一種中草藥的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液及其制備和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種中草藥的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液及其制備和應(yīng)用，中草藥為五倍子，通過(guò)抑制多殺性巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌篩選試驗(yàn)，五倍子可以抑制多殺性巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)，運(yùn)用枯草芽孢桿菌AP139對(duì)五倍子進(jìn)行發(fā)酵，在動(dòng)物養(yǎng)殖舍中進(jìn)行噴霧，發(fā)酵后中草藥對(duì)空氣中多殺性巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)具有顯著的抑制特性，效果優(yōu)于枯草芽孢桿菌AP139單獨(dú)發(fā)酵組和中草藥對(duì)照組，具有較好的應(yīng)用前景。CCTCC NO:M 20140532014.02.28
【專利說(shuō)明】一種中草藥的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液及其制備和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵殺菌劑領(lǐng)域，具體涉及一種中草藥五倍子的枯草芽孢桿菌 發(fā)酵液及其制備方法，和其用于抑制多殺性巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌是畜、禽、野生動(dòng)物和人類的一種重要共患性病 原體，主要通過(guò)呼吸道傳播。多殺性巴氏桿菌可引發(fā)禽霍亂、豬肺疫和牛出血型敗血癥等， 產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌還可引起豬萎縮性鼻炎，金黃色葡萄球菌可引起奶牛乳腺炎、食品污 染、傷口化膿等。金黃色葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌遍布空氣、水、人畜排泄物，在畜禽養(yǎng)殖 場(chǎng)中普遍存在多殺性巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌，在不使用抗生素的畜禽舍發(fā)病率較高。
[0003] 隨著畜禽養(yǎng)殖集約化和規(guī)模化程度不斷提高，養(yǎng)殖場(chǎng)空氣質(zhì)量逐漸降低，多殺性 巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌引起動(dòng)物發(fā)病的概率和損害程度不斷增加。目前，養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)多 殺性巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌引起的疾病進(jìn)行控制主要通過(guò)抗生素進(jìn)行預(yù)防和治療。然 而，抗生素的大量使用引起內(nèi)源性感染和二重感染、細(xì)菌耐藥菌株的產(chǎn)生、畜禽免疫力下降 和畜產(chǎn)品及環(huán)境中殘留引起二次污染等一系列嚴(yán)重問(wèn)題，很多國(guó)家和地區(qū)比如歐盟和韓國(guó) 都已經(jīng)禁止使用抗生素。因此，如何在對(duì)人和環(huán)境影響較小或不影響的條件下，有效預(yù)防多 殺性巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌的感染與傳播，是一個(gè)急需解決的問(wèn)題。
[0004] 本發(fā)明研制的中草藥枯草芽孢桿菌發(fā)酵液能有效抑制畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)中多殺性巴氏 桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，降低畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)多殺性巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌發(fā)病 率，減少常規(guī)消毒劑的使用，具有環(huán)保、無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，在我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)中具有良好 的應(yīng)用前景。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的主要目的是提供一種中草藥五倍子的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液及其制備和 應(yīng)用方法，該發(fā)酵液能顯著的抑制養(yǎng)殖舍中多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)繁殖， 降低養(yǎng)殖場(chǎng)由多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌引起的發(fā)病率，減少畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)消毒劑和 抗生素的使用。
[0006] -種中草藥的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的制備方法：由保藏編號(hào)為CCTCCN0:M 2014053的枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis)AP139和中草藥五倍子進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng) 制成。
[0007] 上述方法發(fā)酵培養(yǎng)后枯草芽孢桿菌含量為108CFU/ml-109CFU/ml。
[0008] 上述方法中五倍子添加質(zhì)量比例為液體發(fā)酵培養(yǎng)基的1-5%。
[0009] 上述方法具體是將經(jīng)過(guò)搖瓶培養(yǎng)所得到的枯草芽孢桿菌AP139液體培養(yǎng)液，按照 液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積百分比1-5%接種量，接種到發(fā)酵罐中，液體發(fā)酵培養(yǎng)基成分及質(zhì)量百 分比為：細(xì)菌學(xué)蛋白胨1%、氯化鈉0. 5%、葡萄糖1%，七水硫酸鎂1%，五倍子粉1-5%，pH 值自然；發(fā)酵條件為：裝液量體積百分比40-70%，發(fā)酵溫度30-40°C，pH值自然，發(fā)酵時(shí)間 24-36h，轉(zhuǎn)速，200-400r/min。
[0010] 上述方法發(fā)酵前先將保存的枯草芽孢桿菌AP139進(jìn)行復(fù)活：
[0011] 枯草芽孢桿菌AP139在LB固體培養(yǎng)基上，在恒溫生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行劃線培養(yǎng)， 培養(yǎng)溫度30-37°C，培養(yǎng)時(shí)間18-24h ;LB固體培養(yǎng)基成分及質(zhì)量百分比為：細(xì)菌學(xué)蛋白胨 1 %、酵母浸出物〇? 5%、氯化鈉0? 5%、瓊脂粉L 5%，pH值6. 8-7. 2。
[0012] 然后從LB固體培養(yǎng)基上挑取復(fù)活的枯草芽孢桿菌AP139單個(gè)克隆株至裝有100 毫升LB液體培養(yǎng)基的500毫升錐形瓶中，在恒溫生化搖床中進(jìn)行培養(yǎng)，得到枯草芽孢桿菌 AP139液體培養(yǎng)液，培養(yǎng)溫度30-37°C，轉(zhuǎn)速180-220r/min，培養(yǎng)時(shí)間18-24h，LB液體培養(yǎng)基 成分及質(zhì)量百分比為：細(xì)菌學(xué)蛋白胨1 %、酵母浸出物〇. 5%、氯化鈉0. 5%，pH值6. 8-7. 2。
[0013] 上述方法使用的中草藥五倍子在烘箱中烘干，烘干溫度75-80°C，烘干時(shí)間1-2 天；用粉碎機(jī)粉碎至300目備用。
[0014] 一種中草藥的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液，是由上述的方法制備而成的。
[0015] 所述的中草藥的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液用于抑制多殺性巴氏桿菌和金黃色葡萄球 菌，或者用于制備抑制多殺性巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌的制劑。具體是用于制備養(yǎng)殖舍 消毒的制劑或者動(dòng)物飼料的添加劑。
[0016] 將所述枯草芽孢桿菌中草藥發(fā)酵液制備成溶液（枯草芽孢桿菌含量為5 X IO8CFU/ ml)，1000倍稀釋后在養(yǎng)殖舍中進(jìn)行噴霧，噴霧后養(yǎng)殖舍枯草芽孢桿菌AP139的濃度為 5X 105CFU/m3,噴霧后，養(yǎng)殖舍中的多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌的含量顯著降低。
[0017] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0018] 本發(fā)明的中草藥五倍子的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液能通過(guò)抑制空氣多殺性巴氏桿菌 和金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)繁殖，降低多殺性巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌發(fā)病率和危害程度。
[0019] 本發(fā)明枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)AP139的篩選
[0020] 從動(dòng)物腸道中分離得到200多株芽孢桿菌，分別對(duì)這200多株芽孢桿菌進(jìn)行大腸 桿菌、金黃色葡萄球菌、副傷寒沙門氏菌、巴氏桿菌439 (低毒巴氏桿菌）、巴氏桿菌2010 (中 毒巴氏桿菌）、巴氏桿菌2011 (強(qiáng)毒巴氏桿菌）抑菌試驗(yàn)，結(jié)果芽孢桿菌139菌株對(duì)巴氏桿 菌的抑制效果最佳，達(dá)到18-25_，芽孢桿菌139菌株經(jīng)生化及分子生物學(xué)鑒定為枯草芽孢 桿菌，并將其命名為枯草芽孢桿菌AP139。
[0021] 表1、部分芽孢桿菌菌株對(duì)巴氏桿菌及其它致病菌的抑制效果
[0022]
【權(quán)利要求】
1. 一種中草藥的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的制備方法，其特征在于：由保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2014053的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)AP139和中草藥五倍子進(jìn)行液體發(fā)酵 培養(yǎng)制成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的中草藥的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的制備方法，其特征在于：發(fā) 酵培養(yǎng)后枯草芽孢桿菌含量為l〇8_l〇9CFU/ml。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的中草藥的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的制備方法，其特征在于：五 倍子添加質(zhì)量比例為液體發(fā)酵培養(yǎng)基的1-5%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的中草藥的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的制備方法，其特征在于：將 經(jīng)過(guò)搖瓶培養(yǎng)所得到的枯草芽孢桿菌AP139液體培養(yǎng)液，按照液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積百分比 1-5%接種量，接種到發(fā)酵罐中，液體發(fā)酵培養(yǎng)基成分及質(zhì)量百分比為：細(xì)菌學(xué)蛋白胨1%、 氯化鈉0. 5%、葡萄糖1 %，七水硫酸鎂1 %，五倍子粉1-5%，pH值自然；發(fā)酵條件為：裝液 量體積百分比40-70%，發(fā)酵溫度30-401：，口11值自然，發(fā)酵時(shí)間24-3611，轉(zhuǎn)速，200-4001'/ min〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的中草藥的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的制備方法，其特征在于：發(fā) 酵前先將保存的枯草芽孢桿菌AP139進(jìn)行復(fù)活： 枯草芽孢桿菌AP139在LB固體培養(yǎng)基上，在恒溫生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)溫 度30-37°C，培養(yǎng)時(shí)間18-24h ;LB固體培養(yǎng)基成分及質(zhì)量百分比為：細(xì)菌學(xué)蛋白胨1%、酵 母浸出物〇? 5%、氯化鈉0? 5%、瓊脂粉1. 5%，pH值6. 8-7. 2。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的中草藥的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的制備方法，其特征在于：從 LB固體培養(yǎng)基上挑取復(fù)活的枯草芽孢桿菌AP139單個(gè)克隆株至裝有100毫升LB液體培養(yǎng) 基的500毫升錐形瓶中，在恒溫生化搖床中進(jìn)行培養(yǎng)，得到枯草芽孢桿菌AP139液體培養(yǎng) 液，培養(yǎng)溫度30-37°C，轉(zhuǎn)速180-220r/min，培養(yǎng)時(shí)間18-24h，LB液體培養(yǎng)基成分及質(zhì)量百 分比為：細(xì)菌學(xué)蛋白胨1 %、酵母浸出物0. 5%、氯化鈉0. 5%，pH值6. 8-7. 2。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的中草藥的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的制備方法，其特征在于：中 草藥五倍子在烘箱中烘干，烘干溫度75-80°C，烘干時(shí)間1-2天；用粉碎機(jī)粉碎至300目備 用。
8. -種中草藥的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液，其特征在于，是由權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的 方法制備而成的。
9. 權(quán)利要求8所述的中草藥的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的 中草藥的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液用于抑制多殺性巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌，或者用于制備 抑制多殺性巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌的制劑。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的中草藥的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的應(yīng)用方法，其特征在于，所 述的中草藥的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液用于制備養(yǎng)殖舍消毒的制劑或者動(dòng)物飼料的添加劑。
【文檔編號(hào)】A61K35/64GK104351472SQ201410537587
【公開(kāi)日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年10月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月13日
【發(fā)明者】舒燕, 王升平, 劉惠知, 郭照輝, 張德元, 鄔理洋, 周映華, 胡新旭, 高書(shū)鋒, 周小玲, 繆東, 曾發(fā)姣 申請(qǐng)人:湖南省微生物研究院