用于治療中性粒細胞減少癥的組合物和方法與流程

本發(fā)明是根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院授予的資助號CA120512和ARRA-CA120512在政府支持下進行的。政府具有本發(fā)明的一定權利。

發(fā)明領域

本發(fā)明涉及用于利用類視色素激動劑和粒細胞集落刺激因子(G-CSF或GCSF)治療疾患的組合物、方法和試劑盒。本發(fā)明還涉及用于利用細胞治療所用的離體修飾細胞(諸如來源于造血干細胞[HSC]的粒細胞[例如，中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞])治療疾患的組合物、方法和試劑盒。所述疾患包括但不限于各種形式的中性粒細胞減少癥。

背景

本文中引用的所有公布均以引用方式全部并入本文，就如同每個單獨的公布或?qū)＠暾埍幻鞔_地并單獨地指示為以引用方式并入本文一般。以下描述包括可用于理解本發(fā)明的信息。并不承認本文提供的任何信息都是現(xiàn)有技術，或與目前要求保護的本發(fā)明有關，或并不承認明確地或隱含地引用的任何公布是現(xiàn)有技術。

中性粒細胞是最常見的粒細胞，它構(gòu)成多達70％的主要抵御病原體感染的循環(huán)白細胞。癌癥化療誘導的中性粒細胞減少癥是一種血液病，其標志是血流中的中性粒細胞數(shù)量顯著降低，引起微生物感染易感性。約15-40％的癌癥患者由于化療誘導的中性粒細胞減少癥而需要治療延緩和/或劑量減少。由于中性粒細胞減少癥導致的死亡率在患有實體腫瘤的患者中為約5％并且在一些血液惡性腫瘤中為11％。

中性粒細胞產(chǎn)生需要在造血干細胞(HSC)的粒細胞生成期間的平衡的增殖和分化。GCSF被用于治療獲得性和先天性中性粒細胞減少癥已有二十多年了，因為它促進了HSC的粒細胞生成來再生中性粒細胞。然而，大量響應于GCSF施用而再生的中性粒細胞是不成熟的，因此導致了無效的GCSF治療，這種治療無法減少癌癥化療誘導的中性粒細胞減少癥(CCIN)患者的感染和感染相關的死亡率。證據(jù)支持針對CCIN的GCSF的主要預防用途的成本效益為不確定的，以及最近研究示出，在化療的第一個療程期間GCSF的主要預防用途與總體醫(yī)療保健成本的57％增加相關聯(lián)。在美國，CCIN的成本在每次門診患者發(fā)作$1,893至每次發(fā)熱性中性白細胞減少癥住院$38,583的范圍內(nèi)。取決于癌癥類型、共病率和感染類型，存在CCIN的臨床和經(jīng)濟負擔的實質(zhì)性差異。由于CCIN中炎癥反應降低，所以感染的癥狀和體征減弱或甚至是不存在的。因此，對于發(fā)熱性中性粒細胞減少癥(33.5％)和非發(fā)熱性中性粒細胞減少癥(40.6％)患者來說，化療占成本的大部分。僅2015的發(fā)熱性中性粒細胞減少癥住院(FNH)的估計成本為約$21億。此成本不包括治療非發(fā)熱性中性粒細胞減少癥、需要新化療的復發(fā)癌癥患者、先天性中性粒細胞減少癥、特發(fā)性嚴重慢性中性粒細胞減少癥、周期性中性粒細胞減少癥和放射誘導的中性粒細胞減少癥的成本。因此，盡管預防性地使用了GCSF，但對于癌癥患者來說中性粒細胞減少癥仍然保持毀滅性問題，具有實質(zhì)性的發(fā)病率、死亡率和醫(yī)療保健成本。因此，對于這些中性粒細胞減少癥患者來說，迫切地需要替代的治療模式。

本文中，發(fā)明人證明了類視色素激動劑(例如，Am80)和G-CSF的組合對減少感染和感染相關的死亡率的協(xié)同效應。對于治療中性粒細胞減少癥和中性粒細胞減少癥相關的疾患，本文提供了利用類視色素激動劑(例如，Am80)與G-CSF對成熟中性粒細胞的再生的協(xié)同效應對抵抗感染和感染相關的死亡率的組合物、方法和試劑盒。

發(fā)明概述

本發(fā)明的各種實施方案提供了一種在受試者體內(nèi)治療疾患、預防疾患、減輕疾患的嚴重程度和/或減緩疾患的進展的方法。所述方法包括以下或可由以下組成：提供類視色素激動劑；提供G-CSF或其類似物；和向受試者施用治療有效量的類視色素激動劑和G-CSF或其類似物，從而在受試者體內(nèi)治療疾患、預防疾患、減輕疾患的嚴重程度和/或減緩疾患的進展。在各種實施方案中，類視色素激動劑和G-CSF或其類似物可為一種組合物的形式或為單獨的組合物的形式。在各種實施方案中，所述方法可還包括向受試者提供并且施用化療劑和/或抗微生物劑。

本發(fā)明的各種實施方案提供了一種組合物，其包含類視色素激動劑和G-CSF或其類似物。在各種實施方案中，組合物可還包含化療劑和/或抗微生物劑。

本發(fā)明的各種實施方案提供了一種用于在受試者體內(nèi)治療疾患、預防疾患、減輕疾患的嚴重程度和/或減緩疾患的進展的試劑盒。試劑盒包括：一定量的類視色素激動劑；一定量的G-CSF或其類似物；和用于使用類視色素激動劑和G-CSF或其類似物來在受試者體內(nèi)治療疾患、預防疾患、減輕疾患的嚴重程度和/或減緩疾患的進展的說明書。在各種實施方案中，試劑盒可還包括化療劑和/或抗微生物劑以及使用化療劑和/或抗微生物劑來在受試者體內(nèi)治療疾患、預防疾患、減輕疾患的嚴重程度和/或減緩疾患的進展的說明書。

本發(fā)明的各種實施方案提供了一種生成成熟粒細胞的方法。所述方法包括提供細胞(例如，HSC、骨髓粒細胞祖細胞和造血CD34+細胞)以及用類視色素激動劑和G-CSF或其類似物刺激細胞，從而生成成熟粒細胞。本發(fā)明的各種實施方案進一步提供了一種組合物，其包含再生的成熟粒細胞。在各種實施方案中，組合物還包含類視色素激動劑和G-CSF或其類似物。在某些實施方案中，粒細胞是中性粒細胞。

本發(fā)明的各種實施方案提供了一種在受試者體內(nèi)治療疾患、預防疾患、減輕疾患的嚴重程度和/或減緩疾患的進展的方法。所述方法包括提供細胞(例如，HSC、骨髓粒細胞祖細胞和造血CD34+細胞)，用類視色素激動劑和G-CSF或其類似物刺激細胞，從而生成粒細胞，以及向受試者施用生成的粒細胞，從而在受試者體內(nèi)治療疾患。在某些實施方案中，粒細胞是中性粒細胞。在各種實施方案中，生成粒細胞是刺激粒細胞的形成。

本發(fā)明的各種實施方案提供了一種在受試者體內(nèi)治療疾患、預防疾患、減輕疾患的嚴重程度和/或減緩疾患的進展的方法。所述方法包括提供細胞(例如，HSC、骨髓粒細胞祖細胞和造血CD34+細胞)，用類視色素激動劑和G-CSF或其類似物刺激細胞，以及向受試者施用刺激的磁暴，從而在受試者體內(nèi)治療疾患。

類視色素激動劑的實例包括但不限于他米巴羅汀(tamibarotene)(Am80、視黃苯甲酸(retinobenzoic acid)、Amnoid、他米巴羅(Tamibaro))、CH55、ITYA(ITYA-01115)、Am580、BD4或NRX195183(也稱為AGN195183)或它們的功能等同物、類似物或衍生物。G-CSF或其類似物的實例包括但不限于野生型G-CSF、重組G-CSF、G-CSF單體或二聚體、重組人G-CSF(rhG-CSF)二聚體、G-CSF突變體、G-CSF融合蛋白、G-CSF片段、修飾的G-CSF多肽、PEG化G-CSF、糖基化G-CSF和在特定賴氨酸(Lys 17)處用Y形支鏈聚乙二醇(YPEG-G-CSF)修飾的G-CSF。

本發(fā)明的各種組合物、方法和試劑盒在治療各種疾患，包括但不限于各種形式的中性粒細胞減少癥和中性粒細胞減少癥相關的疾患，中具有實用性。作為非限制性實例，本發(fā)明的組合物、方法和試劑盒可結(jié)合癌癥治療(例如，化療和放射治療)和/或微生物感染的治療一起使用。

本發(fā)明的各種實施方案提供了用于確定有需要的受試者體內(nèi)的治療功效的方法。所述方法包括：提供來自受試者的樣本，其中受試者已施用了有效量的類視色素激動劑和有效量的G-CSF；測定反應性氧物質(zhì)(ROS)的產(chǎn)生水平；以及如果ROS產(chǎn)生高于參考樣本的ROS產(chǎn)生，那么確定治療是有效的，或如果ROS產(chǎn)生與參考樣本相同或相對于參考樣本較低，那么確定治療是無效的。

附圖簡述

在參考的附圖中說明示例性實施方案。本文公開的實施方案和附圖旨在被視為說明性的而非限制性的。

圖1示出根據(jù)本發(fā)明的各種實施方案，細胞周期、RA靶基因表達和一般轉(zhuǎn)錄通過有利CAK和含TFIIH的CAK兩者的磷酸化調(diào)控。

圖2示出根據(jù)本發(fā)明的各種實施方案，MAT1蛋白固有程序性裂解成M30和pM9片段降低RARα的CAK磷酸化，導致是平衡的髓細胞生成性擴增和分化的基礎的粒細胞。CMP：普通骨髓祖細胞；GMP：粒細胞/單核細胞組細胞；并且Gra：粒細胞。

圖3示出根據(jù)本發(fā)明的各種實施方案，相比于RA，Am80選擇性激活RARα以誘導新型轉(zhuǎn)錄應答，從而實現(xiàn)刺激髓細胞的擴增和分化。帶狀向上箭頭指出擴增增加，并且?guī)钕蛳录^指示擴增減小。

圖4示出根據(jù)本發(fā)明的各種實施方案，在人(左圖)和小鼠(右圖)中化療誘導的中性粒細胞減少癥的比較，以確立小鼠模型類似于人中性粒細胞減少癥。

圖5示出根據(jù)本發(fā)明的各種實施方案，EC₅₀測試示出，人等效低和中等劑量的Am80和Am80-GCSF組合有效促進在中性粒細胞減少階段中性粒細胞的恢復。

圖6示出根據(jù)本發(fā)明的各種實施方案，在中性粒細胞減少階段中性粒細胞減少癥小鼠中中等劑量的Am80誘導的中性粒細胞表現(xiàn)出大于G-CSF或Am80-GCSF誘導的中性粒細胞的殺菌活性。

圖7示出根據(jù)本發(fā)明的各種實施方案，在中性粒細胞減少階段中性粒細胞減少癥小鼠中低劑量的Am80誘導的中性粒細胞表現(xiàn)出大于GCSF或Am80-GCSF誘導的中性粒細胞的殺菌活性。

圖8示出根據(jù)本發(fā)明的各種實施方案，在中性粒細胞恢復階段中性粒細胞減少癥小鼠中較低劑量的Am80-GCSF組合誘導的中性粒細胞表現(xiàn)出大于Am80或GCSF誘導的中性粒細胞的殺菌活性。

圖9示出根據(jù)本發(fā)明的實施方案，存活的小鼠模型證明，較低劑量的Am80-GCSF減小中性粒細胞減少癥小鼠的感染相關的死亡率。

圖10示出根據(jù)本發(fā)明的各種實施方案，Am80的分子信號傳導。

圖11示出根據(jù)本發(fā)明的各種實施方案，Am80和G-CSF的組合相比于單獨Am80或G-CSF促進了較大的ROS產(chǎn)生，同時抑制了白血病生長。

圖12示出根據(jù)本發(fā)明的各種實施方案，Am80和GCSF的組合在正常造血CD34⁺前體中相比于單獨Am80或G-CSF促進較大的ROS產(chǎn)生。

圖13示出根據(jù)本發(fā)明的各種實施方案，G-CSF治療相比于用Am80或ATRA治療促進了非APL(急性早幼粒細胞白血病)AML患者胚細胞的生長。

圖14示出根據(jù)本發(fā)明的各種實施方案，Am80-GCSF顯著促進了從健康人供體分離的外周血單核細胞中的ROS產(chǎn)生。

圖15示出根據(jù)本發(fā)明的各種實施方案，Am80-GCSF促進了獲自急性骨髓白血病患者的健康骨髓(BM)細胞或外周血(PB)單核細胞中顯著較大的ROS產(chǎn)生。

發(fā)明詳述

本文引用的所有參考文獻都如同充分闡述一般以引用方式整體并入。除非另外定義，否則本文使用的技術術語和科學術語具有與本發(fā)明所屬領域中的普通技術人員通常所理解的相同的含義。Allen等人,Remington:The Science and Practice of Pharmacy第22版,Pharmaceutical Press(2012年9月15日)；Hornyak等人,Introduction to Nanoscience and Nanotechnology,CRC Press(2008)；Singleton和Sainsbury,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology第3版,修訂版,J.Wiley&Sons(New York,NY 2006)；Smith,March’s Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure第7版,J.Wiley&Sons(New York,NY 2013)；Singleton,Dictionary of DNA and Genome Technology第3版,Wiley-Blackwell(2012年11月28日)；以及Green和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual第4t版,Cold Spring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor,NY 2012)為本領域技術人員對本申請中使用的許多術語提供總體引導。關于如何制備抗體的參考文獻，參見Greenfield,Antibodies A Laboratory Manual第2版,Cold Spring Harbor Press(Cold Spring Harbor NY,2013)；和Milstein,Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion,Eur.J.Immunol.1976年7月,6(7):511-9；Queen和Selick,Humanized immunoglobulins，美國專利號5,585,089(1996年12月)；和Riechmann等人,Reshaping human antibodies for therapy,Nature 1988年3月24日,332(6162):323-7。

本領域技術人員將認識到與本文所述的方法和材料類似或等同的可用于實施本發(fā)明的許多方法和材料。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢將根據(jù)連同附圖一起進行的以下詳細描述而變得顯而易見，所述附圖舉例說明本發(fā)明的實施方案的各種特征。實際上，本發(fā)明決不限于所述的方法和材料。為了方便起見，在此集中了在說明書、實施例和所附權利要求書中采用的某些術語。

除非另行指出或從上下文暗示，否則下列術語和短語包括以下所提供的含義。除非另行明確指出或從上下文顯而易見，否則以下術語和短語不排除術語或短語在其所屬的領域獲取的含義。提供定義是為了有助于描述特定實施方案，并且不旨在限制要求保護的發(fā)明，因為本發(fā)明的范圍僅受權利要求限制。除非另外定義，否則本文中所用的所有技術術語和科學術語均具有與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同的含義。

如本文所用，術語“包含(comprising)”或“包括(comprises)”關于可用于實施方案的組合物、方法和其相應組分來使用，其仍然為包括未指定的要素的開放的術語，無論要素是否有用。本領域技術人員應了解，一般而言，本文使用的術語通常旨在作為“開放”術語(例如，術語“包括”應解釋為“包括但不限于”，術語“具有”應解釋為“至少具有”，術語“包括”應解釋為“包括但不限于”等)。

除非另行指出，否則在描述本申請的特定實施方案的上下文(特別是在權利要求的上下文中)中使用的術語“一個”和“一種”和“所述”和類似的參考可以理解為涵蓋單數(shù)和復數(shù)。本文值的范圍的列舉僅僅旨在用作單獨提及落入范圍中的每個獨立值的簡寫方法。除非本文另外指明，否則每個單獨的值均并入本說明書中，如同本文單獨列舉每個單獨的值一樣。可按任何合適的順序來執(zhí)行本文所述的所有方法，除非本文另外指明或明顯地與上下文矛盾。使用相對于本文的某些實施方案提供的任何和所有實例或示例性語言(例如，“諸如”)僅僅旨在更好地闡明本申請而不對另外要求保護的本申請造成限制?？s寫“e.g.”源于拉丁語例如(exempli gratia)，并且本文用于指示非限制性實例。因此，縮寫“e.g.”與術語“例如”同義。不應該將說明書中的語言理解為是指示對實施本申請必需的任何未要求保護的要素。

如本文所用，術語“治療(treat)”、“治療(treatment)”、“治療(treating)”或“改善”當關于疾病、病癥或醫(yī)學疾患使用時是指治療性治療和預防或預防性措施，其中目的在于預防、逆轉(zhuǎn)、緩解、改善、抑制、減輕、減緩或停止癥狀或疾患的進展或嚴重程度。術語“治療”包括減小或緩解疾患的至少一個不利影響或癥狀。如果一種或多種癥狀或臨床標志減少，則治療大體為“有效”?；蛘?，如果疾病、病癥或醫(yī)學疾患的進展得以減輕或停滯，則治療為“有效”。即，“治療”不僅包括癥狀或標志的改善，而且還包括中止或至少減緩不存在治療時可預期到的癥狀進展或惡化。另外，“治療”可意指追求或獲得有益的結(jié)果，或降低個體出現(xiàn)疾患的幾率，即使治療最后是不成功的。需要治療的對象包括已經(jīng)患有疾患的對象，以及易患所述疾患的對象或要預防所述疾患的對象。

“有益的結(jié)果”或“期望的結(jié)果”可以包括，但決不限于，減輕或緩解所述疾病疾患的嚴重程度、預防所述疾病疾患惡化、治愈所述疾病疾患、預防所述疾病疾患出現(xiàn)、降低患者出現(xiàn)所述疾病疾患的幾率、降低發(fā)病率和死亡率以及延長患者壽命或預期壽命。作為非限制性實例，“有益的結(jié)果”或“期望的結(jié)果”可為一種或多種癥狀的緩解、缺陷程度的減弱、中性粒細胞減少癥的穩(wěn)定化(即，不惡化)狀態(tài)、中性粒細胞減少癥的延遲或減緩以及與中性粒細胞減少癥相關聯(lián)的癥狀的改善或緩和。

如本文所用，術語“施用”是指將如本文所公開的藥劑，以導致藥劑至少部分定位在期望位點的方法或途徑放置于受試者中。

如本文所用，“疾患”和“疾病疾患”可以包括，但決不限于，任何形式的中性粒細胞減少癥或中性粒細胞減少癥相關的疾患、疾病或病癥。如本文所用，“中性粒細胞減少癥”是指特征在于血液中的中性粒細胞水平低得異常的粒細胞病癥。中性粒細胞減少癥可能是由于白細胞的產(chǎn)生降低(例如，由于，包括但不限于影響骨髓的治療劑、影響骨髓的遺傳/先天性病癥、酒精中毒、脾功能亢進、狼瘡、再生障礙性貧血、癌癥(尤其是血癌)、放射治療、維生素B12缺乏癥、葉酸缺乏癥或銅缺乏癥和/或暴露于殺蟲劑)。中性粒細胞減少癥還可能是由于白細胞的破壞(例如，由于，包括但不限于病毒感染、急性細菌感染、某些自身免疫疾病、化療治療和/或治療劑)。中性粒細胞減少癥還可能是由于白細胞的排斥(marginalization)、隔離(sequestration)和/或遷移(例如，由于，包括但不限于血液透析、瘧疾和/或細菌感染)。某些藥物諸如氟卡尼(flecainide)、苯妥英(phenytoin)、吲哚美辛(indomethacin)、丙基硫氧嘧啶、卡比馬唑(carbimazole)、氯丙嗪(chlorpromazine)、甲氧芐啶(trimethoprim)/磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole，復方新諾明)、氯氮平(clozapine)、噻氯平(ticlodipine)和某些抗精神病藥物也可能導致中性粒細胞減少癥。本發(fā)明的方法和組合物可以用于治療、抑制、減輕由任何以上原因引起的中性粒細胞減少癥的嚴重程度和/或促進其預防。本發(fā)明的方法和組合物還可以通過治療、抑制、減輕中性粒細胞減少癥的嚴重程度和/或促進其預防來用于治療、抑制、減輕由中性粒細胞減少癥的任何以上原因引起的中性粒細胞相關的疾患諸如細菌、真菌、病毒、寄生蟲感染以及先天免疫的放射損傷的嚴重程度和/或促進其預防。

如本文所用，術語“樣本”或“生物樣本”指示取自或分離自生物有機體的樣本，例如來自受試者的腫瘤樣本。示例性生物樣本包括但不限于，生物流體樣本；血清；血漿；尿液；唾液；腫瘤樣本；腫瘤活檢物和/或組織樣本等。術語還包括上文所提及的樣本的混合物。術語“樣品”還包括未處理或預處理(或預加工)的生物樣本。在一些實施方案中，樣本可包含來自受試者的一種或多種細胞。在一些實施方案中，樣本可以是腫瘤細胞樣品，例如樣本可包括癌性細胞、來自腫瘤的細胞和/或腫瘤活檢物。

術語“功能的”當結(jié)合“等同物”、“類似物”、“衍生物”或“變體”或“片段”使用時是指這樣的實體或分子，它們具有的生物活性與是其等同物、類似物、衍生物、變體或片段的實體或分子的生物活性大致上相似。

如本文所用，“受試者”意指人或動物。通常動物為脊椎動物，諸如靈長類動物、嚙齒動物、家畜或野生動物。靈長類動物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和獼猴例如恒河猴。嚙齒動物包括小鼠、大鼠、土撥鼠、白鼬、兔子和倉鼠。家畜和野生動物包括牛、馬、豬、鹿、野牛、水牛、貓科例如家養(yǎng)貓、犬科例如狗、狐貍、狼。術語“患者”、“個體”和“受試者”在本文中可互換使用。在一個實施方案中，受試者是哺乳動物。哺乳動物可以是人、非人的靈長類動物、小鼠、大鼠、狗、貓、馬或牛，但不限于這些實例。此外，本文所述的方法可用于治療馴養(yǎng)的動物和/或?qū)櫸铩?/p>

如本文所用，“哺乳動物”是指哺乳綱的任何成員，不加限制地包括人和非人靈長類動物，諸如黑猩猩以及其他猿和猴物種；農(nóng)畜，諸如牛、綿羊、豬、山羊和馬；家養(yǎng)哺乳動物，諸如狗和貓；實驗室動物，包括嚙齒動物，諸如小鼠、大鼠和豚鼠等。術語不指示特定年齡或性別。因此，成年和新生受試者以及胎兒無論雄性或雌性都旨在被包括在這個術語的范圍內(nèi)。

如本文所用，“中性粒細胞減少癥誘導”或“中性粒細胞減少”階段是指癌癥化療誘導的中性粒細胞減少癥，并且符合如圖4，左圖人類第0-12天和右圖小鼠第0-3天中所示的外周血(PB)絕對中性粒細胞計數(shù)(ANC)的減少。

如本文所用，“中性粒細胞減少癥恢復”或“中性粒細胞恢復”或“中性粒細胞誘導”階段是指在最低點或凹點之后PB中性粒細胞數(shù)目(ANC)的恢復。參見圖4，第12-24天(左圖)和第3-9天(右圖)。

“受試者”可為先前診斷或識別為罹患或患有需要治療的疾患(例如，中性粒細胞減少癥或中性粒細胞減少癥相關的病癥)，或者與此類疾患相關的一種或多種并發(fā)癥，并任選已經(jīng)歷過對疾患或與疾患相關的一種或多種并發(fā)癥的治療的個體?；蛘?，受試者還可為先前未診斷為患有疾患或與疾患相關的一種或多種并發(fā)癥的個體。例如，受試者可為表現(xiàn)出疾患或與疾患相關的一種或多種并發(fā)癥的一種或多種風險因素的個體或未表現(xiàn)出風險因素的受試者。就特定疾患而言，“需要治療的受試者”可為疑似患有所述疾患、診斷為患有所述疾患、已對所述疾患進行治療或正在治療、未對所述疾患進行治療或具有出現(xiàn)所述疾患的風險的受試者。

術語“統(tǒng)計學顯著”或“顯著地”是指有差異存在的統(tǒng)計證明。它被定義為當無效假設實際上為真時作出否決這個無效假設的決定的可能性。通常使用p值作出決定。

除非本文另外定義，否則結(jié)合本申請使用的科學術語和技術術語將具有由本公開所屬領域的普通技術人員通常所理解的含義。應了解本發(fā)明不限于本文所述的特定方法、方案和試劑等，并且因此可變化。本文所用的術語僅出于描述特定實施方案的目的，并且不旨在限制本發(fā)明的范圍，所述范圍僅由權利要求限定。

粒細胞集落刺激因子(G-CSF或GCSF)誘導血流中的中性粒細胞數(shù)目的快速增加。遺憾的是，G-CSF誘導的中性粒細胞是不良分化的，連同它們的殺菌功能是受損的，這是由在分化過程早期的粒細胞生成期間中性粒細胞效應子功能發(fā)展不足所引起。

視黃酸(RA)通過視黃酸受體γ(RARγ)增強了造血干細胞(HSC)的自我更新，同時通過RARα激活促進了定向骨髓性祖細胞的分化。Am-80是一種全反式視黃酸(ATRA或RA)激動劑，其被設計成選擇性地結(jié)合RARα但不結(jié)合RARγ。Am80的這種選擇特性可充分地促進粒細胞分化。

我們最近發(fā)現(xiàn)，Am-80(他米巴羅汀)增強適度的髓細胞生成性擴增，同時誘導成熟的中性粒細胞，在對抗細菌感染中優(yōu)異于G-CSF。這種效應是由于轉(zhuǎn)錄因子RARα的Am80誘導的選擇性激活通過抑制RARα磷酸化誘導了RA靶基因的新型選擇性表達，這是通過調(diào)控細胞周期和一般轉(zhuǎn)錄的CAK復合物所介導的。

通過使用各種中性粒細胞減少癥小鼠模型所進行的全面的體內(nèi)研究，我們發(fā)現(xiàn)，盡管在中性粒細胞減少癥小鼠模型中在中性粒細胞減少階段Am-80相比于G-CSF或Am80-G-CSF組合具有顯著較高的殺菌活性，但是其表現(xiàn)出的在中性粒細胞恢復階段對抗細菌感染的效率低于Am80-G-CSF組合誘導的那些。這指出：a)相比于從造血干細胞(HSC)再生中性粒細胞，Am-80可更有效地促進中性粒細胞分化；b)在小鼠中性粒細胞減少癥的較早發(fā)展階段(中性粒細胞減少階段)Am80誘導的顯著較高的中性粒細胞殺菌活性是由于Am80促進的現(xiàn)有PB和BM粒細胞前體向成熟中性粒細胞的分化；c)在低劑量的Am80-GCSF治療的情況下，Am80可有效地以GCSF再生的方式將大量粒細胞前體分化成對抗微生物感染的成熟中性粒細胞；以及d)在再生成熟中性粒細胞方面，Am80-GCSF組合優(yōu)異于GCSF，能夠減小中性粒細胞小鼠的感染和感染相關的死亡率。響應于G-CSF施用所再生的大量中性粒細胞是不成熟的，因此導致了在中性粒細胞減少和中性粒細胞恢復階段無效的對抗感染的殺菌活性。通過對Am80增強中性粒細胞成熟化的效應連同G-CSF促進HSC的骨髓性擴增的功能進行協(xié)同，我們證明了，在連續(xù)細菌感染的情況下，Am80和G-CSF的組合相比于單獨Am80或GCSF顯著降低了中性粒細胞減少癥小鼠的死亡率。

我們展示了，在始終的細菌感染的存在下顯著減小中性粒細胞減少癥小鼠的死亡率方面，組合的Am80-GCSF治療顯著大于Am80，表明盡管Am80選擇性激活RARα可得到有效的中性粒細胞分化，但是Am80介導的適度的骨髓性擴增無法滿足在經(jīng)歷始終的細菌感染的中性粒細胞減少癥疾患的情況下對于中性粒細胞的較大再生的需要。這些發(fā)現(xiàn)指示協(xié)同的Am80增強中性粒細胞成熟化的效應連同G-CSF促進HSC的骨髓性擴增的功能的需要，這種協(xié)同作用可克服由治療癌癥化療誘導的中性粒細胞減少癥的當前G-CSF治療引起的無效性。

因此，基于這些發(fā)現(xiàn)，我們計劃利用類視色素激動劑和G-CSF的組合作為治療癌癥化療誘導的中性粒細胞減少癥和超過，包括但不限于治療先天性中性粒細胞減少癥(例如，柯士文綜合征(Kostmann syndrome)、周期性中性粒細胞減少癥和Chediak Higashi)的有效治療。我們還計劃使用類視色素激動劑和G-CSF的組合用于離體粒細胞生成，尤其是中性粒細胞，從而實現(xiàn)減少中性粒細胞減少癥的持續(xù)時間的轉(zhuǎn)輸治療以及AML患者的HSC移植，并且作為對抗急性放射綜合征的放射防護治療。

治療方法

在建立的人和小鼠中性粒細胞減少癥模型(圖4)中，GCSF或Am80均無法預防在中性粒細胞減少癥的早期發(fā)展中由化療藥物誘導的中性粒細胞減少。另一方面，盡管通過GCSF而數(shù)目快速增加的中性粒細胞可在中性粒細胞恢復期期間縮短中性粒細胞減少癥持續(xù)時間，但是這些增加的中性粒細胞在對抗微生物感染中是不成熟的。通過使用涵蓋了中性粒細胞減少癥的不同階段的一系列中性粒細胞減少癥小鼠模型，發(fā)明人解決了是單獨Am80還是Am80-GCSF的組合可有效地對抗微生物感染的問題。中性粒細胞減少小鼠模型(圖6、7)的結(jié)果示出，在HSC的中性粒細胞再生仍受化療藥物抑制的早期小鼠中性粒細胞減少癥發(fā)展階段，單獨Am80在將現(xiàn)有的粒細胞前體分化成抵抗感染的成熟中性粒細胞中優(yōu)異于GCSF或Am80-GCSF。但是，在之后的粒細胞逐漸復蘇以實現(xiàn)中性粒細胞的再生的中性粒細胞恢復期中，是Am80-GCSF組合，而不是單獨Am80或GCSF，Am80-GCSF組合協(xié)同地再生并分化大量的成熟中性粒細胞，以便對抗細菌感染(圖8)。另外，通過使用在連續(xù)的菌血癥的狀態(tài)下的不同中性粒細胞減少癥小鼠存活模型，我們展示了Am80-GCSF協(xié)同作用足以再生足夠量的成熟中性粒細胞以減少中性粒細胞減少癥小鼠的感染和感染相關的死亡率(圖9)。這些發(fā)現(xiàn)表明，Am80的促進中性粒細胞分化比從HSC再生中性粒細胞更有效，并且通過增強中性粒細胞分化的Am80效應連同促進HSC的骨髓性擴增的GCSF功能的協(xié)同，Am80-GCSF組合滿足了較大量的在中性粒細胞減少癥疾患中對抗微生物的成熟中性粒細胞的需求。因此，我們的研究指示，Am80-GSCF組合可協(xié)調(diào)骨髓性擴增與中性粒細胞分化，從而通過使用Am80-GCSF組合治療提供開發(fā)有效的癌癥化療誘導的中性粒細胞減少癥(CCIN)治療的機會。

在各種實施方案中，本發(fā)明提供了一種在受試者體內(nèi)治療疾患、預防疾患、減少出現(xiàn)疾患的可能性、減輕疾患的嚴重程度、促進疾患的預防和/或減緩疾患的進展的方法。所述方法包括以下或可由以下組成：提供類視色素激動劑；提供G-CSF或其類似物；和向受試者施用治療有效量的類視色素激動劑和G-CSF或其類似物，從而在受試者體內(nèi)治療疾患、預防疾患、減少出現(xiàn)疾患的可能性、減輕疾患的嚴重程度、促進疾患的預防和/或減緩疾患的進展。在各種實施方案中，類視色素激動劑和G-CSF或其類似物是呈一種組合物的形式。在其他實施方案中，類視色素激動劑和G-CSF或其類似物是呈單獨的組合物的形式。

根據(jù)本發(fā)明的各種實施方案，疾患為中性粒細胞減少癥或微生物感染。在某些實施方案中，微生物感染為細菌感染、病毒感染、真菌感染或寄生蟲感染。在某些實施方案中，中性粒細胞減少癥為化療誘導的中性粒細胞減少癥、先天性中性粒細胞減少癥、特發(fā)性中性粒細胞減少癥、周期性中性粒細胞減少癥、自身免疫中性粒細胞減少癥或放射中性粒細胞減少癥。

在各種實施方案中，本發(fā)明提供了一種在受試者體內(nèi)治療中性粒細胞減少癥、預防中性粒細胞減少癥、減少出現(xiàn)中性粒細胞減少癥的可能性、減輕中性粒細胞減少癥的嚴重程度、促進中性粒細胞減少癥的預防和/或減緩中性粒細胞減少癥的進展的方法。所述方法包括以下或可由以下組成：提供類視色素激動劑；提供G-CSF或其類似物；和向受試者施用治療有效量的類視色素激動劑和G-CSF或其類似物，從而在受試者體內(nèi)治療疾患、預防疾患、減少出現(xiàn)疾患的可能性、減輕疾患的嚴重程度、促進疾患的預防和/或減緩疾患的進展。在各種實施方案中，類視色素激動劑和G-CSF或其類似物是呈一種組合物的形式。在其他實施方案中，類視色素激動劑和G-CSF或其類似物是呈單獨的組合物的形式。在一個實施方案中，中性粒細胞減少癥為癌癥化療誘導的中性粒細胞減少癥(CCIN)。

在各種實施方案中，感染性疾病是由感染性細菌所引起。感染性細菌的實例包括：幽門螺旋桿菌(Helicobacterpyloris)、伯氏疏螺旋體(Borelia burgdorferi)、嗜肺軍團菌(Legionella pneumophilia)、分枝桿菌屬(Mycobacteria sps)(諸如結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)、鳥分枝桿菌(M.avium)、細胞內(nèi)分枝桿菌(M.intracellulare)、堪薩斯分枝桿菌(M.kansaii)、戈登分枝桿菌(M.gordonae))、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、單核細胞增多性李氏菌(Listeria monocytogenes)、釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)(A組鏈球菌屬)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)(B組鏈球菌屬)、鏈球菌屬(綠色組)、糞鏈球菌(Streptococcus faecalis)、牛鏈球菌(Streptococcus bovis)、鏈球菌屬(厭氧屬)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、病原性彎曲桿菌屬(pathogenic Campylobacter sp.)、腸球菌屬(Enterococcus sp.)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、炭疽桿菌(Bacillus anthracis)、白喉棒桿菌(corynebacterium diphtheriae)、棒桿菌屬(corynebacterium sp.)、紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、破傷風梭菌(Clostridium tetani)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、多殺巴斯德氏桿菌(Pasturella multocida)、擬桿菌屬(Bacteroides sp.)、核粒梭形桿菌(Fusobacterium nucleatum)、念珠狀鏈桿菌(Streptobacillus moniliformis)、蒼白密螺旋體(Treponema pallidum)、細弱密螺旋體(Treponema pertenue)、鉤端螺旋體屬(Leptospira)和以色列放線菌(Actinomyces israelli)。本文所述的組合物和方法設想用于治療利用這些細菌藥劑的感染。其他感染性有機體(諸如原生生物)包括：惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)和剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)。本文所述的組合物和方法設想用于治療利用這些藥劑的感染。

在各種實施方案中，感染性疾病可由病毒感染引起。感染性病毒的實例包括：逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)(例如，HIV)；小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(例如，脊髓灰質(zhì)炎病毒、甲型肝炎病毒；腸道病毒、人柯薩奇病毒、鼻病毒、?？虏《?；杯狀病毒科(Calciviridae)(諸如引起腸胃炎的株系)；披膜病毒科(Togaviridae)(例如，馬腦炎病毒、風疹病毒)；黃病毒科(Flaviviridae)(例如，登革病毒、腦炎病毒、黃熱病病毒)；冠狀病毒科(Coronaviridae)(例如，冠狀病毒(coronaviruse))；彈狀病毒科(Rhabdoviridae)(例如，水泡性口膜炎病毒、狂犬病病毒)；線狀病毒科(Filoviridae)(例如，埃博拉病毒)；副粘液病毒科(Paramyxoviridae)(例如，副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，流感病毒)；布尼亞病毒科(Bungaviridae)(例如，漢坦病毒、布尼亞病毒、白蛉熱病毒和內(nèi)羅病毒)；沙粒病毒科(Arena viridae)(出血熱病毒)；呼腸孤病毒科(Reoviridae)(例如，呼腸孤病毒、環(huán)狀病毒和輪狀病毒)；雙核糖核酸病毒科(Birnaviridae)；肝脫氧核糖核酸病毒科(Hepadnaviridae)(乙型肝炎病毒)；細小病毒科(Parvoviridae)(細小病毒)；乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳頭瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)(大多數(shù)腺病毒)；皰疹病毒科(Herpesviridae)(單純皰疹病毒(HSV)1和HSV-2、水痘帶狀皰疹病毒、巨細胞病毒(CMV)、皰疹病毒)；痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)；和虹膜病毒科(Iridoviridae)(諸如，非洲豬瘟病毒)；以及未分類的病毒(例如，海綿狀腦病的病原、丁型肝炎的病原(被認為是乙型肝炎病毒的有缺陷的衛(wèi)星病毒)、非甲非乙型肝炎的病原(第1類＝內(nèi)部傳播；第2類＝胃腸外傳播(即，丙型肝炎)；諾瓦克病毒和相關病毒，以及星狀病毒)。本文所述的組合物和方法設想用于治療利用這些病毒藥劑的感染。

可利用本文所述的組合物和方法治療的真菌感染的實例包括但不限于：曲霉病(aspergillosis)；鵝口瘡(由白色念珠菌引起)；隱球菌病(由隱球菌引起)；和組織胞漿菌病。因此，感染性真菌的實例包括但不限于新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)、白色念珠菌和曲霉菌屬。本文所述的組合物和方法設想用于治療利用這些真菌藥劑的感染。

在各種實施方案中，受試者為人。在各種實施方案中，受試者為哺乳動物受試者，包括但不限于人、猴、猿、狗、貓、牛、馬、山羊、豬、兔子、小鼠和大鼠。在一些實施方案中，受試者患有始終的微生物感染，包括但不限于細菌感染、病毒感染、真菌感染和寄生蟲感染。

在各種實施方案中，類視色素激動劑是他米巴羅汀(Am80、視黃苯甲酸、AMNOID、他米巴羅(TAMIBARO))、CH55、ITYA(ITYA-01115)、Am580、BD4或NRX195183(也稱為AGN195183)或它們的功能等同物、類似物或衍生物，或其組合。在各種實施方案中，類視色素激動劑是RARα特異性激動劑。在一個實施方案中，類視色素激動劑是Am80，或Am80的功能等同物、類似物、衍生物或鹽。

在各種實施方案中，G-CSF或其組合可來自任何來源，例如，大鼠、小鼠、豚鼠、狗、貓、兔子、豬、牛、馬、山羊、驢子或人。根據(jù)本發(fā)明，G-CSF或其類似物的實例包括但不限于野生型G-CSF、重組G-CSF、G-CSF單體或二聚體、重組人G-CSF(rhG-CSF)二聚體、G-CSF突變體、G-CSF融合蛋白、G-CSF片段、修飾的G-CSF多肽、PEG化G-CSF、糖基化G-CSF和在特定賴氨酸(Lys 17)處用Y形支鏈聚乙二醇(YPEG-G-CSF)修飾的G-CSF。這些各種G-CSF和G-CSF等同物、類似物、衍生物、變體或片段是具有大致上類似于野生型G-CSF或甚至比野生型G-CSF好的生物活性的功能分子。額外的信息可見于例如US 8557546(用于治療神經(jīng)疾病的重組人G-CSF二聚體和其用途(Recombinant human G-CSF dimer and use thereof for the treatment of neurological diseases))；US 8530417(Y形聚乙二醇修飾的G-CSF、其制備和用途(Y-shaped polyethylene glycol modified G-CSF,the preparation and use thereof))；US 8507221(用于使用GCSF作為融合配偶體表達關注的多肽的方法(Process for the expression of peptides of interest using GCSF as a fusion partner))；US 8058398(修飾的G-CSF多肽(Modified G-CSF polypeptide))；US 7655766(包含PEG化G-CSF的位置異構(gòu)體的組合物(Compositions comprising positional isomers of PEGylated G-CSF))；和US 7402304(使用G-CSF類似物組合物的方法(Methods of using G-CSF analog compositions))中，這些專利都如同充分闡述一般以引用方式整體并入。

有效量的類視色素激動劑或G-CSF或其類似物的典型劑量可以在使用已知治療化合物的制造商推薦范圍內(nèi)，并且還如通過細胞中的體外響應或動物模型中的體內(nèi)響應向技術人員所指示。此類劑量一般可以在濃度或量上降低至多約一個數(shù)量級而不損失相關的生物活性。實際劑量可以取決于醫(yī)師的判斷、患者的疾患和治療方法的有效性，所述治療方法是基于例如相關的培養(yǎng)細胞或組織培養(yǎng)組織樣本的體外響應性或在適當?shù)膭游锬Ｐ椭杏^察到的響應。在各種實施方案中，類視色素激動劑或G-CSF或其類似物可以每天一次(SID/QD)、每天兩次(BID)、每天三次(TID)、每天四次(QID)或每天更多次施用，以便對受試者施用有效量的類視色素激動劑和G-CSF或其類似物，其中有效量是任何一種或多種本文所述的劑量。

在各種實施方案中，類視色素激動劑以約0.001至0.01mg/kg、0.01至0.1mg/kg、0.1至0.5mg/kg、0.5至5mg/kg、5至10mg/kg、10至20mg/kg、20至50mg/kg、50至100mg/kg、100至200mg/kg、200至300mg/kg、300至400mg/kg、400至500mg/kg、500至600mg/kg、600至700mg/kg、700至800mg/kg、800至900mg/kg或900至1000mg/kg施用。在一些實施方案中，類視色素激動劑每天1-3次或每周1-7次施用。仍在一些實施方案中，類視色素激動劑施用約1-10天、10-20天、20-30天、30-40天、40-50天、50-60天、60-70天、70-80天、80-90天、90-100天、1-6個月、6-12個月或1-5年。在一個實施方案中，類視色素激動劑是Am80，或Am80的功能等同物、類似物、衍生物或鹽。在此，“mg/kg”是指mg/kg受試者體重。在某些實施方案中，將類視色素激動劑施用給人。

在各種實施方案中，類視色素激動劑的有效量是以下中的任何一個或多個：約0.01至0.05μg/kg/天、0.05-0.1μg/kg/天、0.1至0.5μg/kg/天、0.5至5μg/kg/天、5至10μg/kg/天、10至20μg/kg/天、20至50μg/kg/天、50至100μg/kg/天、100至150μg/kg/天、150至200μg/kg/天、200至250μg/kg/天、250至300μg/kg/天、300至350μg/kg/天、350至400μg/kg/天、400至500μg/kg/天、500至600μg/kg/天、600至700μg/kg/天、700至800μg/kg/天、800至900μg/kg/天、900至1000μg/kg/天、0.01至0.05mg/kg/天、0.05-0.1mg/kg/天、0.1至0.5mg/kg/天、0.5至1mg/kg/天、1至5mg/kg/天、5至10mg/kg/天、10至15mg/kg/天、15至20mg/kg/天、20至50mg/kg/天、50至100mg/kg/天、100至200mg/kg/天、200至300mg/kg/天、300至400mg/kg/天、400至500mg/kg/天、500至600mg/kg/天、600至700mg/kg/天、700至800mg/kg/天、800至900mg/kg/天、900至1000mg/kg/天或其組合。在此，“μg/kg/天”或“mg/kg/天”是指μg/kg受試者體重/天或mg/kg受試者體重/天。

在各種實施方案中，G-CSF或其類似物以約0.01至0.1mcg/kg、0.1至0.5mcg/kg、0.5至5mcg/kg、5至10mcg/kg、10至20mcg/kg、20至50mcg/kg、50至100mcg/kg、100至200mcg/kg、200至300mcg/kg、300至400mcg/kg、400至500mcg/kg、500至600mcg/kg、600至700mcg/kg、700至800mcg/kg、800至900mcg/kg或900至1000mcg/kg施用。在一些實施方案中，G-CSF或其類似物每天1-3次或每周1-7次施用。仍在一些實施方案中，G-CSF或其類似物施用約1-10天、10-20天、20-30天、30-40天、40-50天、50-60天、60-70天、70-80天、80-90天、90-100天、1-6個月、6-12個月或1-5年。在此，“mcg/kg”是指mcg/kg受試者體重。在某些實施方案中，將G-CSF或其類似物施用給人。

在各種實施方案中，方案劑量可在小鼠與人之間進行轉(zhuǎn)換。表1提供了轉(zhuǎn)換的示例性表。作為一個非限制性實例，針對在ATRA誘導的完全緩解(CR)之后復發(fā)的APL患者的臨床治療，患者在無間隔的情況下每天接受6至9mg/m²Am80(經(jīng)口)持續(xù)最多56天。作為另外非限制性實例，中性粒細胞減少癥(先天性、特發(fā)性或周期性)患者通過皮下注射接受0.5-40mcg/kg/天G-CSF，并且化療誘導的中性粒細胞減少癥患者通過皮下注射接受4-69mcg/kg/天(7-20天)G-CSF。

表1：在一些實施方案中，小鼠與人之間的方案劑量的轉(zhuǎn)換

在一些實施方案中，類視色素激動劑和G-CSF或其類似物可在疾患的中性粒細胞減少階段(即，當受試者未出現(xiàn)疾患，但可能出現(xiàn)疾患或在出現(xiàn)疾患的過程中)施用。在其他實施方案中，類視色素激動劑和G-CSF或其類似物可在疾患的治療階段(即，當受試者已經(jīng)出現(xiàn)疾患時)施用。作為一個非限制性實例，目標疾患是中性粒細胞減少癥，并且受試者是已被吩咐化療或放療的癌癥患者。在此示例性情況下，當患者還未出現(xiàn)中性粒細胞減少癥，或在出現(xiàn)中性粒細胞減少癥的過程中，或已經(jīng)出現(xiàn)中性粒細胞減少癥時，可利用本文所述的方法治療患者。

根據(jù)本發(fā)明，類視色素激動劑和G-CSF或其類似物可使用適當?shù)氖褂媚Ｊ絹硎┯?，例如，制造商針對類視色素激動劑和G-CSF或其類似物中的每一種所推薦的施用模式。根據(jù)本發(fā)明，可使用各種途徑施用要求保護的方法的類視色素激動劑和G-CSF或其類似物，包括但不限于氣霧劑、經(jīng)鼻、經(jīng)口、經(jīng)粘膜、經(jīng)皮、胃腸外、植入泵、連續(xù)輸注、局部施用、膠囊和/或注射。在各種實施方案中，類視色素激動劑是通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、經(jīng)口或經(jīng)由吸入施用的。在各種實施方案中，G-CSF或其類似物是通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、經(jīng)口或經(jīng)由吸入施用的。類視色素激動劑和G-CSF或其類似物可通過相同途徑或單獨的途徑來施用。

在各種實施方案中，類視色素激動劑和G-CSF或其類似物是同時或順序地施用的。在各種實施方案中，類視色素激動劑是在施用G-CSF或其類似物之前、期間或之后施用的。在另外實施方案中，類視色素激動劑和/或G-CSF或其類似物是與食物或不與食物一起施用的。作為一個非限制性實例，類視色素激動劑(例如，Am80)可例如以前述劑量每天使用，并且G-CSF或其類似物可例如以前述劑量每天、每周、每周兩次(biweekly)、每兩周(every fortnight)和/或每月施用。作為另一個非限制性實例，類視色素激動劑可例如以前述劑量每天、每周、每周兩次、每兩周和/或每月施用，并且G-CSF或其類似物可例如以前述劑量每天施用。另外，類視色素激動劑和G-CSF或其類似物中的每一種可每天、每周、每周兩次、每兩周和/或每月施用，其中類視色素激動劑以前述劑量施用的天與G-CSF或其類似物以前述劑量施用的天不同。

在各種實施方案中，所述方法可還包括向受試者提供并且施用化療劑。根據(jù)本發(fā)明，類視色素激動劑、G-CSF或其類似物和化療劑是同時或順序地施用的。還根據(jù)本發(fā)明，類視色素激動劑和/或G-CSF或類似物是在使用化療劑之前、期間或之后施用的。在一些實施方案中，類視色素激動劑、G-CSF或其類似物和化療劑是呈一種組合物的形式或呈單獨的組合物的形式。

化療劑的實例包括但不限于放線菌素(Actinomycin)、阿利類視色素(Alitretinoin)、全反式類視色素、阿扎胞苷(Azacitidine)、硫唑嘌呤(Azathioprine)、貝伐珠單抗(Bevacizumab)、貝沙羅汀(Bexatotene)、博萊霉素(Bleomycin)、硼替佐米(Bortezomib)、卡鉑(Carboplatin)、卡培他濱(Capecitabine)、西妥昔單抗(Cetuximab)、順鉑、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、柔紅霉素、多西他賽(Docetaxel)、去氧氟尿苷、多柔比星(Doxorubicin)、表柔比星(Epirubicin)、埃博霉素(Epothilone)、埃羅替尼(Erlotinib)、依托泊苷(Etoposide)、氟尿嘧啶、吉非替尼(Gefitinib)、吉西他濱(Gemcitabine)、羥基脲、伊達比星(Idarubicin)、伊馬替尼(Imatinib)、易普利單抗(Ipilimumab)、伊立替康(Irinotecan)、氮芥、美法侖(Melphalan)、巰嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌(Mitoxantrone)、阿侖單抗(Ocrelizumab)、奧法木單抗(Ofatumumab)、奧沙利鉑(Oxaliplatin)、紫杉醇、帕尼妥單抗(Panitumab)、培美曲塞(Pemetrexed)、利妥昔單抗(Rituximab)、他氟泊苷(Tafluposide)、替尼泊苷(Teniposide)、硫鳥嘌呤(Tioguanine)、拓撲替康(Topotecan)、類視色素、戊柔比星(Valrubicin)、威羅菲尼(Vemurafenib)、長春堿(Vinblastine)、長春新堿(Vincristine)、長春地辛(Vindesine)、長春瑞濱(Vinorelbine)、伏立諾他(Vorinostat)、羅米地辛(Romidepsin)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巰基嘌呤(6-MP)、克拉屈濱(Cladribine)、氯法拉濱(Clofarabine)、氟尿苷(Floxuridine)、氟達拉濱(Fludarabine)、噴司他丁(Pentostatin)、絲裂霉素、伊沙匹隆(ixabepilone)、雌莫司汀(Estramustine)、潑尼松(prednisone)、甲基潑尼松龍(methylprednisolone)、地塞米松(dexamethasone)或其組合。

在各種實施方案中，所述方法可還包括向受試者提供并且施用抗微生物劑。根據(jù)本發(fā)明，類視色素激動劑、G-CSF或其類似物和抗微生物劑是同時或順序地施用的。還根據(jù)本發(fā)明，類視色素激動劑和/或G-CSF或類似物是在使用抗微生物劑之前、期間或之后施用的。在一些實施方案中，類視色素激動劑、G-CSF或其類似物和抗微生物劑是呈一種組合物的形式或呈單獨的組合物的形式?？刮⑸飫┛梢允强辜毦鷦?、抗病毒劑、抗真菌劑或抗寄生蟲劑，或其組合。

藥物組合物

在各種實施方案中，本發(fā)明提供了組合物，其包含類視色素激動劑和G-CSF或其類似物。在一個實施方案中，類視色素激動劑和G-CSF是呈相同組合物的形式。在另一個實施方案中，類視色素激動劑和G-CSF是呈單獨的組合物的形式。根據(jù)本發(fā)明，組合物可用于在受試者體內(nèi)治療疾患、預防疾患、減少出現(xiàn)疾患的可能性、減輕疾患的嚴重程度和/或減緩疾患的進展。根據(jù)本發(fā)明，疾患可為中性粒細胞減少癥或微生物感染。還根據(jù)本發(fā)明，組合物可用于刺激細胞(包括但不限于HSC、骨髓粒細胞祖細胞和造血CD34+細胞)生成粒細胞，并且尤其是中性粒細胞。

在各種實施方案中，類視色素激動劑是他米巴羅汀(AM 80、視黃苯甲酸、Amnoid、他米巴羅)、CH55、ITYA(ITYA-01115)、Am580、BD4或NRX195183(也稱為AGN195183)或它們的功能等同物、類似物或衍生物，或其組合。在各種實施方案中，類視色素激動劑是RARα特異性激動劑。在一個實施方案中，類視色素激動劑是Am80，或Am80的功能等同物、類似物、衍生物或鹽。

在各種實施方案中，組合物中的類視色素激動劑以mg/kg受試者體重計來提供；例如，約0.001至0.01mg/kg、0.01至0.1mg/kg、0.1至0.5mg/kg、0.5至5mg/kg、5至10mg/kg、10至20mg/kg、20至50mg/kg、50至100mg/kg、100至200mg/kg、200至300mg/kg、300至400mg/kg、400至500mg/kg、500至600mg/kg、600至700mg/kg、700至800mg/kg、800至900mg/kg或900至1000mg/kg。在一個實施方案中，類視色素激動劑是Am80，或Am80的功能等同物、類似物、衍生物或鹽。在某些實施方案中，將組合物施用給人。

在各種實施方案中，組合物中的G-CSF或其類似物以mcg/kg受試者體重計來提供；例如，約0.01至0.1mcg/kg、0.1至0.5mcg/kg、0.5至5mcg/kg、5至10mcg/kg、10至20mcg/kg、20至50mcg/kg、50至100mcg/kg、100至200mcg/kg、200至300mcg/kg、300至400mcg/kg、400至500mcg/kg、500至600mcg/kg、600至700mcg/kg、700至800mcg/kg、800至900mcg/kg或900至1000mcg/kg。在某些實施方案中，將組合物施用給人。

在一個實施方案中，組合物還包含化療劑。在另一個實施方案中，組合物還包含抗微生物劑。在各種實施方案中，組合物被配制用于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、經(jīng)口或經(jīng)由吸入施用。

根據(jù)本發(fā)明，可用于在哺乳動物體內(nèi)治療疾病的類視色素激動劑和/或G-CSF或其類似物常常制備成大致上不含天然存在的免疫球蛋白或其他生物分子。優(yōu)選的類視色素激動劑和/或G-CSF或其類似物當向哺乳動物施用時也表現(xiàn)出最小毒性。

在各種實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可含有任何藥學上可接受的賦形劑。“藥學上可接受的賦形劑”意指可用于制備藥物組合物的通常安全、無毒并且合乎需要的賦形劑，并且包括可為獸醫(yī)學用途以及人醫(yī)藥用途所接受的賦形劑。此類賦形劑可為固體、液體、半固體，或在氣霧劑組合物的情況下可為氣體。賦形劑的實例包括但不限于淀粉、糖、微晶纖維素、稀釋劑、成粒劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑、潤濕劑、乳化劑、著色劑、剝離劑、涂層劑、甜味劑、調(diào)味劑、芳香劑、防腐劑、抗氧化劑、增塑劑、膠凝劑、增稠劑、硬化劑、定形劑、懸浮劑、表面活性劑、濕潤劑、載體、穩(wěn)定劑和其組合。

在各種實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可被配制來通過任何施用途徑進行遞送?！笆┯猛緩健笨芍副绢I域中已知的任何施用途徑，包括但不限于氣霧劑、經(jīng)鼻、經(jīng)口、經(jīng)粘膜、經(jīng)皮、胃腸外、腸內(nèi)、局部(topical)或局部(local)。“胃腸外”是指通常與注射相關聯(lián)的施用途徑，包括眶內(nèi)、輸注、動脈內(nèi)、囊內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)、脊椎內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、子宮內(nèi)、靜脈內(nèi)、蛛網(wǎng)膜下、囊下、皮下、經(jīng)粘膜或經(jīng)氣管。通過胃腸外途徑，組合物可呈用于輸注或用于注射的溶液或混懸液的形式，或呈凍干粉末的形式。通過胃腸外途徑，組合物可呈用于輸注或用于注射的溶液或混懸液的形式。通過經(jīng)腸途徑，藥物組合物可呈片劑、凝膠膠囊、糖包衣片劑、糖漿、混懸液、溶液、粉末、顆粒劑、乳劑、允許控釋的微球或納米球或脂質(zhì)囊泡或聚合物囊泡的形式。通常，通過注射施用組合物。這些施用的方法是本領域的技術人員已知的。

在各種實施方案中，組合物每天1-3次或每周1-7次施用。在各種實施方案中，組合物施用約1-10天、10-20天、20-30天、30-40天、40-50天、50-60天、60-70天、70-80天、80-90天、90-100天、1-6個月、6-12個月或1-5年。根據(jù)本發(fā)明，組合物被配制用于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、經(jīng)口或經(jīng)由吸入施用。在各種實施方案中，組合物可以每天一次(SID/QD)、每天兩次(BID)、每天三次(TID)、每天四次(QID)或每天更多次施用，以便對受試者施用有效量的類視色素激動劑和G-CSF或其類似物，其中有效量是任何一種或多種本文所述的劑量。

在各種實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可含有任何藥學上可接受的載體。如本文所用，“藥學上可接受的載體”是指涉及從身體的一個組織、器官或部分將關注的化合物攜帶或運送到身體的另一個組織、器官或部分的藥學上可接受的物質(zhì)、組合物或媒介物。例如，載體可為液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包封物質(zhì)或其組合。載體的各個組分必須是“藥學上可接受的”，因為它必須與制劑的其他成分相容。它還必須適用于與它可能接觸的任何組織或器官接觸，這意味著它必須不攜帶毒性、刺激、過敏反應、免疫原性或過度超過其治療益處的任何其他并發(fā)癥的風險。

根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物也可被包封、制片或以乳劑或糖漿形式制備以供經(jīng)口施用?？商砑铀帉W上可接受的固體或液體載體以增強或穩(wěn)定組合物，或有助于制備組合物。液體載體包括糖漿、花生油、橄欖油、甘油、鹽水、醇和水。固體載體包括淀粉、乳糖、硫酸鈣、二水合物、白土、硬脂酸鎂或硬脂酸、滑石粉、果膠、阿拉伯膠、瓊脂或明膠。載體還可以包括持續(xù)釋放物質(zhì)，諸如單獨或與蠟組合的單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

藥物制備物是遵循常規(guī)制藥技術制備的，所述技術涉及研磨、混合、?；捅匾獣r壓制(針對片劑形式)；或研磨、混合和填充(針對硬質(zhì)明膠膠囊形式)。當使用液體載體時，制備物將呈糖漿、酏劑、乳劑或水性或非水性混懸液的形式。此類液體制劑可直接經(jīng)口(p.o.)施用或填充到軟質(zhì)明膠膠囊中。

根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以以治療有效量遞送。精確的治療有效量是就在給定受試者中的治療療效而言，組合物將產(chǎn)生最有效的結(jié)果的那個量。這個量將取決于多種因素而變化，所述因素包括但不限于治療化合物的特征(包括活性、藥物動力學、藥效動力學和生物利用率)、受試者的生理條件(包括年齡、性別、疾病類型和階段、一般身體條件、對給定劑量的反應性和藥物類型)、制劑中的一種或多種藥學上可接受的載體的性質(zhì)以及施用途徑。臨床和藥理學領域的技術人員將能夠通過常規(guī)實驗，例如通過監(jiān)測受試者對施用化合物的反應以及對應地調(diào)節(jié)劑量來確定治療有效量。對于其他指導，參見Remington:The Science and Practice of Pharmacy(Gennaro編，第20版,Williams&Wilkins PA,USA)(2000)。

在向受試者施用之前，可將制劑組分(formulant)添加到組合物。液體制劑是優(yōu)選的。例如，這些制劑組分可包括油、聚合物、維生素、碳水化合物、氨基酸、鹽、緩沖液、白蛋白、表面活性劑、增量劑或其組合。

碳水化合物制劑組分包括糖或糖醇諸如單糖、二糖或多糖，或水溶性葡聚糖。糖類或葡聚糖可包括果糖、右旋糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、蔗糖、葡聚糖、支鏈淀粉、糊精、α-環(huán)糊精和β-環(huán)糊精、可溶性淀粉、羥乙基淀粉和羧甲基纖維素，或其混合物。“糖醇”定義為具有-OH基團的C4-C8烴，并且包括半乳糖醇、肌醇、甘露糖醇、木糖醇、山梨醇、甘油、和阿拉伯糖醇。上文提及的這些糖或糖醇可單獨使用或以組合的形式使用。用量沒有固定的限制，只要糖或糖醇在液體制備物中可溶。在一個實施方案中，糖或糖醇濃度在1.0重量/體積％與7.0重量/體積％之間，更優(yōu)選在2.0重量/體積％與6.0重量/體積％之間。

氨基酸制劑組分包括肉毒堿、精氨酸和甜菜堿的左旋(L)形式；然而，可添加其他氨基酸。

在一些實施方案中，作為制劑組分的聚合物包括平均分子量在2,000與3,000之間的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或平均分子量在3,000與5,000之間的聚乙二醇(PEG)。

還優(yōu)選在組合物中使用緩沖液以將凍干前或重組后溶液的pH變化最小化?？墒褂么蠖鄶?shù)任何生理緩沖液，包括但不限于檸檬酸鹽、磷酸鹽、琥珀酸鹽和谷氨酸鹽緩沖液或其混合物。在一些實施方案中，濃度為0.01至0.3摩爾。可添加到制劑的表面活性劑示于歐洲專利號270,799和268,110中。

用于增加循環(huán)半衰期的另一種藥物遞送體系是脂質(zhì)體。制備脂質(zhì)體遞送體系的方法在Gabizon等人，Cancer Research(1982)42:4734；Cafiso,Biochem Biophys Acta(1981)649:129；和Szoka,Ann Rev Biophys Eng(1980)9:467中有所討論。其他藥物遞送體系在本領域中是已知的并且在例如Poznansky等人,Drug Delivery Systems(R.L.Juliano編,Oxford,N.Y.1980)，第253-315頁；M.L.Poznansky,Pharm Revs(1984)36:277中有所描述。

在液體藥物組合物制備后，可凍干以防止降解并保持無菌。用于凍干液體組合物的方法是本領域普通技術人員已知的。組合物僅在使用前可用可包括額外的成分的無菌稀釋劑重建(例如，林格溶液、蒸餾水或無菌鹽水)。重建后，使用本領域技術人員已知的那些方法將組合物施用給受試者。

本發(fā)明的組合物可以通過常規(guī)熟知的滅菌技術來滅菌。所得到的溶液可以包裝使用或在無菌條件下過濾并且凍干，凍干的制備物在施用之前與無菌溶液組合。當需要接近生理條件時，組合物可以含有藥學上可接受的輔助物質(zhì)，諸如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑等，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣和穩(wěn)定劑(例如，1-20％麥芽糖等)。

細胞治療

在各種實施方案中，本發(fā)明提供一種生成粒細胞，并且具體地說中性粒細胞的方法。所述方法包括：提供細胞(包括但不限于HSC、骨髓粒細胞祖細胞和造血CD34⁺細胞)；以及用類視色素激動劑和G-CSF或其類似物刺激細胞，從而生成粒細胞，并且具體地說中性粒細胞。根據(jù)本發(fā)明，所述方法可還包括培養(yǎng)刺激的細胞和/或生成的粒細胞，并且具體地說中性粒細胞。根據(jù)本發(fā)明的各種實施方案，所述方法還包括分離刺激的細胞和/或生成的粒細胞，并且具體地說中性粒細胞。根據(jù)本發(fā)明的各種實施方案，所述方法還包括向需要治療疾患的受試者施用刺激的細胞和/或生成的粒細胞，并且具體地說中性粒細胞。在各種實施方案中，本發(fā)明提供一種生成粒細胞，并且具體地說中性粒細胞的試劑盒。試劑盒包括：一定量的類視色素激動劑；一定量的G-CSF或其類似物；和使用類視色素激動劑和G-CSF或其類似物以刺激細胞(包括但不限于HSC、骨髓粒細胞祖細胞和造血CD34⁺細胞)從而生成粒細胞，并且具體地說中性粒細胞的說明書。

在各種實施方案中，本發(fā)明提供一種組合物，其根據(jù)所述方法和/或使用所述試劑盒包含生成的粒細胞，或具體地說中性粒細胞。在各種實施方案中，本發(fā)明提供一種組合物，其根據(jù)所述方法和/或使用所述試劑盒包含刺激的細胞。根據(jù)本發(fā)明的各種實施方案，這些組合物還包含類視色素激動劑和G-CSF或其類似物。根據(jù)本發(fā)明的各種實施方案，這些組合物還包含藥學上可接受的賦形劑和/或載體。根據(jù)本發(fā)明，這些組合物可配制用于通過各種途徑向受試者施用，這些途徑包括但不限于轉(zhuǎn)輸和移植。在另外實施方案中，本發(fā)明提供了一種通過向受試者施用這些所述組合物中的至少一種來在受試者體內(nèi)治療疾患、預防疾患、減輕疾患的嚴重程度和/或減緩疾患的進展的方法。作為一個非限制性實例，受試者可以是患有中性粒細胞減少癥的患者，并且可將包含生成的粒細胞，并且具體地說中性粒細胞的組合物轉(zhuǎn)輸?shù)交颊咧?。作為另一個非限制性實例，受試者可以是AML患者，并且可將包含刺激的HSC和/或骨髓細胞的組合物移植到患者中。

在各種實施方案中，本發(fā)明提供了一種在受試者體內(nèi)治療疾患、預防疾患、減少患有疾患的可能性、減輕疾患的嚴重程度和/或減緩疾患的進展的方法。所述方法包括：提供細胞(包括但不限于HSC、骨髓粒細胞祖細胞和造血CD34⁺細胞)；用類視色素激動劑和G-CSF或其類似物刺激細胞，從而生成粒細胞，或具體地說中性粒細胞；以及向受試者施用生成的粒細胞，或具體地說中性粒細胞，從而在受試者體內(nèi)治療疾患。在各種實施方案中，疾患是中性粒細胞減少癥或AML。在各種實施方案中，通過轉(zhuǎn)輸或移植向受試者施用生成的粒細胞，或具體地說中性粒細胞。

在各種實施方案中，本發(fā)明提供了一種在受試者體內(nèi)治療疾患、預防疾患、減少患有疾患的可能性、減輕疾患的嚴重程度和/或減緩疾患的進展的方法。所述方法包括：提供細胞(包括但不限于HSC、骨髓細胞、CD34⁺細胞和干細胞)；用類視色素激動劑和G-CSF或其類似物刺激細胞；以及向受試者施用刺激的磁暴，從而在受試者體內(nèi)治療疾患。在各種實施方案中，疾患是中性粒細胞減少癥或AML。在各種實施方案中，通過轉(zhuǎn)輸或移植向受試者施用刺激的細胞。

本發(fā)明的試劑盒

在各種實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于在受試者體內(nèi)治療疾患、預防疾患、減輕疾患的嚴重程度和/或減緩疾患的進展的試劑盒。試劑盒包括：一定量的類視色素激動劑；一定量的G-CSF或其類似物；和用于使用類視色素激動劑和G-CSF或其類似物來在受試者體內(nèi)治療疾患、預防疾患、減輕疾患的嚴重程度和/或減緩疾患的進展的說明書。

在各種實施方案中，類視色素激動劑是他米巴羅汀(Am80、視黃苯甲酸、Amnoid、他米巴羅)、CH55、ITYA(ITYA-01115)、Am580、BD4或NRX195183(也稱為AGN195183)或它們的功能等同物、類似物或衍生物，或其組合。在各種實施方案中，類視色素激動劑是RARα特異性激動劑。在一個實施方案中，類視色素激動劑是Am80，或Am80的功能等同物、類似物、衍生物或鹽。

在各種實施方案中，G-CSF或其組合可來自任何來源，例如，大鼠、小鼠、豚鼠、狗、貓、兔子、豬、牛、馬、山羊、驢子或人。根據(jù)本發(fā)明，G-CSF或其類似物的實例包括但不限于野生型G-CSF、重組G-CSF、G-CSF單體或二聚體、重組人G-CSF(rhG-CSF)二聚體、G-CSF突變體、G-CSF融合蛋白、G-CSF片段、修飾的G-CSF多肽、PEG化G-CSF、糖基化G-CSF和在特定賴氨酸(Lys 17)處用Y形支鏈聚乙二醇(YPEG-G-CSF)修飾的G-CSF。這些各種G-CSF和G-CSF等同物、類似物、衍生物、變體或片段是具有大致上類似于野生型G-CSF或甚至比野生型G-CSF好的生物活性的功能分子。額外的信息可見于例如US 8557546(用于治療神經(jīng)疾病的重組人G-CSF二聚體和其用途(Recombinant human G-CSF dimer and use thereof for the treatment of neurological diseases))；US 8530417(Y形聚乙二醇修飾的G-CSF、其制備和用途(Y-shaped polyethylene glycol modified G-CSF,the preparation and use thereof))；US 8507221(用于使用GCSF作為融合配偶體表達關注的多肽的方法(Process for the expression of peptides of interest using GCSF as a fusion partner))；US 8058398(修飾的G-CSF多肽(Modified G-CSF polypeptide))；US 7655766(包含PEG化G-CSF的位置異構(gòu)體的組合物(Compositions comprising positional isomers of PEGylated G-CSF))；和US 7402304(使用G-CSF類似物組合物的方法(Methods of using G-CSF analog compositions))中，這些專利都如同充分闡述一般以引用方式整體并入。

試劑盒是包括本發(fā)明組合物中的至少一種的材料或組分的集合。因此，在一些實施方案中，試劑盒含有包括如上文所述的與治療劑復合的藥物遞送分子的組合物。

本發(fā)明試劑盒中配置的組分的準確性質(zhì)取決于試劑盒的預定目的。在一個實施方案中，試劑盒被特定配置來實現(xiàn)治療哺乳動物受試者的目的。在另一個實施方案中，試劑盒被特定配置來實現(xiàn)治療人受試者的目的。在其它實施方案中，試劑盒被配置用于治療諸如但不限于、農(nóng)畜、家畜和實驗室動物的受試者的獸醫(yī)學應用。

使用說明書可包括在試劑盒中?！笆褂谜f明書”通常包括描述在使用試劑盒的組分來實現(xiàn)所需結(jié)果時采用的技術的明確表述。任選地，試劑盒也含有其他可用組分，諸如稀釋劑、緩沖劑、藥學上可接受的載體、注射器、導管、施用器、吸移或測量工具、綁扎材料或如將易于由本領域技術人員認識到的其他可用附件。

可向從業(yè)者提供在試劑盒中組裝的以保持材料或組分的可操作性和效用的任何便利和適合方式儲存的材料或組分。例如，組分可呈溶解、脫水或凍干的形式；它們可提供在室溫、冷藏溫度或冷凍溫度下。組分通常包含于合適的包裝材料中。如本文所用，短語“包裝材料”是指一種或多種用于容納試劑盒的內(nèi)容物(諸如本發(fā)明組合物等)的物理結(jié)構(gòu)。包裝材料是通過熟知方法構(gòu)造的，優(yōu)選提供無菌、無污染物的環(huán)境。如本文所用，術語“包裝”是指諸如玻璃、塑料、紙、箔等能夠容納個別試劑盒組分的合適的固體基質(zhì)或材料。因此，例如，包裝可為用于含有適量的如本文所述的組合物的的玻璃小瓶。包裝材料一般具有指示試劑盒和/或其組分的內(nèi)容物和/或目的的外部標簽。

在一些實施方案中，需要本文所述的方法、組合物和試劑盒的受試者是由(包括但不限于)影響骨髓的藥物(諸如癌癥藥物、抗精神病藥物、抗驚厥藥物)、影響骨髓的遺傳和/或先天性病癥、患者進行放射治療、維生素B12缺乏、葉酸缺乏或其組合所引起的白細胞產(chǎn)生減少的受試者。

在另外實施方案中，需要本文所述的方法、組合物和試劑盒的受試者是由于(包括但不限于)急性細菌感染、自身免疫病癥(諸如系統(tǒng)性紅斑狼瘡)、使用磺胺藥物或其組合所引起的白細胞損傷、破壞和/或其量減少的受試者。

在另外實施方案中，需要本文所述的方法、組合物和試劑盒的受試者是由于(包括但不限于)血液透析、瘧疾、細菌感染或其組合而經(jīng)歷白細胞(諸如中性粒細胞)的隔離和/或遷移的受試者。

在各種實施方案中，本文所述的方法、組合物和試劑盒可結(jié)合其他治療包括但不限于化療和/或放射治療來使用?；熀?或放射治療常常減少白細胞的數(shù)量，導致中性粒細胞減少癥。與化療和/或放射治療一起同時或順序地應用本發(fā)明的方法、組合物和試劑盒可以預防中性粒細胞減少癥、抑制中性粒細胞減少癥和/或減輕中性粒細胞減少癥的嚴重程度。類似地，與抗驚厥藥物和/或抗精神病藥物一起同時或順序地應用本發(fā)明的方法、組合物和試劑盒可以預防由所述藥物的使用引起的中性粒細胞減少癥、抑制這種中性粒細胞減少癥和/或減輕這種中性粒細胞減少癥的嚴重程度。此外，與用于治療微生物感染(例如，細菌感染、真菌感染、病毒感染和寄生蟲感染)和/或自身免疫疾病或放射誘導的中性粒細胞減少癥的治療劑一起同時或順序地應用本發(fā)明的方法、組合物和試劑盒，可以預防中性粒細胞減少癥、抑制中性粒細胞減少癥和/或減輕中性粒細胞減少癥的嚴重程度，所述中性粒細胞減少癥可由于微生物感染和/或自身免疫疾病和/或由于可用于治療微生物感染和/或自身免疫疾病的治療劑而發(fā)生。

用于估計治療功效的方法

如本文所述，與GCSF組合使用低于推薦劑量的Am80，中性粒細胞減少癥小鼠的感染相關的死亡率相比于單獨Am80或GCSF顯著減小。此外，在正常和惡性造血前體中與GCSF組合的Am80治療增加了反應性氧物質(zhì)(ROS)產(chǎn)生，反應性氧物質(zhì)產(chǎn)生是對抗微生物感染的基本中性粒細胞功能?；卺槍毦腥竞驼婢腥镜闹行粤＜毎麣⑽⑸锕δ?，ROS產(chǎn)生生物測定可用于估計本文所述的組合治療方法的功效。當前的中性粒細胞減少癥治療的臨床終點包括中性粒細胞計數(shù)和發(fā)熱性中性粒細胞減少癥的發(fā)生率，這兩種均不提供中性粒細胞的對抗微生物的能力的信息。ROS產(chǎn)生生物測定允許基于響應于細菌刺激或真菌刺激的中性粒細胞ROS產(chǎn)生的參考值監(jiān)測中性粒細胞殺微生物活性。中性粒細胞ROS產(chǎn)生的此類確立的基線值傳遞了迅速的功能臨床終點，對于辨別作為GCSF的附加治療的Am80的最佳給藥和安排表。

因此，本文提供用于確定有需要的受試者體內(nèi)的治療功效的方法。所述方法包括：提供來自受試者的樣本，其中受試者已施用了有效量的類視色素激動劑和有效量的G-CSF；測定反應性氧物質(zhì)(ROS)的產(chǎn)生水平；以及如果ROS產(chǎn)生高于參考樣本的ROS產(chǎn)生，那么確定治療是有效的，或如果ROS產(chǎn)生與參考樣本相同或相對于參考樣本較低，那么確定治療是無效的。在一些實施方案中，如果治療被認為是無效的，那么可增加Am80或GCSF或兩者的劑量。

在一些實施方案中，待評估功效的受試者正經(jīng)歷化療治療或已經(jīng)歷了化療治療(利用或不利用GCSF。在一些實施方案中，待評估功效的受試者正經(jīng)歷中性粒細胞減少癥的治療或已經(jīng)歷了中性粒細胞減少癥的治療。

在一個實施方案中，樣本是血液、外周血、骨髓細胞、血漿、組織或其組合。在各種實施方案中，樣本是在中性粒細胞減少癥的治療之前、期間或之后獲得的。在示例性實施方案中，ROS產(chǎn)生可如以下中所述進行測定：Babior,Blood 1999,第93卷,第1464頁；Dahlgren等人,J Immunol Methods,1999,第232卷,第3頁；Weiss,Acta Physiol Scand Suppl,1986,第548卷,第9頁；Charles等人,Infect Immun,2008,第76卷,第2439頁；Wei等人,J Biomed Opt,2010,第15卷,第027006頁。在一些實施方案中，ROS使用模擬細菌感染和真菌感染的刺激物來測量，例如fMLP、PMA、ZAS或其組合。

在本文所述方法的各種實施方案中，參考值是基于反應性氧物質(zhì)(ROS)的產(chǎn)生的量或水平。在一個實施方案中，參考值是基于健康供體的骨髓細胞中的ROS產(chǎn)生。在另一個實施方案中，參考值是基于健康供體的外周血單核細胞中的ROS產(chǎn)生。在一個額外的實施方案中，參考值是基于患有或過去患有急性骨髓性白血病的受試者的健康骨髓細胞中的ROS產(chǎn)生。在一個另外的實施方案中，參考值是基于患有或過去患有急性骨髓性白血病的受試者的健康外周血細胞中的ROS產(chǎn)生。(其他細胞類型如何？有沒有任何更廣泛的實施方案？)可用于測定參考值的其他細胞類型對于本領域技術人員而言將是顯而易見的。在額外的實施方案中，參考值是根據(jù)不同的(例如，較早的)時間點從受試者獲得的樣本中ROS產(chǎn)生的量/水平，時間點諸如在診斷中性粒細胞減少癥期間，在治療中性粒細胞減少癥之前、在治療中性粒細胞減少癥之后或其組合。

在各種實施方案中，相比于參考值，受試者(例如，正在治療中性粒細胞減少癥的受試者)中ROS產(chǎn)生的量/水平增加了至少或約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在各種實施方案中，相比于參考值，受試者(例如，正在治療中性粒細胞減少癥的受試者)中ROS產(chǎn)生的量/水平增加了至少或約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍或其組合。

實施例

僅出于說明目的提供以下實施例，并且不旨在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

實施例1：Am80的選擇性活性所誘導的髓細胞生成性擴增對比于髓細胞生成性分化

Am80-GCSF對于成熟中性粒細胞的再生以減少暴露于細菌的中性粒細胞減少癥小鼠的死亡率的協(xié)同效應的機制是什么？細胞特異性轉(zhuǎn)錄模式可通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子來改變，轉(zhuǎn)錄因子是細胞命運的主要調(diào)節(jié)子。全反式視黃酸(ATRA或RA)具有與兩類轉(zhuǎn)錄因子視黃酸受體(RARα、-β、-γ)和類視色素X受體(RXRα、-β、-γ)結(jié)合和其反式激活的高親和力。先前的研究示出，RA通過RARγ激活增強了HSC自我更新，同時通過RARα激活促進了定向骨髓性祖細胞的分化。RA的此類全作用(pan-action)發(fā)揮出對通過在各種正常和腫瘤組織中激活RARα、-β、-γ亞型來抑制增殖同時促進分化的有力的效應。相反，Am80是一種類視色素激動劑，其被設計來選擇性地結(jié)合RARα而不是RARγ，因此在治療APL患者中避免了由RA激活的RARγ所誘導的副作用。我們證明了，Am80促進了適度的骨髓性擴增，同時顯著地增強了抵抗細菌感染的中性粒細胞的分化，其與大大增強骨髓性擴增然而無法誘導有效的中性粒細胞分化的G-CSF相反。對于在持續(xù)的細菌感染的存在下顯著減小中性粒細胞減少癥小鼠的死亡率來說，組合的Am80-GCSF治療顯著大于Am80，此發(fā)現(xiàn)表明，盡管Am80選擇性激活RARα可得到有效的中性粒細胞分化，但是Am80介導的適度的骨髓性擴增無法滿足在持續(xù)的細菌感染與中性粒細胞減少癥同時發(fā)生的情況下對于足夠數(shù)目的成熟中性粒細胞的需要。這些發(fā)現(xiàn)指示使用組合的Am80-GSCF來充分平衡骨髓性擴增和中性粒細胞分化兩者，從而克服由治療癌癥化療誘導的中性粒細胞減少癥的當前G-CSF治療引起的無效性的需要。

實施例2：調(diào)節(jié)Am80-G-CSF的協(xié)同效應的信號傳導途徑

RARα是細胞周期蛋白依賴性激酶-激活激酶(CAK)復合物的底物，這種復合物由CDK7、細胞周期蛋白H和MAT1蛋白組成。CAK存在于細胞中，作為通過磷酸化激活不同CDK來調(diào)控細胞周期進展的游離CAK，或作為TFIIH復合物的激酶亞基，在TFIIH復合物中CAK通過磷酸化RNA聚合酶II C末端結(jié)構(gòu)域(RNA PII)來介導轉(zhuǎn)錄。值得注意的是，游離CAK或含有TFIIH的CAK磷酸化RARα以抑制粒細胞分化(圖1)，而通過固有程序化的或RA介導的MAT1蛋白片段化所介導的RARα的CAK磷酸化的降低通過RA靶基因的RARα-依賴性轉(zhuǎn)錄誘導了粒細胞分化(圖2)。我們最近發(fā)現(xiàn)，Am80效應是由其通過抑制RARα的CAK磷酸化來選擇性激活RARα轉(zhuǎn)錄因子以誘導RA靶基因的選擇性表達引起的。Am80誘導的髓細胞生成性擴增是RA靶基因的改變的轉(zhuǎn)錄表達模式的基礎，如通過細胞周期抑制劑p21^Cip/Kip的水平降低，但是中性粒細胞效應子CD18、次級顆粒LL-37和骨髓特異性轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強子結(jié)合蛋白ε(C/EBPε)的表達增加所示。RA靶基因的這種Am80誘導的選擇性表達不同于RA刺激，并且與正常或惡性造血前體中的中性粒細胞殺菌功能的有效出現(xiàn)、顯著的MAT1片段化、RARα磷酸化降低和反應性氧物質(zhì)(ROS)的產(chǎn)生顯著較高相關聯(lián)，如相比于G-CSF或RA。這些數(shù)據(jù)表明，通過控制粒細胞生成的轉(zhuǎn)錄響應的類視色素介導的CAK-RARα信號傳導途徑，Am80與RARα的選擇性結(jié)合誘導了協(xié)調(diào)適度的髓細胞生成性擴增和有效的中性粒細胞分化的新型轉(zhuǎn)錄響應(圖3)?；谶@些研究連同我們發(fā)現(xiàn)Am80-GCSF組合顯著減小中性粒細胞減少癥小鼠的死亡率，同時不希望受特定理論的束縛，我們認為，Am80-GCSF組合的協(xié)同效應可依賴于介導CAK-RARα作用模式，其交叉調(diào)控髓細胞生成前體的最佳擴增和中性粒細胞的有效終末分化兩者，從而導致感染和感染誘導的死亡率減小。我們的研究提供克服了使用Am80或GCSF的單一方案治療癌癥化療誘導的中性粒細胞減少癥患者的缺陷的有效治療。

實施例3：由癌癥化療藥物誘導的中性粒細胞減少癥和中性粒細胞恢復

如Ding等人(Blood，2013年第121卷第996頁)、Trillet-Lenoir等人(Eur J Cancer，1993年第29A(3)卷第319頁)、Lalami等人(Ann Oncol，2006年第17(3)卷第507頁)和Abdul Rasool Hassan等人(Asian Pac J Cancer Prev，2011年第12(6)卷第1425頁)所示，癌癥化療可用于誘導中性粒細胞減少癥。由癌癥化療誘導的嚴重中性粒細胞減少癥的中值持續(xù)時間在人中為3-6天(ANC<0.5x10⁹/L)并且在小鼠中為2-3天，而GCSF可通過增加中性粒細胞數(shù)目來縮短人和小鼠兩者中的中性粒細胞減少癥持續(xù)時間(圖4)。我們的研究將2/3的小鼠中性粒細胞減少癥期間劃分為中性粒細胞減少(沒有方案可在人或小鼠中預防中性粒細胞的減少)和中性粒細胞恢復(BM功能仍受抑制)階段(圖4，右圖)，在此期間微生物感染的風險顯著增加。中性粒細胞減少癥的整個周期涵蓋了中性粒細胞減少癥誘導階段、中性粒細胞減少癥減少階段、中性粒細胞減少癥恢復階段和中性粒細胞恢復到正常階段(圖4，右圖)。測試了在忍受連續(xù)的菌血癥疾患的小鼠中性粒細胞減少癥的整個周期中Am80-GCSF組合對減小中性粒細胞減少癥小鼠的死亡率的效應。

實施例4：人等效低劑量和中等劑量的Am80和Am80-GCSF組合在中性粒細胞減少階段有效促進中性粒細胞的恢復

為了評估體內(nèi)Am80效應，我們首先測試了不同的人等效高劑量、中等劑量和低劑量的Am80和GCSF(圖5a)在中性粒細胞減少癥小鼠體內(nèi)對再生成熟中性粒細胞的半最大有效濃度(EC₅₀)。用單一劑量的環(huán)磷酰胺(CPA)注射正常的C57BL6/J小鼠以減少小鼠中性粒細胞。在CPA注射后4小時，用媒介物、Am80、GCSF或Am80-GCSF治療小鼠連續(xù)3天，之后將小鼠處死(圖5b)?？瞻仔∈蟮耐庵苎?PB)的菲柯爾(Ficoll)分離示出，成熟中性粒細胞被分選到下層(圖5c)。相比于所有其他治療，低劑量和中等劑量的Am80或Am80-GCSF示出較好的維持中性粒細胞水平的EC₅₀效應(圖5d，右圖)，同時低劑量的Am80和Am80-GCSF對粒細胞形態(tài)分化的增強比中等劑量的Am80和Am80-GCSF對粒細胞形態(tài)分化的增強好(圖5e)。此外，骨髓(BM)細胞的多密度珀可(Percoll)分離指示，空白小鼠的成熟BM中性粒細胞被分選到第3層(圖5f)。值得注意的是，盡管中等劑量的GCSF誘導第3層BM細胞的最高恢復(圖5g，右圖)，但是這些細胞的分化低于低劑量的Am80-GCSF誘導的細胞，如通過粒細胞形態(tài)分析所示(圖5h，上圖對比下圖)。總之，這些結(jié)果表明，低劑量和中等劑量的Am80和Am80-GCSF可在小鼠中性粒細胞減少癥的早期階段維持適度水平的PB和BM中性粒細胞兩者。*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.005。數(shù)據(jù)代表具有類似結(jié)果的2個獨立實驗。

實施例5：在中性粒細胞減少階段的中性粒細胞減少癥小鼠中中等劑量的Am80誘導的中性粒細胞表現(xiàn)出大于G-CSF或Am80-GCSF誘導的那些中性粒細胞的殺菌活性

圖6A實驗設計。將C57BL/6J小鼠(n＝19)隨機分成5組(對照組3只并且每個實驗組4只)。在第0天通過IP注射CPA來誘導小鼠中性粒細胞減少癥。在CPA注射4小時之后，向小鼠每天一次給予不同的方案，其中Am80通過口服，或GCSF通過SC，或媒介物通過口服。在第2天經(jīng)由尾靜脈注射用6.3x10⁶CFU的金黃色葡萄球菌(S.aureus)攻擊小鼠。在注射3小時之后，從尾巴采集各100μl血液，用于分析中性粒細胞的初始殺菌活性。在注射后16小時處死小鼠，由此獲得PB和心臟。(圖6B)PB中WBC和中性粒細胞的Vetscan分析。除了空白小鼠之外，在所有其他組中未觀察到中性粒細胞誘導(圖6C-E)。通過使用活的細胞外細菌的血液瓊脂分析來測定在PB中注射后3小時(圖6C)和16小時(圖6D)以及在心臟中(圖E)中性粒細胞的殺菌活性。因為中性粒細胞誘導未通過在GCSF或Am80或Am80-GCSF小鼠中的細菌感染來促成，所以其指示Am80小鼠中顯著增加的中性粒細胞殺菌活性是由于在小鼠中性粒細胞減少癥的早期發(fā)展階段Am80促進的現(xiàn)有粒細胞前體向成熟中性粒細胞的分化所導致的。*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.005。A+G：Am80-GCSF。

實施例6：在中性粒細胞減少階段在添加Am80-GCSF組的情況下較低劑量的使用

將小鼠(C57BL6/J)隨機分成5組(對照組3只并且每個實驗組4只，n＝19只小鼠)。將C57BL/6J小鼠(n＝19)隨機分成5組(對照組3只并且每個實驗組4只)。誘導小鼠中性粒細胞減少癥和治療的程序與中值劑量測試相同(參見幻燈片6)。在第2天經(jīng)由尾靜脈注射用6.3x10⁶CFU的金黃色葡萄球菌攻擊小鼠。在注射3小時之后，從尾巴采集各100μl血液，用于測定中性粒細胞的初始殺菌活性。在第3天處死小鼠，由此獲得PB和脾。(圖7A)。執(zhí)行PB中WBC和中性粒細胞的Vetscan分析(圖7B)。除了空白小鼠之外，在所有其他組中未觀察到中性粒細胞誘導(圖7C-E)。使用活的細胞外細菌的血液瓊脂分析測定在PB中注射后3小時(圖C)和16小時(圖D)以及在脾中(圖E)中性粒細胞的殺菌活性。因為中性粒細胞誘導未通過在GCSF或Am80或Am80-GCSF小鼠中的細菌感染來促成，所以其指示Am80小鼠中顯著增加的中性粒細胞殺菌活性是由于在小鼠中性粒細胞減少癥的早期發(fā)展階段Am80促進的現(xiàn)有粒細胞前體向成熟中性粒細胞的分化所導致的。*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.005。在中性粒細胞減少癥小鼠中在預防階段由較低劑量的Am80誘導的中性粒細胞表現(xiàn)出大于G-CSF或Am80+GCSF誘導的那些中性粒細胞的殺菌活性。

實施例7：在中性粒細胞恢復階段在添加Am80-GCSF組的情況下較低劑量的使用

將小鼠(C57BL6/J)隨機分成5組(對照組3只并且每個實驗組4只，n＝19只小鼠)。如所示(圖8a)，在CPA注射后2天，向小鼠給予方案(200mg/kg)。在連續(xù)的3天治療之后，用金黃色葡萄球菌攻擊小鼠至多16小時，之后進行安樂死。我們發(fā)現(xiàn)，在細菌感染之后所有組中外周血(PB)中性粒細胞顯著增加(圖8b)。將注射后3小時和16小時所采集的PB用于分析中性粒細胞殺菌活性。獨立殺死(Independent killing)測定示出，Am80-GCSF組合而不是單獨Am80誘導的中性粒細胞殺死顯著更多的細菌(圖8c)。通過估計中性粒細胞產(chǎn)生，我們發(fā)現(xiàn)相比于GCSF或Am80-GCSF，Am80在BM和PB中誘導最少數(shù)目的中性粒細胞(圖8d、8e)。盡管相比于Am80-GCSF，GCSF在BM中誘導的中性粒細胞顯著更多而在PB中誘導的中性粒細胞量類似(圖8d、8e；下圖)，但是GCSF誘導的中性粒細胞相比于Am80-GCSF誘導的那些中性粒細胞表現(xiàn)出顯著低的殺菌活性(圖8c)。此外，Am80-GCSF組合誘導的中性粒細胞表現(xiàn)出較好的粒細胞形態(tài)分化(圖8d、8e；左圖)。這些結(jié)果指示，在當BM功能仍受抑制時的中性粒細胞恢復期間，僅較少數(shù)目的粒細胞前體可用于通過Am80分化成成熟中性粒細胞，而大量由GCSF誘導的中性粒細胞在細菌殺死中是有缺陷的。然而，在低劑量的Am80-GCSF治療的情況下，Am80可有效地將GCSF再生的粒細胞前體分化成對抗微生物感染的成熟中性粒細胞。P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.005。

實施例8：使用較低劑量的Am80-GCSF組合顯著減小忍受連續(xù)菌血癥的中性粒細胞減少癥小鼠的感染相關的死亡率

如果Am80可確實將GCSF再生的大量的粒細胞前體分化成對抗感染的成熟中性粒細胞，那么Am80-GCSF組合應在癌癥化療誘導的中性粒細胞減少癥中有效地減小感染相關的死亡率。我們通過使用中性粒細胞減少癥小鼠測試了這種假設，這些小鼠在整個中性粒細胞減少癥期間經(jīng)歷菌血癥。如所示(圖9A)，在CPA注射后4小時向小鼠給予不同方案持續(xù)至多第8天。在第3天執(zhí)行金黃色葡萄球菌感染，并且在第9天計算存活率。利用3個獨立的實驗，我們確定，Am80-GCSF比單獨GCSF或Am80使存活率增加顯著更高(圖9B-D)。為了評估存活的小鼠中再生的中性粒細胞的殺菌能力，在第11天用金黃色葡萄球菌對存活的空白小鼠和Am80-GCSF小鼠進行進一步感染持續(xù)15分鐘，之后進行安樂死。利用吉姆薩染色和革蘭氏染色進行的新鮮分離的PB的平行分析測定了感染小鼠中對比于不含菌血癥的未感染小鼠中的中性粒細胞吞噬作用(圖9E)。因為GCSF通常在化療藥物后≥24小時提供到CCIN，所以我們進一步測試了CPA后24小時低劑量和中等劑量的Am80-GCSF治療，如所示(圖9F、9J)，其中每個劑量進行兩次獨立實驗。低劑量測試的結(jié)果示出，GCSF組僅具有12.5％存活率，同時在空白組或Am80-GCSF組中未觀察到死亡(圖9g-i)。然而，在中等劑量測試中，Am80-GCF(55.6％)組與GCSF(11.1％)組之間的存活率不具有統(tǒng)計學差異(圖9K-M)?？偠灾?，這些存活的小鼠模型證明，低劑量的Am80-GCSF減小中性粒細胞減少癥小鼠的感染相關的死亡率。

實施例9：CD34+細胞中Am80和RA的效應

蛋白質(zhì)印跡示出了CD34+細胞中MAT1片段化(其指示了粒細胞分化)(圖10A)和視黃酸受體(RARα)低磷酸化(即RARα的磷酸化降低，其指示促進粒細胞分化)(圖10B)由Am80的漸進式誘導。與全反式視黃酸(ATRA或RA)相反，Am80誘導了新型基因轉(zhuǎn)錄模式。在Am80施用之后觀察到了C/EBPε、CD18和顆粒LL-37的顯著上調(diào)以及p21Cip/Kip mRNA水平的降低(圖10C)。

實施例10：白血病細胞和CD34+細胞中的方案效應

Am80-GCSF抑制NB4細胞增殖(圖11A)，同時顯著促進粒細胞分化(圖11B)和在甲?；?甲硫氨酰基-亮氨?；?苯丙氨酸(f-Met-Leu-Phe；fMLP)存在下(圖11C)或在PMA存在下(圖11D)第6天的ROS產(chǎn)生。*，至少P<0.04。G-CSF無法在fMLP或PMA存在下誘導NB4細胞中的ROS產(chǎn)生。

Am80-GCSF類似于GCSF誘導髓細胞生成擴增，同時促進相比于Am80或GCSF顯著更大的中性粒細胞分化(圖12A、12B)，以及相比于單獨Am80或GCSF，在fMLP存在下(圖12C)或在PMA存在下(圖12D)顯著更高的第5天的ROS產(chǎn)生。*，至少P<0.02。

實施例11：在Am80或GCSF或ATRA治療之后的AML患者胚細胞

對急性骨髓白血病患者的PB初級胚細胞的增殖進行測定(圖13A)并且定量P<0.05(圖13B)。對AML PB初級胚細胞的粒細胞形態(tài)進行分析(圖13C)并且定量；Am80對比于G-CSF，P<4.0E-8；Am80對比于對照，P<6.02E-7(圖13D)。

在第8天對急性骨髓白血病患者的BM初級胚細胞的增殖進行測定(圖13E)并且定量，Am80對比于G-CSF，P<0.008；G-CSF對比于對照，P<0.032(圖13F)。對AML BM初級胚細胞的粒細胞形態(tài)進行分析(圖13G)并且定量；Am80對比于G-CSF，P<9.9E-4；Am80對比于RA，P<1.0E-4(圖13H)。在AML BM初級胚細胞中G-CSF誘導了較高的生長速率(圖13I)，并且對細胞增殖進行定量；G-CSF對比于對照，P<0.018(圖13J)。這些數(shù)據(jù)表明，G-CSF治療相比于用Am80或ATRA治療促進了非APL(急性早幼粒細胞白血病)AML患者胚細胞的生長。

實施例12：Am80-GCSF促進外周血單核細胞和骨髓(BM)細胞中的ROS產(chǎn)生

將單核細胞的上層從三種正常人供體的PB分離，并且用低劑量的Am80、GCSF或Am80-GCSF培養(yǎng)于粒細胞譜系培養(yǎng)基中至多4天(圖14A、B)。在每種供體中，Am80-GCSF誘導的中性粒細胞相比于單獨Am80或GCSF表現(xiàn)出在fMLP存在下(圖14C)或在PMA存在下(圖14D)顯著更高的ROS產(chǎn)生水平。Am80-GCSF顯著促進從正常人供體分離的外周血單核細胞中的ROS產(chǎn)生。

將從急性骨髓白血病(AML)患者新鮮分離的骨髓(BM)細胞或外周血(PB)單核細胞培養(yǎng)于粒細胞譜系誘導培養(yǎng)基中，并且在第3天進行計數(shù)(圖15A(i)、15B(i)和15C(i))。測定在fMLP存在下(圖15A(ii)、15B(ii)和15C(ii))或在PMA存在下(圖15A(iii)、15B(iii)和15C(iii))的ROS產(chǎn)生。Am80-GCSF相比于單獨Am80或GCSF促進了顯著更大的ROS產(chǎn)生。

上文所述的各種方法和技術提供若干實現(xiàn)本申請的途徑。當然，應理解根據(jù)本文所述的任何特定實施方案并非必定可以實現(xiàn)所述的所有目標或優(yōu)勢。因此，例如，本領域技術人員將認識到，所述方法可以以實現(xiàn)或最優(yōu)化如本文中教導的一個優(yōu)勢或一組優(yōu)勢的方式進行，而不一定必定實現(xiàn)如本文中教導或指出的其他目標或優(yōu)勢。本文中提到多種替代方案。應理解，一些優(yōu)選實施方案專門地包括一個、另一個或幾個特征，而其他的實施方案專門地排除一個、另一個或幾個特征，而又一些其他的實施方案通過包括一個、另一個或幾個有利的特征而弱化特定的特征。

此外，本領域技術人員將認識到來自不同實施方案的各種特征的適用性。類似地，本領域的普通技術人員可以以各種組合使用上文所討論的各種元素、特征和步驟以及各個這樣的元素、特征或步驟的其他已知等同物來執(zhí)行根據(jù)本文所述的原理的方法。在不同的實施方案中，所述各種元素、特征和步驟中的一些將被專門地包括而其他的則被專門地排除。

雖然已經(jīng)在某些實施方案和實施例的上下文中公開了本申請，但是本領域技術人員將理解，本申請的實施方案將專門公開的實施方案擴展到其他替代實施方案和/或用途以及其修改和等同物。

本文中描述了本申請的優(yōu)選實施方案，包括發(fā)明人已知的實現(xiàn)本申請的最佳方式。通過閱讀上述描述，那些優(yōu)選實施方案的變化對普通技術人員而言將變得顯而易見。預計本領域技術人員可以適當?shù)厥褂眠@些變化，并且可以用本文中特定描述的其他方式實踐本申請。因此，經(jīng)適用的法律許可，本申請的許多實施方案包括在此附加的權利要求中敘述的標的物的所有修改和等同物。此外，除非另外在文中指出或明顯與上下文矛盾，否則本申請涵蓋所有可能的變化的上述元素的任何組合。

本文中提及的所有專利、專利申請、專利申請公布和其他材料(諸如論文、書籍、說明書、出版物、記錄、事物和/或類似的東西)均在此通過引用的方式全部并入本文以達到所有目的，與上述文件相關的任何起訴文檔記錄、與本文件不一致或沖突的任何上述文件或?qū)t早與本文件相關的權利要求書的廣泛范圍有限定作用的任何上述文件除外。舉例來說，如果任何并入材料相關的與本文件相關的描述、定義和/或術語使用之間有任何不一致或沖突，那么本文件中的描述、定義和/或術語使用應該優(yōu)先。

應理解本文中公開的本申請的實施方案是本申請的實施方案的原理的說明。可以使用的其他修改可以在本申請的范圍內(nèi)。因此，舉例來說，但不限制，可以根據(jù)本文中的教導使用本申請的實施方案的替代構(gòu)造。因此，本申請的實施方案不嚴格限于如圖所示和所述的實施方案。

以上在詳細描述中描述本發(fā)明的各種實施方案。盡管這些描述直接描述以上實施方案，但應了解本領域技術人員可設想本文所示以及所述的特定實施方案的修改和/或變化。屬于本描述的范圍內(nèi)的任何此類修改或變化都也意圖包括在本描述中。除非明確指示，否則發(fā)明人意圖說明書和權利要求書中的用詞和短語被給予對于適用領域中的普通技術人員而言普通并且慣常的含義。

已遞呈在提交本申請時為申請人所知的本發(fā)明的各種實施方案的上文描述，并且所述上文描述旨在出于說明和描述的目的。本描述并非旨在窮舉，也不是將本發(fā)明限制于公開的精確形式，并且根據(jù)上文教導，許多修改和變化為可能的。所述實施方案用于解釋本發(fā)明的原理和本發(fā)明的實際應用，并且用于使本領域其他技術人員能夠以各種實施方案且在如適于涵蓋的特定用途的各種修改下利用本發(fā)明。因此，意圖本發(fā)明不限于所公開的用于實現(xiàn)本發(fā)明的特定實施方案。

盡管已示出并且描述本發(fā)明的特定實施方案，但本領域技術人員將顯而易知的是，基于本文中的教導，可在不脫離本發(fā)明和其更廣泛方面的情況下進行改變和修改，并且因此隨附權利要求將在其范圍內(nèi)涵蓋如在本發(fā)明的真實精神和范圍內(nèi)的所有所述改變和修改。