本發(fā)明涉及一種功能性納米凝膠探針及其制備方法，具體是一種磁共振熒光雙顯影功能性納米凝膠探針及其制備方法,屬于生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
納米凝膠的粒徑小，有較大的比表面積，很強的吸附性和生物活性，且穩(wěn)定性良好，易于在肝臟和淋巴系統(tǒng)匯聚而具有靶向性。納米凝膠容易通過細胞膜進入細胞，可以實現(xiàn)藥物和DNA、RNA等的輸送，并可保護藥物及所載物質(zhì)，提高運送效率和生物利用度，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。因此，對功能性納米凝膠載體在生物體內(nèi)的運行軌跡、藥物釋放部位、釋放方式、治療效果等進行精確的監(jiān)測具有十分重要的意義。
然而，由于生物組織對光的高散射和高吸收的制約，傳統(tǒng)的光學(xué)成像技術(shù)已難以達到要求。近紅外熒光探針具有較大的組織穿透距離，且在650-1000nm的波段范圍內(nèi)生物組織的自發(fā)熒光干擾較為微弱，使得在一定深度的組織內(nèi)可獲得較好的近紅外熒光信號，提高細胞顯影的準(zhǔn)確性，且相比傳統(tǒng)熒光探針，可降低對生物組織造成的光損傷。文獻(Zhou S,Min X，Dou H,et al.Facile fabrication of dextran-based fluorescent nanogels as potential glucose sensors[J].Chemical Communications,2013,49:9473-9475)公開了一種熒光探針的制備方法，在氮氣保護下，依次加入引發(fā)劑、單體、交聯(lián)劑后透析得到納米凝膠，最后加入3HF-AM熒光分子制備成熒光顯影探針。但是近紅外顯影的顯示分辨率低。
MRI顯影是另外一類廣泛應(yīng)用的生物醫(yī)學(xué)顯影方式，文獻(Darras V,Nelea M,Winnik F M,et al.Chitosan modified with gadolinium diethylenetriaminepenta acetic acid for magnetic resonance imaging of DNA/chitosan nanoparticles[J].Carbohydrate Polymers,2010,80(4):1137-1146.)公開了一種制備磁共振顯影探針的方法，通過在納米粒子中加入螯合有釓離子的DTPA的方法，將核磁顯影試劑連接至殼聚糖納米粒子之上形成磁共振顯影探針。磁共振顯影雖然能夠提供高分辨的組織信息以及三維成像結(jié)構(gòu)，但是其靈敏度和靶向性較差，在臨床應(yīng)用中受到限制。
現(xiàn)有探針都只具備單功能顯影能力，無法同時實現(xiàn)兩種顯影方式，因此無法積聚兩種顯影方式的優(yōu)勢于一身。若將兩者結(jié)合，制備兼具近紅外光和MRI雙顯影性能的顯影探針，則可實現(xiàn)磁共振顯影的高分辨率與光學(xué)顯影形成良好的互補，對于疾病的準(zhǔn)確診斷無疑具有重要意義。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何實現(xiàn)具備近紅外光和MRI雙顯影能力的探針。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了磁共振熒光雙顯影探針及其制備方法。
技術(shù)方案一:
一種磁共振熒光雙顯影功能化納米凝膠的制備方法，包括以下步驟：
步驟1：將納米凝膠與核磁顯影分子偶聯(lián)；生成磁共振顯影化納米凝膠；
步驟2：將步驟1生成的磁共振顯影化納米凝膠與熒光分子偶聯(lián)，生成磁共振熒光雙顯影功能化納米凝膠。
進一步，所述核磁顯影分子為螯合有釓離子的DTPA或DOTA分子。
進一步，所述熒光分子為甲基菁染料Cy3、Cy5、Cy5.5或Cy7。
進一步，所述納米凝膠以多糖為基體,由對還原性物質(zhì)或弱酸性環(huán)境具有響應(yīng)性的交聯(lián)劑交聯(lián)而成；其制備方法包括以下步驟：
步驟N1：在隔絕空氣的條件下，將多糖基體充分溶解后，加入引發(fā)劑，所述引發(fā)劑為可在多糖上引發(fā)自由基的化合物；
步驟N2：在多糖基體反應(yīng)15-30分鐘后，加入疏水性單體和對還原性物質(zhì)或弱酸性環(huán)境敏感的交聯(lián)劑進一步反應(yīng)；
更進一步，所述多糖基體為葡聚糖、殼聚糖、羧甲基殼聚糖、羧甲基葡聚糖或二乙氨基葡聚糖。
更進一步，所述引發(fā)劑過氧化二苯甲酰、N，N-二甲苯基胺、過氧化十二酰、過硫酸銨或硝酸鈰銨。
更進一步，所述單體為丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸羥乙酯或丙烯酸丁酯。
更進一步，所述交聯(lián)劑為含有二硫鍵的化合物或N,N-亞甲基雙丙烯酰胺。
更進一步，還包括對所述磁共振熒光雙顯影功能化納米凝膠的透析處理步驟。
技術(shù)方案二：
一種磁共振熒光雙顯影功能化納米凝膠，根據(jù)技術(shù)方案一所述的制備方法制備而成。
技術(shù)方案三：
一種探針，所述探針的基體為磁共振熒光雙顯影功能化納米凝膠，根據(jù)技術(shù)方案一中所述的制備方法制備。
技術(shù)效果
本發(fā)明的有益效果在于：
1、本發(fā)明同步實現(xiàn)了紅外顯影和磁共振顯影，既具有磁共振顯影的高分辨性 又有熒光顯影的高靈敏性，兩者互為輔助，對研究探針在體內(nèi)的運行軌跡和其上負載藥物的作用機理有極大幫助，從而在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力。
2、本方法的基體同時對還原性及弱酸性環(huán)境具有響應(yīng)性，可在腫瘤環(huán)境中“解體”從而促進熒光和磁共振顯影信號的突變，在腫瘤的高靈敏度診斷中具有良好的應(yīng)用前景。
3、本發(fā)明合成方法簡單，成本低，且高效便捷。
以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明的構(gòu)思、具體結(jié)構(gòu)及產(chǎn)生的技術(shù)效果作進一步說明，以充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。
附圖說明
圖1是本發(fā)明的制備示意圖。
具體實施方式
實施例1：
一種磁共振熒光雙顯影探針的制備方法，包括以下步驟：
步驟1：制備納米凝膠；包括以下步驟：
步驟N1：在隔絕空氣的條件下，將殼聚糖加入到一定量的醋酸溶液中，并于室溫下進行磁力攪拌24h，使充分溶解；取50mL的殼聚糖溶液加入三口燒瓶，氮氣保護，在30℃油浴下恒溫攪拌后，加入引發(fā)劑硝酸鈰銨；在多糖單體反應(yīng)15分鐘后，用微量進樣器加入單體丙烯酸甲酯0.640mL進行反應(yīng)；并加入對還原性物質(zhì)環(huán)境敏感的交聯(lián)劑DADS；并在在氮氣保護下繼續(xù)反應(yīng)4h；
步驟N2：將反應(yīng)后的凝膠進行透析，以去除其中的雜質(zhì)；
步驟2：將制備得到的納米凝膠與含有磁性粒子的核磁顯影分子偶聯(lián)；取15.0mg DTPA，溶于5mL的TEMED/HCL緩沖溶液中，加入14mg的EDC與6mg的NHS；待全部溶解后與殼聚糖凝膠混合，磁力攪拌72h后轉(zhuǎn)入透析袋透析；將6.9mg的無水氯化釓加入已偶聯(lián)有DTPA的凝膠，磁力攪拌12h后透析；
步驟3：將與所述磁性粒子偶聯(lián)的納米凝膠進一步偶聯(lián)熒光分子，使其具有熒光顯影的功能，得到功能化納米凝膠；取10mL步驟2的透析產(chǎn)物與Cy5.5-NHS酯以1:25的質(zhì)量比混合，在室溫下磁力攪拌24h；反應(yīng)后將凝膠透析，得到殼聚糖基雙顯影的功能化納米凝膠。
通過動態(tài)光散射在Malvern Zetasizer ZS90上進行表征，殼聚糖基雙顯影功能化納米凝膠的粒徑在206nm。
實施例2：
一種磁共振熒光雙顯影探針的制備方法，包括以下步驟：
步驟1：制備納米凝膠；包括以下步驟：
步驟N1：在隔絕空氣的條件下，羧甲基葡聚糖加入到一定量的去離子水中，加熱并進行磁力攪拌24h使充分溶解；取50mL的羧甲基葡聚糖溶液加入三口燒瓶，氮氣保護，在50℃油浴下恒溫攪拌后，加入引發(fā)劑過氧化二苯甲酰；在多糖單體反應(yīng)30分鐘后，用微量進樣器加入單體甲基丙烯酸甲酯0.360mL進行反應(yīng)；并加入對還原性物質(zhì)敏感的交聯(lián)劑DADS；在氮氣保護下繼續(xù)反應(yīng)12h；
步驟N2：將反應(yīng)后的凝膠進行透析，以去除其中的雜質(zhì)；
步驟2：將制備得到的納米凝膠與含有磁性粒子的核磁顯影分子偶聯(lián)；取8.0mg DTPA，溶于5mL的TEMED/HCL緩沖溶液中，加入25.0mg的EDC與15.0mg的NHS；待全部溶解后與羧甲基葡聚糖凝膠混合，磁力攪拌72h后轉(zhuǎn)入透析袋透析；將4.2mg的無水氯化釓加入已偶聯(lián)有DTPA的凝膠，磁力攪拌12h后透析；
步驟3：將與所述磁性粒子偶聯(lián)的納米凝膠進一步偶聯(lián)熒光分子，使其具有熒光顯影的功能，得到功能化納米凝膠；避光攪拌條件下加入23.5mg的EDC與12.5mg的NHS，后加入含有Cy5熒光染料的DMSO溶液，反應(yīng)避光過夜，之后轉(zhuǎn)入透析袋透析，得到殼聚糖基雙顯影的功能化納米凝膠。
通過動態(tài)光散射在Malvern Zetasizer ZS90上進行表征，羧甲基葡聚糖基雙顯影功能化納米凝膠的粒徑在195nm。
實施例3：
一種磁共振熒光雙顯影探針的制備方法，包括以下步驟：
步驟1：制備納米凝膠；包括以下步驟：
步驟N1：將葡聚糖在加熱及磁力攪拌的情況溶于去離子水配置成一定濃度的葡聚糖溶液。取25mL的葡聚糖溶液加入三口燒瓶，氮氣保護，在50℃油浴下恒溫攪拌后，加入引發(fā)劑N，N-二甲苯基胺；反應(yīng)30分鐘后，用加入0.275mL丙烯酸羥乙酯單體反應(yīng)；并加入N,N-亞甲基雙丙烯酰胺進行交聯(lián)；在氮氣保護下繼續(xù)反應(yīng)6h；
步驟N2：將反應(yīng)后的凝膠進行透析，以去除其中的雜質(zhì)；
步驟2：將制備得到的納米凝膠與含有磁性粒子的核磁顯影分子偶聯(lián)；取42mg DOTA，溶于20mL的TEMED/HCL緩沖溶液中，加入32.5mg的EDC與20.6mg的NHS；待全部溶解后與葡聚糖凝膠混合，磁力攪拌72h后轉(zhuǎn)入透析袋透析；將5.6mg的無水氯化釓加入已偶聯(lián)有DOTA的凝膠，磁力攪拌18h后透析；
步驟3：將與所述磁性粒子偶聯(lián)的納米凝膠進一步偶聯(lián)熒光分子，使其具有熒光顯影的功能，得到功能化納米凝膠；避光攪拌條件下加入24.5mg的EDC與13.0mg的NHS，后加入含有Cy7熒光染料的DMSO溶液，反應(yīng)避光48h，之后轉(zhuǎn)入透析袋透析，得到葡聚糖基雙顯影的功能化納米凝膠。
實施例4：
一種磁共振熒光雙顯影探針的制備方法，包括以下步驟：
步驟1：制備納米凝膠；包括以下步驟：
步驟N1：羧甲基殼聚糖溶于去離子水配置成羧甲基葡聚糖溶液，并于室溫下進行磁力攪拌24h，使充分溶解。取30mL的羧甲基殼聚糖溶液加入三口燒瓶，氮氣保護，在30℃油浴下恒溫攪拌后，加入引發(fā)劑過硫酸銨；反應(yīng)15分鐘后，加入0.540mL的單體丙烯酸甲酯進行反應(yīng)；并加入N,N-亞甲基雙丙烯酰胺進行交聯(lián)；在氮氣保護下繼續(xù)反應(yīng)12h
步驟N2：將反應(yīng)后的凝膠進行透析，以去除其中的雜質(zhì)；
步驟2：將制備得到的納米凝膠與含有磁性粒子的核磁顯影分子偶聯(lián)；取3.3mg DTPA，溶于3mL的TEMED/HCL緩沖溶液中，加入12.3mg的EDC與6.2mg的NHS；待全部溶解后與羧甲基殼聚糖凝膠混合，磁力攪拌72h后轉(zhuǎn)入透析袋透析；將4.5mg的無水氯化釓加入已偶聯(lián)有DTPA的凝膠，磁力攪拌12h后透析；
步驟3：將與所述磁性粒子偶聯(lián)的納米凝膠進一步偶聯(lián)熒光分子，使其具有熒光顯影的功能，得到功能化納米凝膠；取20mL所述步驟2的透析產(chǎn)物與Cy3-NHS酯以1:30的質(zhì)量比混合，在室溫下磁力攪拌24h。反應(yīng)后將凝膠透析，得到羧甲基殼聚糖基雙顯影的功能化納米凝膠。
實施例5：
一種磁共振熒光雙顯影探針的制備方法，包括以下步驟：
步驟1：制備納米凝膠；包括以下步驟：
步驟N1：將二乙氨基葡聚糖加入到一定量的去離子水中，加熱并進行磁力攪拌24h，使充分溶解。取50mL的二乙氨基葡聚糖溶液加入三口燒瓶，氮氣保護，在50℃油浴下恒溫攪拌后，加入引發(fā)劑過氧化十二酰；反應(yīng)30分鐘后，加入0.660mL單體丙烯酸丁酯進行反應(yīng)；并加入溶于DMSO的DADS進行交聯(lián)，在氮氣保護下繼續(xù)反應(yīng)24h；
步驟N2：將反應(yīng)后的凝膠進行透析，以去除其中的雜質(zhì)；
步驟2：將制備得到的納米凝膠與含有磁性粒子的核磁顯影分子偶聯(lián)；取12.0mg DTPA，溶于10mL的TEMED/HCL緩沖溶液中，加入42.2mg的EDC與24.5mg的NHS；待全部溶解后與二乙氨基葡聚糖混合，磁力攪拌72h后轉(zhuǎn)入透析袋透析；將8.8mg的無水氯化釓加入已偶聯(lián)有DTPA的凝膠，磁力攪拌18h后透析；
步驟3：將與所述磁性粒子偶聯(lián)的納米凝膠進一步偶聯(lián)熒光分子，使其具有熒光顯影的功能，得到功能化納米凝膠；避光攪拌條件下加入20.1mg的EDC與11.6mg的NHS，后加入含有Cy5.5熒光染料的DMSO溶液，反應(yīng)避光過夜，之后轉(zhuǎn)入透析袋透析，得到殼聚糖基雙顯影的功能化納米凝膠。
實施例6：
一種磁共振熒光雙顯影功能化納米凝膠，根據(jù)實施例1-5中任一所述的制備方法制備而成。
實施例7：
一種探針，所述探針的基體為磁共振熒光雙顯影納米凝膠，根據(jù)實施例1-5中任一所述的制備方法制備而成。
本發(fā)明使用的多糖基體在自然界中廣泛易得、其生物相容性好，對人體無毒無害，且具有可降解，其上多有羥基或氨基等官能團，容易進行化學(xué)改性，有很好的應(yīng)用前景，備受研究者青睞。
以上詳細描述了本發(fā)明的較佳具體實施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無需創(chuàng)造性勞動就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護范圍內(nèi)。