NBP158及其用途的制作方法

糖尿病的流行病學(xué)、病理生理學(xué)和治療

糖尿病(Diabetic Mellitus，DM)是以由胰島素之產(chǎn)生、胰島素之作用或這二者的缺陷引起的高水平血糖為標(biāo)志的一組疾病。DM可導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥和過(guò)早死亡。2010年，DM在美國(guó)影響2580萬(wàn)各年齡的人，包括1880萬(wàn)人已被診斷且700萬(wàn)人尚未被診斷。基于空腹血糖水平或血紅蛋白A1C水平，65歲以上成年人中的50％患有前驅(qū)糖尿病(prediabetes)。DM是腎衰、非創(chuàng)傷性下肢截肢和新發(fā)成人失明(blindness)病例的首要原因，是心臟病和卒中(stroke)的主要原因，并且是美國(guó)第七位的致死原因。

1型DM或胰島素依賴型糖尿病(insulin-dependent diabetes mellitus，IDDM)在患者的免疫系統(tǒng)破壞胰腺細(xì)胞(產(chǎn)生胰島素的唯一細(xì)胞)時(shí)發(fā)生。2型DM或非胰島素依賴型糖尿病(non-insulin-dependent diabetes mellitus，IDDM)始于胰島素抵抗(其中細(xì)胞不適當(dāng)?shù)厥褂靡葝u素的疾病)。隨著對(duì)胰島素之需求的提高，胰腺逐漸喪失其產(chǎn)生胰島素的能力。妊娠糖尿病是在妊娠期間診斷出的葡萄糖不耐受(glucose intolerance)形式。其他類型的DM由特定遺傳病癥、外科手術(shù)、用藥、感染、胰腺疾病等疾病引起。

目前的針對(duì)DM的治療和處理包括患者教育、自我護(hù)理練習(xí)、飲食、胰島素和降低血糖水平的口服用藥?；加?型DM的患者必須接受胰島素注射。對(duì)于2型DM，通過(guò)血糖控制、血壓控制、血脂控制預(yù)防并發(fā)癥，以及對(duì)眼、足和腎的預(yù)防性護(hù)理是非常重要的。對(duì)于早期2型DM患者，健康的飲食計(jì)劃和鍛煉計(jì)劃、降低過(guò)重體重和口服用藥可使其血糖水平處于控制之下。但是對(duì)于晚期2型DM患者，口服用藥和胰島素二者是必需的。高劑量的胰島素抑制胰腺產(chǎn)生內(nèi)源性胰島素，且這可能不降低血糖水平，因?yàn)樵谠S多患有2型DM的患者中存在胰島素抵抗。

病理生理學(xué)研究顯示，提高的胰島素抵抗和不充足的胰島素分泌是2型糖尿中高血糖狀態(tài)的主要基礎(chǔ)原因。胰島素抵抗在診斷前通常已經(jīng)存在，表現(xiàn)為抑制的肝中響應(yīng)于胰島素的葡萄糖產(chǎn)生和降低的對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)到肌肉和脂肪組織中的刺激。然而，只要β細(xì)胞分泌較高量的胰島素，正常血糖可以維持。最終，胰島素水平由于降低的β細(xì)胞數(shù)量及其降低的分泌能力而降低。

血糖控制的總體目標(biāo)是使長(zhǎng)期并發(fā)癥盡最小化，同時(shí)避免嚴(yán)重的低血糖事件。血糖控制的目標(biāo)是保持糖化血紅蛋白水平低于7.0％。目前可用的口服降糖藥包括改善胰島素敏感性的藥劑，例如二甲雙胍；噻唑烷二酮類(吡格列酮和羅格列酮)；提高循環(huán)胰島素水平的藥劑，例如磺酰脲類(例如，格列吡嗪、格列本脲等)；美格列奈類(例如，瑞格列奈、那格列奈)；GLP-1受體激動(dòng)劑(例如，艾塞那肽、利拉魯肽)，以及二肽基肽酶IV(Dipeptidyl peptidase IV，DPP-IV)抑制劑(例如，西格列汀、沙格列汀)；其他藥劑，例如α-葡糖苷酶抑制劑(例如，阿卡波糖、米格列醇)、膽汁酸螯合劑(例如，考來(lái)維侖)、多巴胺激動(dòng)劑(例如，溴隱亭)、胰淀素(amylin)模擬物(例如，普蘭林肽)。在臨床上顯著高血糖(血糖水平＞300mg/dl或16.7mmol/l；糖化血紅蛋白水平＞10％)的患者中，應(yīng)當(dāng)開始胰島素治療。低血糖和體重增長(zhǎng)是長(zhǎng)期使用胰島素的主要問(wèn)題。

總之，患有2型DM的患者中的血糖控制至關(guān)重要，然而，目前的口服和注射用藥遠(yuǎn)非最終的選擇。需要通過(guò)獨(dú)特機(jī)制起效的新降糖劑來(lái)更好地治療或者甚至治愈2型DM。

FGFBP3的生理學(xué)和生物化學(xué)

FGFBP3是FGF結(jié)合蛋白家族(FGFBP1、FGFBP2和FGFBP3)的成員。人FGFBP3前體(登錄號(hào)NP_689642、RefSeq NM_152429.4、CCDS ID7418.1)由圖1(SEQ ID NO：1)中的具有26個(gè)殘基長(zhǎng)度的信號(hào)肽(1-26位氨基酸)和232個(gè)殘基長(zhǎng)度的分泌肽(27-258位氨基酸)的258個(gè)氨基酸組成。編碼人FGFBP3的DNA可獲自從具有FGFBP3mRNA并以可檢出的水平表達(dá)它的許多組織(例如腦、結(jié)腸、肝、肺等)制備的cDNA文庫(kù)。

旁分泌/自分泌因子(例如FGF1和FGF2)由于高結(jié)合親和力³通過(guò)硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycan，HSPG)結(jié)合(sequester)至細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞表面。由于低結(jié)合親和力，內(nèi)分泌因子(例如FGF19、FGF21和FGF23)可在循環(huán)中經(jīng)過(guò)很長(zhǎng)距離。如果在沒有外源性FGF的情況下施用，F(xiàn)GFBP家族蛋白(FGFBP1、FGFBP2和FGFBP3)在體外或在體內(nèi)并不活化FGF信號(hào)傳送途徑。在外源性FGF存在下，F(xiàn)GFBP蛋白顯著增強(qiáng)FGF信號(hào)傳送。FGFBP3與旁分泌/自分泌FGF(例如FGF1和FGF2)或內(nèi)分泌FGF(例如FGF19、FGF21和FGF23)結(jié)合。由于FGF及其受體參與許多癌細(xì)胞系和原發(fā)腫瘤的增殖和進(jìn)展，F(xiàn)GFBP3作為長(zhǎng)期施用之藥物的一個(gè)主要問(wèn)題是促分裂可能性(mitogenic potential)。例如，F(xiàn)GFBP3以高親和力與FGF19結(jié)合，所述FGF19在骨骼肌中表達(dá)人FGF19的轉(zhuǎn)基因小鼠中誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的發(fā)生。最近，F(xiàn)GF19中和抗體已被用于在FGF19轉(zhuǎn)基因小鼠中預(yù)防部分地通過(guò)抑制β-聯(lián)蛋白(β-catenin)信號(hào)傳送介導(dǎo)的HCC發(fā)生，這進(jìn)一步確證了FGF19在HCC進(jìn)展中的作用。

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3(Fibroblast growth factor binding protein 3，F(xiàn)GFBP3)在體外還自身與肝素以高親和力結(jié)合，但在FGF2存在下，以低親和力結(jié)合。然而，F(xiàn)GFBP3與HSPG在體內(nèi)的結(jié)合親和力是未知的。最近的研究表明，F(xiàn)GFBP3可局部地和全身性地發(fā)揮功能作用。在雞胚中，發(fā)現(xiàn)FGFBP3通過(guò)活化旁分泌/自分泌FGF信號(hào)傳送來(lái)提高腦中的血管通透性；在基因敲除小鼠模型中，F(xiàn)GFBP3通過(guò)獨(dú)特的信號(hào)傳送途徑在焦慮相關(guān)行為的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。初步的表型數(shù)據(jù)還提供了在FGFBP3缺失(-/-)小鼠中瘦體重(lean body mass)降低的證據(jù)，這表明FGFBP3可以內(nèi)分泌的方式參與能量代謝(fuel metabolism)的調(diào)節(jié)。

發(fā)明概述

本項(xiàng)發(fā)明提供了新的治療性蛋白質(zhì)和新的用于治療代謝性疾病和病癥(包括糖尿病和肥胖癥)的方案。所述治療性蛋白質(zhì)包括分泌型(secreted)人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3(FGFBP3)和分泌型FGFBP3的N端158個(gè)氨基酸(NBP158)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了合成的核酸分子，其包含編碼人FGFBP3蛋白突變體(NBP158)的DNA。

在一方面中，所述合成的核酸分子包含與(a)編碼具有1至約184或27至約184位氨基酸殘基序列(包括圖1(SEQ ID NO：1))的人FGFBP3多肽N端158個(gè)氨基酸(NBP158)的DNA分子或(b)(a)的DNA分子的互補(bǔ)物(complement)具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA。

在另一方面中，本發(fā)明提供了包含編碼NBP158或其變體的DNA的載體。所述載體可包含上文中定義的任何合成的核酸分子。還提供了包含這樣的載體的宿主細(xì)胞。例如，所述宿主細(xì)胞可以是CHO細(xì)胞、大腸桿菌(E.coli)或者酵母。還提供了用于產(chǎn)生NBP158多肽的方法，包括在適于表達(dá)NBP158的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞并從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收NBP158。

在另一方面中，本發(fā)明提供了由上文中定義的任何合成的核酸序列編碼的重組NBP158多肽。NBP158多肽由具有與(a)1至約184或(b)27至約184位氨基酸殘基序列(包括圖1(SEQ ID NO：1))具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的肽組成。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物，其包含與可藥用載體組合的人FGFBP3多肽或者上文中所定義的人FGFBP3突變體多肽(NBP158)。在一方面中，所述組合物包含治療有效劑量的FGFBP3或NBP158。優(yōu)選地，所述組合物是無(wú)菌的。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了在哺乳動(dòng)物中治療糖尿病的方法，其包括腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下或肌內(nèi)將上文中所定義的藥物組合物全身性遞送到哺乳動(dòng)物中。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在哺乳動(dòng)物中治療肥胖癥的方法，其包括腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下或肌內(nèi)將上文中所定義的藥物組合物全身性遞送到哺乳動(dòng)物中。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于治療血脂異常和代謝性疾病并發(fā)癥的方法，其包括腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下或肌內(nèi)將上文中所定義的藥物組合物全身性遞送到哺乳動(dòng)物中。

附圖簡(jiǎn)述

圖1，人FGFBP3的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。

圖2，人FGFBP3蛋白(未標(biāo)記)在CHO細(xì)胞中的表達(dá)。A、B，來(lái)自轉(zhuǎn)染有人FGFBP3表達(dá)載體(72小時(shí))的CHO細(xì)胞的上清液中分泌型人FGFBP3(27-158位氨基酸)通過(guò)考馬斯藍(lán)(Coomassie Blue)染色示出(A)并且通過(guò)對(duì)FGFBP3的免疫印跡(immunoblotting，IB)檢測(cè)(B)。C，加載CHO細(xì)胞裂解物并進(jìn)行對(duì)FGFBP3的免疫印跡以檢測(cè)FGFBP3前體和分泌型FGFBP3肽二者。D，圖A中所指示的蛋白質(zhì)樣品通過(guò)質(zhì)譜法進(jìn)行分析，并且通過(guò)LC/MS鑒定分泌型人FGFBP3肽的100％序列(如下劃線所示)。

圖3，人BP3的合成的66個(gè)殘基長(zhǎng)度的C末端尾部(CBD66，SEQ ID NO：1的193-258位氨基酸)的氨基酸序列和二硫鍵橋。

圖4，F(xiàn)GFBP3處理對(duì)葡萄糖代謝的治療效果不依賴于FGF信號(hào)傳送。A，單次FGFBP3處理后2小時(shí)后，空腹血糖水平下降，并且葡萄糖耐量在15、30、60和120分鐘時(shí)示出顯著的改善(n＝5)。B，用CBD 66單次處理后2小時(shí)后，在ob/ob小鼠中葡萄糖代謝未改善(n＝5)。C，選擇性FGFR抑制劑PD173074無(wú)法阻斷FGFBP3的治療效果(n＝5，p＜0.001)。(＊＊，p＜0.01；＊＊＊，p＜0.001)。D，F(xiàn)GFBP3在HepG2細(xì)胞中未活化Erk1/2信號(hào)傳送。符號(hào)(＊＊和＊＊＊)表示FGFBP3處理之前(基線)和之后血漿葡萄糖水平的顯著差異。

圖5，通過(guò)氫/氘交換進(jìn)行的分泌型人FGFBP3構(gòu)象分析。FGFBP3不依賴于FGF21信號(hào)傳送地改善葡萄糖耐量。(A、B)分泌型FGFBP3和CBD66的氘?dāng)z取。Y軸對(duì)應(yīng)于整合到肽中的氘的實(shí)際量；并且X軸代表FGFBP3肽片段的氨基酸序列(-25-0，信號(hào)肽序列；1-232分泌型FGFBP3蛋白序列；167-232，C端66個(gè)氨基酸，CBD66)。無(wú)FGF21時(shí)FGFBP3(A)或CBD66(B)的氘?dāng)z取(----)與有FGF21時(shí)的氘?dāng)z取(----)進(jìn)行比較。最顯著的區(qū)別由黑框圖出。(C、D)在肝素不存在下的FGFBP3(C)或CBD66(D)的氘?dāng)z取(----)與肝素存在下的氘?dāng)z取(----)進(jìn)行比較。最顯著的區(qū)別以示出。

圖6，人FGFBP3突變體蛋白(NBP158)在CHO細(xì)胞中的表達(dá)。A，在轉(zhuǎn)染有突變體FGFBP3表達(dá)載體的CHO細(xì)胞的條件化培養(yǎng)基中的分泌型人FGFBP3的N端158個(gè)氨基酸(NBP158，SEQ ID NO：1的27-184位氨基酸)通過(guò)考馬斯藍(lán)染色顯示(A)。B，圖A中所指示的蛋白質(zhì)級(jí)分(fraction)通過(guò)質(zhì)譜分析進(jìn)行分析，并且通過(guò)LC/MS鑒定NBP158的100％序列(如下劃線所示)。

圖7，單次NBP158處理對(duì)ob/ob小鼠中葡萄糖代謝的時(shí)間過(guò)程。A，單次NBP158注射后2小時(shí)，葡萄糖耐量在處理之前和之后在60和90分鐘時(shí)明顯改善(n＝6)。B，單次NBP158處理后24小時(shí)，空腹血糖沒有降低，但是在30和60分鐘時(shí)示出顯著差異(n＝6)。C，單次NBP158處理之后48小時(shí)，在120分鐘時(shí)示出顯著差異(n＝6)(＊，p＜0.05；＊＊，p＜0.01；＊＊＊，p＜0.001)。D，單次NBP158處理之后2小時(shí)(n＝8)、24小時(shí)(n＝6)和48小時(shí)(n＝5)ob/ob小鼠中葡萄糖代謝的改善。(＊，p＜0.05；＊＊，p＜0.01；＊＊＊，p＜0.001)。符號(hào)(＊、＊＊和＊＊＊)表明NBP158處理之前(基線)和之后血漿葡萄糖水平的顯著差異。

圖8，單次NBP158處理對(duì)ob/ob小鼠中葡萄糖代謝的劑量響應(yīng)。A-C，空腹血糖水平降低，并且葡萄糖耐量在15、30、60和120分鐘時(shí)示出顯著改善(n＝6)(A)，并且更大的作用見于0.5mg/kg(n＝6)(B)和1mg/kg(n＝6)(C)。D，腹膜內(nèi)注射0.1mg/kg(n＝6)、0.5mg/kg(n＝6)或1.0mg/kg(n＝6)NBP158之后DIO小鼠中空腹血糖水平的降低和葡萄糖耐量的改善。(＊，p＜0.05；＊＊，p＜0.01；＊＊＊，p＜0.001)。

圖9，單次NBP158處理對(duì)飲食誘導(dǎo)的肥胖癥(DIO)小鼠中葡萄糖代謝的急性效應(yīng)。A，NBP158單次處理后2小時(shí)，空腹血糖水平降低且葡萄糖耐量在15、30、60、120和180分鐘時(shí)示出顯著改善(n＝6)。B，腹腔內(nèi)注射NBP158后，DIO小鼠中葡萄糖代謝的改善(n＝6)。(＊，p＜0.05；＊＊，p＜0.01；＊＊＊，p＜0.001)。

圖10，用NBP-158單次處理后飲食誘導(dǎo)的肥胖癥(DIO)小鼠的體重改變。A，DIO小鼠(15-20周齡)用NBP158(n＝5)或CBD66(n＝5)處理。單次處理1周后，將小鼠稱重，并將體重的改變?cè)谶@些組之間進(jìn)行比較。在CBD66處理組中，體重提高了(1.9±0.6克/只動(dòng)物)；在NBP158處理組，體重降低了(2.1±0.7克/只動(dòng)物)。(p＜0.05)。

發(fā)明詳述

本發(fā)明提供了用于治療代謝性疾病和病癥(例如糖尿病(DM)和肥胖癥)的組合物和方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明使用FGFBP3蛋白或FGFBP3突變體蛋白(包括人FGFBP3和NBP158)以實(shí)現(xiàn)對(duì)DM的治療益處。本發(fā)明提供了新的多肽、核酸分子、載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明提供了使用新的多肽來(lái)降低空腹血糖并且改善DM中葡萄糖糖耐量的方法。本發(fā)明還提供了治療糖尿病和肥胖癥的最佳劑量、持續(xù)時(shí)間和施用途徑。1.定義

本文中使用的術(shù)語(yǔ)“NBP158多肽”、“NBP158蛋白”和“NBP158”包括與SEQ ID NO：1的27至184或者1至184位殘基的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽。所述NBP158可通過(guò)重組和/或合成的方法來(lái)制備。

“NBP158突變體”意指任何非天然序列NBP158多肽，其為有活性的NBP158，如以下所定義，與圖1(SEQ ID NO：1)中所示具有推導(dǎo)出的氨基酸序列的FGFBP3多肽的27至184或者1至184位氨基酸序列具有至少約80％氨基酸序列同一性。這樣的FGFBP3突變體包括例如NBP158多肽，其中在圖1(SEQ ID NO：1)的27至184或者1至184位殘基序列的N端或C端以及在一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)部結(jié)構(gòu)域內(nèi)添加或缺失一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基。

“天然序列FGFBP3”包含與從自然界得到的FGFBP3具有相同氨基酸序列的多肽。這樣的天然序列FGFBP3可以從自然界分離或者通過(guò)重組和/或合成的方式產(chǎn)生。術(shù)語(yǔ)“天然序列FGFBP3”特別地包括FGFBP3的天然的截?cái)嗷蛘叻置谛问?例如，細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域序列)、天然變體形式(例如，選擇性剪接形式)和天然等位基因變體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，天然序列FGFBP3是成熟的或全長(zhǎng)的天然序列FGFBP3，其包含圖1(SEQ ID NO：1)的27至258(或者1至258)位氨基酸。

術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用，是指由通過(guò)肽鍵連接的單鏈氨基酸殘基構(gòu)成的化合物。多肽或蛋白質(zhì)可以(但不需要)包含非天然氨基酸和氨基酸衍生物?？杀徊迦氲降鞍踪|(zhì)或多肽(包括本文中公開的嵌合多肽)中的非天然氨基酸的非限制性實(shí)例列表包括：氨基酸、高氨基酸(homoamino acid)、環(huán)狀氨基酸和具有衍生化側(cè)鏈的氨基酸。實(shí)例包括(L型或D型；縮寫在括號(hào)內(nèi))：對(duì)乙酰基苯丙氨酸、對(duì)疊氮基苯丙氨酸、對(duì)溴代苯丙氨酸、對(duì)碘代苯丙氨酸和對(duì)乙炔基苯丙氨酸、瓜氨酸(Cit)、高瓜氨酸(hCit)、Na-甲基瓜氨酸(NMeCit)、Na-甲基高瓜氨酸(Na-MeHoCit)、鳥氨酸(Om)、Na-甲基鳥氨酸(Na-MeOrn或NMeOrn)、肌氨酸(Sar)、高賴氨酸(hLys或hK)、高精氨酸(hArg或hR)、高谷氨酰胺(hQ)、Na-甲基精氨酸(NMeR)、Na-甲基亮氨酸(Na-MeL或NMeL)、N-甲基高賴氨酸(NMeHoK)、Na-甲基谷氨酰胺(NMeQ)、正亮氨酸(Nle)、正纈氨酸(Nva)、1，2，3，4-四氫異喹啉(Tic)、八氫吲哚-2-羧酸(Oic)、3-(1-萘基)丙氨酸(1-Nai)、3-(2-萘基)丙氨酸(2-Nai)、1，2，3，4-四氫異喹啉(Tic)、2-茚滿基甘氨酸(Igi)、對(duì)碘代苯丙氨酸(pi-Phe)、對(duì)氨基苯丙氨酸(4AmP或4-Amino-Phe)、4-胍基苯丙氨酸(Guf)、甘氨酰賴氨酸(縮寫為″K(NE-glycyl)″或″K(glycyl)″或″K(gly)″)、硝基苯丙氨酸(nitrophe)、氨基苯丙氨酸(aminophe或Amino-Phe)、芐基苯丙氨酸(benzylphe)、γ-羧基谷氨酸(γ-carboxyglu)、羥脯氨酸(hydroxypro)、對(duì)羧基苯丙氨酸(Cpa)、a-氨基已二酸(Aad)、Na-甲基纈氨酸(NMeVal)、N-a-甲基亮氨酸(NMeLeu)、Na-甲基正亮氨酸(NMeNle)、環(huán)戊基甘氨酸(Cpg)、環(huán)己基甘氨酸(Chg)、乙?；彼?acetylarg)、α二氨基丙酸(Dpr)、α，γ-二氨基丁酸(Dab)、二氨基丙酸(Dap)、環(huán)己基丙氨酸(Cha)、4-甲基苯丙氨酸(MePhe)、二苯基丙氨酸(Bi-PhA)、氨基丁酸(Abu)、4-苯基苯丙氨酸(或聯(lián)苯丙氨酸；4Bip)、α-氨基異丁酸(Aib)、β-丙氨酸、β-氨基丙酸、哌啶酸、氨基己酸、氨基庚酸、氨基庚二酸、鎖鏈素(desmosine)、二氨基庚二酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羥基賴氨酸、異羥基賴氨酸、異鎖鏈素、別異亮氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基異亮氨酸、N-甲基纈氨酸、4-羥基脯氨酸(Hyp)、γ-羧基谷氨酸、e-N,N,N-三甲基賴氨酸、E-N-乙?；嚢彼?、0-磷酸絲氨酸、N-乙?；z氨酸、N-甲?；琢虬彼帷?-甲基組氨酸、5-羥基賴氨酸、w-甲基精氨酸、4-氨基-0-鄰苯二甲酸(4APA)，以及其他相似的氨基酸，以及特別地列出的這些中任一種的衍生化形式。

與NBP158序列相關(guān)的“氨基酸序列同一性百分比(％)”在本文中定義為，在序列比對(duì)并引入空位(如果必需的話)以實(shí)現(xiàn)最大百分比序列同一性之后(并且不考慮任何保守替換作為序列同一性的一部分)，候選序列中與NBP158序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基百分比。本文中使用的％同一性值通過(guò)獲自[NCBI，http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi]的DELTA-BLAST生成。DELTA-BLAST使用數(shù)個(gè)搜索參數(shù)，大多數(shù)設(shè)定為缺省值?？烧{(diào)整的參數(shù)設(shè)定為以下值：重疊跨度＝1，重疊分?jǐn)?shù)＝0.125，單詞閾值(T)＝11。HSP S和HSP S2參數(shù)為動(dòng)態(tài)值，并且由程序本身根據(jù)特定序列的構(gòu)成和搜索目標(biāo)序列的特定數(shù)據(jù)庫(kù)的組成來(lái)設(shè)定；然而，可對(duì)值進(jìn)行調(diào)整以提高敏感性。％氨基酸序列同一性值通過(guò)匹配的相同殘基數(shù)目除以比對(duì)區(qū)域中“較長(zhǎng)”序列的殘基總數(shù)來(lái)確定。所述“較長(zhǎng)”序列是在比對(duì)區(qū)域中具有最多實(shí)際殘基的序列(忽略通過(guò)DELTA-BLAST引入以使比對(duì)得分最大化的空位)。

以類似的方式，與本文中鑒定的NBP158多肽的編碼序列相關(guān)的“百分比(％)核酸序列同一性”定義為候選序列中的核苷酸殘基與NBP158編碼序列中的核苷酸殘基相同的核苷酸殘基的百分比。本文中使用的同一性值通過(guò)設(shè)定為缺省參數(shù)的BLASTN生成，其中重疊跨度和重疊分?jǐn)?shù)分別設(shè)定為1和0.125。

當(dāng)用于描述本文中公開的多種多肽時(shí)，“分離的”意指已從其天然環(huán)境的組分中鑒定并分離和/或回收的多肽。天然環(huán)境的污染組分是通常會(huì)干擾所述多肽的診斷或治療用途的物質(zhì)，并且可包括酶、激素和其他蛋白質(zhì)性或非蛋白質(zhì)性溶質(zhì)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽將被純化至(1)通過(guò)使用轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀(spinning cup sequenator)足以獲得至少15個(gè)N端或中間的氨基酸序列的程度，或者(2)通過(guò)使用考馬斯藍(lán)(或優(yōu)選銀)染色的在非還原性或還原性條件下的SDS-PAGE的均一性。分離的多肽包括在重組細(xì)胞內(nèi)的原位多肽，因?yàn)镕GFBP3天然環(huán)境中的至少一種組分將不存在。然而，分離的多肽通常將通過(guò)至少一個(gè)純化步驟制備。

編碼FGFBP3多肽的“分離的”核酸分子是從在FGFBP3編碼核酸的天然來(lái)源中通常與其相關(guān)的至少一種污染核酸分子鑒定和分離的核酸分子。分離的FGFBP3編碼核酸分子與其見于自然界中的形式或背景不同。因此，分離的FGFBP3編碼核酸分子與天然細(xì)胞中存在的FGFBP3編碼核酸分子不同。然而，分離的編碼FGFBP3多肽的核酸分子包括包含在通常表達(dá)FGFBP3的細(xì)胞(其中，例如，所述核酸分子處于與天然細(xì)胞不同的染色體位置)中的FGFBP3編碼核酸分子。

本文中所用的術(shù)語(yǔ)“載體”用于指用于向宿主細(xì)胞傳遞編碼信息的任何分子(例如，核酸、質(zhì)?；虿《?。

本文中所用的術(shù)語(yǔ)“載體”是指適用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的載體，并且含有指導(dǎo)和/或控制所插入的異源核酸序列之表達(dá)的核酸序列。表達(dá)包括但不限于例如轉(zhuǎn)錄、翻譯和RNA剪接(如果存在內(nèi)含子的話)的過(guò)程。

術(shù)語(yǔ)“控制序列”是指在特定的宿主生物中表達(dá)可操縱地連接的編碼序列所必需的DNA序列。例如，適用于原核生物的控制序列包括啟動(dòng)子、任選地操縱子序列、以及核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞使用啟動(dòng)子、多聚腺苷酸化信號(hào)和增強(qiáng)子。

當(dāng)核酸與另一核酸序列產(chǎn)生功能關(guān)聯(lián)時(shí)，核酸被“可操縱地連接”。例如，如果前序列(presequence)或分泌前導(dǎo)序列的DNA作為參與多肽分泌的前體蛋白(preprotein)表達(dá)，則所述前序列或分泌前導(dǎo)序列的DNA與所述多肽的DNA可操縱地連接；如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響序列的轉(zhuǎn)錄，則所述啟動(dòng)子或增強(qiáng)子與編碼序列可操縱地連接；或者核糖體結(jié)合位點(diǎn)如果處在便于翻譯的位置，則所述核糖體結(jié)合位點(diǎn)與編碼序列可操縱地連接。一般而言，“可操縱地連接”意味著被連接的DNA序列是鄰近的，并且在分泌前導(dǎo)序列的情況下，是鄰近的且在同一閱讀框(reading phase)內(nèi)。然而，增強(qiáng)子不一定必須是鄰近的序列。連接通過(guò)在方便的限制性酶切位點(diǎn)的連接來(lái)完成。如果這樣的位點(diǎn)不存在，根據(jù)常規(guī)實(shí)踐使用合成的寡核苷酸銜接子(adaptor)或接頭(linker)。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“表位標(biāo)記的”是指嵌合多肽，其包含與“標(biāo)記多肽(tag polypeptide)”融合的NBP158多肽。適合的標(biāo)記多肽一般具有至少6個(gè)氨基酸殘基，并且通常為約8至50個(gè)氨基酸殘基(優(yōu)選地，約10至20個(gè)氨基酸殘基)。

本文中使用的術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”用于指已經(jīng)被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，或者能夠用核酸序列轉(zhuǎn)化并且然后能夠表達(dá)選定的目的基因。該術(shù)語(yǔ)包括親代細(xì)胞的后代，不論所述后代與原親代在形態(tài)上或在基因構(gòu)成上是否相同，只要所述選定的基因存在即可。

“活性的”或“活性”對(duì)于本文中的目的而言是指保持重組或合成的NBP158的生物學(xué)和/或免疫學(xué)活性的NBP158形式。優(yōu)選地，活性是指促進(jìn)葡萄糖代謝或者降低體重的能力。

“生物學(xué)活性”在可通過(guò)動(dòng)物研究鑒定的蛋白質(zhì)或其他分子的情況下用于指這樣的蛋白或者其他分子改變體內(nèi)生理學(xué)參數(shù)(例如血糖、血壓、體溫、體重等)的能力。

“治療”是為了防止疾病的發(fā)生或者改變疾病的病理學(xué)而進(jìn)行的干預(yù)。因此，“治療”是指治療性治療和預(yù)防性或防止性措施。需要治療者包括已經(jīng)患病者和需要預(yù)防疾病發(fā)生者。在糖尿病治療中，治療劑可以直接降低空腹血糖水平或者改善糖耐量。

在本文中使用的術(shù)語(yǔ)“有效劑量”和“治療有效劑量”均指本文中公開的嵌合多肽的量，其用于支持NBP158或其突變體多肽的可觀察水平的一種或更多種生物活性，例如在人或非人對(duì)象中降低血糖、胰島素、甘油三酯或膽固醇水平，降體重，或改善葡萄糖耐量、能量消耗或胰島素敏感性的能力。

用于治療目的的“哺乳動(dòng)物”是指歸類為哺乳動(dòng)物的任何動(dòng)物，包括人、家養(yǎng)和農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物、以及動(dòng)物園飼養(yǎng)的動(dòng)物、用于體育的動(dòng)物或者寵物動(dòng)物，例如狗、馬、貓、牛等。優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物是人。

本文中使用的“載體”包括可藥用的載體、賦形劑或者穩(wěn)定劑，其在所使用的劑量和濃度下對(duì)暴露于它的細(xì)胞或哺乳動(dòng)物無(wú)毒。通常來(lái)說(shuō)，生理學(xué)上可接受的載體是水性pH緩沖溶液。生理學(xué)上可接受的載體包括：緩沖劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(小于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白、明膠或者免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖或其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖醇，例如甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，例如鈉離子；和/或非離子表面活性劑，例如TWEEN^TM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS^TM。

與一種或更多種另外的治療劑“組合”施用包括同時(shí)和以任何順序先后施用。

2.本發(fā)明的組合物

a.人FGFBP3分泌多肽之N端158個(gè)氨基酸殘基(NBP158)

本發(fā)明提供了合成的核苷酸序列，其編碼在本申請(qǐng)中稱為NBP158的多肽。特別地，已合成并優(yōu)化了編碼全長(zhǎng)FGFBP3多肽(SEQ ID NO：1)的1至184位氨基酸的cDNA，如在下文中的實(shí)施例中進(jìn)一步詳細(xì)公開的。這184個(gè)氨基酸的開放閱讀框被亞克隆到市售可得的載體中。NBP158作為沒有C端表位標(biāo)記的重組蛋白產(chǎn)生。未標(biāo)記的NBP158蛋白從經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中分泌出來(lái)，其編碼全長(zhǎng)FGFBP3多肽(SEQ ID NO：1)的27至184位氨基酸。

b.NBP158突變體多肽

除了本文中描述的NBP158多肽的全長(zhǎng)或分泌序列之外，還考慮可制備NBP158突變體?？梢酝ㄟ^(guò)向NBP158的DNA中引入合適的核苷酸改變，和/或通過(guò)合成期望的NBP158突變體多肽來(lái)制備NBP158突變體，如下文實(shí)施例中所述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，氨基酸的改變可以改變NBP158的翻譯后過(guò)程，例如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)目或位置或者改變磷酸化位點(diǎn)。

全長(zhǎng)序列NBP158中或者本文中所述的NBP158的多個(gè)結(jié)構(gòu)域中的變異可使用已提出的保守和非保守突變的技術(shù)和指導(dǎo)來(lái)完成。變異可以是一個(gè)或更多個(gè)編碼NBP158的密碼子的替換、缺失或插入，其導(dǎo)致與(SEQ ID NO：1)的1至約184或27至約184位氨基酸殘基相比NBP158氨基酸序列的改變。任選地，變異可以是在NBP158的一個(gè)或更多個(gè)結(jié)構(gòu)域中將至少一個(gè)氨基酸用任何其他氨基酸替換。在決定哪個(gè)氨基酸殘基可以被插入、替換或缺失而不不利地影響期望的活性的指導(dǎo)可通過(guò)對(duì)NBP158的序列與同源的已知蛋白質(zhì)分子進(jìn)行比較并將高同源性區(qū)域中進(jìn)行的氨基酸序列改變的數(shù)目最小化而找到。氨基酸替換可以是將一個(gè)氨基酸用具有相似結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)特性的另一個(gè)氨基酸替換的結(jié)果，例如用絲氨酸來(lái)替換亮氨酸，即保守型氨基酸替換。插入或缺失可任選地在1至5個(gè)氨基酸的范圍內(nèi)。允許的變異可通過(guò)在序列中系統(tǒng)地進(jìn)行氨基酸的插入、缺失或替換并且測(cè)試所得變體在體外測(cè)定中的活性來(lái)確定。

突變可使用本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行，例如寡核苷酸介導(dǎo)的(位點(diǎn)定向)誘變、丙氨酸掃描和PCR誘變?？蓪?duì)克隆的DNA進(jìn)行位點(diǎn)定向誘變、盒式誘變(cassette mutagenesis)、限制性選擇誘變或其他已知技術(shù)來(lái)產(chǎn)生NBP158突變體。也可采用DNA掃描氨基酸分析以沿連續(xù)的序列鑒定一個(gè)或更多個(gè)氨基酸。在優(yōu)選的掃描中，氨基酸相對(duì)較小，即中性氨基酸。這樣的氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸和半胱氨酸。丙氨酸通常是該組中優(yōu)選的掃描氨基酸，因?yàn)樗サ袅顺甩?碳之外的側(cè)鏈，且不太可能改變突變體的主鏈構(gòu)象。通常首選丙氨酸還因?yàn)樗亲畛Ｒ姷陌被?。此外，它?jīng)常存在于被包埋的和暴露的位置。如果丙氨酸替換不產(chǎn)生足夠數(shù)量的變體，可使用電子等排氨基酸(isosteric amino acid)。

c.多肽的表達(dá)和檢測(cè)

以下描述主要涉及通過(guò)培養(yǎng)用含有NBP158核酸的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生NBP158。當(dāng)然，考慮可使用本領(lǐng)域中公知的替代方法來(lái)制備NBP158。例如，NBP158序列或其一部分可以通過(guò)使用固相技術(shù)的直接肽合成產(chǎn)生。體外蛋白質(zhì)合成可使用手動(dòng)技術(shù)或通過(guò)自動(dòng)化來(lái)進(jìn)行。自動(dòng)合成可例如用Applied Biosystems肽合成儀(Foster City，Calif.)使用制造商的使用手冊(cè)來(lái)完成。NBP158的各部分可分別化學(xué)合成并使用化學(xué)或酶學(xué)方法組合以產(chǎn)生全長(zhǎng)的NBP158。

宿主細(xì)胞用本文中所述的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化用于產(chǎn)生NBP158，并將其在經(jīng)合適的修飾以用于誘導(dǎo)啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化子或者擴(kuò)增編碼期望序列之基因的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件(例如介質(zhì)、溫度、pH等)可由有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員無(wú)需過(guò)多實(shí)驗(yàn)而選擇。一般來(lái)說(shuō)，用于使細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)率最大化的原則、方法步驟和實(shí)際技術(shù)可見于Mammalian Cell Biotechnology：A Practical Approach，M.Butler，ed.(IRL Press，1991)和Sambrook et al.，(同上)。

轉(zhuǎn)染的方法是普通技術(shù)人員已知的，例如，CaPO4和電穿孔。根據(jù)所使用的宿主細(xì)胞，使用適于這樣的細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。采用氯化鈣的鈣處理(如Sambrook et al.，(同上)中所述)或電穿孔通常用于原核生物或包含堅(jiān)固細(xì)胞壁屏障的其他細(xì)胞。以土壤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)感染用于轉(zhuǎn)化某些植物細(xì)胞，如Shaw et al.，Gene，23：315，(1983)所述。對(duì)于沒有這樣的細(xì)胞壁的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，可使用Graham and Van Der Eb，Virology，52：456-457，(1978)的磷酸鈣沉淀法。已描述哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的一般方面。向酵母中轉(zhuǎn)化通常按照Van Solingen et al.，J.Bact.，130：946，(1977)和Hsiao et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，76：3829，(1979)的方法進(jìn)行。然而，也可使用用于將DNA引入到細(xì)胞中的其他方法，例如通過(guò)核顯微注射、電穿孔、細(xì)菌原生質(zhì)體與完整細(xì)胞融合、或聚陽(yáng)離子(例如聚凝胺(polybrene)、聚鳥氨酸(polyornithine))。對(duì)于用于轉(zhuǎn)化哺乳細(xì)胞的多種技術(shù)，參見Keown et al.，Methods in Enzymology,185：527-537(1990)和Mansour et al.，Nature，336：348-352(1988)。

本文中用于克隆或表達(dá)載體中的DNA的合適宿主細(xì)胞包括原核生物、酵母或高等真核細(xì)胞。合適的原核生物包括但不限于真細(xì)菌，例如革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性生物，例如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，例如大腸桿菌。多種大腸桿菌菌株是可公開獲得的，例如大腸桿菌K12菌株MM294(ATCC 31，446)；大腸桿菌X1776(ATCC 31，537)；大腸桿菌菌株W3110(ATCC 27，325)和K5772(ATCC 53，635)。除了原核生物，真核微生物(例如絲狀真菌或酵母)也是FGFBP3編碼載體的合適克隆或表達(dá)宿主。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是常用的低等真核宿主微生物。

用于表達(dá)糖基化NBP158的合適宿主細(xì)胞來(lái)自于多細(xì)胞生物。無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞的實(shí)例包括昆蟲細(xì)胞(例如果蠅S2和夜蛾Sf9)，以及植物細(xì)胞?？捎玫牟溉閯?dòng)物宿主細(xì)胞系的實(shí)例包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞和COS細(xì)胞。更具體的實(shí)例包括：以SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CVI系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚腎系(293或亞克隆用于在懸浮培養(yǎng)中生長(zhǎng)的293細(xì)胞，Graham et al.，J.Gen Viral.，36：59(1977))；中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞/-DHFR；小鼠睪丸支持細(xì)胞(TM4)；人肺細(xì)胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝細(xì)胞(Hep G2，HB 8065)；以及小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞(MMT060562，ATCC CCL51)。合適宿主細(xì)胞的選擇被認(rèn)為是本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)。

編碼NBP158的核酸(例如，cDNA或基因組DNA)可以插入到用于克隆(DNA的擴(kuò)增)或用于表達(dá)的可復(fù)制載體。多種載體是可公開獲得的。所述載體可以是例如質(zhì)粒、黏粒、病毒顆?；蚴删w的形式。合適的核酸序列可以通過(guò)多種方法插入到載體中。一般來(lái)說(shuō)，使用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)將DNA插入到適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點(diǎn)。載體構(gòu)件通常包括但不限于：一個(gè)或更多個(gè)信號(hào)序列、復(fù)制起點(diǎn)、一個(gè)或更多個(gè)標(biāo)記基因、增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列。含有這些構(gòu)件中的一種或更多種的合適載體的構(gòu)建采用技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)。

NBP158不僅可以直接重組產(chǎn)生，也可作為與異源多肽的融合多肽重組產(chǎn)生，所述異源多肽可以是信號(hào)序列或者在成熟蛋白質(zhì)或多肽的N端具有特異性切割位點(diǎn)的其他多肽。一般而言，信號(hào)序列可以是載體的構(gòu)件，或者它可以是插入到載體中的NBP158編碼DNA的一部分。所述信號(hào)序列可以是選定的原核信號(hào)序列，其例如選自堿性磷酸酶、青霉素酶、lpp或熱穩(wěn)定的腸毒素II前導(dǎo)序列。為了在酵母中分泌，所述信號(hào)序列可以是酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列、α因子前導(dǎo)序列(包括酵母屬和克魯維酵母屬α-因子前導(dǎo)序列)、或酸性磷酸酶前導(dǎo)序列、白色念珠菌(C.albicans)葡萄糖淀粉酶前導(dǎo)序列(1990年4月4日公布的EP 362,179)，或者在1990年11月15日公布的WO 90/13646中描述的信號(hào)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)中，哺乳動(dòng)物信號(hào)序列可以用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)的分泌，例如來(lái)自相同或相關(guān)物種的分泌型多肽的信號(hào)序列，以及病毒分泌前導(dǎo)序列。

表達(dá)載體和克隆載體都包含核酸序列，其使載體能夠在一種或更多種選擇的宿主細(xì)胞中復(fù)制。這樣的序列對(duì)于多種細(xì)菌、酵母和病毒是公知的。來(lái)自質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點(diǎn)適用于大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌，2fA質(zhì)粒起點(diǎn)適用于酵母，且多種病毒起點(diǎn)(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的克隆載體。

表達(dá)載體和克隆載體將通常包含選擇基因，也稱為選擇標(biāo)志。典型的選擇基因編碼這樣的蛋白質(zhì)，其(a)賦予對(duì)抗生素或其他毒素(例如氨芐青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四環(huán)素)的抗性；(b)補(bǔ)足營(yíng)養(yǎng)缺陷型缺陷；或(c)供應(yīng)不能從復(fù)合培養(yǎng)基中得到的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物，例如，編碼芽孢桿菌(Bacilli)D-丙氨酸消旋酶的基因。用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的合適選擇標(biāo)記是能夠鑒定細(xì)胞組分?jǐn)z取FGFBP3編碼核酸的那些，例如DHFR或胸苷激酶。在采用野生型DHFR時(shí)，合適的宿主細(xì)胞是如Urlaub et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216(1980)所述制備和繁殖的DHFR活性缺陷的CHO細(xì)胞系。用于酵母的合適選擇基因是存在于酵母質(zhì)粒YRp7中的trp1基因。trp1基因?yàn)槿狈υ谏彼嶂猩L(zhǎng)之能力的酵母突變株提供選擇標(biāo)志，例如，ATCC No.44076或PEP4-1[Jones，Genetics，85∶12(1977)]。

表達(dá)載體和克隆載體通常包含可操縱地與NBP158編碼核酸序列連接的啟動(dòng)子以指導(dǎo)mRNA合成。被多種潛在宿主細(xì)胞識(shí)別的啟動(dòng)子是公知的。適用于原核宿主的啟動(dòng)子包括內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)，堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)，以及雜合啟動(dòng)子(例如tac啟動(dòng)子)。用于細(xì)菌系統(tǒng)的啟動(dòng)子還將包含與編碼NBP158的DNA可操縱地連接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。

適用于與酵母宿主一起使用的合適啟動(dòng)序列的實(shí)例包括用于以下的啟動(dòng)子：3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶，例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡糖激酶。

其他酵母啟動(dòng)子(其為具有通過(guò)生長(zhǎng)條件控制的轉(zhuǎn)錄的額外優(yōu)勢(shì)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)為用于以下的啟動(dòng)子區(qū)域：醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、以及負(fù)責(zé)利用麥芽糖和半乳糖的酶。用于酵母表達(dá)的合適的載體和啟動(dòng)子在EP 73,657中進(jìn)一步描述。

哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中NBP158從載體的轉(zhuǎn)錄受到例如以下啟動(dòng)子的控制：從病毒基因組獲得的啟動(dòng)子，所述病毒例如多瘤病毒、禽痘病毒(1989年7月5日公布的UK 2,211,504)、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙肝病毒和猿猴病毒40(SV40)；從異源哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子獲得的啟動(dòng)子，例如肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或免疫球蛋白啟動(dòng)子；以及從熱休克啟動(dòng)子獲得的啟動(dòng)子；只要這樣的啟動(dòng)子與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容即可。

編碼NBP158的DNA通過(guò)高等真核生物的轉(zhuǎn)錄可通過(guò)在載體中插入增強(qiáng)子序列而提高。增強(qiáng)子是DNA的順式作用元件(通常為約10至300bp)，其作用于啟動(dòng)子以提高其轉(zhuǎn)錄?，F(xiàn)在已知許多增強(qiáng)子序列來(lái)自哺乳動(dòng)物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰島素)。然而，人們通常會(huì)使用來(lái)自真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。實(shí)例包括在復(fù)制起點(diǎn)晚期側(cè)(late side)的SV40增強(qiáng)子(bp 100-270)、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、在復(fù)制起點(diǎn)的晚期側(cè)的多瘤病毒增強(qiáng)子、以及腺病毒增強(qiáng)子。增強(qiáng)子可被剪接到載體中，位于FGFBP3編碼序列5′或3′側(cè)的位置，但優(yōu)選位于啟動(dòng)子5′側(cè)的位點(diǎn)。

在真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動(dòng)物、人或來(lái)自其他多細(xì)胞生物的有核細(xì)胞)中使用的表達(dá)載體將也可包含用于終止轉(zhuǎn)錄和用于穩(wěn)定mRNA的必需序列。這樣的序列通?？色@自真核或者病毒DNA或cDNA的5′側(cè)(以及偶爾3′端)非翻譯區(qū)。這些區(qū)域包含在編碼FGFBP3的mRNA的非翻譯部分中作為聚腺苷酸化片段轉(zhuǎn)錄的核苷酸區(qū)段。

適用于適應(yīng)在重組脊椎動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中合成NBP158的另一些方法、載體和宿主細(xì)胞描述于Gething et al.,Nature，293：620-625(1981)；Mantei et al.，Nature,281：40-46(1979)；EP 117,060；以及EP 117,058。

基于本文中所提供的序列，基因擴(kuò)增和/或表達(dá)可使用適當(dāng)標(biāo)記的探針在樣品中直接測(cè)量，例如，通過(guò)常規(guī)的Southern印跡、定量mRNA轉(zhuǎn)錄的Northern印跡、斑點(diǎn)印跡(DNA分析)或原位雜交。或者，可使用識(shí)別特異性雙鏈體(包括DNA雙鏈體、RNA雙鏈體和DNA-RNA雜合雙鏈體或DNA-蛋白質(zhì)雙鏈體)的抗體。繼而，抗體可被標(biāo)記，并且可在雙鏈體與表面結(jié)合時(shí)進(jìn)行測(cè)定，使得可在表面上形成雙鏈體后檢測(cè)與所述雙鏈體結(jié)合之抗體的存在。

或者，基因表達(dá)可通過(guò)免疫學(xué)方法(例如細(xì)胞或組織切片的免疫組織化學(xué)染色以及細(xì)胞培養(yǎng)物或體液的測(cè)定)進(jìn)行測(cè)量以直接定量基因產(chǎn)物的表達(dá)?？捎糜诿庖呓M化染色和/或樣品體液測(cè)定的抗體可以是單克隆或多克隆的，并且可在任何哺乳動(dòng)物中制備。為方便起見，所述抗體可針對(duì)全序列NBP158多肽或針對(duì)基于本文中提供的DNA序列的合成多肽或者針對(duì)與NBP158 DNA融合并且編碼特定抗體表位的外源序列來(lái)制備。

d.多肽的純化

NBP158的形式可從培養(yǎng)基或從宿主細(xì)胞裂解物中回收。如果是膜結(jié)合的，可使用合適的去污劑溶液(例如Triton-X100)或通過(guò)酶促切割從膜上釋放。在NBP158表達(dá)中所采用的細(xì)胞可通過(guò)多種物理或化學(xué)手段來(lái)破壞，例如凍融循環(huán)、超聲處理、機(jī)械破碎或細(xì)胞裂解劑。

可期望從重組細(xì)胞蛋白質(zhì)或多肽中純化NBP158。以下過(guò)程是示例性的合適純化過(guò)程：通過(guò)在離子交換柱上分級(jí)分離；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅膠上或在陽(yáng)離子交換樹脂(例如DEAE)上進(jìn)行的色譜；色譜聚焦；SDS-PAGE；硫酸銨沉淀；使用例如Sephadex G-75的凝膠過(guò)濾；除去污染物(例如IgG)的蛋白A瓊脂糖凝膠柱；以高結(jié)合親和力純化NBP158的肝素柱；以及結(jié)合NBP158的表位標(biāo)記形式的金屬螯合柱?？刹捎枚喾N蛋白質(zhì)純化方法，且此類方法是本領(lǐng)域中已知的并且描述于例如Deutscher,Methods in Enzymology,182(1990)；Scopes，Protein Purification：Principles and Practice，Springer-Verlag，New York(1982)。選擇的純化步驟將取決于例如所使用的產(chǎn)生方法的性質(zhì)和所產(chǎn)生的特定NBP158。

3.NBP158和NBP158突變體的用途

a.藥物組合物

可以藥物組合物的形式施用NBP158多肽以及NBP158突變體用于治療代謝性疾病和病癥，包括DM和肥胖癥。

通過(guò)將具有期望純度的多肽與任選的本領(lǐng)域中通常采用的“可藥用”或“生理學(xué)上可接受的”載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(其均稱為“賦形劑”)混合制備多肽的治療性制劑用于作為凍干制劑或水溶液保存。例如，緩沖劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、滲透壓平衡劑(isotonifier)、非離子洗滌劑、抗氧化劑和其他雜項(xiàng)添加劑(miscellaneous additive)。(見Remington′s Pharmaceutical Sciences，16th edition(or later)，A Osol，Ed.(1980))。這樣的添加劑在所采用的劑量和濃度下對(duì)接受者必須是無(wú)毒的。

緩沖劑有助于維持近似生理?xiàng)l件范圍內(nèi)的pH。其優(yōu)選以約2mM至約50mM的濃度存在。用于本發(fā)明中使用的合適的緩沖劑包括有機(jī)和無(wú)機(jī)酸及其鹽。例如，檸檬酸鹽緩沖劑(例如，檸檬酸一鈉-檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸一鈉混合物等)、琥珀酸鹽緩沖劑(例如，琥珀酸-琥珀酸一鈉混合物、琥珀酸-氫氧化鈉混合物、琥珀酸-琥珀酸二鈉混合物等)、酒石酸鹽緩沖劑(例如，酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物等)、富馬酸鹽緩沖劑(例如，富馬酸-富馬酸一鈉混合物等)、富馬酸鹽緩沖劑(例如，富馬酸-富馬酸一鈉混合物、富馬酸-富馬酸二鈉混合物、富馬酸一鈉-富馬酸二鈉混合物等)、葡糖酸鹽緩沖劑(例如，葡糖酸-葡糖酸鈉混合物、葡糖酸-氫氧化鈉混合物、葡糖酸-葡糖酸鉀混合物等)、草酸鹽緩沖劑(例如草酸-草酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物等)、乳酸鹽緩沖劑(例如，乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物等)和乙酸鹽緩沖劑(例如，乙酸-乙酸鈉混合物、乙酸-氫氧化鈉混合物等)。另外，也可以采用磷酸鹽緩沖劑、組氨酸緩沖劑和三甲胺鹽(例如Tris)。

添加防腐劑以延遲微生物的生長(zhǎng)，并且以0.2％-1％(w/v)的量添加。用于本發(fā)明中使用的合適的防腐劑包括酚、苯甲醇、間甲酚、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基芐基氯化銨、苯扎鹵銨(例如，苯扎氯銨、苯扎溴銨、苯扎碘銨)、六甲氯銨(hexamethonium chloride)、對(duì)羥基苯甲酸烷基酯(例如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環(huán)己醇和3-戊醇。

存在滲透壓平衡劑(有時(shí)被稱為“穩(wěn)定劑”)以確保本發(fā)明液體組合物的等滲性，所述滲透壓平衡劑包括多羥基糖醇，優(yōu)選三羥基或更多羥基的糖醇，例如甘油、赤蘚醇、阿糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露糖醇?？紤]到其他成分的相對(duì)量，多羥基醇可以按重量計(jì)0.1％至25％、優(yōu)選1％至5％的量存在。

穩(wěn)定劑是指功能范圍可從填充劑(bulking agent)到使治療劑增溶或有助于阻止變性或附著于容器壁的添加劑的一大類賦形劑。典型的穩(wěn)定劑可以是多羥基糖醇(上文中列舉)；氨基酸，例如精氨酸、賴氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、丙氨酸、鳥氨酸、L-亮氨酸、2-苯基丙氨酸、谷氨酸、蘇氨酸等；有機(jī)糖或糖醇，例如乳糖、海藻糖、水蘇糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌肌醇(myoinisitol)、半乳糖醇、甘油等，包括環(huán)多醇(cyclitol)，例如肌醇(inositol)；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫還原劑，例如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巰基乙酸鈉、硫代甘油、氨基硫代甘油和硫代硫酸鈉；低分子量多肽(即＜10個(gè)殘基)；蛋白質(zhì)，例如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；單糖，例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖，例如乳糖、麥芽糖、蔗糖；以及三糖，例如棉子糖；多糖，例如葡聚糖。穩(wěn)定劑可以活性蛋白質(zhì)重量的0.1至10,000重量份存在。

存在非離子表面活性劑或去污劑(也稱作“濕潤(rùn)劑”)以有助于使治療劑增溶以及保護(hù)治療性蛋白質(zhì)免受攪動(dòng)誘導(dǎo)的聚集，這也允許制劑暴露于受到應(yīng)力的剪切表面而不引起蛋白質(zhì)變性。合適的非離子表面活性劑包括聚山梨醇酯(20、80等)、泊洛沙姆(184、188等)、多元醇、聚氧乙烯失水山梨醇單醚(等)。非離子表面活性劑以約0.05mg/ml至約1.0mg/ml，優(yōu)選約0.07mg/ml至約0.2mg/ml的范圍存在。額外的雜項(xiàng)賦形劑包括填充劑(例如淀粉)、螯合劑(例如EDTA)、抗氧化劑(例如，抗壞血酸、甲硫氨酸、維生素E)和潛溶劑。

本文中的制劑也可含有多于一種對(duì)于被治療的特定適應(yīng)證所必需的活性化合物，優(yōu)選具有不彼此不利地影響的互補(bǔ)活性的那些。例如，可希望進(jìn)一步提供免疫抑制劑。這樣的分子在組合中以有效用于期望目的的量合適地存在。

活性成分也可以包埋在微膠囊中，所述微膠囊例如通過(guò)凝聚技術(shù)或通過(guò)界面聚合(分別例如羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)在膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)或在粗乳液中制備。這樣的技術(shù)在Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16th版(或更晚的版本)，A Osal，Ed.(1980)中公開。

待用于體內(nèi)施用的制劑必須是無(wú)菌的。這可很容易地例如通過(guò)無(wú)菌濾膜過(guò)濾來(lái)實(shí)現(xiàn)。

可制備緩釋制劑。緩釋制劑的合適實(shí)例包括含有FGFBP3多肽突變體的固體疏水性聚合物的半透性基質(zhì)，所述基質(zhì)為成型制品(例如薄膜或微膠囊)的形式。緩釋基質(zhì)的實(shí)例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(甲基丙烯酸2-羥基乙基酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯、L-谷氨酸與L谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯的共聚物、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(例如，(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構(gòu)成的可注射微球))，以及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然聚合物(例如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸)使得能夠釋放分子超過(guò)100天，但是某些水凝膠釋放蛋白質(zhì)的時(shí)間較短。當(dāng)包封的抗體在體內(nèi)保持很長(zhǎng)時(shí)間，它們可由于在37℃下暴露于潮濕而可變性或聚集，導(dǎo)致生物學(xué)活性的喪失和可能的免疫原性改變。根據(jù)所涉及的機(jī)制可設(shè)計(jì)用于穩(wěn)定化的理性策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)制是通過(guò)硫基-二硫化物互換的分子間S-S鍵形成，那么穩(wěn)定化可通過(guò)修飾巰基殘基、從酸性溶液中凍干、控制含水量、使用適宜添加劑和開發(fā)特定的聚合物基質(zhì)組合物來(lái)實(shí)現(xiàn)。

通過(guò)本發(fā)明的篩選測(cè)定鑒定的非蛋白質(zhì)化合物可以類似的方式使用本領(lǐng)域中公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)配制。

b.治療方法

本發(fā)明的試劑(例如NBP158蛋白或NBP158突變體)根據(jù)已知的方法(例如作為推注的靜脈內(nèi)施用或通過(guò)一段時(shí)間的連續(xù)輸液，通過(guò)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、經(jīng)口、局部(topical)或吸入途徑)向哺乳動(dòng)物(優(yōu)選人)施用。優(yōu)選多肽的靜脈內(nèi)施用。為預(yù)防或治療疾病，試劑(例如本文中的蛋白質(zhì))的適當(dāng)劑量將取決于待治療的疾病類型(如上文中所定義)、疾病的嚴(yán)重程度和病程、施用試劑是預(yù)防性或治療性目的、先前的治療、患者的臨床病史和對(duì)試劑的響應(yīng)、以及主治醫(yī)師的判斷。所述試劑一次性或在一系列治療中向患者合適地施用。

將有效治療特定疾病或病癥的治療性多肽或其片段的量將取決于疾病或病癥的性質(zhì)，并且可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)來(lái)確定。在可能的情況下，希望確定劑量-響應(yīng)曲線，并且本發(fā)明的藥物組合物先在體外測(cè)試，然后在于人中測(cè)試之前可用于動(dòng)物模型系統(tǒng)。然而，基于本領(lǐng)域中的常識(shí)，有效地促進(jìn)感覺神經(jīng)元存活的藥物組合物可提供約5至20ng/ml并且優(yōu)選約10至20ng/ml的局部治療劑濃度。

用于皮下施用的劑量方案可以從每月一次到每天一次，這取決于若干臨床因，包括疾病的類型、疾病的嚴(yán)重程度、以及患者對(duì)治療劑的敏感性。例如，根據(jù)疾病的類型和嚴(yán)重程度，約500ng/kg至100mg/kg(即0.0005-100mg/kg)的蛋白質(zhì)為用于向患者施用的初始候選劑量，無(wú)論是例如通過(guò)一次或更多次分開施用，或者通過(guò)連續(xù)輸液。典型的每日劑量范圍可以是約1μg/kg至20mg/kg或更多，這取決于上述因素。對(duì)于數(shù)天或更長(zhǎng)時(shí)間的重復(fù)施用，根據(jù)情況，持續(xù)治療直至發(fā)生期望的疾病癥狀抑制。然而，其他劑量方案也是可用的。常規(guī)技術(shù)和測(cè)定很容易地監(jiān)控該治療進(jìn)程。

在一個(gè)實(shí)施案例中，單獨(dú)的NBP158對(duì)禁食的ob/ob小鼠的葡萄糖耐量產(chǎn)生即時(shí)效應(yīng)。如圖7A中所示，單獨(dú)的單劑量FGFBP3在2小時(shí)處理之后顯著降低在15、30、60、120和180分鐘時(shí)的血清葡萄糖水平。最大藥理學(xué)作用發(fā)生在單劑量的組合方案之后的2小時(shí)，持續(xù)至少24小時(shí)，并在2天后回到基線。

在另一個(gè)實(shí)施例中，NBP158改善了飲食誘導(dǎo)的肥胖癥(DIO)小鼠(臨床相關(guān)的糖尿病動(dòng)物模型)的葡萄糖耐量。首先，用NBP158(0.5mg/kg)的單次處理顯著降低空腹血糖水平并改善葡萄糖耐量，但單劑量的CBD66即使在高得多的劑量(1mg/kg至5mg/kg)下也沒有作用。

如普通技術(shù)人員可以理解的，本發(fā)明藥物組合物的最佳劑量和期望藥物濃度可隨所考慮的特定用途而改變。合適劑量或施用途徑的確定完全在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能力范圍內(nèi)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供了用于確定用于人治療的有效劑量的可靠指導(dǎo)。物種之間有效劑量的縮放可以按照Mordenti，J.和Chappell，W.，″The use of interspecies scaling in toxicokinetics"，Toxicokinetics and New Drug Development，Yacobi et al.，Eds，Pergamon Press，New York 1989，pp.42-96所制定的原則進(jìn)行。

總之，NBP158多肽(人分泌型FGFBP3之N端的158個(gè)氨基酸)以劑量依賴性方式顯著地降低了血漿葡萄糖水平，而且起效快(＜2小時(shí))且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)(＞24小時(shí))。人分泌型FGFBP3蛋白不通過(guò)其C端FGF結(jié)合結(jié)構(gòu)域CBD66改善葡萄糖代謝。FGFBP3的降糖作用獨(dú)立于FGF信號(hào)傳送。由于NBP158不與FGF結(jié)合，我們得出結(jié)論，NBP158治療不太可能誘導(dǎo)癌癥(例如，肝細(xì)胞癌(HCC))的發(fā)生。因此，NBP158對(duì)代謝性疾病(包括DM和肥胖癥)而言是非常安全且有前途的治療肽。

實(shí)施例

實(shí)施例1：人FGFBP3和分泌型人FGFBP3的N端158個(gè)氨基酸(NBP158)的氨基酸序列。

人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3前體(FGFBP3，登錄號(hào)NP_689642、RefSeq NM_152429.4、CCDS ID7418.1)由258個(gè)氨基酸組成，其中具有圖1(SEQ ID NO：1)中的26個(gè)殘基長(zhǎng)度(1-26位氨基酸)的信號(hào)肽和232個(gè)殘基長(zhǎng)度(27-258位氨基酸)的分泌肽。通過(guò)EMBOSS Water軟件進(jìn)行的人FGFBP3(NP_689642.3)BLAST搜索示出與小鼠FGFBP3(NP_114156)的57.6％同一性和67.6％相似性。疏/親水性圖(hydropathy plot)分析顯示出在FGFBP3的N末端的一個(gè)強(qiáng)疏水性區(qū)域，并且使用SignalP 3.0 Server以位于26位氨基酸(A)與27位氨基酸(R)之間的切割位點(diǎn)預(yù)測(cè)到分泌信號(hào)序列。分泌型人FGFBP3的N端158個(gè)氨基酸片段(NBP-158)與肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(而非FGF結(jié)合結(jié)構(gòu)域)重疊。NBP158的氨基酸序列是SEQ ID NO：1(圖1)的27至184位。

實(shí)施例2：人FGFBP3蛋白(未標(biāo)記)在CHO細(xì)胞中的表達(dá)。

在經(jīng)含有無(wú)標(biāo)記天然FGFBP3蛋白的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的上清液中僅發(fā)現(xiàn)分泌型人FGFBP3(圖2，A、B)。在經(jīng)轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的裂解物中，發(fā)現(xiàn)人FGFBP3的前體和分泌肽分別以33kDa和27kDa的表觀分子量遷移(圖2，C)。為進(jìn)一步分析FGFBP3蛋白，將表達(dá)外源性無(wú)標(biāo)記人FGFBP3(圖2A)的條件化培養(yǎng)基在4％-12％的NUPAGE凝膠上進(jìn)行分離，并且用考馬斯藍(lán)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行染色。該級(jí)分中存在的主要蛋白質(zhì)遷移的位置與免疫反應(yīng)性FGFBP3相同(圖2B)。在圖A中的標(biāo)出的蛋白質(zhì)樣品通過(guò)質(zhì)譜法進(jìn)行分析，并且通過(guò)LC/MS鑒定分泌型人FGFBP3肽的100％序列(以下劃線示出)(圖2D)。

實(shí)施例3：FGFBP3處理對(duì)葡萄糖代謝的治療作用獨(dú)立于FGF信號(hào)。

8周齡雄性ob/ob小鼠購(gòu)自南京大學(xué)南京生物醫(yī)學(xué)研究所(南京，中國(guó))。動(dòng)物在中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的GLP動(dòng)物設(shè)施中飼養(yǎng)，并定期不限量地提供嚙齒動(dòng)物飼料(rodent chow)和水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)審查并批準(zhǔn)。為確認(rèn)FGFBP3的活性，我們用單劑量FGFBP注射ob/ob小鼠并且進(jìn)行腹膜內(nèi)葡萄糖耐量測(cè)試(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)。小鼠禁食過(guò)夜(16小時(shí))。在開始實(shí)驗(yàn)之前，將動(dòng)物稱重以確定葡萄糖的注射量。IPGTT在安靜的房間中進(jìn)行，并將操作保持在最低限度以降低操作過(guò)程中的應(yīng)激。推注葡萄糖(1g kg^-1)到腹膜腔中(30％D-葡萄糖：H₂O溶液)，在0、15、30、60、120和180分鐘時(shí)從尾尖取血樣，并血糖水平用便攜式葡萄糖計(jì)(S60，Yuwell)來(lái)測(cè)定。在未經(jīng)任何處理時(shí)測(cè)量IPGTT基線，并將血漿葡萄糖水平與正常范圍(空腹血糖＜6.1mmol/L，2小時(shí)ipGTT血漿葡萄糖＜7.8mmol/L)相比較。FGFBP3在早上(上午9：00)單次腹膜內(nèi)(i.p.)注射施用。進(jìn)行葡萄糖耐量測(cè)試并在測(cè)試后3-6周測(cè)量體重變化。

單次FGFBP3注射(0.5mg/kg)后2小時(shí)，葡萄糖耐量在處理之前和之后在60和90分鐘時(shí)顯著改善(n＝5)(圖4A)。為了評(píng)估內(nèi)源性FGF在FGFBP3處理中的作用，我們向ob/ob小鼠中全身性遞送了CBD66(FGFBP3的FGF結(jié)合結(jié)構(gòu)域)，然后在CBD66處理后2小時(shí)行ipGTT?？崭寡菦]有下降，葡萄糖耐量也沒有得到改善(圖4B，n＝5)。此外，給予ob/ob小鼠5mg/kg PD173074(p.o.)或20％的DMSO作為對(duì)照。PD173074沒有阻斷0.5mg/kg FGFBP3的降血糖效果(圖4C，n＝5，p＜0.001)，盡管它可以防止體內(nèi)過(guò)表達(dá)FGFBP3而導(dǎo)致的腦血管通透性的提高。此外，沒有外源性FGF時(shí)，F(xiàn)GFBP3處理無(wú)法活化HepG2細(xì)胞中的Erk1/2信號(hào)傳送(圖4D)。因?yàn)镋rk1/2的磷酸化對(duì)所有的FGF信號(hào)傳送途徑都是必不可少的，所以這些結(jié)果表明，F(xiàn)GFBP3處理不通過(guò)FGF活化或內(nèi)源性FGF信號(hào)傳送改善葡萄糖穩(wěn)態(tài)。

實(shí)施例4：通過(guò)氫/氘交換進(jìn)行的分泌型人FGFBP3構(gòu)象分析。

內(nèi)分泌FGF的成員FGF21具有對(duì)代謝性疾病的治療潛力^3-7。FGF21模擬物的臨床試驗(yàn)顯示出強(qiáng)烈的降脂作用，但對(duì)葡萄糖穩(wěn)態(tài)則顯示出出人意料地適中的作用⁸。先前的研究表明，F(xiàn)GFBP3通過(guò)CBD66與內(nèi)源性FGF締合，并且在體內(nèi)通過(guò)活化FGFR提高腦血管通透性¹。為確認(rèn)FGF21與FGFBP3的相互作用，我們通過(guò)氫-氘交換(H/D交換)質(zhì)譜法(MS)分析了分泌型FGFBP3蛋白(-25-0，信號(hào)肽序列；1-232，分泌型FGFBP3蛋白質(zhì)序列)和CBD66(167-232)的構(gòu)象。

在此先簡(jiǎn)要描述氘標(biāo)記和質(zhì)譜分析。10mM磷酸鈉、150mM NaCl(pH7.4)中的30μM蛋白質(zhì)儲(chǔ)備溶液(stock solution)用于實(shí)驗(yàn)。蛋白質(zhì)的混合物FGFBP3-FGF21和CBD66-FGF21以1∶1的比例制備，并在4℃下溫和攪拌孵育過(guò)夜。通過(guò)在25℃下用D₂O緩沖液(10mM磷酸鈉，pD 7.0)將儲(chǔ)液稀釋9倍(v/v)來(lái)起始H/D交換反應(yīng)。對(duì)于零時(shí)間點(diǎn)，將樣品用10mM磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)稀釋。同位素交換反應(yīng)在一小時(shí)后通過(guò)使用冰冷的100mM磷酸鈉緩沖液(pH 2.3)進(jìn)行1∶1稀釋來(lái)猝滅，然后在線(online)進(jìn)樣到固定化胃蛋白酶柱(Applied Biosystem，Thermo，USA)中，隨后使用具有用于超高效液相色譜儀(ultraperformance liquid chromatograph，UPLC)的HDX技術(shù)的Waters nanoACQUITY系統(tǒng)(Waters公司，美國(guó))進(jìn)行分離，并使用Waters Synapt-G2S HDMS質(zhì)譜儀(Waters公司，美國(guó))進(jìn)行質(zhì)量分析。蛋白質(zhì)樣品(70-80pmol)進(jìn)樣到填充有固定化胃蛋白酶的2.1mm/30mmL不銹鋼柱中，其中流量為0.1％甲酸中1μl/分鐘。在VanGuard Pre-Column(2.1mm＊5mm，ACQUITY UPLC BEH C18，1.7μm)上捕獲肽3分鐘。然后將捕獲物置于與ACQUITY UPLC BEH C18柱(1.7μm，1.0mm＊100mm；Waters公司)連接，在0℃使用20％-80％梯度的乙腈在9分鐘中以37μl/min的流量分離肽。向這兩種流動(dòng)相中添加甲酸(0.1％)以維持pH為2.5。在配備有離子遷移分離(ion mobility separation)的Waters Q-TOF質(zhì)譜儀上使用電噴霧電離以正靈敏度離子模式在優(yōu)化條件下獲取肽的質(zhì)譜。在12分鐘內(nèi)，在50-2,000的質(zhì)荷比(m/z)范圍內(nèi)獲取譜，碰撞能量階梯為21-44V。質(zhì)量準(zhǔn)確度是使用亮氨酸腦啡肽標(biāo)準(zhǔn)物(Waters公司，美國(guó))通過(guò)不斷的鎖質(zhì)量修正(lock-mass correction)維持。一式兩份的未氘化對(duì)照樣品的胃蛋白肽(FGFBP3為一式三份樣品)使用精確質(zhì)量和碰撞誘導(dǎo)解離的組合以由Waters MassLynx 4.1軟件輔助的與離子遷移分離偶聯(lián)的數(shù)據(jù)非依賴性獲取模式(MS^E)鑒定。選取未氘化和氘化的肽在0小時(shí)和1小時(shí)時(shí)的質(zhì)譜并在Waters DynamX v2.0中進(jìn)行分析。

所有FGFBP3肽片段在60分鐘時(shí)的氘?dāng)z取都提高，其表現(xiàn)出1-77、107-139和165-197位氨基酸殘基的更松弛的構(gòu)象。緊密的構(gòu)象顯示在具有較少氘?dāng)z取的78-106和198-232位氨基酸序列(圖5A，----)。與FGF21孵育后，F(xiàn)GFBP3片段(158-205)(圖5A，)和CBD66(167-232)(圖5B，)的氘?dāng)z取均提高，這表明該FGF21結(jié)合結(jié)構(gòu)域解折疊。FGFBP3的構(gòu)象在4℃與肝素孵育過(guò)夜之后也發(fā)生變化。37-77位氨基酸的氘?dāng)z取在肝素存在下降低(圖5C，----)，但對(duì)于通過(guò)FGFBP3與FGFBP1的序列比對(duì)預(yù)測(cè)的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(82-114位氨基酸)，氘?dāng)z取卻沒有改變。CBD66的構(gòu)象在肝素存在下沒有改變(圖5C、D----和----)，這與先前的研究結(jié)果一致。

實(shí)施例5：人FGFBP3突變體蛋白NBP158在CHO細(xì)胞中的表達(dá)。

分泌型人FGFBP3的N端158個(gè)氨基酸(NBP158，SEQ ID NO：1的27-184位氨基酸)存在于經(jīng)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的上清中，所述載體包含全長(zhǎng)NBP158序列(SEQ ID NO：1的1-184位氨基酸)。發(fā)現(xiàn)分泌型NBP158以18kDa的表觀分子量遷移(圖6，A)。所指示的蛋白質(zhì)樣品通過(guò)質(zhì)譜法進(jìn)行分析，并且通過(guò)LC/MS鑒定NBP158的100％序列(以下劃線示出)(圖6B)。

實(shí)施例6：?jiǎn)未蜰BP158處理對(duì)ob/ob小鼠中葡萄糖代謝的時(shí)間過(guò)程。

為了確證NBP158的活性，我們用單劑量的NBP158注射ob/ob小鼠并進(jìn)行IPGTT，如上文中所述。單次NBP158注射(0.5mg/kg)后2小時(shí)，空腹血糖、萄糖耐量在處理之前和之后在60和90分鐘時(shí)顯著改善(n＝6)(圖7A)。為確定單次NBP158處理的時(shí)間過(guò)程，在單次NBP158注射之后24小時(shí)進(jìn)行GTT，并且空腹葡萄糖水平?jīng)]有降低，但是發(fā)現(xiàn)30和60分鐘時(shí)葡萄糖耐量的顯著差異(n＝6)(圖7B)。單次NBP158處理之后48小時(shí)，未表現(xiàn)出顯著差異(n＝6)(圖7C、D)。

實(shí)施例7：NBP158處理對(duì)ob/ob小鼠中葡萄糖代謝的劑量響應(yīng)。

為了評(píng)估純化的NBP158蛋白的全身性作用，我們用提高劑量的NBP158(0.1、0.5、1mg/kg)處理ob/ob小鼠。單次NBP158處理(0.1mg/kg)之后2小時(shí)，空腹血糖從基線10.6±0.7(mmol/L)降低至7.06±0.15(mmol/L)(p＜0.01)，并且葡萄糖耐量在30、60、120和180分鐘時(shí)改善(圖8A，0.1mg/kg，p＜0.001)(n＝6)。曲線下面積(AUC)降低了38.4％，從2694.54±125.46降至1659.17±95.83(mmol/l/分鐘)(圖8D，0.1mg/kg，p＜0.01)。用0.5mg/kg NBP158處理之后，空腹血糖降至6.65±0.38(mmol/L)(p＜0.01)，并且顯著降低的血漿葡萄糖水平還見于15、30、60、120和180分鐘(圖8B，0.5mg/kg，p＜0.001)(n＝6)。AUC降低了49.2％，降至1369±161(mmol/l/分鐘)(FIG.8D，0.5mg/kg，p＜0.01)。在更高的劑量下，NBP158處理將空腹血糖水平降至7.19±0.15(mmol/L)(p＜0.01)，并且顯著降低的血漿葡萄糖水平還見于15、30、60、120和180分鐘，AUC降低了56.8％，降至1164.67±35.33(mmol/l/分鐘)(圖8C、D，1.0mg/kg，p＜0.001)(n＝6)。

這些動(dòng)物的正常運(yùn)動(dòng)在實(shí)驗(yàn)后觀察三周。在進(jìn)食的ob/ob小鼠中，NBP158處理(0.5mg/kg)并不改變注射后15分鐘至24小時(shí)的隨機(jī)血糖水平，這表明血漿葡萄糖水平可以通過(guò)食物攝入來(lái)維持。因此，我們的結(jié)論是：NBP158處理以劑量依賴的方式顯著地降低血漿葡萄糖水平，而且起效快(＜2小時(shí))且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)(＞24小時(shí))。

實(shí)施例8：NBP158處理對(duì)飲食誘導(dǎo)的肥胖癥(DIO)小鼠中葡萄糖代謝的急性效應(yīng)。

3周齡雄性C57BL6小鼠購(gòu)自中山大學(xué)(廣州，中國(guó))。實(shí)驗(yàn)前3個(gè)月，動(dòng)物不限量飼喂60％高脂飲食(目錄號(hào)D12492，Research Diets，Inc.，NJ)和水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)中山大學(xué)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)(IACUC)審查并批準(zhǔn)。NBP158多肽或CBD66多肽如上文中所述施用。NBP158單次處理(0.5mg/kg)之2后小時(shí)，空腹血糖水平降低，并且在15、30、60、120和180分鐘時(shí)顯示出葡萄糖耐量的顯著改善(n＝6)(圖9A、B)。單次CBD66處理之后2小時(shí)，發(fā)現(xiàn)處理之前和之后沒有顯著差異(n＝6)(圖9C、D)。因此，用NBP158(而非CBD66)處理在DIO小鼠中降低空腹血糖并且改善葡萄糖耐量。

實(shí)施例9：用NBP158或CBD66單次處理之后DIO小鼠的體重變化。

用60％高脂飲食飼喂3周齡雄性B6小鼠12周，然后隨機(jī)分配到NBP158或CBD66處理組。DIO小鼠(18周齡)用單次注射NBP158(n＝6)或CBD66(n＝6)處理。處理之后一周，將DIO小鼠稱重并將體重的變化在這些組之間進(jìn)行比較。在NBP158處理組，體重下降了(-2.4±0.46g/只動(dòng)物)或(-5.545±1.08％/只動(dòng)物)；而在CBD66處理組，體重提高了(0.74±0.14g/只動(dòng)物)或(1.66±0.42％/只動(dòng)物)，這與未處理的動(dòng)物類似(圖10A、B)。因此，NBP158(而非CBD66)顯著降低體重，這表明在治療肥胖癥中的治療作用(p＜0.05，圖10)。

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雖然本發(fā)明已針對(duì)其某些實(shí)施方案進(jìn)行了描述，并且為了舉例說(shuō)明的目的已列舉了許多細(xì)節(jié)，但對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言明顯的是，本發(fā)明很容易被添加另外的一些實(shí)施方案，并且本文中所描述的某些細(xì)節(jié)可以被顯著改變而不脫離本發(fā)明的基本原則。