,113,906號；第6,127,355號；第6,132,713號；第6,177,087號；第6,180,095號；第6,448,369號；第6,495,659號；第6.602,498號；第6,858,736號；第6,828,401號；第7,026,440號；第7,608,678號；第7,655,747號；第7,786,221號；第7,872,072號；以及第7,910,661號中，其各自以全文引用的方式并入本文中。

在一些實(shí)施例中，連接基團(tuán)為親水性的，例如以提高結(jié)合物在體液中的溶解度。在一些實(shí)施例中，p97多肽和siRNA分子通過包含氨基酸或肽、脂質(zhì)或糖殘基的連接子接合。在一些實(shí)施例中，p97多肽和siRNA分子接合在以合成方式或通過轉(zhuǎn)譯后修飾引入的基團(tuán)處。

變異體序列.某些實(shí)施例包括通過名稱或參考序列識別碼描述的本文所述的參考多肽和多核苷酸序列的變異體，包括p97序列、IDS序列、連接子序列、信號肽序列、純化標(biāo)記和蛋白酶位點(diǎn)(參看例如表1到6和序列表)。這些多肽的野生型或最盛行序列為所屬領(lǐng)域中已知的，并且可用作本文所述的變異體和片段的比較。

在本文使用術(shù)語“變異體”序列時(shí)是指與本文所披露的參考序列相差一個(gè)或多個(gè)取代、缺失(例如截短)、添加和/或插入的多肽或多核苷酸序列。特定變異體因此包括本文所述的參考序列的片段。變異體多肽為生物活性的，也就是說其繼續(xù)具有參考多肽的酶促或結(jié)合活性。此類變異體可由例如遺傳學(xué)多態(tài)現(xiàn)象和/或人類操作產(chǎn)生。

在許多情況下，生物活性變異體將含有一個(gè)或多個(gè)保守取代?！氨Ｊ厝〈睘榘被峤?jīng)另一個(gè)具有類似特性的氨基酸取代，使得肽化學(xué)方法領(lǐng)域的技術(shù)人員將預(yù)期多肽的二級結(jié)構(gòu)和親水性質(zhì)大體上不變。如上文所述，可以在本發(fā)明的多核苷酸和多肽的結(jié)構(gòu)中進(jìn)行修飾并且仍獲得編碼具有理想特征的變異體或衍生物多肽的功能性分子。當(dāng)希望改變多肽的氨基酸序列形成本發(fā)明多肽的等效或甚至改良的變異體或部分時(shí)，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常將改變編碼根據(jù)下文表A的DNA序列的一個(gè)或多個(gè)密碼子。

舉例來說，特定氨基酸可取代蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的其它氨基酸而不明顯損失與例如抗體的抗原結(jié)合區(qū)域或底物分子上的結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)相互結(jié)合能力。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的相互作用能力和性質(zhì)界定蛋白質(zhì)的生物功能活性，所以可以在蛋白質(zhì)序列以及當(dāng)然其潛在DNA編碼序列中進(jìn)行特定氨基酸序列取代，且仍獲得具有類似特性的蛋白質(zhì)。因此預(yù)期所披露組合物的肽序列或編碼所述肽的相應(yīng)DNA序列中進(jìn)行多種改變而不明顯損失其效用。

在進(jìn)行此類改變時(shí)，可以考慮氨基酸的親水指數(shù)。所屬領(lǐng)域中一般理解親水性氨基酸指數(shù)在賦予蛋白質(zhì)相互作用生物功能中的重要性(Kyte和Doolittle,1982，以引用的方式併入本文中)。公認(rèn)氨基酸的相對親水性特征有助于所得蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，這又限定蛋白質(zhì)與其它分子(例如酶、襯底、受體、DNA、抗體、抗原等)相互作用。各氨基酸已基于其疏水性和電荷特征指定親水指數(shù)(Kyte和Doolittle,1982)。這些值為：異白氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；白氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；以及精氨酸(-4.5)。所屬領(lǐng)域中已知特定氨基酸可以經(jīng)具有類似親水指數(shù)或評分的其它氨基酸取代并且仍產(chǎn)生具有類似生物活性的蛋白質(zhì)，即仍獲得生物功能等效蛋白質(zhì)。進(jìn)行這類改變時(shí)，親水指數(shù)在±2之內(nèi)的氨基酸取代是優(yōu)選的，在±1之內(nèi)的那些尤其優(yōu)選，并且在±0.5之內(nèi)的那些甚至更優(yōu)選。

所屬領(lǐng)域中還應(yīng)理解可以基于親水性有效進(jìn)行類似的氨基酸取代。美國專利4,554,101(以全文引用的方式明確并入本文中)表述由相鄰氨基酸的親水性決定的蛋白質(zhì)的最大局部平均親水性與蛋白質(zhì)的生物學(xué)特性相關(guān)。如美國專利4,554,101中詳細(xì)描述，氨基酸殘基已經(jīng)指定以下親水性值：精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；白氨酸(-1.8)；異白氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。應(yīng)理解，氨基酸可以是經(jīng)具有類似親水性值的另一個(gè)氨基酸取代并且仍獲得生物等效蛋白質(zhì)，并且尤其免疫等效蛋白質(zhì)。在這類改變時(shí)，親水性值在±2之內(nèi)的氨基酸取代是優(yōu)選的，在±1之內(nèi)的那些尤其優(yōu)選，并且在±0.5之內(nèi)的那些甚至更尤其優(yōu)選。

如上文所概述，氨基酸取代一般因此基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對相似性，例如其疏水性、親水性、電荷、大小等?？紤]前述一個(gè)或多個(gè)特征的示范性取代為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知并且包括：精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、白氨酸和異白氨酸。

可以基于殘基的極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兩親性中的相似性進(jìn)行進(jìn)一步氨基酸取代。舉例來說，帶負(fù)電的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；以及具有類似親水性值的具有不帶電極性頭端的氨基酸包括白氨酸、異白氨酸和纈氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸?？梢源肀Ｊ馗淖兊钠渌被峄鶊F(tuán)包括：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；以及(5)phe、tyr、trp、his。

變異體還可以或替代地含有非保守改變。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，與原生或參考序列的不同之處在于取代、缺失或添加少于約10、9、8、7、6、5、4、3、2個(gè)氨基酸或甚至1個(gè)氨基酸的變異體多肽。變異體還可以(或替代地)通過例如缺失或添加對多肽的免疫原性、二級結(jié)構(gòu)、酶促活性和/或親水性影響最小的氨基酸來修飾。

在某些實(shí)施例中，DSSHAFTLDELR(SEQ ID NO:14)p97多肽的變異體可以基于來自其它生物體的p97序列的序列，如下表B中所示。相對于人類序列的變異體氨基酸帶下劃線。

因此，在某些實(shí)施例中，p97肽包含表B中的序列，由表B中的序列組成或基本上由表B中的序列組成。在特定方面，p97肽在DSSHAFTLDELR(SEQ ID NO:14)肽的C端處保留短α-螺旋(LDEL)。

在某些實(shí)施例中，多肽序列的長度為約、至少約或高達(dá)約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000或更多個(gè)(包括中間的全部整數(shù))連續(xù)氨基酸并且可包含全部或一部分參考序列(參看例如序列表)。

在某些實(shí)施例中，多肽序列由組成約或不超過約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800.800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000或更多個(gè)(包括中間的全部整數(shù))連續(xù)氨基酸組成，并且可包含全部或一部分參考序列(參看例如序列表)。

在一些實(shí)施例中，多肽序列為約10-1000、10-900、10-800、10-700、10-600、10-500、10-400、10-300、10-200、10-100、10-50、10-40、10-30、10-20、20-1000、20-900、20-800、20-700、20-600、20-500、20-400、20-300、20-200、20-100、20-50、20-40、20-30、50-1000、50-900、50-800、50-700、50-600、50-500、50-400、50-300、50-200、50-100、100-1000、100-900、100-800、100-700、100-600、100-500、100-400、100-300、100-200、200-1000、200-900、200-800、200-700、200-600、200-500、200-400或200-300個(gè)(包括中間的全部整數(shù))連續(xù)氨基酸，并且包含全部或一部分參考序列。在某些實(shí)施例中，任何參考多肽的C端或N端區(qū)域可以截短約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750或800個(gè)或更多個(gè)氨基酸，或約10-50、20-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800個(gè)或更多個(gè)氨基酸(包括中間的全部整數(shù)(例如101、102、103、104、105))、只要截短的多肽保留參考多肽的結(jié)合特性和/或活性。通常，生物活性片段具有不低于其來源生物活性參考多肽的約1％、約5％、約10％、約25％或約50％活性。

一般來說，變異體將展現(xiàn)與參考多肽序列至少約30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相似性或序列一致性或序列同源性。另外，涵蓋通過添加(例如C端添加、N端添加、它們兩個(gè))、缺失、截短、插入或取代(例如保守取代)約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個(gè)氨基酸(包括中間的全部整數(shù)和范圍)與原生序列或親本序列不同但仍保留親本多肽序列或參考多肽序列的特性或活性的序列。

在一些實(shí)施例中，變異體多肽與參考序列相差至少一個(gè)但少于50、40、30、20、15、10、8、6、5、4、3或2個(gè)氨基酸殘基。在其它實(shí)施例中，變異體多肽與參考序列相差至少1％但少于20％、15％、10％或5％殘基。(如果這一比較需要比對，那么應(yīng)該針對最大相似性來比對序列。缺失或插入引起的“退出循環(huán)”序列或錯(cuò)配視為不同。)

如下進(jìn)行序列之間的序列相似性或序列一致性(所述術(shù)語在本文中可互換使用)的計(jì)算。為了測定兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸序列的一致性百分比，將所述序列針對最優(yōu)比較目的比對(例如，可將間隙引入第一和第二氨基酸或核酸序列中的一個(gè)或兩個(gè)中以便最優(yōu)比對且出于比較目的可以忽略非同源序列)。在某些實(shí)施例中，出于比較目的所比對的參考序列長度是參考序列長度的至少30％，優(yōu)選至少40％，更優(yōu)選至少50％、60％，并且甚至更優(yōu)選至少70％、80％、90％、100％。接著對相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸殘基或核苷酸進(jìn)行比較。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械奈恢帽慌c第二序列中相應(yīng)位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時(shí)，則分子在所述位置處相同。

兩個(gè)序列之間的一致性百分比與所述序列共有的一致位置的數(shù)目有關(guān)，并且考慮最佳比對兩個(gè)序列需要引入的間隙的數(shù)目和每一間隙的長度。

序列的比較和兩個(gè)序列之間的一致性百分比的測定可以使用數(shù)學(xué)算法實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，使用已并入GCG軟件包中的GAP程序中的尼德曼和文施(Needleman and Wunsch)(《分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)》48:444-453,1970)算法，使用Blossum62矩陣或PAM250矩陣，以及16、14、12、10、8、6或4的間隙權(quán)數(shù)和1、2、3、4、5或6的長度權(quán)數(shù)測定兩個(gè)氨基酸序列之間的一致性百分比。在另一優(yōu)選實(shí)施例中，兩個(gè)核苷酸序列之間的一致性百分比使用GCG軟件包中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩陣和40、50、60、70或80的間隙權(quán)數(shù)以及1、2、3、4、5或6的長度權(quán)數(shù)計(jì)算。尤其優(yōu)選的參數(shù)集(并且除非另外規(guī)定，否則應(yīng)使用的參數(shù)集)是Blossum62計(jì)分矩陣，其中間隙罰分為12，間隙擴(kuò)大罰分為4，并且移碼空隙罰分為5。

兩個(gè)氨基酸或核苷酸序列之間的一致性百分比可以使用已并入到ALIGN程序(2.0版)中的E.Meyers和W.Miller算法(Cabios.4:11-17,1989)，使用PAM120加權(quán)殘基表，12的間隙長度罰分和4的間隙罰分測定。

本文所述的核酸和蛋白質(zhì)序列可用作“查詢序列”來執(zhí)行公用數(shù)據(jù)庫的檢索，例如來鑒別其它家族成員或相關(guān)序列。此類檢索可以使用Altschul等人,(1990,《分子生物學(xué)雜志》,215:403-10)的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)進(jìn)行。BLAST核苷酸檢索可以用NBLAST程序進(jìn)行，總分＝100，字長＝12，由此獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質(zhì)檢索可以用XBLAST程序進(jìn)行，總分＝50，字長＝3，由此獲得與本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的帶間隙比對，可以如Altschul等人(《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》25:3389-3402,1997)中所述利用帶間隙BLAST。當(dāng)利用BLAST和帶間隙BLAST程序時(shí)，可使用各別程序(例如XBLAST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)。

在一個(gè)如上文所述的實(shí)施例中，可以使用BLAST比對工具評估多核苷酸和/或多肽。局部比對僅由一對序列片段組成，一個(gè)序列片段來自所比較序列的每一個(gè)。史密斯-沃特曼或塞勒斯算法的改良將發(fā)現(xiàn)評分不能通過伸展或微調(diào)提高的全部區(qū)段對，稱為高評分區(qū)段對(HSP)。BLAST比對的結(jié)果包括指示BLAST評分可能預(yù)期來自單獨(dú)機(jī)會(huì)的可能性的統(tǒng)計(jì)措施。

初始評分S從與各比對序列有關(guān)的間隙和取代數(shù)目計(jì)算，其中越高的相似性評分指示越顯著的比對。取代評分由查詢表(參看PAM、BLOSUM)給出。

間隙評分通常作為間隙開啟罰分G和間隙擴(kuò)大罰分L的總和計(jì)算。對于長度n的間隙，間隙代價(jià)將為G+Ln。間隙代價(jià)G和L的選擇是經(jīng)驗(yàn)值，但習(xí)慣選擇高G值(10-15)，例如11，以及低L值(1-2)，例如1。

比特評分S'來自初始比對評分S，其中已考慮所用評分系統(tǒng)的統(tǒng)計(jì)特性。比特評分關(guān)于評分系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)化，因此其可用于比較來自不同檢索的比對評分。術(shù)語“比特評分”和“相似性評分”可互換使用。比特評分給出比對良好程度的指示；評分越高，比對越好。

E值或預(yù)期值描述數(shù)據(jù)庫中偶然出現(xiàn)具有類似評分的序列的可能性，這是預(yù)期在數(shù)據(jù)庫檢索中偶然出現(xiàn)的評分等于S或比S更好的不同比對的數(shù)目的預(yù)測。E值越小，比對越顯著。舉例來說，E值為e^-117的比對意思是具有類似評分的序列非常不可能僅偶然出現(xiàn)。另外，比對隨機(jī)氨基酸對的預(yù)期評分需要為負(fù)，而長比對將傾向于不管比對的區(qū)段是否相關(guān)都具有高評分。另外，BLAST算法使用適當(dāng)取代基質(zhì)、核苷酸或氨基酸并且針對帶間隙比對使用間隙形成和擴(kuò)大罰分。舉例來說，多肽序列的BLAST比對和比較通常使用BLOSUM62矩陣進(jìn)行，間隙存在罰分為11并且間隙擴(kuò)大罰分為1。

在一個(gè)實(shí)施例中，序列相似性評分從使用BLOSUM62矩陣、間隙存在罰分11和間隙擴(kuò)大罰分1的BLAST分析報(bào)道。

在特定實(shí)施例中，本文提供的序列一致性/相似性評分是指使用GAP版本10(GCG、Accelrys、San Diego、Calif.)，使用以下參數(shù)獲得的值：使用GAP權(quán)數(shù)50和長度權(quán)數(shù)3，以及nwsgapdna.cmp評分矩陣的核苷酸序列的一致性％和相似性％；使用GAP權(quán)數(shù)8和長度權(quán)數(shù)2，以及BLOSUM62評分矩陣的氨基酸序列一致性％和相似性％(Henikoff和Henikoff,《美國國家科學(xué)院院刊(PNAS USA)》.89:10915-10919,1992)。GAP使用尼德曼和文施算法(分子生物學(xué)雜志《J Mol Biol.》48:443-453,1970)發(fā)現(xiàn)使匹配數(shù)目最大并且使間隙數(shù)最少的兩個(gè)全序列的比對。

在一個(gè)特定實(shí)施例中，變異體多肽包含可以與參考多肽序列(參看例如序列表)最優(yōu)地比對以產(chǎn)生至少約50、60、70、80、90、100、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000或更大(包括中間的全部整數(shù)和范圍)的BLAST比特評分或序列相似性評分的氨基酸序列，其中BLAST比對使用BLOSUM62矩陣，間隙存在罰分11和間隙擴(kuò)大罰分1。

如上文所述，參考多肽可以使用不同方式改變，包括氨基酸取代、缺失、截短、添加和插入。用于此類操控的方法在所屬領(lǐng)域中一般已知。舉例來說，參考多肽的氨基酸序列變異體可以通過DNA中的突變制備。突變誘發(fā)和核苷酸序列改變的方法在所屬領(lǐng)域中眾所周知。參看例如Kunkel(《美國國家科學(xué)院院刊》.82:488-492,1985)；Kunkel等人,(《酶學(xué)方法(Methods in Enzymol)》.154:367-382,1987)；美國專利第4,873,192號；Watson,J.D.等人,(“《基因分子生物學(xué)(Molecular Biology of the Gene)》,”第四版,Benjamin/Cummings,加利福尼亞州門洛帕克(Menlo Park,Calif.),1987)以及其中引用的參考文獻(xiàn)。關(guān)于不影響所關(guān)注蛋白質(zhì)的生物活性的適當(dāng)氨基酸取代的指導(dǎo)存在于Dayhoff等人,(1978)蛋白序列和結(jié)構(gòu)圖集(Atlas of Protein Sequence and Structure)(《國家生物醫(yī)學(xué)研究基礎(chǔ)(Natl.Biomed.Res.Found.)》,華盛頓(Washington,D.C.))的模型中。

通過此類修飾篩選組合文庫的基因產(chǎn)物以及篩選具有所選特性的基因產(chǎn)物的cDNA文庫的方法為所屬領(lǐng)域中已知的。此類方法可調(diào)適用于快速篩選通過參考多肽的組合突變誘發(fā)產(chǎn)生的基因文庫。作為一個(gè)實(shí)例，提高文庫中功能性突變體頻率的技術(shù)遞歸整體突變誘發(fā)(REM)可與篩選分析法組合用于鑒別多肽變異體(Arkin和Yourvan,《美國國家科學(xué)院院刊》89:7811-7815,1992；Delgrave等人,《蛋白質(zhì)工程改造(Protein Engineering.)》6:327-331,1993)。

可檢測實(shí)體.在一些實(shí)施例中，p97結(jié)合物可操作地連接到“可檢測實(shí)體”。示范性可檢測實(shí)體包括(但不限于)碘類標(biāo)記、放射性同位素、熒光團(tuán)/熒光染料和納米粒子。

示范性碘類標(biāo)記包括泛影酸(通用電氣醫(yī)療集團(tuán)(GE Healthcare))和其陰離子形式泛影酸根。泛影酸為用于高級X射線技術(shù)(例如CT掃描)中的中波頻率造影劑。還包括下文所述的碘放射性同位素。

可用作可檢測實(shí)體的示范性放射性同位素包括³²P、³³P、³⁵S、³H、¹⁸F、¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹¹¹In、¹⁶⁹Yb、^99mTC、⁵⁵Fe以及碘同位素，例如¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I以及¹³¹I。這些放射性同位素具有不同半衰期、衰變類型以及可調(diào)適以匹配具體方案的需要的能級。這些放射性同位素中的某些可以通過結(jié)合到p97結(jié)合物選擇性靶向或更好的靶向CNS組織，例如改良此類組織的醫(yī)學(xué)成像。

可用作直接可檢測實(shí)體的熒光團(tuán)或熒光染料的實(shí)例包括熒光素、四甲基羅丹明(tetramethylrhodamine)、德克薩斯紅(Texas Red)、Oregon以及許多其它實(shí)體(例如Haugland,《熒光探針手冊(Handbook of Fluorescent Probes)》-第9版,2002,Molec.Probes,Inc.,Eugene OR；Haugland,《熒光探針和標(biāo)記技術(shù)指導(dǎo)手冊(The Handbook:A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies)》-第10版,2005,加利福尼亞州卡爾斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA))。還包括發(fā)光或其它可檢測染料。染料發(fā)射的光可以是可見光或不可見光，例如紫外光或紅外光。在示范性實(shí)施例中，染料可以是熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)染料；二苯并哌喃染料，例如熒光素和若丹明；在α或β位置中具有氨基的染料(例如萘胺染料、1-二甲基氨基萘基-5-磺酸酯、1-苯胺基-8-萘磺酸酯以及2-對-甲苯胺基-6-萘磺酸酯)；具有3-苯基-7-異氰酸酯基香豆素的染料；吖啶，例如9-異硫代氰酸酯基吖啶以及吖啶橙；芘、苯并噁二唑以及芪；具有3-(e-羧基戊基)-3'-乙基-5,5'-二甲基氧雜甲花青苷碘(CYA)的染料；6-羧基熒光素(FAM)；5&6-羧基羅丹明-110(R110)；6-羧基羅丹明-6G(R6G)；N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA)；6-羧基-X-若丹明(ROX)；6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基熒光素(JOE)；ALEXA FLUOR^TM；Cy2；德克薩斯紅和若丹明紅；6-羧基-2',4,7,7'-四氯熒光素(TET)；6-羧基-2',4,4',5',7,7'-六氯熒光素(HEX)；5-羧基-2',4',5',7'-四氯熒光素(ZOE)；NAN；NED；Cy3；Cy3.5；Cy5；Cy5.5：Cy7；以及Cy7.5；IR800CW、ICG、Alexa Fluor350；Alexa Fluor 488；Alexa Fluor 532；Alexa Fluor 546；Alexa Fluor 568；Alexa Fluor594；Alexa Fluor 647；Alexa Fluor 680或Alexa Fluor 750。特定實(shí)施例包括與化學(xué)治療劑(例如太平洋紫杉醇、阿德力霉素(adriamycin))結(jié)合，所述化學(xué)治療劑經(jīng)例如熒光團(tuán)(例如OregonAlexa Fluor 488)的可檢測實(shí)體標(biāo)記。

納米粒子的尺寸通常在約1-1000nm范圍內(nèi)并且包括不同化學(xué)結(jié)構(gòu)，例如金和銀粒子和量子點(diǎn)。當(dāng)用傾斜入射白光照射時(shí)，約40-120nm范圍內(nèi)的銀或金納米粒子將散射具有高強(qiáng)度的單色光。散射光的波長取決于粒子尺寸。極為接近的四到五個(gè)不同粒子將各自散射單色光，所述單色光疊加時(shí)將獲得特定獨(dú)特顏色。例如銀或金粒子的衍生的納米粒子可以連接到大量分子，包括蛋白質(zhì)、抗體、小分子、受體配位體和核酸。納米粒子的特定實(shí)例包括金屬納米粒子和金屬納米殼層，例如金粒子、銀粒子、銅粒子、鉑粒子、鎘粒子、復(fù)合粒子、金中空球、金涂布的二氧化硅納米殼層，以及二氧化硅涂布的金殼層。還包括二氧化硅、乳膠、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯、PVDF納米粒子和任何這些材料的彩色粒子。

量子點(diǎn)為可以被大范圍波長的光激發(fā)的直徑約1-5納米的熒光晶體。當(dāng)被具有適當(dāng)波長的光激發(fā)時(shí)，這些晶體發(fā)光，例如單色光，波長取決于其化學(xué)組成和尺寸。例如CdSe、ZnSe、InP或InAs的量子點(diǎn)具有獨(dú)特光學(xué)特性；這些和類似量子點(diǎn)獲自許多商業(yè)來源(例如NN-Labs,Fayetteville,AR；Ocean Nanotech,Fayetteville,AR；Nanoco Technologies,Manchester,UK；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)。

使用方法和藥物組合物

本發(fā)明的某些實(shí)施例涉及使用本文所述的p97結(jié)合物的方法。此類方法的實(shí)例包括治療方法和診斷方法，包括例如使用p97結(jié)合物進(jìn)行特定器官/組織(例如神經(jīng)系統(tǒng)的器官/組織)的醫(yī)學(xué)成像。一些實(shí)施例包括診斷和/或治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的病癥或病況，或具有CNS組分的病癥或病況的方法。具體方面包括治療溶酶體貯積病癥(LSD)，包括具有CNS組分的那些的方法。

因此，某些實(shí)施例包括治療有需要的個(gè)體的方法，包含投予本文所述的p97結(jié)合物。還包括將IDS酶傳遞到個(gè)體的神經(jīng)系統(tǒng)(例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織)的方法，包含投予包含本文所述的p97結(jié)合物的組合物。在這些和相關(guān)實(shí)施例的某些中，所述方法相對于例如通過包含未結(jié)合siRNA分子的組合物傳遞提高所述藥劑到中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織的傳遞速率。

在某些實(shí)施例中，個(gè)體患有表2中的疾病或病況。在具體實(shí)施例中，siRNA分子靶向NOX基因，例如NOX1、NOX2和/或NOX4，且個(gè)體患有以下疾病或病況，例如與細(xì)胞死亡有關(guān)的疾病、慢性腎病、糖尿病或糖尿病并發(fā)癥，糖尿病性腎病(參看例如Jha等人,《美國腎臟病學(xué)會(huì)雜志(J Am Soc Nephrol.)》2014)、神經(jīng)心血管疾病，例如心肌梗塞誘發(fā)的心臟功能不全，或CNS病癥(參看例如Nayernia等人,《抗氧化劑和氧化還原信號傳導(dǎo)(Antioxidants&Redox Signaling)》,doi:10.1089/ars.2013.5703,2014；Sorce和Krause,《抗氧化劑和氧化還原信號傳導(dǎo)》.11:2481-2504,2009。具體實(shí)例包括神經(jīng)退行性疾病，例如其中微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的NOX酶活化產(chǎn)生細(xì)胞損傷的病理學(xué)循環(huán)，導(dǎo)致微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化提高，這導(dǎo)致進(jìn)一步細(xì)胞損傷等。還包括帕金森氏病，例如其中多巴胺能神經(jīng)元中的NOX(例如NOX1)表達(dá)可造成神經(jīng)退化。

還包括NOX相關(guān)精神疾病的治療。舉例來說，NOX2日益牽涉于精神病性疾病，具體來說氯胺酮誘發(fā)的精神病的動(dòng)物模型中。此處，有跡象表明神經(jīng)元(并且不專有的限于微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)中可能存在疾病相關(guān)NOX2活性。具體實(shí)例包括急性應(yīng)激障礙；未分型適應(yīng)障礙；焦慮性適應(yīng)障礙；抑郁心境的適應(yīng)障礙；品行異常的適應(yīng)障礙；伴隨焦慮與憂郁情緒的適應(yīng)障礙；情緒和品行混合的適應(yīng)障礙；無驚恐發(fā)作史的廣場恐怖癥；神經(jīng)性厭食癥；反社會(huì)型人格障礙；身體狀況引起的焦慮癥；焦慮癥，NOS；回避型人格障礙；兩極型異常NOS；I型兩極型異常，最近抑郁發(fā)作，完全緩解；I型兩極型異常，最近抑郁發(fā)作，部分緩解；I型兩極型異常，最近抑郁發(fā)作，輕微；I型兩極型異常，最近抑郁發(fā)作，中等；I型兩極型異常，最近抑郁發(fā)作，嚴(yán)重且具有精神病特征；I型兩極型異常，最近抑郁發(fā)作，嚴(yán)重且不具有精神病特征；I型兩極型異常，最近抑郁發(fā)作，未分型；I型兩極型異常，最近躁狂發(fā)作，完全緩解；I型兩極型異常，最近躁狂發(fā)作，部分緩解；I型兩極型異常，最近躁狂發(fā)作，輕微；I型兩極型異常，最近躁狂發(fā)作，中等；I型兩極型異常，最近躁狂發(fā)作，嚴(yán)重且具有精神病特征；I型兩極型異常，最近躁狂發(fā)作，嚴(yán)重且不具有精神病特征；I型兩極型異常，最近躁狂發(fā)作，未分型；I型兩極型異常，最近混合發(fā)作，完全緩解；I型兩極型異常，最近混合發(fā)作，部分緩解；I型兩極型異常，最近混合發(fā)作，輕微；I型兩極型異常，最近混合發(fā)作，中等；I型兩極型異常，最近混合發(fā)作，嚴(yán)重且具有精神病特征；I型兩極型異常，最近混合發(fā)作，嚴(yán)重且不具有精神病特征；I型兩極型異常，最近混合發(fā)作，未分型；I型兩極型異常，最近未分型發(fā)作；I型兩極型異常，最近輕度躁狂發(fā)作；I型兩極型異常，單次躁狂發(fā)作，完全緩解；I型兩極型異常，單次躁狂發(fā)作，部分緩解；I型兩極型異常，單次躁狂發(fā)作，輕微；I型兩極型異常，單次躁狂發(fā)作，中等；I型兩極型異常，單次躁狂發(fā)作，嚴(yán)重且具有精神病特征；I型兩極型異常，單次躁狂發(fā)作，嚴(yán)重且不具有精神病特征；I型兩極型異常，單次躁狂發(fā)作，未分型；II型兩極型異常；身體變形障礙；邊緣性人格障礙；呼吸相關(guān)睡眠障礙；短時(shí)精神障礙；神經(jīng)性暴食癥；生理節(jié)律睡眠障礙；轉(zhuǎn)換障礙；循環(huán)情感障礙；妄想癥；依賴型人格障礙；人格解體障礙；抑郁癥NOS；分離性失憶癥；分離性障礙NOS；分離性神游；分離性身份識別障礙；性交困難；睡眠障礙NOS；與(另一病癥)相關(guān)的睡眠障礙；心境惡劣障礙；進(jìn)食障礙NOS；裸露癖；身體狀況引起的女性性交困難；身體狀況引起的女性機(jī)能減退的性欲障礙；女性性高潮障礙；女性性喚起障礙；戀物癖；摩擦癖；青少年或成人性別認(rèn)定障礙；兒童性別認(rèn)定障礙；性別認(rèn)定障礙NOS；廣泛性焦慮癥；表演型人格障礙；機(jī)能減退的性欲障礙；臆想癥；沖動(dòng)控制障礙NOS；與(另一病癥)相關(guān)的失眠癥；間歇性暴發(fā)障礙；盜竊癖；重度抑郁癥，復(fù)發(fā)，完全緩解；重度抑郁癥，復(fù)發(fā)，部分緩解；重度抑郁癥，復(fù)發(fā)，輕微；重度抑郁癥，復(fù)發(fā)，中等；重度抑郁癥，復(fù)發(fā)，嚴(yán)重且具有精神病特征；重度抑郁癥，復(fù)發(fā)，嚴(yán)重且不具有精神病特征；重度抑郁癥，復(fù)發(fā)，未分型；重度抑郁癥，單次發(fā)作，完全緩解；重度抑郁癥，單次發(fā)作，部分緩解；重度抑郁癥，單次發(fā)作，輕微；重度抑郁癥，單次發(fā)作，中等；重度抑郁癥，單次發(fā)作，嚴(yán)重且具有精神病特征；重度抑郁癥，單次發(fā)作，嚴(yán)重且不具有精神病特征；重度抑郁癥，單次發(fā)作，未分型；身體狀況引起的男性性交困難；男性勃起障礙；身體狀況引起的男性勃起障礙；身體狀況引起的男性機(jī)能減退的性欲障礙；男性高潮障礙；身體狀況引起的情感障礙；自戀型人格障礙；嗜眠發(fā)作；夢魘癥；強(qiáng)迫癥；強(qiáng)迫型人格障礙；身體狀況引起的其它女性性功能障礙；身體狀況引起的其它男性性功能障礙；與心理因素和身體狀況相關(guān)的疼痛障礙；與心理特征相關(guān)的疼痛障礙；廣場恐怖癥性驚恐障礙；不伴隨廣場恐怖癥的驚恐障礙；偏執(zhí)型人格障礙；性欲倒錯(cuò)，NOS；睡眠異常NOS；病理性賭博；戀童癖；人格障礙NOS；創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙；早泄；原發(fā)性嗜睡癥；原發(fā)性失眠；身體狀況引起的精神障礙，伴隨妄想；身體狀況引起的精神障礙，伴隨幻想；精神障礙，NOS；縱火癖；分裂情感性障礙；精神分裂樣人格障礙；精神分裂癥，緊張型；精神分裂癥，紊亂型；精神分裂癥，偏執(zhí)型；精神分裂癥，后遺癥型；精神分裂癥，未分化型；類精神分裂癥；分裂型人格障礙；性厭惡；性異常NOS；性功能障礙NOS；性受虐癥；性虐待狂；共有型精神??；身體狀況引起的睡眠障礙，嗜睡型；身體狀況引起的睡眠障礙，失眠型；身體狀況引起的睡眠障礙，混合型；身體狀況引起的睡眠障礙，異常睡眠型；夜驚障礙癥；夢游癥；社交恐懼癥；軀體化障礙；軀體形式障礙NOS；特殊恐懼癥

還包括缺血或中風(fēng)的治療。有充分證據(jù)證明NOX缺乏小鼠受保護(hù)免于中風(fēng)。神經(jīng)元和微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞NOX都可以起作用。已證實(shí)支持NOX2和NOX4的實(shí)驗(yàn)證據(jù)(參看Radermacher等人,《抗氧化劑和氧化還原信號傳導(dǎo)》.18:1418-27,2013；Suzuki等人,《科學(xué)報(bào)道(Sci Rep.)》2:896,2012)。還包括CNS損傷的治療。有跡象表明CNS損傷可導(dǎo)致長效微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化和NOX2表達(dá)。認(rèn)為這一機(jī)制在CNS損傷后造成神經(jīng)退化。靶向NOX4的分子還顯示改善周圍神經(jīng)損傷(例如脊髓外傷性損傷)之后的神經(jīng)痛(參看Im等人,《細(xì)胞死亡與疾病(Cell Death Dis)》.3:e426,2012)。

特定實(shí)施例包括神經(jīng)退化性病癥的治療，例如神經(jīng)發(fā)炎、特定類型的癌癥、多發(fā)性硬化癥(MS)、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、帕金森氏病、阿茲海默氏病、弗里德希氏共濟(jì)失調(diào)(Friedreich's ataxia)、脊髓性肌萎縮、亨廷頓氏病(Huntington's disease)、路易體癡呆(Dementia with Lewy bodies)、脊髓性肌萎縮、視神經(jīng)脊髓炎、重度抑郁癥、精神分裂癥、青光眼或周圍神經(jīng)病變(糖尿病性或AIDS神經(jīng)病變)。

還包括中心和周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。具體實(shí)例包括不存在透明隔、酸性脂肪酶病、酸性麥芽糖酶缺乏癥、獲得性癲癇失語、急性播散性腦脊髓炎、艾迪氏瞳(Adie's Pupil)、艾迪氏綜合癥(Adie's Syndrome)、腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、胼胝體發(fā)育不良、失認(rèn)癥、艾卡爾迪綜合癥(Aicardi Syndrome)、艾卡迪-葛帝爾障礙綜合癥(Aicardi-Goutieres Syndrome Disorder)、AIDS-神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥、亞歷山大病(Alexander Disease)、阿爾佩斯病(Alpers'Disease)、交替性偏癱、阿茲海默氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化、無腦畸形、動(dòng)脈瘤、安琪兒綜合癥(Angelman Syndrome)、血管瘤病、缺氧癥、抗磷脂綜合癥、失語癥、失用癥、蛛網(wǎng)膜囊腫、蛛網(wǎng)膜炎、阿諾德-基亞里畸形(Arnold-Chiari Malformation)、動(dòng)靜脈畸形(Arteriovenous Malformation)、阿斯伯格綜合癥(Asperger Syndrome)、共濟(jì)失調(diào)、共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張、共濟(jì)失調(diào)和小腦或脊髓小腦變性、心房顫動(dòng)和中風(fēng)、注意力不足過動(dòng)癥(ADHD)、孤獨(dú)癥、自主神經(jīng)功能障礙、背痛、巴氏綜合癥(Barth Syndrome)、貝敦氏病(Batten Disease)、貝克爾肌強(qiáng)直(Becker's Myotonia)、白塞氏病(Behcet's Disease)、貝爾氏麻痹(Bell's Palsy)、良性原發(fā)性眼瞼痙攣、良性局限性肌萎縮、良性顱高壓、伯恩哈特-羅斯綜合癥(Bernhardt-Roth Syndrome)、賓斯旺格病(Binswanger's Disease)、眼瞼痙攣、布洛赫-蘇茲貝格綜合癥(Bloch-Sulzberger Syndrome)、臂叢神經(jīng)產(chǎn)傷、臂叢神經(jīng)損傷、布拉德伯里-埃格爾斯頓綜合癥(Bradbury-Eggleston Syndrome)、腦和脊髓腫瘤(Brain and Spinal Tumors)、腦動(dòng)脈瘤、腦梗塞、腦缺血、腦損傷、脊髓半切綜合癥(Brown-Sequard Syndrome)、延髓肌肉萎縮、CADASIL、卡納萬病(Canavan Disease)、腕管綜合癥(Carpal Tunnel Syndrome)、灼痛(Causalgia)、海綿狀瘤、海綿狀血管瘤、海綿狀靜脈畸形、中央頸脊髓綜合癥、中央脊髓綜合癥、中樞性疼痛綜合癥、中央髓鞘溶解癥(Central Pontine Myelinolysis)、頭部病癥、神經(jīng)酰胺酶缺乏癥、小腦變性、小腦發(fā)育不全、腦動(dòng)脈瘤、腦動(dòng)脈硬化、大腦萎縮、腦型腳氣病、腦海綿狀血管畸形、腦巨人癥、腦缺氧、腦癱、腦-眼-面-骨骼綜合癥(Cerebro-Oculo-Facio-Skeletal Syndrome)、恰克-馬利-杜斯氏病(Charcot-Marie-Tooth Disease)、小腦扁桃體下疝畸形、膽固醇酯沉積病、舞蹈病、舞蹈病棘紅細(xì)胞增多癥、慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病(CIDP)、慢性立位耐力不良、慢性疼痛、II型科凱恩氏綜合癥(Cockayne Syndrome Type II)、科勒二氏綜合癥(Coffin Lowry Syndrome)、COFS、空洞腦、昏迷、復(fù)雜區(qū)域疼痛綜合癥、先天性面部雙癱、先天性肌無力癥、先天性肌病、先天性血管海綿狀血管瘤、皮質(zhì)基底節(jié)變性、顱動(dòng)脈炎、顱縫早閉、庫賈氏病(Creutzfeldt-Jakob Disease)、累積性傷害紊亂、庫欣氏綜合癥(Cushing's Syndrome)、巨細(xì)胞包涵體體病、巨細(xì)胞病毒感染(Cytomegalovirus Infection)、眼足舞蹈綜合癥(Dancing Eyes-Dancing Feet Syndrome)、丹迪-沃克綜合癥(Dandy-Walker Syndrome)、道森病(Dawson Disease)、德莫舍綜合癥(De Morsier's Syndrome)、帕金森氏病的深部腦刺激、下臂叢麻痹(Dejerine-Klumpke Palsy)、癡呆、多發(fā)性梗塞癡呆、語義性癡呆、皮層下癡呆、路易體癡呆、齒狀小腦性共濟(jì)失調(diào)、齒狀萎縮、皮肌炎、發(fā)展性運(yùn)動(dòng)障礙、德維克綜合癥(Devic's Syndrome)、糖尿病性神經(jīng)病變、彌漫性硬化(Diffuse Sclerosis)、德維特綜合癥(Dravet Syndrome)、自主神經(jīng)障礙、書寫障礙、閱讀障礙、吞咽困難、運(yùn)用障礙、肌陣攣性小腦性協(xié)調(diào)障礙(Dyssynergia Cerebellaris Myoclonica)、進(jìn)行性小腦共濟(jì)失調(diào)、肌張力障礙、嬰兒早期癲癇性腦病、空蝶鞍綜合癥、腦炎、流行性腦炎、腦膨出、腦病變、腦病變、具有顱內(nèi)鈣化及慢性腦脊液淋巴細(xì)胞增多的家族性嬰兒病；克里腦炎(Cree encephalitis)；偽火炬綜合癥(Pseudo-Torch syndrome)；偽弓形體病綜合癥、腦三叉神經(jīng)血管瘤病、癲癇、癲癇偏癱、上臂型和下臂叢麻痹、歐勃氏麻痹(Erb's Palsy)、特發(fā)性震顫、外髓鞘溶解、法布里病(Fabry Disease)、法爾氏綜合癥(Fahr's Syndrome)、昏厥、家族性植物神經(jīng)障礙、家族性血管瘤、家族性基底節(jié)鈣化、家族性周期性麻痹、家族性痙攣性癱瘓、法伯氏病(Farber's Disease)、高熱驚厥、肌纖維發(fā)育不良、菲希爾綜合癥(Fisher Syndrome)、嬰兒低肌張力綜合癥、足下垂、弗里德共濟(jì)失調(diào)(Friedreich's Ataxia)、額顳癡呆、神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥、高雪氏病(Gaucher's Disease)、杰斯特曼綜合癥(Gerstmann's Syndrome)、杰茨曼-斯脫司勒-史茵克綜合癥(Gerstmann-Straussler-Scheinker Disease)、巨軸索神經(jīng)病變、巨細(xì)胞動(dòng)脈炎、巨細(xì)胞性包涵體病、球形細(xì)胞樣腦白質(zhì)病變、舌咽神經(jīng)痛、糖原貯積病、格林-巴利綜合癥(Guillain-BarréSyndrome)、哈勒沃登-斯帕茨病(Hallervorden-Spatz Disease)、頭部受傷、頭痛、連續(xù)性半側(cè)顱痛、面肌痙攣、交叉性偏癱、遺傳性神經(jīng)病變、遺傳性痙攣性下半身麻痹、遺傳性共濟(jì)失調(diào)性多發(fā)性神經(jīng)炎樣病、帶狀皰疹、耳帶狀皰疹、平山綜合癥(Hirayama Syndrome)、霍姆斯-阿迪綜合癥(Holmes-Adie syndrome)、前腦無裂畸形、HTLV-1相關(guān)脊髓病、休斯綜合癥(Hughes Syndrome)、亨廷頓氏病(Huntington's Disease)、積水性無腦畸形、腦積水、正常顱壓腦積水、脊髓積水、皮質(zhì)醇增多癥、嗜睡、張力亢進(jìn)、張力減退、組織缺氧、免疫介導(dǎo)性腦脊髓炎、包涵體肌炎、色素失調(diào)癥、嬰兒期肌張力低下、幼兒神經(jīng)軸索性營養(yǎng)不良、嬰兒植烷酸貯積癥、嬰兒雷弗素姆病(Infantile Refsum Disease)、嬰兒痙攣癥、炎癥性肌病、枕骨裂露腦畸形、腸道脂肪代謝障礙、顱內(nèi)囊腫、顱內(nèi)壓增高、艾薩克斯綜合癥(Isaac's Syndrome)、茹貝爾綜合癥(Joubert Syndrome)、卡恩斯-塞爾綜合癥(Kearns-Sayre Syndrome)、肯尼迪氏病(Kennedy's Disease)、金斯伯恩綜合癥(Kinsbourne syndrome)、克萊恩-萊文綜合癥(Kleine-Levin Syndrome)、克-費(fèi)綜合癥(Klippel-Feil Syndrome)、克-特綜合癥(Klippel-Trenaunay Syndrome，KTS)、克魯爾-布西綜合癥(Klüver-Bucy Syndrome)、柯薩可夫遺忘綜合癥(Korsakoffs Amnesic Syndrome)、克拉伯病(Krabbe Disease)、庫格爾貝格-韋蘭德病(Kugelberg-Welander Disease)、苦魯病(Kuru)、蘭姆博特-伊頓二氏重癥肌無力綜合癥(Lambert-Eaton Myasthenic Syndrome)、蘭達(dá)-克萊夫納綜合癥(Landau-Kleffner Syndrome)、外側(cè)股神經(jīng)皮支卡壓、延髓外側(cè)綜合癥、學(xué)習(xí)障礙、利氏病(Leigh's Disease)、林-戈綜合癥(Lennox-Gastaut Syndrome)、萊-尼綜合癥(Lesch-Nyhan Syndrome)、腦白質(zhì)病變、萊文-克里奇利綜合癥(Levine-Critchley Syndrome)、路易體癡呆、脂貯積癥、類脂蛋白沉積癥、無腦回畸形、閉鎖綜合癥、魯蓋瑞氏病(Lou Gehrig's Disease)、狼瘡-神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥、萊姆病-神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥(Lyme Disease-Neurological Complications)、馬查多-約瑟夫病(Machado-Joseph Disease)、巨腦畸形、巨腦癥、梅-羅綜合癥(Melkersson-Rosenthal Syndrome)、腦膜炎、腦膜炎和腦炎、緬克斯綜合癥(Menkes Disease)、感覺異常性股痛(Meralgia Paresthetica)、異染性腦白質(zhì)障礙、小頭畸形、偏頭痛、米勒-費(fèi)希爾綜合癥(Miller Fisher Syndrome)、輕度認(rèn)知功能障礙、小中風(fēng)、線粒體肌病、麥比烏斯綜合癥(Moebius Syndrome)、單肢肌萎縮、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病、煙霧病、粘多糖癥、粘多糖貯積癥、多灶性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病變、多發(fā)梗塞性癡呆、發(fā)性硬化癥、多系統(tǒng)萎縮癥、伴隨起立性低血壓的多系統(tǒng)萎縮癥、肌肉萎縮癥、重癥-先天性、重癥肌無力、髓鞘破壞彌漫性硬化癥、嬰兒肌陣攣性腦病變、肌陣攣、肌肉病變、先天性肌肉病變、甲狀腺毒素肌病、肌強(qiáng)直、先天性肌強(qiáng)直癥、嗜眠發(fā)作、神經(jīng)棘紅細(xì)胞增多癥、伴隨腦鐵積累的神經(jīng)變性、經(jīng)纖維瘤、神經(jīng)安定藥惡性綜合癥、AIDS的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥、萊姆病的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥、巨細(xì)胞病毒感染的神經(jīng)影響、龐貝氏病(Pompe Disease)的神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)、狼瘡的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥、視神經(jīng)脊髓炎、神經(jīng)性肌強(qiáng)直、神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥、神經(jīng)元移行障礙、遺傳性神經(jīng)病變、神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)節(jié)病、神經(jīng)毒性、海綿形痣、尼曼-皮克病(Niemann-Pick Disease)、正常顱壓腦積水、枕神經(jīng)痛、大田原綜合癥(Ohtahara Syndrome)、橄欖體橋腦小腦萎縮、斜視性眼陣攣-肌陣攣、起立性低血壓、奧沙利文-麥克勞德綜合癥(O'Sullivan-McLeod Syndrome)、過度使用綜合癥、慢性疼痛、泛酸激酶相關(guān)神經(jīng)變性、副腫瘤綜合癥、感覺異常、帕金森氏病、發(fā)作性舞蹈手足徐動(dòng)癥、陣發(fā)性半側(cè)顱痛、帕瑞-羅姆伯格氏綜合癥(Parry-Romberg)、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(Pelizaeus-Merzbacher Disease)、舒凱爾Ⅰ型綜合癥(Pena Shokeir II Syndrome)、神經(jīng)周圍囊腫、周期性麻痹、周圍神經(jīng)病變、室周腦白質(zhì)軟化、持續(xù)性植物狀態(tài)、廣泛性發(fā)育障礙、植烷酸貯積病、匹克氏病(Pick's Disease)、神經(jīng)受壓、梨狀肌損傷綜合癥(Piriformis Syndrome)、垂體腫瘤、多肌炎、龐貝氏病(Pompe Disease)、孔洞腦畸形、帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛、感染后腦脊髓炎、脊髓灰質(zhì)炎后綜合癥、體位性低血壓、體位性心動(dòng)過速綜合癥、直立性心動(dòng)過速綜合癥、原發(fā)性生發(fā)層萎縮(Primary Dentatum Atrophy)、原發(fā)性脊髓側(cè)索硬化(Primary Lateral Sclerosis)、原發(fā)性進(jìn)行性失語(Primary Progressive Aphasia)、朊病毒病(Prion Disease)、進(jìn)行性面部偏側(cè)萎縮(Progressive Hemifacial Atrophy)、進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)性共濟(jì)失調(diào)、進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦病、進(jìn)行性硬化性灰質(zhì)萎縮、進(jìn)行性核上性麻痹、人面失認(rèn)癥、假性腦瘤、I型拉姆齊·亨特綜合癥(Ramsay Hunt Syndrome I)(曾用名)、II型拉姆齊·亨特綜合癥(曾用名)、拉斯馬森腦炎(Rasmussen's Encephalitis)、反射性交感神經(jīng)營養(yǎng)不良綜合癥、雷弗素姆病(Refsum Disease)、嬰兒雷弗素姆病、重復(fù)運(yùn)動(dòng)障礙、重復(fù)性應(yīng)激損傷、多動(dòng)腿綜合癥、逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)性脊髓病、蕾特綜合癥(Rett Syndrome)、雷氏綜合癥(Reye's Syndrome)、風(fēng)濕性腦炎、萊利日綜合癥(Riley-Day Syndrome)、骶神經(jīng)根囊腫、圣維特斯舞蹈病(Saint Vitus Dance)、唾液腺疾病、山德霍夫氏病(Sandhoff Disease)、謝耳德氏病(Schilder's Disease)、腦裂畸形、賽特貝格病(Seitelberger Disease)、癲癇發(fā)作、語義性癡呆、中隔-視神經(jīng)發(fā)育不良、嬰兒嚴(yán)重肌陣攣癲癇(SMEI)、搖晃嬰兒綜合癥、帶狀皰疹、休-德雷格綜合癥(Shy-Drager Syndrome)、休格連綜合癥( Syndrome)、睡眠呼吸暫停、昏睡病(Sleeping Sickness)、索托斯綜合癥(Sotos Syndrome)、痙攣、脊柱裂、脊髓梗死、脊髓損傷、椎管內(nèi)腫瘤、脊髓性肌萎縮、脊髓小腦萎縮癥、脊髓小腦變性、斯蒂爾-理查德森-歐斯祖斯基綜合癥(Steele-Richardson-Olszewski Syndrome)、僵人綜合癥、紋狀體黑質(zhì)變性、中風(fēng)、斯特奇-韋伯綜合癥(Sturge-Weber Syndrome)、亞急性硬化性全腦炎、皮質(zhì)下動(dòng)脈硬化性腦病變、SUNCT頭痛、吞咽障礙、西德納姆舞蹈病(Sydenham Chorea)、昏厥、梅毒性脊髓硬化癥、脊髓空洞積水癥、脊髓空洞癥、全身性紅斑狼瘡、脊髓癆、遲發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙、骶管囊腫、泰薩二氏病(Tay-Sachs Disease)、顳動(dòng)脈炎、脊髓栓系綜合癥、湯姆森肌強(qiáng)直(Thomsen's Myotonia)、胸廓出口綜合癥、甲亢性肌病、三叉神經(jīng)痛、托德麻痹(Todd's Paralysis)、妥瑞癥(Tourette Syndrome)、短暫性腦缺血發(fā)作、傳染性海綿狀腦病變、橫貫性脊髓炎、外傷性腦損傷、震顫、三叉神經(jīng)痛、熱帶痙攣性截癱、特洛亞綜合癥、結(jié)節(jié)性硬化癥、血管勃起腫瘤、中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的血管炎綜合癥、埃科諾莫病(Von Economo's Disease)、希佩爾·林道綜合病(Von Hippel-Lindau Disease，VHL)、馮·雷克林霍遜病(Von Recklinghausen's Disease)、瓦倫貝格綜合癥、韋德尼希-霍夫曼病(Werdnig-Hoffman Disease)、韋尼克-柯薩可夫綜合癥(Wernicke-Korsakoff Syndrome)、韋斯特氏綜合癥(West Syndrome)、頸部受傷、惠普爾病(Whipple's Disease)、威廉斯綜合癥(Williams Syndrome)、威爾森氏病(Wilson's Disease)、沃爾曼病(Wolman's Disease)、X連鎖脊髓延髓肌萎縮、齊薇格綜合癥(Zellweger Syndrome)、視神經(jīng)炎、慢性疲勞綜合癥、纖維肌痛、精神疾病，例如情緒障礙、重度抑郁、雙極綜合癥、精神錯(cuò)亂、精神分裂癥、強(qiáng)迫綜合癥、毒品或藥物濫用疾病，例如酒精中毒和藥物濫用，以及腦病變，例如肝性腦病變。

因此，針對NOX基因(例如NOX1、NOX2、NOX4)且具有改良的CNS組織滲透的p97-siRNA結(jié)合物可提供治療CNS的這些和其它NOX相關(guān)疾病或病況的治療效用。

對于體內(nèi)用途，例如對于治療人類疾病、醫(yī)學(xué)成像或測試，本文所述的p97結(jié)合物一般在投予之前并入到藥物組合物中。藥物組合物包含本文所述的p97結(jié)合物中的一個(gè)或多個(gè)以及生理學(xué)上可接受的載劑或賦形劑。

為了到藥物組合物，有效量或所要量的一種或多種結(jié)合物與所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知適于具體投予模式的任何藥物載劑或賦形劑混合。藥物載劑可以是液體、半液體或固體。用于腸胃外、皮內(nèi)、皮下或局部應(yīng)用的溶液或懸浮液可包括例如無菌稀釋劑(例如水)、生理食鹽水(例如磷酸鹽緩沖生理食鹽水；PBS)、不揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗微生物劑(例如苯甲醇和對羥苯甲酸甲酯)；抗氧化劑(例如抗壞血酸和亞硫酸氫鈉)以及螯合劑(例如乙二胺四乙酸(EDTA))；緩沖劑(例如乙酸鹽、檸檬酸鹽和磷酸鹽)。如果靜脈內(nèi)投予(例如通過IV輸注)，那么適合載劑包括生理食鹽水或磷酸鹽緩沖生理食鹽水(PBS)，以及含有增濃和增溶劑(例如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二醇以及其混合物)的溶液。

純形式或適當(dāng)藥物組合物形式的本文所述的結(jié)合物的投予可以通過起類似效用的試劑的任何可接受投予模式進(jìn)行。藥物組合物可以通過組合含有結(jié)合物的組合物與適當(dāng)生理學(xué)上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑制備，并且可以調(diào)配成固體、半固體、液體或氣體形式的制劑，例如片劑、膠囊、散劑、顆粒、軟膏、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠、微球體以及氣霧劑。另外，組合物中可存在但并非必需存在其它藥學(xué)活性成分(包括如本文別處描述的其它小分子)和/或適合賦形劑(例如鹽)、緩沖劑和穩(wěn)定劑。

可以通過多種不同途徑(包括經(jīng)口、腸胃外、經(jīng)鼻、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下或局部)實(shí)現(xiàn)投予。優(yōu)選投予模式取決于打算治療或預(yù)防的病況的性質(zhì)。具體實(shí)施例包括通過IV輸注投予。

載劑可包括例如藥學(xué)上可接受的載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑，其對暴露于所采用劑量和濃度的所述載劑的細(xì)胞或哺乳動(dòng)物無毒。生理學(xué)上可接受的載劑通常是水性pH緩沖溶液。生理學(xué)上可接受的載劑的實(shí)例包括緩沖劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖醇，例如甘露糖醇或山梨糖醇；形成鹽的抗衡離子，例如鈉；和/或非離子型表面活性劑，例如聚山梨醇酯20(TWEEN^TM)聚乙二醇(PEG)，和泊洛沙姆(poloxamers)(PLURONICS^TM)等。

在某些方面，p97多肽序列和siRNA分子各自獨(dú)立地結(jié)合于或囊封于粒子內(nèi)或?yàn)榻Y(jié)合于或囊封于粒子內(nèi)的預(yù)先存在結(jié)合物形式，所述粒子例如納米粒子、珠粒、脂質(zhì)調(diào)配物、脂質(zhì)粒子或脂質(zhì)體，例如免疫微脂囊。舉例來說，在具體實(shí)施例中，p97多肽序列結(jié)合于粒子表面，且所關(guān)注的siRNA分子結(jié)合于粒子表面和/或囊封于粒子內(nèi)。在這些和相關(guān)實(shí)施例的一些中，p97多肽和siRNA分子僅通過粒子本身(例如納米粒子、脂質(zhì)體)共價(jià)或可操作地彼此連接，并且不以任何其它方式彼此共價(jià)連接；也就是說，其獨(dú)立地結(jié)合于同一粒子。在其它實(shí)施例中，p97多肽和siRNA分子首先如本文所述共價(jià)或非共價(jià)彼此結(jié)合(例如通過連接子分子)，接著結(jié)合或囊封于粒子(例如脂質(zhì)體、納米粒子)內(nèi)。在具體實(shí)施例中，粒子為脂質(zhì)體，且組合物包含一個(gè)或多個(gè)p97多肽、一個(gè)或多個(gè)所關(guān)注的siRNA分子以及脂質(zhì)混合物以形成脂質(zhì)體(例如磷脂、具有表面活性劑特性的混合脂質(zhì)鏈)。在一些方面，p97多肽和siRNA分子獨(dú)立地與脂質(zhì)/脂質(zhì)體混合物混合，使得形成無需共價(jià)結(jié)合即可操作地連接p97多肽和siRNA分子的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)。在其它方面，p97多肽和siRNA分子首先如本文所述共價(jià)或非共價(jià)彼此結(jié)合，接著與脂質(zhì)混合形成脂質(zhì)體。p97多肽、siRNA分子或p97結(jié)合物可以例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合(分別例如羥基甲基纖維素或明膠微膠囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)包埋于所制備的微膠囊、膠體藥物傳遞系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球體、微乳液、納米粒子和納米膠囊)或巨乳液中。此類技術(shù)披露于《雷明頓藥物科學(xué)(Remington's Pharmaceutical Sciences)》,第16版,Oslo,A.編,(1980)中。粒子或脂質(zhì)體可進(jìn)一步包含其它治療劑或診斷劑，例如細(xì)胞毒性劑。

確切劑量和治療持續(xù)時(shí)間隨所治療的疾病而變化并且可以使用已知測試方案或通過在所屬領(lǐng)域中已知的模型系統(tǒng)中測試組合物憑經(jīng)驗(yàn)測定并且從它推斷。還可以進(jìn)行對照臨床試驗(yàn)。劑量還可以隨著打算緩解的病況的嚴(yán)重程度變化。藥物組合物一般調(diào)配和投予以發(fā)揮治療適用作用，同時(shí)使不合意副作用降到最低。組合物可以是投予一次，或可以分成許多較小劑量每隔一定間隔投予。對于任何具體個(gè)體，特定劑量方案可以根據(jù)個(gè)別需要隨時(shí)間調(diào)整。

投予這些和相關(guān)藥物組合物的典型途徑因此包括(但不限于)經(jīng)口、局部、經(jīng)皮、吸入、腸胃外、舌下、經(jīng)頰、經(jīng)直腸、經(jīng)陰道以及鼻內(nèi)。如本文所用的術(shù)語“腸胃外”包括皮下注射、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、胸骨內(nèi)注射或輸注技術(shù)。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施例的藥物組合物調(diào)配成允許其中所含有的活性成分在將組合物投予到患者時(shí)生物可用。將向個(gè)體或患者投予的組合物可以采取一種或多種劑量單元形式，其中例如，片劑可以是單個(gè)劑量單元，并且氣霧劑形式的本文所述結(jié)合物的容器可以保存多個(gè)劑量單元。制備這類劑型的實(shí)際方法對所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知或顯而易知；例如，參看《雷明頓：醫(yī)藥科學(xué)和實(shí)踐(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)》,第20版(費(fèi)城藥學(xué)和科學(xué)學(xué)院(Philadelphia College of Pharmacy and Science),2000)。打算投予的組合物通常將含有治療有效量的本文所述的結(jié)合物，用于治療所關(guān)注的疾病或病況。

藥物組合物可以采取固體或液體形式。在一個(gè)實(shí)施例中，載劑是顆粒，使得組合物例如呈片劑或散劑形式。載劑可以是液體，同時(shí)組合物是例如口服精油、可注射液體或適用于例如吸入投予的氣霧劑。當(dāng)打算經(jīng)口投予時(shí)，藥物組合物優(yōu)選地呈固體或液體形式，其中半固體、半液體、懸浮液以及凝膠形式包括在本文視為固體或液體的形式中。

作用用于經(jīng)口投予的固體組合物，藥物組合物可以調(diào)配成散劑、顆粒、壓縮片劑、丸劑、膠囊、口嚼錠、粉片等。這類固體組合物通常將含有一種或多種惰性稀釋劑或可食載劑。此外，可以存在以下中的一種或多種：粘合劑，例如羧甲基纖維素、乙基纖維素、微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，例如淀粉、乳糖或糊精；崩解劑，例如海藻酸、海藻酸鈉、淀粉羥基乙酸鈉(Primogel)、玉米淀粉等；潤滑劑，例如硬脂酸鎂或史提若特(Sterotex)；助滑劑，例如膠態(tài)二氧化硅；甜味劑，例如蔗糖或糖精；調(diào)味劑，例如胡椒薄荷、水楊酸甲酯或柑橘調(diào)味劑；以及著色劑。當(dāng)藥物組合物呈膠囊(例如明膠膠囊)形式時(shí)，除上述類型的物質(zhì)以外，其可含有例如聚乙二醇或油的液體載劑。

藥物組合物可以呈液體形式，例如酏劑、糖漿、溶液、乳液或懸浮液。作為兩個(gè)實(shí)例，液體可以用于經(jīng)口投予或用于通過注射傳遞。當(dāng)打算用于經(jīng)口投予時(shí)，優(yōu)選組合物除本發(fā)明化合物以外含有甜味劑、防腐劑、染料/著色劑以及香味增強(qiáng)劑中的一種或多種。在打算通過注射投予的組合物中，可以包括表面活性劑、防腐劑、濕潤劑、分散劑、懸浮劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑以及等張劑中的一種或多種。

液體藥物組合物不論是溶液、懸浮液或其它類似形式，都可以包括以下助劑中的一種或多種：無菌稀釋劑，例如注射用水、鹽水溶液(優(yōu)選地生理食鹽水)、林格氏溶液(Ringer's solution)、等張氯化鈉、不揮發(fā)性油(例如可以充當(dāng)溶劑或懸浮介質(zhì)的合成單或二甘油酯)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶劑；抗細(xì)菌劑，例如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，例如乙二胺四乙酸；緩沖劑，例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及用于調(diào)整張力的試劑，例如氯化鈉或右旋糖。可以將腸胃外制劑封閉于由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。生理食鹽水是優(yōu)選助劑?？勺⑸渌幬锝M合物優(yōu)選地是無菌的。

打算用于腸胃外或經(jīng)口投予的液體藥物組合物應(yīng)含有一定量的結(jié)合物，從而將獲得適合劑量。通常，這一量為至少0.01％組合物中的所關(guān)注試劑。當(dāng)打算用于經(jīng)口投予時(shí)，這一量可以在介于0.1與約70％組合物重量之間變化。特定經(jīng)口藥物組合物含有介于約4％和約75％之間的所關(guān)注試劑。在某些實(shí)施例中，制備根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物和制劑使得腸胃外劑量單元在稀釋之前含有介于0.01到10重量％之間的所關(guān)注試劑。

藥物組合物可以打算用于局部投予，在這一情況下，載劑可適合地包含溶液、乳液、軟膏或凝膠基質(zhì)。舉例來說，基質(zhì)可以包含以下中的一種或多種：石蠟脂、羊毛蠟、聚乙二醇、蜂蠟、礦物油、稀釋劑(例如水和醇)以及乳化劑和穩(wěn)定劑。增稠劑可以存在于藥物組合物中以用于局部投予。如果打算用于經(jīng)皮投予，那么組合物可以包括經(jīng)皮貼片或離子電滲療(iontophoresis)裝置。

藥物組合物可以打算以例如栓劑形式用于直腸投予，栓劑將在直腸中熔融并且釋放藥物。用于直腸投予的組合物可以含有油性基質(zhì)作為適合無刺激性賦形劑。這類基質(zhì)包括(但不限于)羊毛脂、可可脂以及聚乙二醇。

藥物組合物可包括多種材料，其修改固體或液體劑量單元的物理形式。舉例來說，組合物可以包括圍繞活性成分形成包覆殼層的材料。形成包覆殼層的材料通常呈惰性，并且可以選自例如糖、蟲膠以及其它腸溶包覆劑。或者，活性成分可以封裝于明膠膠囊中。固體或液體形式的藥物組合物可包括結(jié)合于結(jié)合物或試劑的試劑并且由此幫助傳遞化合物?？梢云疬@一作用的適合試劑包括單克隆或多克隆抗體、一種或多種蛋白質(zhì)或脂質(zhì)體。

藥物組合物可以基本上由可以氣霧劑形式投予的劑量單元組成。術(shù)語氣溶膠用于表示在具有膠態(tài)性質(zhì)的那些系統(tǒng)到由加壓封裝組成的系統(tǒng)范圍內(nèi)的多種系統(tǒng)。傳遞可以通過液化或壓縮氣體或通過分配活性成分的適合泵系統(tǒng)進(jìn)行。氣霧劑可以單相、雙相或三相系統(tǒng)傳遞，從而傳遞活性成分。氣霧劑的傳遞包括必需容器、活化劑、閥門、子容器等，其在一起可以形成套組。普通技術(shù)人員在不進(jìn)行過度實(shí)驗(yàn)的情況下可以確定優(yōu)選氣霧劑。

本文所述的組合物可以使用保護(hù)結(jié)合物不從身體快速消除的載劑(例如時(shí)間釋放調(diào)配物或涂層)制備。此類載劑包括控制釋放調(diào)配物，例如(但不限于)插入物和微囊封傳遞系統(tǒng)，以及可生物降解生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、聚原酸酯、聚乳酸以及普通技術(shù)人員已知的其它聚合物。

藥物組合物可以通過藥物技術(shù)中眾所周知的方法制備。舉例來說，打算通過注射投予的藥物組合物可包含鹽、緩沖劑和/或穩(wěn)定劑中的一種或多種，且包含形成溶液的無菌蒸餾水?？梢蕴砑颖砻婊钚詣﹣泶龠M(jìn)形成均質(zhì)溶液或懸浮液。表面活性劑是與結(jié)合物非共價(jià)相互作用從而促進(jìn)結(jié)合物在水性傳遞系統(tǒng)中溶解或均質(zhì)懸浮的化合物。

組合物可以治療有效量投予，所述量將視多種因素而變化，包括所采用特定化合物的活性；化合物的代謝穩(wěn)定性和作用時(shí)間長度；患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；投予模式和時(shí)間；分泌速率；藥物組合；具體病癥或病況的嚴(yán)重程度；以及進(jìn)行治療的個(gè)體。一般來說，治療有效日劑量為(對于70kg哺乳動(dòng)物)約0.001mg/kg(即約0.07mg)到約100mg/kg(即約7.0g)；優(yōu)選治療有效劑量為(對于70kg哺乳動(dòng)物)約0.01mg/kg(即約0.7mg)到約50mg/kg(即約3.5g)；更優(yōu)選治療有效劑量為(對于70kg哺乳動(dòng)物)約1mg/kg(即約70mg)到約25mg/kg(即約1.75g)。

本文所述的組合物還可以在投予一種或多種如本文所述的其它治療劑同時(shí)投予、在投予它們之前或之后投予。舉例來說，在一個(gè)實(shí)施例中，結(jié)合物與消炎劑一起投予。消炎劑或藥物包括(但不限于)類固醇和糖皮質(zhì)激素(包括倍他米松(betamethasone)、布地奈德(budesonide)、地塞米松(dexamethasone)、乙酸氫皮質(zhì)酮(hydrocortisone acetate)、氫皮質(zhì)酮(hydrocortisone)、氫皮質(zhì)酮、甲基潑尼松龍(methylprednisolone)、潑尼松龍(prednisolone)、潑尼松(prednisone)、曲安西龍(triamcinolone))；非類固醇消炎藥物(NSAIDS)，包括阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、甲胺喋呤(methotrexate)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、來氟米特(leflunomide)、抗TNF藥劑、環(huán)磷酰胺和霉酚酸酯(mycophenolate)。

此類組合療法可包括投予含有本發(fā)明化合物(即結(jié)合物)和一種或多種額外活性劑的單藥物劑量調(diào)配物，以及投予包含呈自身獨(dú)立藥物劑量調(diào)配物的本發(fā)明結(jié)合物以及各活性劑的組合物。舉例來說，本發(fā)明化合物和其它活性劑可以一起以單一經(jīng)口劑量組合物形式(如片劑或膠囊)向患者投予，或每種試劑以單獨(dú)經(jīng)口劑量配制品形式投予。類似地，如本文所述的結(jié)合物和另一活性劑可在單個(gè)腸胃外劑量組合物(例如在生理食鹽水溶液或其它生理學(xué)上可接受的溶液)中一起投予患者或各試劑在獨(dú)立腸胃外劑量調(diào)配物中投予。當(dāng)使用獨(dú)立劑量調(diào)配物時(shí)，包含結(jié)合物和一種或多種額外活性劑的組合物可以基本上在同一時(shí)間(即同時(shí))投予或在交錯(cuò)時(shí)間分別(即依序和以任何順序)投予；組合療法理解為包括全部這些方案。

本文所述的各種實(shí)施例可以組合提供其它實(shí)施例。本說明書中提及和/或申請資料表中列出的全部美國專利、美國專利申請公開案、美國專利申請案、外來專利、外來專利申請案和非專利公開案都以全文引用的方式并入本文中。必要時(shí)可以修改實(shí)施例的各方面以使用不同專利、申請案以及公開案的觀點(diǎn)來提供其它實(shí)施例。

實(shí)例

實(shí)例1

p97-siRNA結(jié)合物的制備和測試

為了測試p97提高siRNA分子跨越血腦屏障(BBB)傳遞的能力，p97多肽DSSHAFTLDERYC(SEQ ID NO:29)的C端經(jīng)連接子部分結(jié)合到靶向NOX4基因的siRNA分子的反義股(5'-A UGU UCA CAA AGU CAG GUC TT-3')(SEQ ID NO:31)的3'端。對于檢測，siRNA分子的有義股(5'-GAC CUG ACU UUG UGA ACA UTT-3')(SEQ ID NO:32)經(jīng)連接子結(jié)合到Alexa680(AF680)。對于陽性對照，p97結(jié)合的反義股和AF680標(biāo)記的有義股退火形成p97-siRNA結(jié)合物(參看圖2A)。對于陰性對照，未結(jié)合反義股和AF680標(biāo)記的有義股經(jīng)退火(參看圖2B)。

如下表E1中所示的研究設(shè)計(jì)中所概述，將測試分子注射到小鼠中。

在Balb/c小鼠中靜脈內(nèi)注射(經(jīng)尾靜脈)測試分子，且1小時(shí)后，如下處死動(dòng)物：在安樂死之前，將小鼠注射(i.v.)西紅柿凝集素-德克薩斯紅(80mg)持續(xù)10分鐘將腦部血管染色。通過心內(nèi)輸注10ml肝素化生理食鹽水(1ml/min)清除血液。切除腦部且在干冰上冷凍，且在-80℃下儲(chǔ)存。腦部安置于Tissue Tek中且在-20℃下用低溫恒溫器分段(25mm，3段/腦部)。將區(qū)段(n＝3/腦部)安置于Superfrost Plus顯微鏡載玻片上，在室溫下在冷丙酮/MeOH(1:1)中固定10分鐘，接著用PBS洗滌。使用具有DAPI的Prolong Gold抗熒光衰減試劑(分子探針公司(Molecular probes)，P36931)將玻璃蓋玻片安置于區(qū)段上。進(jìn)行3D共焦顯微(每個(gè)截面捕捉到4個(gè)隨機(jī)場)。圖3示出了腦部區(qū)段中四個(gè)視場的位置。

全部區(qū)段的信號都關(guān)于PBS對照組校準(zhǔn)以觀測那些區(qū)段中僅最小(而非全部空)AF680熒光信號(參看圖4A)。對于siRNA^AF680，任何小鼠的腦實(shí)質(zhì)中都未檢測到核周AF680信號(參看圖4B)且血管中未觀測到AF680信號。對于p97-siRNA^AF680，全部小鼠的腦實(shí)質(zhì)中都檢測到核周AF680信號(參看圖4D)，并且血管中未觀測到AF680信號。圖7顯示腦部組織中siRNA^AF680和p97-siRNA^AF680結(jié)合物相對于PBS對照的計(jì)算體積分?jǐn)?shù)。這些結(jié)果顯示結(jié)合到p97多肽可顯著提高siRNA分子到CNS組織(例如腦實(shí)質(zhì))中的傳遞。

為了測量NOX4的mRNA含量，向小鼠注射(如上文所述)低劑量的測試分子(10mg/kg)，且在注射后一小時(shí)收集組織樣品用于分析。全部RNA從冷凍腦部組織提取(參看試劑和方法)并且使用下表E2中的引物對RNA樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。

對于實(shí)時(shí)PCR，使用qScript cDMA SuperMix試劑(QuantaBio)使用無規(guī)六聚體和寡dT將1μg各RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。接著使用SYBR Green I技術(shù)在ABI 7500快速實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(美國福斯特市應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems,Foster city,USA))上進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR。各PCR操作的主混合物使用SYBR Green PCR核心試劑(美國福斯特市應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)制備，其含有：1×SYBR Green PCR緩沖劑、3mM MgCl2、1mM dNTP、0.625U Taq聚合酶以及0.25U Amperase UNG。添加10ng cDNA，且特異性有義和反義引物各使用300nM。用于實(shí)時(shí)PCR的擴(kuò)增程序如下：50℃2分鐘，95℃10分鐘，在95℃持續(xù)15秒進(jìn)行40次循環(huán)，隨后60℃持續(xù)1分鐘。全部樣品自相同RNA制劑重復(fù)三次擴(kuò)增并且視為平均值。使用線性回歸模型的斜率測定各基因和各應(yīng)力的實(shí)時(shí)PCR效率。為此，各cDNA樣品膨大，接著在50、25、10、5和2ng范圍中用作PCR模板。對于各基因，通過測量膨大cDNA的連續(xù)稀釋液的CT比特定臨界值(Walker，2002)來測定PCR效率。全部PCR反應(yīng)展現(xiàn)介于84％與96％之間的效率。

數(shù)據(jù)顯示于圖8和9A-9C中。圖8示出了所測試的七只不同小鼠的RT-PCR結(jié)果(一個(gè)PBS對照和三個(gè)各siRNA測試分子)。相對于GAPDH對照顯示NOX4 mRNA的含量。

圖9A-9C顯示使用ΔΔCT方法分析的數(shù)據(jù)：＝(CT(目標(biāo)，未經(jīng)處理)-CT(參考，未經(jīng)處理))-(CT(目標(biāo)，處理)-CT(參考，處理))。圖9A示出了用p97-siRNA結(jié)合物處理的小鼠的腦部組織中的NOX4 mRNA相對于對照(PBS和未結(jié)合的siRNA)顯著下調(diào)。圖9B示出了用p97-siRNA結(jié)合物處理的小鼠的腦部組織中內(nèi)源性NOX4表達(dá)相對于未結(jié)合的siRNA的降低百分比。圖9C示出了用p97-siRNA結(jié)合物處理的小鼠的腦部組織中的NOX4表達(dá)相對于未結(jié)合的siRNA的降低倍數(shù)(約1.8倍)。

這些數(shù)據(jù)顯示siRNA(針對NOX4基因)與p97肽的結(jié)合能夠促進(jìn)跨越BBB到腦實(shí)質(zhì)中的較高傳輸。另外，通過RT-PCR定量對NOX4基因特異的mRNA證實(shí)使用p97-siRNA結(jié)合物治療后相對于未結(jié)合siRNA較高的NOX4下調(diào)。

實(shí)例2

p97-siRNA結(jié)合物在局部缺血誘發(fā)中風(fēng)小鼠模型中的作用

測試來自實(shí)例1的NOX4基因靶向p97-siRNA結(jié)合物在大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)小鼠模型中提供神經(jīng)保護(hù)的能力(參看例如Chang等人,《視頻實(shí)驗(yàn)期刊(J Vis Exp.)》2761:2011；等人,《細(xì)胞和分子生命科學(xué)(Cell.Mol.Life Sci.)》69:2327-2343,2012；以及Kleinschnitz等人,《公共科學(xué)圖書館·生物學(xué)(PLoS Biol.)》8(9):e1000479,2010)。

C57/Bl6小鼠經(jīng)靜脈內(nèi)(IV)注射用PBS或30mg/kg單獨(dú)siRNA或p97-siRNA預(yù)處理3次(每次注射之間1小時(shí)間隔)。如下所述，在最后一次注射之后約1小時(shí)，動(dòng)物發(fā)生MCAO誘發(fā)的中風(fēng)。解剖和分離外部和內(nèi)部頸動(dòng)脈(分別ECA和ICA)并且接合頸總動(dòng)脈(CCA)。將在牙科硅酮中涂布的11cm 8-0尼龍線朝向CCA的分叉插入到ECA中小孔中。將線輕緩引入到ICA中并且饋入直到僅剩1mm從孔中突出。線通入到威利環(huán)(Circle of Willis)中并且堵塞大腦中動(dòng)脈的開口，使得血液不能通過。線留在原位1小時(shí)，接著去除，并且去除CCA上的結(jié)扎線使受影響的腦部區(qū)域再灌注。再灌注24小時(shí)后處死小鼠，并且解剖和去除腦部用于樣品分析。

梗塞體積分析.為了測量1小時(shí)MCA阻塞之后24小時(shí)的局部缺血破壞，從安樂死動(dòng)物去除腦部，將大腦切成五個(gè)2mm厚冠狀切片，將其使用2％溴化2,3,5-三苯基四氮鹽(TTC)染色。接著將腦部切片切成兩半來分離局部缺血半球和對側(cè)半球。將局部缺血和對側(cè)腦部切片轉(zhuǎn)移到含有2％TTC溶液的獨(dú)立小瓶并且在37℃下繼續(xù)染色60分鐘。在室溫下染色10-15分鐘之后，使用HP掃描儀獲得腦部切片的影像。

當(dāng)TTC染色完成時(shí)，通過比色染色法測量梗塞尺寸。簡單來說，使用生理食鹽水沖洗組織并且隨后暴露于乙醇/二甲亞砜的混合物(1:1)來溶解甲產(chǎn)物。在暗處培育24小時(shí)后，紅色溶劑提取物在三個(gè)玻璃試管中用新鮮乙醇/二甲亞砜(1:1)溶劑1:20倍稀釋，接著轉(zhuǎn)移到比色管中。

在485nm下，在分光光度計(jì)中測量吸光度，并且將各值取平均值。使用以下等式將腦部局部缺血側(cè)中的腦部TTC染色的百分比損失與同一動(dòng)物的腦部對側(cè)比較：

損失％＝100×(1-局部缺血半球吸光度/對側(cè)半球吸光度)

假手術(shù)組(無MCAO)的腦部中未觀測到梗塞組織，并且PBS和siRNA處理的中風(fēng)動(dòng)物(MCAO)相對于假手術(shù)組都展現(xiàn)大梗塞區(qū)域。然而，如圖10中所示，用p97-siRNA結(jié)合物(MTfp-siRNA)處理的動(dòng)物相對于僅PBS和siRNA組具有顯著較小梗塞區(qū)域。因此，用靶向NOX4的p97-siRNA結(jié)合物預(yù)處理通過顯著減少腦部的梗塞體積在這一MCAO誘發(fā)中風(fēng)的小鼠模型中提供神經(jīng)保護(hù)。

神經(jīng)評定.再灌注之后0和24小時(shí)，由對小鼠處理不知情的個(gè)體進(jìn)行行為評定。

如下進(jìn)行神經(jīng)缺陷評分：

●正常；

●當(dāng)通過尾部拾起時(shí)伴隨或不伴隨不恒定卷縮的溫和轉(zhuǎn)身行為，<50％嘗試向?qū)?cè)卷縮；

●溫和恒定卷縮，>50％嘗試向?qū)?cè)卷縮；

●有力且立即恒定卷縮，小鼠保持卷縮位置持續(xù)超過1-2秒，小鼠鼻子幾乎達(dá)到尾部；

●進(jìn)展成快速移動(dòng)的嚴(yán)重卷縮，失去行走或翻正反射；以及

●昏迷或垂死。

如圖11中示出，在中風(fēng)誘發(fā)后0.5小時(shí)用MTfp-siRNA結(jié)合物預(yù)處理相對于用PBS或僅siRNA預(yù)處理改良動(dòng)物的神經(jīng)功能缺損。

NOX4 mRNA表達(dá).在預(yù)處理和通過MCAO誘發(fā)中風(fēng)之后，進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR來分析NOX4的mRNA含量。圖12A示出了MTfp-siRNA預(yù)處理相對于PBS或僅siRNA導(dǎo)致腦部的中風(fēng)誘發(fā)部分中較低Nox4誘發(fā)。Ct(循環(huán)臨界值；ΔCt＝Ct(nox4,PBS-假處理組)-Ct(B-肌動(dòng)蛋白,PBS-假處理組)表示熒光信號越過臨界值/超過背景水平所需的周期數(shù)，并且與樣品中的目標(biāo)核酸的量成反比(即Ct水平越低，樣品中的目標(biāo)核酸量越高)。

圖12B示出了MTfp-siRNA預(yù)處理相對于PBS或僅siRNA導(dǎo)致中風(fēng)誘發(fā)腦部中Nox4 mRNA表達(dá)降低。這些結(jié)果使用ΔΔCT法(ΔΔCT＝(CT(Nox4,PBS-假處理組)-CT(B-肌動(dòng)蛋白,PBS-假處理組))-(CT(Nox4,MTfp-siRNA-中風(fēng))-CT(B-肌動(dòng)蛋白,MTfp-siRNA-中風(fēng)))分析。

總體來說，p97(MTfp)促進(jìn)siRNA(靶向NOX4基因)跨越BBB進(jìn)入腦部傳輸。另外，用MTfp-siRNA預(yù)處理顯著減少經(jīng)MCAO局部缺血誘發(fā)中風(fēng)24小時(shí)后的梗塞體積。在誘發(fā)中風(fēng)之前注射MTfp-siRNA的小鼠中，較小梗塞區(qū)域與較高神經(jīng)評分相關(guān)。具體來說，在中風(fēng)誘發(fā)之后0.5小時(shí)和24小時(shí)，用MTfp-siRNA預(yù)處理相對于用PBS或僅siRNA預(yù)處理改良小鼠的神經(jīng)功能缺陷。在中風(fēng)誘發(fā)腦部(左腦)中，MTfp-siRNA預(yù)處理還相對于PBS或僅siRNA對照降低mRNA水平的Nox4表達(dá)。

因此，這些數(shù)據(jù)顯示siRNA在與p97多肽(例如MTfp)結(jié)合之后可以治療劑量傳遞到腦部。

序列表

<110> 拜歐斯科技公司

<120> P97多核苷酸結(jié)合物

<130> BIOA-010/03WO

<160> 59

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 738

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Arg Gly Pro Ser Gly Ala Leu Trp Leu Leu Leu Ala Leu Arg Thr

1 5 10 15

Val Leu Gly Gly Met Glu Val Arg Trp Cys Ala Thr Ser Asp Pro Glu

20 25 30

Gln His Lys Cys Gly Asn Met Ser Glu Ala Phe Arg Glu Ala Gly Ile

35 40 45

Gln Pro Ser Leu Leu Cys Val Arg Gly Thr Ser Ala Asp His Cys Val

50 55 60

Gln Leu Ile Ala Ala Gln Glu Ala Asp Ala Ile Thr Leu Asp Gly Gly

65 70 75 80

Ala Ile Tyr Glu Ala Gly Lys Glu His Gly Leu Lys Pro Val Val Gly

85 90 95

Glu Val Tyr Asp Gln Glu Val Gly Thr Ser Tyr Tyr Ala Val Ala Val

100 105 110

Val Arg Arg Ser Ser His Val Thr Ile Asp Thr Leu Lys Gly Val Lys

115 120 125

Ser Cys His Thr Gly Ile Asn Arg Thr Val Gly Trp Asn Val Pro Val

130 135 140

Gly Tyr Leu Val Glu Ser Gly Arg Leu Ser Val Met Gly Cys Asp Val

145 150 155 160

Leu Lys Ala Val Ser Asp Tyr Phe Gly Gly Ser Cys Val Pro Gly Ala

165 170 175

Gly Glu Thr Ser Tyr Ser Glu Ser Leu Cys Arg Leu Cys Arg Gly Asp

180 185 190

Ser Ser Gly Glu Gly Val Cys Asp Lys Ser Pro Leu Glu Arg Tyr Tyr

195 200 205

Asp Tyr Ser Gly Ala Phe Arg Cys Leu Ala Glu Gly Ala Gly Asp Val

210 215 220

Ala Phe Val Lys His Ser Thr Val Leu Glu Asn Thr Asp Gly Lys Thr

225 230 235 240

Leu Pro Ser Trp Gly Gln Ala Leu Leu Ser Gln Asp Phe Glu Leu Leu

245 250 255

Cys Arg Asp Gly Ser Arg Ala Asp Val Thr Glu Trp Arg Gln Cys His

260 265 270

Leu Ala Arg Val Pro Ala His Ala Val Val Val Arg Ala Asp Thr Asp

275 280 285

Gly Gly Leu Ile Phe Arg Leu Leu Asn Glu Gly Gln Arg Leu Phe Ser

290 295 300

His Glu Gly Ser Ser Phe Gln Met Phe Ser Ser Glu Ala Tyr Gly Gln

305 310 315 320

Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Thr Ser Glu Leu Val Pro Ile Ala

325 330 335

Thr Gln Thr Tyr Glu Ala Trp Leu Gly His Glu Tyr Leu His Ala Met

340 345 350

Lys Gly Leu Leu Cys Asp Pro Asn Arg Leu Pro Pro Tyr Leu Arg Trp

355 360 365

Cys Val Leu Ser Thr Pro Glu Ile Gln Lys Cys Gly Asp Met Ala Val

370 375 380

Ala Phe Arg Arg Gln Arg Leu Lys Pro Glu Ile Gln Cys Val Ser Ala

385 390 395 400

Lys Ser Pro Gln His Cys Met Glu Arg Ile Gln Ala Glu Gln Val Asp

405 410 415

Ala Val Thr Leu Ser Gly Glu Asp Ile Tyr Thr Ala Gly Lys Thr Tyr

420 425 430

Gly Leu Val Pro Ala Ala Gly Glu His Tyr Ala Pro Glu Asp Ser Ser

435 440 445

Asn Ser Tyr Tyr Val Val Ala Val Val Arg Arg Asp Ser Ser His Ala

450 455 460

Phe Thr Leu Asp Glu Leu Arg Gly Lys Arg Ser Cys His Ala Gly Phe

465 470 475 480

Gly Ser Pro Ala Gly Trp Asp Val Pro Val Gly Ala Leu Ile Gln Arg

485 490 495

Gly Phe Ile Arg Pro Lys Asp Cys Asp Val Leu Thr Ala Val Ser Glu

500 505 510

Phe Phe Asn Ala Ser Cys Val Pro Val Asn Asn Pro Lys Asn Tyr Pro

515 520 525

Ser Ser Leu Cys Ala Leu Cys Val Gly Asp Glu Gln Gly Arg Asn Lys

530 535 540

Cys Val Gly Asn Ser Gln Glu Arg Tyr Tyr Gly Tyr Arg Gly Ala Phe

545 550 555 560

Arg Cys Leu Val Glu Asn Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Arg His Thr

565 570 575

Thr Val Phe Asp Asn Thr Asn Gly His Asn Ser Glu Pro Trp Ala Ala

580 585 590

Glu Leu Arg Ser Glu Asp Tyr Glu Leu Leu Cys Pro Asn Gly Ala Arg

595 600 605

Ala Glu Val Ser Gln Phe Ala Ala Cys Asn Leu Ala Gln Ile Pro Pro

610 615 620

His Ala Val Met Val Arg Pro Asp Thr Asn Ile Phe Thr Val Tyr Gly

625 630 635 640

Leu Leu Asp Lys Ala Gln Asp Leu Phe Gly Asp Asp His Asn Lys Asn

645 650 655

Gly Phe Lys Met Phe Asp Ser Ser Asn Tyr His Gly Gln Asp Leu Leu

660 665 670

Phe Lys Asp Ala Thr Val Arg Ala Val Pro Val Gly Glu Lys Thr Thr

675 680 685

Tyr Arg Gly Trp Leu Gly Leu Asp Tyr Val Ala Ala Leu Glu Gly Met

690 695 700

Ser Ser Gln Gln Cys Ser Gly Ala Ala Ala Pro Ala Pro Gly Ala Pro

705 710 715 720

Leu Leu Pro Leu Leu Leu Pro Ala Leu Ala Ala Arg Leu Leu Pro Pro

725 730 735

Ala Leu

<210> 2

<211> 692

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Gly Met Glu Val Arg Trp Cys Ala Thr Ser Asp Pro Glu Gln His Lys

1 5 10 15

Cys Gly Asn Met Ser Glu Ala Phe Arg Glu Ala Gly Ile Gln Pro Ser

20 25 30

Leu Leu Cys Val Arg Gly Thr Ser Ala Asp His Cys Val Gln Leu Ile

35 40 45

Ala Ala Gln Glu Ala Asp Ala Ile Thr Leu Asp Gly Gly Ala Ile Tyr

50 55 60

Glu Ala Gly Lys Glu His Gly Leu Lys Pro Val Val Gly Glu Val Tyr

65 70 75 80

Asp Gln Glu Val Gly Thr Ser Tyr Tyr Ala Val Ala Val Val Arg Arg

85 90 95

Ser Ser His Val Thr Ile Asp Thr Leu Lys Gly Val Lys Ser Cys His

100 105 110

Thr Gly Ile Asn Arg Thr Val Gly Trp Asn Val Pro Val Gly Tyr Leu

115 120 125

Val Glu Ser Gly Arg Leu Ser Val Met Gly Cys Asp Val Leu Lys Ala

130 135 140

Val Ser Asp Tyr Phe Gly Gly Ser Cys Val Pro Gly Ala Gly Glu Thr

145 150 155 160

Ser Tyr Ser Glu Ser Leu Cys Arg Leu Cys Arg Gly Asp Ser Ser Gly

165 170 175

Glu Gly Val Cys Asp Lys Ser Pro Leu Glu Arg Tyr Tyr Asp Tyr Ser

180 185 190

Gly Ala Phe Arg Cys Leu Ala Glu Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val

195 200 205

Lys His Ser Thr Val Leu Glu Asn Thr Asp Gly Lys Thr Leu Pro Ser

210 215 220

Trp Gly Gln Ala Leu Leu Ser Gln Asp Phe Glu Leu Leu Cys Arg Asp

225 230 235 240

Gly Ser Arg Ala Asp Val Thr Glu Trp Arg Gln Cys His Leu Ala Arg

245 250 255

Val Pro Ala His Ala Val Val Val Arg Ala Asp Thr Asp Gly Gly Leu

260 265 270

Ile Phe Arg Leu Leu Asn Glu Gly Gln Arg Leu Phe Ser His Glu Gly

275 280 285

Ser Ser Phe Gln Met Phe Ser Ser Glu Ala Tyr Gly Gln Lys Asp Leu

290 295 300

Leu Phe Lys Asp Ser Thr Ser Glu Leu Val Pro Ile Ala Thr Gln Thr

305 310 315 320

Tyr Glu Ala Trp Leu Gly His Glu Tyr Leu His Ala Met Lys Gly Leu

325 330 335

Leu Cys Asp Pro Asn Arg Leu Pro Pro Tyr Leu Arg Trp Cys Val Leu

340 345 350

Ser Thr Pro Glu Ile Gln Lys Cys Gly Asp Met Ala Val Ala Phe Arg

355 360 365

Arg Gln Arg Leu Lys Pro Glu Ile Gln Cys Val Ser Ala Lys Ser Pro

370 375 380

Gln His Cys Met Glu Arg Ile Gln Ala Glu Gln Val Asp Ala Val Thr

385 390 395 400

Leu Ser Gly Glu Asp Ile Tyr Thr Ala Gly Lys Thr Tyr Gly Leu Val

405 410 415

Pro Ala Ala Gly Glu His Tyr Ala Pro Glu Asp Ser Ser Asn Ser Tyr

420 425 430

Tyr Val Val Ala Val Val Arg Arg Asp Ser Ser His Ala Phe Thr Leu

435 440 445

Asp Glu Leu Arg Gly Lys Arg Ser Cys His Ala Gly Phe Gly Ser Pro

450 455 460

Ala Gly Trp Asp Val Pro Val Gly Ala Leu Ile Gln Arg Gly Phe Ile

465 470 475 480

Arg Pro Lys Asp Cys Asp Val Leu Thr Ala Val Ser Glu Phe Phe Asn

485 490 495

Ala Ser Cys Val Pro Val Asn Asn Pro Lys Asn Tyr Pro Ser Ser Leu

500 505 510

Cys Ala Leu Cys Val Gly Asp Glu Gln Gly Arg Asn Lys Cys Val Gly

515 520 525

Asn Ser Gln Glu Arg Tyr Tyr Gly Tyr Arg Gly Ala Phe Arg Cys Leu

530 535 540

Val Glu Asn Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Arg His Thr Thr Val Phe

545 550 555 560

Asp Asn Thr Asn Gly His Asn Ser Glu Pro Trp Ala Ala Glu Leu Arg

565 570 575

Ser Glu Asp Tyr Glu Leu Leu Cys Pro Asn Gly Ala Arg Ala Glu Val

580 585 590

Ser Gln Phe Ala Ala Cys Asn Leu Ala Gln Ile Pro Pro His Ala Val

595 600 605

Met Val Arg Pro Asp Thr Asn Ile Phe Thr Val Tyr Gly Leu Leu Asp

610 615 620

Lys Ala Gln Asp Leu Phe Gly Asp Asp His Asn Lys Asn Gly Phe Lys

625 630 635 640

Met Phe Asp Ser Ser Asn Tyr His Gly Gln Asp Leu Leu Phe Lys Asp

645 650 655

Ala Thr Val Arg Ala Val Pro Val Gly Glu Lys Thr Thr Tyr Arg Gly

660 665 670

Trp Leu Gly Leu Asp Tyr Val Ala Ala Leu Glu Gly Met Ser Ser Gln

675 680 685

Gln Cys Ser Gly

690

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Trp Cys Ala Thr Ser Asp Pro Glu Gln His Lys

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Arg Ser Ser His Val Thr Ile Asp Thr Leu Lys

1 5 10

<210> 5

<211> 13

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Ser Ser His Val Thr Ile Asp Thr Leu Lys Gly Val Lys

1 5 10

<210> 6

<211> 14

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Leu Cys Arg Gly Asp Ser Ser Gly Glu Gly Val Cys Asp Lys

1 5 10

<210> 7

<211> 16

<212> PRT

<213> 智人

<400> 7

Gly Asp Ser Ser Gly Glu Gly Val Cys Asp Lys Ser Pro Leu Glu Arg

1 5 10 15

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 8

Tyr Tyr Asp Tyr Ser Gly Ala Phe Arg

1 5

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人

<400> 9

Ala Asp Val Thr Glu Trp Arg

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 10

Val Pro Ala His Ala Val Val Val Arg

1 5

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<400> 11

Ala Asp Thr Asp Gly Gly Leu Ile Phe Arg

1 5 10

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 12

Cys Gly Asp Met Ala Val Ala Phe Arg

1 5

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人

<400> 13

Leu Lys Pro Glu Ile Gln Cys Val Ser Ala Lys

1 5 10

<210> 14

<211> 12

<212> PRT

<213> 智人

<400> 14

Asp Ser Ser His Ala Phe Thr Leu Asp Glu Leu Arg

1 5 10

<210> 15

<211> 13

<212> PRT

<213> 智人

<400> 15

Ser Glu Asp Tyr Glu Leu Leu Cys Pro Asn Gly Ala Arg

1 5 10

<210> 16

<211> 15

<212> PRT

<213> 智人

<400> 16

Ala Gln Asp Leu Phe Gly Asp Asp His Asn Lys Asn Gly Phe Lys

1 5 10 15

<210> 17

<211> 40

<212> PRT

<213> 智人

<400> 17

Phe Ser Ser Glu Ala Tyr Gly Gln Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser

1 5 10 15

Thr Ser Glu Leu Val Pro Ile Ala Thr Gln Thr Tyr Glu Ala Trp Leu

20 25 30

Gly His Glu Tyr Leu His Ala Met

35 40

<210> 18

<211> 221

<212> PRT

<213> 智人

<400> 18

Glu Arg Ile Gln Ala Glu Gln Val Asp Ala Val Thr Leu Ser Gly Glu

1 5 10 15

Asp Ile Tyr Thr Ala Gly Lys Thr Tyr Gly Leu Val Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Glu His Tyr Ala Pro Glu Asp Ser Ser Asn Ser Tyr Tyr Val Val Ala

35 40 45

Val Val Arg Arg Asp Ser Ser His Ala Phe Thr Leu Asp Glu Leu Arg

50 55 60

Gly Lys Arg Ser Cys His Ala Gly Phe Gly Ser Pro Ala Gly Trp Asp

65 70 75 80

Val Pro Val Gly Ala Leu Ile Gln Arg Gly Phe Ile Arg Pro Lys Asp

85 90 95

Cys Asp Val Leu Thr Ala Val Ser Glu Phe Phe Asn Ala Ser Cys Val

100 105 110

Pro Val Asn Asn Pro Lys Asn Tyr Pro Ser Ser Leu Cys Ala Leu Cys

115 120 125

Val Gly Asp Glu Gln Gly Arg Asn Lys Cys Val Gly Asn Ser Gln Glu

130 135 140

Arg Tyr Tyr Gly Tyr Arg Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Asn Ala

145 150 155 160

Gly Asp Val Ala Phe Val Arg His Thr Thr Val Phe Asp Asn Thr Asn

165 170 175

Gly His Asn Ser Glu Pro Trp Ala Ala Glu Leu Arg Ser Glu Asp Tyr

180 185 190

Glu Leu Leu Cys Pro Asn Gly Ala Arg Ala Glu Val Ser Gln Phe Ala

195 200 205

Ala Cys Asn Leu Ala Gln Ile Pro Pro His Ala Val Met

210 215 220

<210> 19

<211> 32

<212> PRT

<213> 智人

<400> 19

Val Arg Pro Asp Thr Asn Ile Phe Thr Val Tyr Gly Leu Leu Asp Lys

1 5 10 15

Ala Gln Asp Leu Phe Gly Asp Asp His Asn Lys Asn Gly Phe Lys Met

20 25 30

<210> 20

<211> 564

<212> PRT

<213> 智人

<400> 20

Gly Met Glu Val Arg Trp Cys Ala Thr Ser Asp Pro Glu Gln His Lys

1 5 10 15

Cys Gly Asn Met Ser Glu Ala Phe Arg Glu Ala Gly Ile Gln Pro Ser

20 25 30

Leu Leu Cys Val Arg Gly Thr Ser Ala Asp His Cys Val Gln Leu Ile

35 40 45

Ala Ala Gln Glu Ala Asp Ala Ile Thr Leu Asp Gly Gly Ala Ile Tyr

50 55 60

Glu Ala Gly Lys Glu His Gly Leu Lys Pro Val Val Gly Glu Val Tyr

65 70 75 80

Asp Gln Glu Val Gly Thr Ser Tyr Tyr Ala Val Ala Val Val Arg Arg

85 90 95

Ser Ser His Val Thr Ile Asp Thr Leu Lys Gly Val Lys Ser Cys His

100 105 110

Thr Gly Ile Asn Arg Thr Val Gly Trp Asn Val Pro Val Gly Tyr Leu

115 120 125

Val Glu Ser Gly Arg Leu Ser Val Met Gly Cys Asp Val Leu Lys Ala

130 135 140

Val Ser Asp Tyr Phe Gly Gly Ser Cys Val Pro Gly Ala Gly Glu Thr

145 150 155 160

Ser Tyr Ser Glu Ser Leu Cys Arg Leu Cys Arg Gly Asp Ser Ser Gly

165 170 175

Glu Gly Val Cys Asp Lys Ser Pro Leu Glu Arg Tyr Tyr Asp Tyr Ser

180 185 190

Gly Ala Phe Arg Cys Leu Ala Glu Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val

195 200 205

Lys His Ser Thr Val Leu Glu Asn Thr Asp Gly Lys Thr Leu Pro Ser

210 215 220

Trp Gly Gln Ala Leu Leu Ser Gln Asp Phe Glu Leu Leu Cys Arg Asp

225 230 235 240

Gly Ser Arg Ala Asp Val Thr Glu Trp Arg Gln Cys His Leu Ala Arg

245 250 255

Val Pro Ala His Ala Val Val Val Arg Ala Asp Thr Asp Gly Gly Leu

260 265 270

Ile Phe Arg Leu Leu Asn Glu Gly Gln Arg Leu Phe Ser His Glu Gly

275 280 285

Ser Ser Phe Gln Met Phe Ser Ser Glu Ala Tyr Gly Gln Lys Asp Leu

290 295 300

Leu Phe Lys Asp Ser Thr Ser Glu Leu Val Pro Ile Ala Thr Gln Thr

305 310 315 320

Tyr Glu Ala Trp Leu Gly His Glu Tyr Leu His Ala Met Lys Gly Leu

325 330 335

Leu Cys Asp Pro Asn Arg Leu Pro Pro Tyr Leu Arg Trp Cys Val Leu

340 345 350

Ser Thr Pro Glu Ile Gln Lys Cys Gly Asp Met Ala Val Ala Phe Arg

355 360 365

Arg Gln Arg Leu Lys Pro Glu Ile Gln Cys Val Ser Ala Lys Ser Pro

370 375 380

Gln His Cys Met Glu Arg Ile Gln Ala Glu Gln Val Asp Ala Val Thr

385 390 395 400

Leu Ser Gly Glu Asp Ile Tyr Thr Ala Gly Lys Thr Tyr Gly Leu Val

405 410 415

Pro Ala Ala Gly Glu His Tyr Ala Pro Glu Asp Ser Ser Asn Ser Tyr

420 425 430

Tyr Val Val Ala Val Val Arg Arg Asp Ser Ser His Ala Phe Thr Leu

435 440 445

Asp Glu Leu Arg Gly Lys Arg Ser Cys His Ala Gly Phe Gly Ser Pro

450 455 460

Ala Gly Trp Asp Val Pro Val Gly Ala Leu Ile Gln Arg Gly Phe Ile

465 470 475 480

Arg Pro Lys Asp Cys Asp Val Leu Thr Ala Val Ser Glu Phe Phe Asn

485 490 495

Ala Ser Cys Val Pro Val Asn Asn Pro Lys Asn Tyr Pro Ser Ser Leu

500 505 510

Cys Ala Leu Cys Val Gly Asp Glu Gln Gly Arg Asn Lys Cys Val Gly

515 520 525

Asn Ser Gln Glu Arg Tyr Tyr Gly Tyr Arg Gly Ala Phe Arg Cys Leu

530 535 540

Val Glu Asn Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Arg His Thr Thr Val Phe

545 550 555 560

Asp Asn Thr Asn

<210> 21

<211> 22

<212> PRT

<213> 智人

<400> 21

Gly His Asn Ser Glu Pro Trp Ala Ala Glu Leu Arg Ser Glu Asp Tyr

1 5 10 15

Glu Leu Leu Cys Pro Asn

20

<210> 22

<211> 51

<212> PRT

<213> 智人

<400> 22

Gly Ala Arg Ala Glu Val Ser Gln Phe Ala Ala Cys Asn Leu Ala Gln

1 5 10 15

Ile Pro Pro His Ala Val Met Val Arg Pro Asp Thr Asn Ile Phe Thr

20 25 30

Val Tyr Gly Leu Leu Asp Lys Ala Gln Asp Leu Phe Gly Asp Asp His

35 40 45

Asn Lys Asn

50

<210> 23

<211> 53

<212> PRT

<213> 智人

<400> 23

Gly Phe Lys Met Phe Asp Ser Ser Asn Tyr His Gly Gln Asp Leu Leu

1 5 10 15

Phe Lys Asp Ala Thr Val Arg Ala Val Pro Val Gly Glu Lys Thr Thr

20 25 30

Tyr Arg Gly Trp Leu Gly Leu Asp Tyr Val Ala Ala Leu Glu Gly Met

35 40 45

Ser Ser Gln Gln Cys

50

<210> 24

<211> 586

<212> PRT

<213> 智人

<400> 24

Gly Met Glu Val Arg Trp Cys Ala Thr Ser Asp Pro Glu Gln His Lys

1 5 10 15

Cys Gly Asn Met Ser Glu Ala Phe Arg Glu Ala Gly Ile Gln Pro Ser

20 25 30

Leu Leu Cys Val Arg Gly Thr Ser Ala Asp His Cys Val Gln Leu Ile

35 40 45

Ala Ala Gln Glu Ala Asp Ala Ile Thr Leu Asp Gly Gly Ala Ile Tyr

50 55 60

Glu Ala Gly Lys Glu His Gly Leu Lys Pro Val Val Gly Glu Val Tyr

65 70 75 80

Asp Gln Glu Val Gly Thr Ser Tyr Tyr Ala Val Ala Val Val Arg Arg

85 90 95

Ser Ser His Val Thr Ile Asp Thr Leu Lys Gly Val Lys Ser Cys His

100 105 110

Thr Gly Ile Asn Arg Thr Val Gly Trp Asn Val Pro Val Gly Tyr Leu

115 120 125

Val Glu Ser Gly Arg Leu Ser Val Met Gly Cys Asp Val Leu Lys Ala

130 135 140

Val Ser Asp Tyr Phe Gly Gly Ser Cys Val Pro Gly Ala Gly Glu Thr

145 150 155 160

Ser Tyr Ser Glu Ser Leu Cys Arg Leu Cys Arg Gly Asp Ser Ser Gly

165 170 175

Glu Gly Val Cys Asp Lys Ser Pro Leu Glu Arg Tyr Tyr Asp Tyr Ser

180 185 190

Gly Ala Phe Arg Cys Leu Ala Glu Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val

195 200 205

Lys His Ser Thr Val Leu Glu Asn Thr Asp Gly Lys Thr Leu Pro Ser

210 215 220

Trp Gly Gln Ala Leu Leu Ser Gln Asp Phe Glu Leu Leu Cys Arg Asp

225 230 235 240

Gly Ser Arg Ala Asp Val Thr Glu Trp Arg Gln Cys His Leu Ala Arg

245 250 255

Val Pro Ala His Ala Val Val Val Arg Ala Asp Thr Asp Gly Gly Leu

260 265 270

Ile Phe Arg Leu Leu Asn Glu Gly Gln Arg Leu Phe Ser His Glu Gly

275 280 285

Ser Ser Phe Gln Met Phe Ser Ser Glu Ala Tyr Gly Gln Lys Asp Leu

290 295 300

Leu Phe Lys Asp Ser Thr Ser Glu Leu Val Pro Ile Ala Thr Gln Thr

305 310 315 320

Tyr Glu Ala Trp Leu Gly His Glu Tyr Leu His Ala Met Lys Gly Leu

325 330 335

Leu Cys Asp Pro Asn Arg Leu Pro Pro Tyr Leu Arg Trp Cys Val Leu

340 345 350

Ser Thr Pro Glu Ile Gln Lys Cys Gly Asp Met Ala Val Ala Phe Arg

355 360 365

Arg Gln Arg Leu Lys Pro Glu Ile Gln Cys Val Ser Ala Lys Ser Pro

370 375 380

Gln His Cys Met Glu Arg Ile Gln Ala Glu Gln Val Asp Ala Val Thr

385 390 395 400

Leu Ser Gly Glu Asp Ile Tyr Thr Ala Gly Lys Thr Tyr Gly Leu Val

405 410 415

Pro Ala Ala Gly Glu His Tyr Ala Pro Glu Asp Ser Ser Asn Ser Tyr

420 425 430

Tyr Val Val Ala Val Val Arg Arg Asp Ser Ser His Ala Phe Thr Leu

435 440 445

Asp Glu Leu Arg Gly Lys Arg Ser Cys His Ala Gly Phe Gly Ser Pro

450 455 460

Ala Gly Trp Asp Val Pro Val Gly Ala Leu Ile Gln Arg Gly Phe Ile

465 470 475 480

Arg Pro Lys Asp Cys Asp Val Leu Thr Ala Val Ser Glu Phe Phe Asn

485 490 495

Ala Ser Cys Val Pro Val Asn Asn Pro Lys Asn Tyr Pro Ser Ser Leu

500 505 510

Cys Ala Leu Cys Val Gly Asp Glu Gln Gly Arg Asn Lys Cys Val Gly

515 520 525

Asn Ser Gln Glu Arg Tyr Tyr Gly Tyr Arg Gly Ala Phe Arg Cys Leu

530 535 540

Val Glu Asn Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Arg His Thr Thr Val Phe

545 550 555 560

Asp Asn Thr Asn Gly His Asn Ser Glu Pro Trp Ala Ala Glu Leu Arg

565 570 575

Ser Glu Asp Tyr Glu Leu Leu Cys Pro Asn

580 585

<210> 25

<211> 637

<212> PRT

<213> 智人

<400> 25

Gly Met Glu Val Arg Trp Cys Ala Thr Ser Asp Pro Glu Gln His Lys

1 5 10 15

Cys Gly Asn Met Ser Glu Ala Phe Arg Glu Ala Gly Ile Gln Pro Ser

20 25 30

Leu Leu Cys Val Arg Gly Thr Ser Ala Asp His Cys Val Gln Leu Ile

35 40 45

Ala Ala Gln Glu Ala Asp Ala Ile Thr Leu Asp Gly Gly Ala Ile Tyr

50 55 60

Glu Ala Gly Lys Glu His Gly Leu Lys Pro Val Val Gly Glu Val Tyr

65 70 75 80

Asp Gln Glu Val Gly Thr Ser Tyr Tyr Ala Val Ala Val Val Arg Arg

85 90 95

Ser Ser His Val Thr Ile Asp Thr Leu Lys Gly Val Lys Ser Cys His

100 105 110

Thr Gly Ile Asn Arg Thr Val Gly Trp Asn Val Pro Val Gly Tyr Leu

115 120 125

Val Glu Ser Gly Arg Leu Ser Val Met Gly Cys Asp Val Leu Lys Ala

130 135 140

Val Ser Asp Tyr Phe Gly Gly Ser Cys Val Pro Gly Ala Gly Glu Thr

145 150 155 160

Ser Tyr Ser Glu Ser Leu Cys Arg Leu Cys Arg Gly Asp Ser Ser Gly

165 170 175

Glu Gly Val Cys Asp Lys Ser Pro Leu Glu Arg Tyr Tyr Asp Tyr Ser

180 185 190

Gly Ala Phe Arg Cys Leu Ala Glu Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val

195 200 205

Lys His Ser Thr Val Leu Glu Asn Thr Asp Gly Lys Thr Leu Pro Ser

210 215 220

Trp Gly Gln Ala Leu Leu Ser Gln Asp Phe Glu Leu Leu Cys Arg Asp

225 230 235 240

Gly Ser Arg Ala Asp Val Thr Glu Trp Arg Gln Cys His Leu Ala Arg

245 250 255

Val Pro Ala His Ala Val Val Val Arg Ala Asp Thr Asp Gly Gly Leu

260 265 270

Ile Phe Arg Leu Leu Asn Glu Gly Gln Arg Leu Phe Ser His Glu Gly

275 280 285

Ser Ser Phe Gln Met Phe Ser Ser Glu Ala Tyr Gly Gln Lys Asp Leu

290 295 300

Leu Phe Lys Asp Ser Thr Ser Glu Leu Val Pro Ile Ala Thr Gln Thr

305 310 315 320

Tyr Glu Ala Trp Leu Gly His Glu Tyr Leu His Ala Met Lys Gly Leu

325 330 335

Leu Cys Asp Pro Asn Arg Leu Pro Pro Tyr Leu Arg Trp Cys Val Leu

340 345 350

Ser Thr Pro Glu Ile Gln Lys Cys Gly Asp Met Ala Val Ala Phe Arg

355 360 365

Arg Gln Arg Leu Lys Pro Glu Ile Gln Cys Val Ser Ala Lys Ser Pro

370 375 380

Gln His Cys Met Glu Arg Ile Gln Ala Glu Gln Val Asp Ala Val Thr

385 390 395 400

Leu Ser Gly Glu Asp Ile Tyr Thr Ala Gly Lys Thr Tyr Gly Leu Val

405 410 415

Pro Ala Ala Gly Glu His Tyr Ala Pro Glu Asp Ser Ser Asn Ser Tyr

420 425 430

Tyr Val Val Ala Val Val Arg Arg Asp Ser Ser His Ala Phe Thr Leu

435 440 445

Asp Glu Leu Arg Gly Lys Arg Ser Cys His Ala Gly Phe Gly Ser Pro

450 455 460

Ala Gly Trp Asp Val Pro Val Gly Ala Leu Ile Gln Arg Gly Phe Ile

465 470 475 480

Arg Pro Lys Asp Cys Asp Val Leu Thr Ala Val Ser Glu Phe Phe Asn

485 490 495

Ala Ser Cys Val Pro Val Asn Asn Pro Lys Asn Tyr Pro Ser Ser Leu

500 505 510

Cys Ala Leu Cys Val Gly Asp Glu Gln Gly Arg Asn Lys Cys Val Gly

515 520 525

Asn Ser Gln Glu Arg Tyr Tyr Gly Tyr Arg Gly Ala Phe Arg Cys Leu

530 535 540

Val Glu Asn Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Arg His Thr Thr Val Phe

545 550 555 560

Asp Asn Thr Asn Gly His Asn Ser Glu Pro Trp Ala Ala Glu Leu Arg

565 570 575

Ser Glu Asp Tyr Glu Leu Leu Cys Pro Asn Gly Ala Arg Ala Glu Val

580 585 590

Ser Gln Phe Ala Ala Cys Asn Leu Ala Gln Ile Pro Pro His Ala Val

595 600 605

Met Val Arg Pro Asp Thr Asn Ile Phe Thr Val Tyr Gly Leu Leu Asp

610 615 620

Lys Ala Gln Asp Leu Phe Gly Asp Asp His Asn Lys Asn

625 630 635

<210> 26

<211> 73

<212> PRT

<213> 智人

<400> 26

Gly His Asn Ser Glu Pro Trp Ala Ala Glu Leu Arg Ser Glu Asp Tyr

1 5 10 15

Glu Leu Leu Cys Pro Asn Gly Ala Arg Ala Glu Val Ser Gln Phe Ala

20 25 30

Ala Cys Asn Leu Ala Gln Ile Pro Pro His Ala Val Met Val Arg Pro

35 40 45

Asp Thr Asn Ile Phe Thr Val Tyr Gly Leu Leu Asp Lys Ala Gln Asp

50 55 60

Leu Phe Gly Asp Asp His Asn Lys Asn

65 70

<210> 27

<211> 126

<212> PRT

<213> 智人

<400> 27

Gly His Asn Ser Glu Pro Trp Ala Ala Glu Leu Arg Ser Glu Asp Tyr

1 5 10 15

Glu Leu Leu Cys Pro Asn Gly Ala Arg Ala Glu Val Ser Gln Phe Ala

20 25 30

Ala Cys Asn Leu Ala Gln Ile Pro Pro His Ala Val Met Val Arg Pro

35 40 45

Asp Thr Asn Ile Phe Thr Val Tyr Gly Leu Leu Asp Lys Ala Gln Asp

50 55 60

Leu Phe Gly Asp Asp His Asn Lys Asn Gly Phe Lys Met Phe Asp Ser

65 70 75 80

Ser Asn Tyr His Gly Gln Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ala Thr Val Arg

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Ala Val Pro Val Gly Glu Lys Thr Thr Tyr Arg Gly Trp Leu Gly Leu

100 105 110

Asp Tyr Val Ala Ala Leu Glu Gly Met Ser Ser Gln Gln Cys

115 120 125

<210> 28

<211> 104

<212> PRT

<213> 智人

<400> 28

Gly Ala Arg Ala Glu Val Ser Gln Phe Ala Ala Cys Asn Leu Ala Gln

1 5 10 15

Ile Pro Pro His Ala Val Met Val Arg Pro Asp Thr Asn Ile Phe Thr

20 25 30

Val Tyr Gly Leu Leu Asp Lys Ala Gln Asp Leu Phe Gly Asp Asp His

35 40 45

Asn Lys Asn Gly Phe Lys Met Phe Asp Ser Ser Asn Tyr His Gly Gln

50 55 60

Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ala Thr Val Arg Ala Val Pro Val Gly Glu

65 70 75 80

Lys Thr Thr Tyr Arg Gly Trp Leu Gly Leu Asp Tyr Val Ala Ala Leu

85 90 95

Glu Gly Met Ser Ser Gln Gln Cys

100

<210> 29

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 經(jīng)修飾的p97蛋白質(zhì)片段

<400> 29

Asp Ser Ser His Ala Phe Thr Leu Asp Glu Leu Arg Tyr Cys

1 5 10

<210> 30

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 經(jīng)修飾的p97蛋白質(zhì)片段

<400> 30

Asp Ser Ser His Ala Phe Thr Leu Asp Glu Leu Arg Cys

1 5 10

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反義NOX4多核苷酸（siRNA）

<400> 31

auguucacaa agucagguct t 21

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反義NOX4多核苷酸（siRNA）

<400> 32

gaccugacuu ugugaacaut t 21

<210> 33

<211> 12

<212> PRT

<213> 沙漠跳鼠

<400> 33

Asp Ser Ser Asp Ala Phe Thr Leu Asp Glu Leu Arg

1 5 10

<210> 34

<211> 12

<212> PRT

<213> 小耳大嬰猴

<400> 34

Asp Ser Ser His Ser Phe Thr Leu Asp Glu Leu Arg

1 5 10

<210> 35

<211> 12

<212> PRT

<213> 十三線的地松鼠

<400> 35

Asp Ser Ser Tyr Ala Phe Thr Leu Asp Glu Leu Arg

1 5 10

<210> 36

<211> 12

<212> PRT

<213> 白犀牛

<400> 36

Asn Ser Ser His Ala Phe Thr Leu Asp Glu Leu Arg

1 5 10

<210> 37

<211> 12

<212> PRT

<213> 南美羊駝

<400> 37

Asn Ser Ser Tyr Ala Phe Thr Leu Asp Glu Leu Arg

1 5 10

<210> 38

<211> 12

<212> PRT

<213> 美國鼠兔

<400> 38

Asp Ser Ser Tyr Ala Phe Pro Leu Asp Glu Leu Arg

1 5 10

<210> 39

<211> 12

<212> PRT

<213> 中國樹鼩

<400> 39

Asp Ser Thr His Ala Phe Thr Val Asp Glu Leu Arg

1 5 10

<210> 40

<211> 12

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 40

Asp Ser Ser Tyr Ser Phe Thr Leu Asp Glu Leu Arg

1 5 10

<210> 41

<211> 12

<212> PRT

<213> 虎鯨

<400> 41

Asn Ser Ser Asn Ala Phe Thr Leu Asp Glu Leu Arg

1 5 10

<210> 42

<211> 12

<212> PRT

<213> 絨毛絲鼠

<400> 42

Asp Ser Ser Ser Ala Phe Thr Leu Asn Glu Leu Arg

1 5 10

<210> 43

<211> 12

<212> PRT

<213> 九帶犰狳

<400> 43

Asp Ser Ser Tyr Ala Phe Thr Leu Asp Glu Leu Trp

1 5 10

<210> 44

<211> 12

<212> PRT

<213> 太平洋海象

<400> 44

Asn Ser Ser Ser Ala Phe Thr Leu Asp Glu Leu Arg

1 5 10

<210> 45

<211> 12

<212> PRT

<213> 歐洲杯梗孢

<400> 45

Ala Thr Ser His Ala Ile Thr Leu Asp Glu Leu Arg

1 5 10

<210> 46

<211> 12

<212> PRT

<213> 非洲象

<400> 46

Asn Ser Ser Tyr Ala Phe Thr Met Asp Glu Leu Arg

1 5 10

<210> 47

<211> 12

<212> PRT

<213> 中國倉鼠

<400> 47

Asp Arg Ser Tyr Ser Phe Thr Leu Asp Glu Leu Arg

1 5 10

<210> 48

<211> 12

<212> PRT

<213> 穴兔

<400> 48

Asp Ser Ala Tyr Ala Phe Thr Val Asp Glu Leu Arg

1 5 10

<210> 49

<211> 12

<212> PRT

<213> 八齒鼠

<400> 49

Asp Ser Ser Ser Ala Phe Asn Leu Asn Glu Leu Arg

1 5 10

<210> 50

<211> 12

<212> PRT

<213> 家犬

<400> 50

Asn Ser Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Glu Leu Arg

1 5 10

<210> 51

<211> 12

<212> PRT

<213> 灰短尾負(fù)鼠

<400> 51

Asn Ser Ser Tyr Ser Phe Thr Leu Asp Glu Leu Arg

1 5 10

<210> 52

<211> 12

<212> PRT

<213> 馬

<400> 52

Asn Ser Ser Tyr Ala Phe Thr Val Asp Glu Leu Arg

1 5 10

<210> 53

<211> 12

<212> PRT

<213> 星鼻鼴

<400> 53

Asn Ser Ser Tyr Ala Phe Ser Leu Asp Glu Leu Arg

1 5 10

<210> 54

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人

<400> 54

Ser Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys

1 5 10

<210> 55

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人

<400> 55

Ser Asp Thr Ser Leu Thr Trp Asn Ser Val Lys

1 5 10

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 56

aactttggca ttgtggaagg 20

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 57

acacattggg ggtaggaaca 20

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 58

gcctttattg tgcggagaga 20

<210> 59

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 59

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