一種從白眉蝮蛇蛇毒中提取白眉蛇毒血凝酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種從白眉蝮蛇蛇毒中提取效價(jià)更高的白眉蛇毒血凝酶的方法。該方法包括下述步驟：將長白山白眉蝮蛇蛇毒依次進(jìn)行DEAE-Sephadex A-50(二乙基氨基乙基-葡聚糖A-50)離子交換層析、冷藏、堿性水解和Sephadex G-75凝膠過濾層析后收集的具有凝血活性的蛋白。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法簡化了白眉蛇毒血凝酶的提取步驟，縮短了生產(chǎn)周期，并且能夠提高產(chǎn)品的效價(jià)和收率，大幅度地降低生產(chǎn)成本。
【專利說明】一種從白眉蝮蛇蛇毒中提取白眉蛇毒血凝酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種從白眉蝮蛇蛇毒中提取白眉蛇毒血凝酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 凝血是一個(gè)比較復(fù)雜的生理過程，大體分為三個(gè)階段：第一階段，凝血因子 X (coagulation factor X，F(xiàn)x)激活；第二階段，凝血酶原激活；第三階段，纖維蛋白原變?yōu)?纖維蛋白。
[0003] 從蛇毒中提取止血藥具有悠久的歷史。目前，臨床應(yīng)用較為成功的有瑞士生產(chǎn)的 止血藥Reptilase，即立止血，它是從巴西矛頭腹蛇蛇毒中提取的。國內(nèi)仿Reptilase的產(chǎn) 品有從蛇島蝮蛇、從圓斑蝰蛇、尖吻蝮蛇以及浙江蝮蛇的蛇毒中提取得到的凝血酶，這些產(chǎn) 品和立止血都是類凝血酶和少量的類凝血激酶（一種凝血因子X激活物）的混合物，主要 機(jī)理是類凝血酶可使纖維蛋白原I單體交聯(lián)成纖維蛋白，從而形成血凝塊實(shí)現(xiàn)止血。
[0004] 此前，發(fā)明人已經(jīng)成功的從白眉蝮蛇蛇毒中提取一種白眉蛇毒血凝酶，并建立 了完整的技術(shù)方案（見ZL200710099163.X)。在該專利提供的技術(shù)方案，經(jīng)過第一次 DEAE-S印hadex A-50后，電泳分析顯示在得到的白眉蛇毒血凝酶主成分（類凝血酶） 電泳帶下方很近處有一條干擾帶，為雜質(zhì)成分。后面的Sephadex G-15凝膠過濾層析、 DEAE-Sephadex A-50再層析主要是為了除掉這種雜質(zhì)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種從白眉蝮蛇蛇毒中提取效價(jià)更高的白眉蛇毒血凝酶的 方法。
[0006] 本發(fā)明所提供的提取白眉蛇毒血凝酶的方法，包括下述步驟：將長白山白眉蝮蛇 蛇毒依次進(jìn)行DEAE-S印hadex A-50 (二乙基氨基乙基-葡聚糖A-50)離子交換層析、冷藏、 堿性水解和S印hadex G-75凝膠過濾層析后收集的具有凝血活性的蛋白。
[0007] 具體步驟如下：
[0008] 1)將長白山白眉蝮蛇蛇毒溶于pH 7-8、0. 04-0. 06mol/L的Tris-HCl緩沖液中，得 到濃度為200-300g/L的白眉蝮蛇蛇毒液；
[0009] 2)對(duì)步驟1)獲得的長白山白眉蝮蛇蛇毒液進(jìn)行離子交換柱層析；所述離子交換 柱層析中，固相填充物為DEAE-S印hadexA-50,洗脫液為：NaCl濃度為0-0· 75mol/L的pH 7-8、0. 04-0. 06mol/L的Tris-HCl緩沖液，所采用的洗脫方式為梯度洗脫；
[0010] 3)收集步驟2)中的洗脫液；在280nm的波長下對(duì)所述洗脫液進(jìn)行紫外分光光度 計(jì)檢測，收集在280nm的波長下具有吸收峰的洗脫液，并對(duì)該洗脫液進(jìn)行凝血活性檢測，合 并具有凝血活性的洗脫液；
[0011] 4)向所述具有凝血活性的洗脫液中加入適量的牛血清白蛋白，然后將混合液在 4°C環(huán)境冷藏4小時(shí)，得到冷藏后的混合液；
[0012] 5)堿性水解：向冷藏后的混合液中緩慢加入NaOH，使NaOH的濃度為0. 05mol/L， 然后在37. 5±0. 5°C環(huán)境中反應(yīng)15 -17小時(shí)；
[0013] 6)凍干：將步驟5)反應(yīng)后所得溶液進(jìn)行冷凍干燥，得到凍干粉；
[0014] 7)將步驟6)獲得的凍干粉用注射用水復(fù)溶；
[0015] 8)將復(fù)溶液進(jìn)行凝膠過濾層析，所述凝膠過濾層析中固相填充物為Sephadex G-75,洗脫液為注射用水，收集洗脫液，從中收集具有凝血活性的部分，得到白眉蛇毒血凝 酶原液。
[0016] 在上述血凝酶的提取方法中，步驟1)中用于溶解長白山白眉蝮蛇蛇毒的溶劑優(yōu) 選為pH 7. 5、0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液；此外，為獲得更好的實(shí)施效果，可先用離心的 方法去除白眉蝮蛇蛇毒液中的雜質(zhì)，離心條件可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行選擇，如在3000rpm下 離心10分鐘。
[0017] 步驟 2)中的 DEAE-S印hadex A-50 層析柱在使用前，先用 pH 7-8、0· 04-0. 06mol/ L的Tris-HCl緩沖液平衡15-20小時(shí)，流速為0. 8-1. OmL/min ;層析時(shí)，待白眉蝮蛇蛇 毒液完全移動(dòng)到膠面以下后，在膠面上方加與平衡液一致的緩沖液，然后用PH 7-8、 0· 04-0. 06mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液和等體積的含 0· 75mol/L NaCl 的 pH 7-8、 0. 04-0. 06mol/L的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行直線梯度洗脫，流速為0. 8-1. OmL/min ;所述步驟 2)中的Tris-HCl緩沖液優(yōu)選為pH 7. 5、(X 05mol/L的Tris-HCl緩沖液。
[0018] 步驟3)中的收集方法可為：用自動(dòng)餾分收集器收集，每管12-15mL ;具有凝血活性 的收集部分的檢測方法可為：將等體積（優(yōu)選〇. 5mL)并預(yù)熱至37°C的收集液和凝血質(zhì)控 血漿混合并在37°C下水浴，能使血漿在20秒內(nèi)凝固的收集部分為具有凝血活性的。
[0019] 步驟4)中加入的牛血清白蛋白的終濃度為1. 2 - I. 5mg/ml。
[0020] 此步驟中加入牛血清白蛋白是為了下一步堿性水解時(shí)保護(hù)目標(biāo)物質(zhì)（類凝血酶 和類凝血激酶）不被破壞。這是由于牛血清白蛋白具有親水集團(tuán)和疏水基團(tuán)，三級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì) 隨溫度改變而改變，親水基團(tuán)抱團(tuán)會(huì)把類凝血酶和類凝血激酶保護(hù)起來，免受破壞；而糖基 化的蛋白因親水性改變而不能被包埋。
[0021 ] 步驟5)中加入NaOH -定要緩慢加入，邊加邊輕輕攪拌，整個(gè)溶解過程不能使水溫 超過40°C。
[0022] 步驟8)中的S印hadex G-75層析柱在使用前，先用注射水平衡15-20小時(shí)，流速為 0. 8-1. OmL/min ;層析時(shí)，待上清液完全移動(dòng)到膠面以下后，在膠面上方加注射水，然后用注 射水洗脫，流速為0. 8-1. OmL/min ;用與步驟3)相同的方法收集洗脫液中具有凝血活性的 部分。
[0023] 按照本發(fā)明方法制備得到的白眉蛇毒血凝酶也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0024] 所述白眉蛇毒血凝酶具有以下特點(diǎn)：（1)由類凝血酶類物質(zhì)（分子量為34000D) 和類凝血激酶（分子量為69000D)兩種成分組成，高效液相色譜測得類凝血酶物質(zhì)的含量 為84-88%，類凝血激酶的含量為12-16% ; (2)主要成分類凝血酶類物質(zhì)η末端的15位氨 基酸殘基序列如序列表中的序列1所示。
[0025] 所述白眉蛇毒血凝酶可用于制備止血藥和/或治療出血性疾病藥物。
[0026] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種止血和/或治療出血性疾病的藥物。
[0027] 本發(fā)明所提供的藥物的活性成分為上述白眉蛇毒血凝酶。
[0028] 需要的時(shí)候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的輔料，所述輔 料包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、 潤滑劑和穩(wěn)定劑等。
[0029] 本發(fā)明的藥物可以制成凍干粉針劑、注射液或止血繃帶等多種形式。
[0030] 上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
[0031] 上述藥物的成人用量一般為l_8KU/60kg體重/天，可以一次或多次使用。
[0032] 本發(fā)明提供了一種從長白山白眉蝮蛇蛇毒中提取效價(jià)更高的白眉蛇毒血凝酶的 方法血凝酶。發(fā)明人通過對(duì)200710099163. X的方法進(jìn)行進(jìn)一步研宄發(fā)現(xiàn)，其所得到的白眉 蛇毒血凝酶主成分（類凝血酶）電泳帶下方很近處的干擾帶是糖基化的類凝血酶，是糖蛋 白；并且將該糖蛋白的糖基完整釋放，則得到的類凝血酶還能構(gòu)恢復(fù)活性。基于該發(fā)現(xiàn)，本 發(fā)明改進(jìn)了原來的技術(shù)方案，簡化了提取步驟，并通過一步堿液水解使糖蛋白釋放糖基，增 加了類凝血酶的含量。本發(fā)明方法簡化了白眉蛇毒血凝酶的提取步驟，縮短了生產(chǎn)周期，并 且能夠提高產(chǎn)品的效價(jià)和收率，大幅度地降低生產(chǎn)成本（選擇的層析膠可以反復(fù)使用）。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0033] 圖1為本發(fā)明和現(xiàn)有技術(shù)（ZL200710099163. X)方案提取過程中的關(guān)鍵步驟取樣 的電泳分析結(jié)果。
[0034] 圖2為牛血清白蛋白用量篩選結(jié)果圖。
[0035] 圖3為對(duì)比例制備的白眉蛇毒血凝酶中類凝血酶和類凝血激酶含量的高效液相 色譜檢測結(jié)果。
[0036] 圖4為實(shí)施例1制備白眉蛇毒血凝酶中類凝血酶和類凝血激酶含量的高效液相色 譜檢測結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不局限于此。
[0038] 下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材 料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0039] 下述實(shí)施例中所使用的長白山白眉蝮蛇蛇毒凍干粉購于沈陽鴻德蛇類養(yǎng)殖有限 公司；牛血清白蛋白購于上海一研生物科技有限公司，其規(guī)格為Ig/支。
[0040] 實(shí)施例1、提取白眉蛇毒血凝酶
[0041] 用下述方法從長白山白眉蝮蛇蛇毒中提取血凝酶，具體過程包括以下步驟：
[0042] 1)將長白山白眉蝮蛇蛇毒凍干粉（購于沈陽鴻德蛇類養(yǎng)殖有限公司）IOg溶于 40mL pH 7. 5、0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液中，得到濃度為250g/L的白眉蝮蛇蛇毒液，再 將白眉蝮蛇蛇毒液在3000rpm下離心10分鐘，棄去沉淀，保留上清液。
[0043] 2)對(duì)步驟1)獲得的長白山白眉蝮蛇蛇毒液進(jìn)行離子交換柱層析，方法為：層析前 先將DEAE-Sephadex A-50層析柱（柱規(guī)格100X5cm，購自廣州深華生物技術(shù)有限公司） 用 pH 7. 5、0. 05mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液平衡 15-20 小時(shí)，流速為 0. 8-1. OmL/min，膠床 高彡90cm ;層析時(shí)，待蛇毒上清液完全移動(dòng)到膠面以下后，在膠面上方加 pH7. 5、0. 05mol/ L Tris-HCl 緩沖液 50mL，然后用 IOOOmL pH7. 5、0. 05mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液和等體積 的含NaCl 0· 75mol/L的pH 7. 5、0· 05mol/L的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行直線梯度洗脫，流速為 I. OmT,/miη 〇
[0044] 3)用自動(dòng)餾分收集器收集洗脫液，每管12-15mL，在280nm的波長下對(duì)洗脫液進(jìn)行 紫外分光光度計(jì)檢測，得到波長280nm吸收?qǐng)D譜，收集具有凝血活性的部分，方法為：將預(yù) 熱至37°C的0. 5mL收集液和0. 5mL凝血質(zhì)控血漿（美國太平洋試劑公司）混合并在37°C 下水浴，能使血漿在20秒內(nèi)凝固的收集部分為具有凝血活性的。收集液量約300mL，總活性 約 18000 單位（KU)。
[0045] 4)向收集液中加入牛血清白蛋白400mg，溶解混勻后將收集液在4°C環(huán)境冷藏4小 時(shí)。
[0046] 5)堿性水解：向冷藏后的溶液中緩慢加入NaOH 600mg(使終濃度達(dá)到0. 05mol/ L)，緩慢加入，邊加邊輕輕攪拌，讓熱量散發(fā)出去，注意不能使溫度超過40°C ;然后在37°C 環(huán)境中反應(yīng)16小時(shí)；
[0047] 6)凍干：將收集液放入冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥，得到凍干粉。
[0048] 7)將步驟6)獲得的凍干粉用20mL注射用水復(fù)溶。
[0049] 8)對(duì)步驟7)獲得的復(fù)溶液進(jìn)行凝膠過濾層析，方法為：層析前先將Sephadex G-75層析柱（柱的規(guī)格為100X5cm，購自廣州深華生物技術(shù)有限公司）用注射水平衡 15-20小時(shí)，流速為0. 8-1. OmL/min，膠床高多90cm ;層析時(shí)，待上清液完全移動(dòng)到膠面以下 后，在膠面上方加注射水50mL，然后用2000mL注射水洗脫，流速為I. OmL/min ;用與步驟3) 相同的方法收集洗脫液中具有凝血活性的部分，得到約IOOmL白眉蛇毒血凝酶原液，總活 性約15000單位。
[0050] 按照活性【1單位（KU)白眉蛇毒血凝酶的確定：將預(yù)熱至37°C的ImL白眉蛇毒 血凝酶溶液與ImL凝血質(zhì)控血漿（美國太平洋試劑生產(chǎn)）混合，在37°C下，能使ImL凝血 質(zhì)控血漿在60-80秒內(nèi)凝固，混合前的ImL溶液中所含的白眉蛇毒血凝酶的量即為1單位 (KU)?！浚谜麴s水將原液稀釋成40單位（KU) /mL，得到白眉蛇毒血凝酶濃縮液。
[0051] 上述過程中，在步驟3)、步驟5)、步驟8)后分別取樣，分別記為樣品1、樣品2、樣 品3。
[0052] 按照ZL200710099163. X中實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)過程制備白眉蛇毒血凝酶（設(shè)為對(duì)比 例
[0053] 具體過程包括以下步驟：
[0054] 1)將長白山白眉蝮蛇蛇毒凍干粉（購于沈陽鴻德蛇類養(yǎng)殖有限公司）IOg溶于 40mL pH 7. 5、0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液中，得到濃度為250g/L的白眉蝮蛇蛇毒液，再 將白眉蝮蛇蛇毒液在3000rpm下離心10分鐘，棄去沉淀，保留上清液。
[0055] 2)對(duì)步驟1)獲得的長白山白眉蝮蛇蛇毒液進(jìn)行離子交換柱層析，方法為：層析前 先將DEAE-Sephadex A-50層析柱（柱規(guī)格100 X 5cm，購自廣州深華生物技術(shù)有限公司）用 pH 7. 5、0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液平衡15-20小時(shí)，流速為I. OmL/min，膠床高90cm ;層 析時(shí)，待蛇毒上清液完全移動(dòng)到膠面以下后，在膠面上方加 pH7. 5、0. 05mol/L Tris-HCl緩 沖液50mL，然后用 IOOOmL pH7. 5、0. 05mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液和等量的含NaCl 0. 75mol/ L的pH 7. 5、0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行直線梯度洗脫，流速為I. OmL/min。
[0056] 3)用自動(dòng)餾分收集器收集洗脫液，每管12-15mL，在280nm的波長下對(duì)洗脫液進(jìn)行 紫外分光光度計(jì)檢測，得到波長280nm吸收?qǐng)D譜，收集具有凝血活性的部分，方法為：將預(yù) 熱至37°C的0. 5mL收集液和0. 5mL凝血質(zhì)控血漿（美國太平洋試劑公司）混合并在37°C 下水浴，能使血漿在20秒內(nèi)凝固的收集部分為具有凝血活性的。收集液量約300mL，總活性 約 18000 單位（KU)。
[0057] 4)層析除鹽：對(duì)步驟3)獲得的具有凝血活性的收集液進(jìn)行凝膠過濾層析，方法 為：層析前先將Sephadex G-15層析柱（柱的規(guī)格為100X5cm，購自廣州深華生物技術(shù) 有限公司）用注射用水平衡15-20小時(shí)，流速為I. OmL/min，膠床高80cm ;層析時(shí)，待上清 液完全移動(dòng)到膠面以下后，在膠面上方加注射水50mL，然后用2000mL注射水洗脫，流速為 I. OmL/min ;用與步驟3)相同的方法收集洗脫液中具有凝血活性的部分，結(jié)果獲得收集液 約180mL，總活性約15000KU。
[0058] 5)再層析：調(diào)節(jié)步驟4)收集的具有凝血活性的收集液的pH值至5. 2,然后對(duì) 其進(jìn)行離子交換柱層析，方法為：層析前先將DEAE-Sephadex A-50層析柱（柱的規(guī)格為 100父5〇11，購自廣州深華生物技術(shù)有限公司）用？冊(cè).2、0.05111〇1/1的1^8-!1(：1緩沖液平 衡15-20小時(shí)，流速為0. 8-1. OmL/min，膠床高90cm ;層析時(shí)，待收集液完全移動(dòng)到膠面 以下后，在膠面上方加 pH5.2、0.05mol/L Tris-HCl緩沖液50mL，然后用IOOOmL pH5. 2、 0· 05mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液和等量的含 NaCl 0· 25mol/L 的 ρΗ5· 2、0· 05mol/L 的 Tris-HCl緩沖液進(jìn)行直線梯度洗脫，流速為I. OmL/min ;用與步驟3)相同的方法收集洗脫 液中具有凝血活性的部分，結(jié)果獲得收集液約150mL，總活性約14000KU。
[0059] 6)凍干；將收集液放入冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥，得到凍干粉。
[0060] 7)將步驟6)獲得的凍干粉用20mL注射用水復(fù)溶。
[0061] 8)對(duì)步驟7)獲得的復(fù)溶液進(jìn)行凝膠過濾層析，方法為：層析前先將Sephadex G-75層析柱（柱的規(guī)格為100X5cm，購自廣州深華生物技術(shù)有限公司）用注射水平衡 15-20小時(shí)，流速為0. 8-1. OmL/min，膠床高90cm ;層析時(shí)，待上清液完全移動(dòng)到膠面以下 后，在膠面上方加注射水50mL，然后用2000mL注射水洗脫，流速為I. OmL/min ;用與步驟3) 相同的方法收集洗脫液中具有凝血活性的部分，得到約IOOmL白眉蛇毒血凝酶原液，總活 性約12000單位。
[0062] 嚴(yán)格按照上述方法進(jìn)行操作，在步驟3)、步驟5)、步驟8)后分別取樣，分別記為樣 品4、樣品5、樣品6。
[0063] 將上述樣品1 一樣品6按照常規(guī)方法做SDS-聚丙烯酰胺電泳分析，所得電泳結(jié)果 如圖1所示。
[0064] 從電泳圖可以看出，在第一次DEAE-S印hadex A-50層析過后，34000D的主成分上 方有一條雜帶（見樣品1和樣品4)，本發(fā)明經(jīng)過堿液水解則將此雜帶除掉了（見樣品2)， 而專利200710099163. X提供的方案中經(jīng)過第二次DEAE-S印hadex A-50層析后也能夠?qū)⒃?雜帶除掉（見樣品5)。樣品2在65000D處出現(xiàn)多出的一條帶是添加的牛血清白蛋白。
[0065] 實(shí)施例2牛血清白蛋白用量篩選
[0066] 按照實(shí)施例1中的方案重復(fù)試驗(yàn)，固定其他條件，改變牛血清白蛋白的用量，以確 定最佳用量，結(jié)果如圖2所示。
[0067] 試驗(yàn)結(jié)果表明，牛血白蛋白用量過高或者過低，都會(huì)影響蛇毒血凝酶的收率，最佳 濃度為 1. 2 -I. 5mg/ml 〇
[0068] 實(shí)施例3、白眉蛇毒血凝酶的活性測定
[0069] -、凝血質(zhì)控血漿凝固時(shí)間測定
[0070] 將實(shí)施例1獲得的白眉蛇毒血凝酶濃縮液（40單位（KU)/mL)用蒸餾水稀釋成不 同的濃度（白眉蛇毒血凝酶含量分別為5、2、1、0. 8、0. 6和0. 4KU/mL)，然后分別取37°C下 預(yù)熱的各濃度的稀釋液0. 2mL，分別與在37°C條件下預(yù)熱凝血質(zhì)控血漿（美國太平洋試劑 生產(chǎn)）混合，在37°C條件下記錄血漿凝固時(shí)間。結(jié)果如表1所示，再以白眉蛇毒血凝酶含 量（KU/mL)的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，以凝血質(zhì)控血漿凝固時(shí)間為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸 方程，Y = 62. 894X+0. 532, R2= 0. 995。上述檢測結(jié)果表明，白眉蛇毒血凝酶能使凝血質(zhì)控 血漿凝固，并且在〇. 4-5KU/mL之間，血凝酶濃度的倒數(shù)和人血漿凝固時(shí)間有很好的線性關(guān) 系。
[0071] 表1不同含量的白眉蛇毒血凝酶稀釋液測得的凝血質(zhì)控血漿凝固時(shí)間
[0072]
【權(quán)利要求】
1. 一種從白眉蝮蛇蛇毒中提取白眉蛇毒血凝酶的方法，包括下述步驟： 1) 將長白山白眉蝮蛇蛇毒溶于pH 7-8、0. 04-0. 06mol/L的Tris-HCl緩沖液中，得到濃 度為200-300g/L的白眉蝮蛇蛇毒液； 2) 對(duì)步驟1)獲得的長白山白眉蝮蛇蛇毒液進(jìn)行離子交換柱層析，所述離子交換柱層 析中，固相填充物為DEAE-S印hadexA-50,洗脫液為：NaCl濃度為0-0? 75mol/L的pH 7-8、 0. 04-0. 06mol/L的Tris-HCl緩沖液，所采用的洗脫方式為梯度洗脫； 3) 收集步驟2)中的洗脫液；在280nm的波長下對(duì)所述洗脫液進(jìn)行紫外分光光度計(jì)檢 測，收集在280nm的波長下具有吸收峰的洗脫液，并對(duì)該洗脫液進(jìn)行凝血活性檢測，合并具 有凝血活性的洗脫液； 4) 向所述具有凝血活性的洗脫液中加入牛血清白蛋白，然后將混合液在4°C環(huán)境冷藏 4小時(shí)，得到冷藏后的混合液； 5) 堿性水解：向冷藏后的混合液中加入NaOH，使NaOH的濃度為0. 05mol/L，然后在 37. 5±0. 5°C環(huán)境中反應(yīng)15 - 17小時(shí)； 6) 凍干：將步驟5)反應(yīng)后所得溶液進(jìn)行冷凍干燥，得到凍干粉； 7) 將步驟6)獲得的凍干粉用注射用水復(fù)溶； 8) 將復(fù)溶液進(jìn)行凝膠過濾層析，所述凝膠過濾層析中固相填充物為Sephadex G-75,洗 脫液為注射用水，收集洗脫液，從中收集具有凝血活性的部分，得到白眉蛇毒血凝酶原液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟1)所述pH 7-8、0. 04-0. 06mol/ L 的 Tris-HCl 緩沖液為 pH 7. 5、0. 05mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液； 所述步驟1)還包括用離心的方法去除所述白眉蝮蛇蛇毒液中雜質(zhì)的步驟。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步驟2)中的DEAE-Sephadex A-50層析柱在使用前，先用pH 7-8、0. 04-0. 06mol/L的Tris-HCl緩沖液平衡15-20小時(shí)， 流速為0. 8-1. OmL/min ;層析時(shí)，待白眉蝮蛇蛇毒液完全移動(dòng)到膠面以下后，在膠面上方加 與平衡液一致的緩沖液，然后依次用pH 7-8、0. 04-0. 06mol/L的Tris-HCl緩沖液和等體積 的NaCl濃度為0? 75mol/L的pH 7-8、0. 04-0. 06mol/L的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行直線梯度洗 脫，流速為 〇? 8-1. OmL/min。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：所述步驟3)中所述步驟2)中 的洗脫液的方法為：用自動(dòng)餾分收集器收集，每管12_15mL ;所述凝血活性檢測的方法為： 將等體積并預(yù)熱至37°C的收集液和凝血質(zhì)控血漿混合并在37°C下水浴，能使血漿在20秒 內(nèi)凝固的收集部分為具有凝血活性的洗脫液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：步驟4)中所述冷藏后的混合 液中牛血清白蛋白的濃度為1. 2 - 1. 5mg/ml。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：步驟8)中的Sephadex G-75 層析柱在使用前，先用注射水平衡15-20小時(shí)，流速為0. 8-1. OmL/min ;層析時(shí)，待上清液完 全移動(dòng)到膠面以下后，在膠面上方加注射水，然后用注射水洗脫，流速為〇. 8-1. OmL/min。
7. 權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述方法制備得到的白眉蛇毒血凝酶。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的白眉蛇毒血凝酶，其特征在于：所述白眉蛇毒血凝酶N-末端 的15位氨基酸殘基序列如序列表中的序列1所示。
【文檔編號(hào)】A61P7/04GK104498464SQ201410821963
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月24日
【發(fā)明者】王鵬, 余江天, 王丹, 王艷秋 申請(qǐng)人:錦州奧鴻藥業(yè)有限責(zé)任公司