一種用于肺癌治療的磁性納米復(fù)合物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于肺癌治療的磁性納米復(fù)合物，其特征在于：包括磁性納米微球以及吸附在磁性納米微球上的分子信標(biāo)和mircoRNA特異性抑制劑(包括反義核酸)，所述分子信標(biāo)其序列為5’-Aleax488-CCAGCG-gaaacc+Cagc+Aga+Caa+Tgtagct-CGCTGG-BHQ1-3’，其中CCAGCG為5’端莖狀序列，CGCTGG為3’端莖狀序列，發(fā)光基團(tuán)為Aleax488，萃滅基團(tuán)為BHQ1，gaaacc+Cagc+Aga+Caa+Tgtagct為環(huán)狀序列，其中環(huán)狀序列中用大寫表示的堿基是進(jìn)行鎖核酸修飾處理后的堿基；所述磁性納米微球包括磁性納米顆粒以及在包被磁性納米顆粒表面的聚乳酸-羥基乙酸共聚物。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的優(yōu)點(diǎn)是：本發(fā)明的磁性納米復(fù)合物能抵御活細(xì)胞內(nèi)核酸酶的降解作用，能特異性抑制肺癌內(nèi)miR-221的表達(dá)，從而抑制肺癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移，實(shí)現(xiàn)對肺癌的治療。
【專利說明】一種用于肺癌治療的磁性納米復(fù)合物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于抑制肺癌核酸表達(dá)的磁性納米復(fù)合物，特別涉及一種用于肺癌治療的磁性納米復(fù)合物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]微小RNA(microRNA, miRNA)的檢測方法很多。Northern雜交是檢測miRNA在組織細(xì)胞中的表達(dá)水平的一種簡便而可靠方法，可經(jīng)凝膠電泳檢測miRNA的分子大小經(jīng)典的方法是Northern-blot，但需要總RNA量較多?；蛐酒夹g(shù)和實(shí)時熒光定量PCR被應(yīng)用于miRNA的系統(tǒng)研究和定量檢測，但步驟煩瑣，成本較高，易受到逆轉(zhuǎn)錄效率的限制。熒光原位雜交(FISH)等方法是相對簡化的方法，然而miRNAs原位檢測系統(tǒng)相對較少，主要的原因是低拷貝、且片斷較小。盡管通過采取堿基修飾的探針能顯著提高miRNA/cDNA雜交復(fù)合物熔鏈溫度，miRNA/cDNA雜交復(fù)合物熔鏈溫度過低，難于耐受復(fù)雜的漂洗等過程。更為重要的是，傳統(tǒng)的miRNA檢測方法難以實(shí)現(xiàn)完整細(xì)胞內(nèi)miRNA的特異性檢測。分子信標(biāo)可確保反應(yīng)不受其前體及基因組DNA污染等因素的干擾，對序列高度同源的miRNA也可精確區(qū)分；超寬的定量線性范圍和高度的檢測靈敏度，從幾個拷貝到幾萬個拷貝，定量線性范圍跨越7個數(shù)量級；樣品消耗少，僅需I?1ng的總RNA ;適用范圍廣，總RNA、細(xì)胞裂解物以及純化的RNA都可用于miRNA的定量檢測，尤其適用于活體細(xì)胞miRNA的檢測。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)中已有用于定量檢測miR-221表達(dá)的分子信標(biāo)。而最近發(fā)現(xiàn)的miRNA可能成為腫瘤治療的生物新靶點(diǎn)。不同腫瘤具有不同的miRNA表達(dá)模式，通過miRNA表達(dá)譜的分析，將有助于臨床上對腫瘤進(jìn)行診斷、分期及預(yù)后的估計。miCToRNA的表達(dá)情況與包括I期腫瘤在內(nèi)的肺腺癌的生存相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，人miR-221(hsa-miR-221)高表達(dá)與預(yù)后不良有關(guān)；hsa-miR-221高表達(dá)是預(yù)后不良的因素。miR-221可作為肺癌的一個治療祀點(diǎn)。分子信標(biāo)具有背景信號低，靈敏度高、特異識別性強(qiáng)、操作簡單，不必與未反應(yīng)的探針分離即可實(shí)時檢測，可用于活體分析等優(yōu)點(diǎn)。在生物化學(xué)分析，生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷中有著廣泛的應(yīng)用價值。目前已通過基因芯片篩選出肺癌miRNA表達(dá)譜并對其功能進(jìn)行了鑒定，本發(fā)明選擇與肺癌發(fā)生及預(yù)后相關(guān)的miR-221進(jìn)行檢測，但常規(guī)分子信標(biāo)用于活細(xì)胞內(nèi)mRNA的檢測分析時，由于細(xì)胞內(nèi)核酸酶對分子信標(biāo)骨架的降解和破壞作用，常導(dǎo)致假陽性信號的產(chǎn)生。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明是為了解決上述不足，提供了一種用于肺癌治療的磁性納米復(fù)合物及其制備方法。
[0005]本發(fā)明的上述目的通過以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):一種用于肺癌治療的磁性納米復(fù)合物，其特征在于:包括磁性納米微球以及吸附在磁性納米微球上的分子信標(biāo)，所述分子信標(biāo)其序列為
[0006]5， -Aleax488-CCAGCG-gaaacc+Cagc+Aga+Caa+Tgtagct-CGCTGG-BHQl_3，，其中CCAGCG為5’端莖狀序列，CGCTGG為3’端莖狀序列，發(fā)光基團(tuán)為Alexa488，萃滅基團(tuán)為BHQl, gaaacc+Cagc+Aga+Caa+Tgtagct為環(huán)狀序列，其中環(huán)狀序列中用大寫表示的堿基是進(jìn)行鎖核酸修飾處理后的堿基；所述磁性納米微球包括磁性納米顆粒以及在包被磁性納米顆粒表面的聚乳酸-羥基乙酸共聚物。
[0007]根據(jù)成熟micix)RNA的序列信息來設(shè)計分子信標(biāo)，分子信標(biāo)的具體設(shè)計依據(jù)網(wǎng)站(www.molecular-beacons.0rg)中分子信標(biāo)的設(shè)計原則來進(jìn)行,環(huán)狀探針結(jié)構(gòu)設(shè)計原則為:長度在15?30個堿基之間；與目標(biāo)miRNA能互補(bǔ)配對。莖狀序列結(jié)構(gòu)設(shè)計原則:探針序列的長度為5?7個堿基；GC含量一股在70?80%之間；融鏈溫度比檢測溫度要7?10°C;G堿基不能連接發(fā)光基團(tuán)。發(fā)光基團(tuán)與萃滅基團(tuán)的選擇:發(fā)光基團(tuán)能被相應(yīng)的萃滅基團(tuán)所萃滅，兩個基團(tuán)有一高的信號背景比(2.0以上)。根據(jù)以上原則本發(fā)明為抵御活細(xì)胞內(nèi)核酸酶的降解作用，本發(fā)明對設(shè)計好的分子信標(biāo)中的部分堿基進(jìn)行鎖核酸修飾。鎖核酸(Lockednucleic acid, LNA)是一種新型的核苷酸衍生物,其結(jié)構(gòu)中β-D-呋喃核糖的2’ -0,4’ -C位通過縮水作用形成環(huán)形的氧亞甲基橋這一剛性的縮合結(jié)構(gòu)，改變了核苷酸的幾何和立體性質(zhì)，減小了核糖結(jié)構(gòu)的柔韌性，從而顯著地提高了它的穩(wěn)定性，該構(gòu)象不僅顯著提高了核酸的抗酶切能力，而且提高了雜交親和性。LNA修飾的堿基數(shù)目不應(yīng)超過6個，否則與miRNA結(jié)合速度較慢。本發(fā)明將人miR-221分子信標(biāo)中的4個堿基進(jìn)行了 LNA修飾，上述分子信標(biāo)環(huán)狀序列中的大寫字母即做了 LNA修飾。
[0008]為了進(jìn)一步提高分子信標(biāo)定量檢測的靈敏度和穩(wěn)定性，采用磁性納米微球來提取和純化本發(fā)明所述的分子信標(biāo)。磁性納米微球提取DNA的原理是:在磁性納米顆粒表面包被富含正電荷化學(xué)基團(tuán)的高分子材料(如聚乳酸-羥基乙酸共聚物)，制備成帶正電荷的磁性納米微球。把磁性納米微球加入到DNA提取液中，在偏酸性(PH6.5)的緩沖液中，溶液中的DNA能吸附在帶正電荷納米微球上。采用磁性納米微球做為分子信標(biāo)的載體，提取相應(yīng)DNA，可以去除許多影響PCR擴(kuò)增的雜質(zhì)，提高PCR擴(kuò)增的穩(wěn)定性。此外，一定量的磁性納米微球可以吸附一定量的DNA，有助于獲得相對恒量的模板DNA，提高熒光分子信標(biāo)探針定量檢測的準(zhǔn)確性。
[0009]磁性納米顆粒(MNPs)形成以磁性材料為中心，可包被生物分子的核殼結(jié)構(gòu)，不但具備良好的磁導(dǎo)向性，也具有良好的生物相容性，可與多種功能分子結(jié)合，在活細(xì)胞和活體組織成像方面得到廣泛應(yīng)用。但未經(jīng)修飾的納米顆粒對活細(xì)胞有金屬毒性，故要對納米顆粒進(jìn)行表面修飾。
[0010]進(jìn)一步,所述磁性納米顆粒是Fe3O4磁性納米顆粒。
[0011]Fe3O4磁性納米顆粒便于核磁共振(MRI)顯像，分子信標(biāo)便于熒光顯微鏡顯像，該納米技術(shù)具有雙重顯像功能。
[0012]進(jìn)一步，所述磁性納米復(fù)合物是表面經(jīng)聚乙二醇處理的磁性納米復(fù)合物。
[0013]聚乙二醇(PEG)修飾后的納米顆粒有很好的長循環(huán)穩(wěn)定性，可逃避吞噬系統(tǒng)吞噬，能提高體內(nèi)和體外的生物相容性。
[0014]本發(fā)明的一種用于肺癌治療的磁性納米復(fù)合物的制備方法，其特征在于:包括以下步驟:
[0015]A.設(shè)計需要合成的分子信標(biāo):確定人miR-221序列為5’ -AGCTACATTGTCTGCTGGGTTTC-3’，設(shè)計人miR-221的分子信標(biāo)環(huán)狀序列為GAAACCCAGCAGACAATGTAGCT，發(fā)光基團(tuán)為Alexa488，萃滅基團(tuán)為BHQl ;選定4個環(huán)狀序列中需要進(jìn)行LNA修飾的堿基，則設(shè)計分子信標(biāo)其序列確定為5’ -Aleax488-CCAGCG-gaaacc+Cagc+Aga+Caa+T gtagc t_CGCTGG_BHQ 1-3’，其中環(huán)狀序列中用大寫表示的堿基即確定為要進(jìn)行鎖核酸修飾處理的堿基；
[0016]根據(jù)上述確定的分子信標(biāo)序列可采用分子生物學(xué)技術(shù)(如使用DNA剪切酶，聚合酶等)進(jìn)行合成，也可以在DNA合成儀上采用化學(xué)合成方式進(jìn)行合成；
[0017]B.制備磁性納米Fe3O4顆粒:將20mL的KOH溶液倒入燒瓶中攪拌，再將20mL的KNO溶液加入其中，充分?jǐn)嚢韬?，?mL的FeS04溶液加入，直至反應(yīng)溶液呈墨綠色，并產(chǎn)生一些絮狀物質(zhì)；
[0018]充分?jǐn)嚢枭鲜龇磻?yīng)溶液后移入90°C的水浴中陳化4h，得到黑色Fe3O4凝膠溶液。將上述凝膠溶液置于磁場中，進(jìn)行Fe3O4磁性顆粒與溶液的分離；采用去離子水清洗分離得到的Fe3O4磁性顆粒；將清洗好的Fe3O4顆粒真空干燥出黑色的Fe3O4顆粒粉末。
[0019]C.制備磁性納米微球:用聚乙二醇對上步驟最后得到的Fe3O4顆粒進(jìn)行表面處理，然后將處理后的Fe3O4顆粒分散到10mL無水乙醇中，形成磁流體；將磁流體倒入三口燒瓶中并加入十二燒基硫酸鈉0.3g、10mL苯乙烯,攪拌Ih ;然后在N2環(huán)境下加入與Fe3O4顆粒的質(zhì)量比為1:1的聚乳酸-羥基乙酸共聚物以及ImL的二乙烯基苯，水浴加熱至60°C反應(yīng)Ih ;升溫至75°C，在堿性條件(用0.lmol/L NaOH溶液控制至pH = 10)下進(jìn)行懸浮聚合1h ;進(jìn)而在90°C下陳化，陳化后使用乙醇和水洗滌，最后進(jìn)行磁分離，分離出磁性納米微球；
[0020]D.采用吸附法將制備的磁性納米微球與合成的分子信標(biāo)、miR-221特異性抑制劑組成磁性納米復(fù)合物。
[0021 ] 本發(fā)明的磁性納米復(fù)合物的使用方法:在100 μ L PBS中配制250nmol/L的miR-221分子信標(biāo)，加入3 μ I脂質(zhì)體，于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)共同孵育20min ;制作人體肺癌細(xì)胞切片將含分子信標(biāo)和脂質(zhì)體的PBS直接加到活肺癌細(xì)胞中，并于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育60min，再用5mg/L的DAPI復(fù)染1min后應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察活肺癌細(xì)胞miR-221的表達(dá)。
[0022]共聚焦結(jié)果可見A549、SPC-Al肺癌細(xì)胞內(nèi)可見較強(qiáng)的綠色熒光，主要位于胞漿內(nèi)，胞核可見微弱的少量的點(diǎn)狀熒光信號，背景很低，加入miR-221特異性抑制劑后細(xì)胞內(nèi)綠色熒光信號明顯減弱。用Real-time PCR驗證分子信標(biāo)檢測的miR-221表達(dá)的結(jié)果。共聚焦結(jié)果提示肺癌組織均可見到強(qiáng)度不等的綠色熒光，主要見于腫瘤細(xì)胞胞漿，核內(nèi)也可見到少量點(diǎn)狀的熒光信號，背景很低，加入miR-221特異性抑制劑后組織內(nèi)熒光信號明顯減弱。通過細(xì)胞和組織miR-221表達(dá)水平的檢測結(jié)果，說明本發(fā)明設(shè)計的分子信標(biāo)的可行性和實(shí)用性。復(fù)合物DNase I保護(hù)實(shí)驗和細(xì)胞蛋白孵育實(shí)驗觀察復(fù)合物的生物穩(wěn)定性及釋放效應(yīng)，磁性納米復(fù)合物實(shí)時成像A549和SPC-Al肺癌細(xì)胞，用激光共聚焦觀察成像結(jié)果?；铙w成像系統(tǒng)下可見靜脈注射miR-221特異性拮抗劑的磁性納米復(fù)合物后肺部熒光強(qiáng)度較未加miR-221拮抗劑組熒光強(qiáng)度明顯減弱，這可進(jìn)一步證實(shí)了磁性納米復(fù)合物用于治療肺癌的可行性和實(shí)用性。
[0023]上述磁性納米復(fù)合物制備方法中b步驟采用的是溶膠一凝膠法制備磁性納米Fe3O4顆粒，其優(yōu)點(diǎn)是能夠保證嚴(yán)格控制化學(xué)計量比，易實(shí)現(xiàn)高純化；工藝簡單，反應(yīng)周期短，反應(yīng)溫度低；產(chǎn)物粒徑小，分布均勻，分散性好。另外對b步驟生成的Fe3O4顆粒粉末可用TEM觀察生成的Fe3O4納米顆粒的形貌；用電子衍射(ED)和XRD測量其晶體的結(jié)構(gòu)；用VSM測量其磁性；測量合格后，再進(jìn)行c步驟。對c步驟最后分離出磁性納米微球，可用用X射線儀觀察磁性顆粒內(nèi)Fe3O4磁核的晶形是否完整，并粗略計算Fe3O4的粒徑.用透射電鏡觀察Fe3O4磁核和磁性顆粒的結(jié)構(gòu)和形貌，用紅外光譜儀測定磁性顆粒的官能團(tuán)組成，用振動樣品磁強(qiáng)計測定磁性顆粒的磁飽和強(qiáng)度。d步驟所述“吸附法”是指寡核苷酸探針或靶分子通過次級鍵(例如離子鍵)與固相基質(zhì)表面相連并固定，或者是以非共價鍵作用將寡核昔酸探針或靶分子直接或恒電位吸附到固相基質(zhì)的表面，或者由本發(fā)明探針中的磷酸根負(fù)離子與固相基質(zhì)表面帶正電荷的修飾層通過靜電作用而固定。
[0024]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的優(yōu)點(diǎn)是:本發(fā)明的磁性納米復(fù)合物能抵御活細(xì)胞內(nèi)核酸酶的降解作用，能抑制肺癌內(nèi)miR-221的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對肺癌的治療。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步詳述:
[0026]一種用于肺癌治療的磁性納米復(fù)合物，包括磁性納米微球以及吸附在磁性納米微球上的分子信標(biāo)，所述分子信標(biāo)其序列為
[0027]5， -Aleax488-CCAGCG-gaaacc+Cagc+Aga+Caa+Tgtagct-CGCTGG-BHQl_3，，其中CCAGCG為5’端莖狀序列，CGCTGG為3’端莖狀序列，發(fā)光基團(tuán)為Alexa488，萃滅基團(tuán)為BHQl, gaaacc+Cagc+Aga+Caa+Tgtagct為環(huán)狀序列，其中環(huán)狀序列中用大寫表示的堿基是進(jìn)行鎖核酸修飾處理后的堿基；所述磁性納米微球包括磁性納米顆粒以及在包被磁性納米顆粒表面的聚乳酸-羥基乙酸共聚物。
[0028]根據(jù)成熟micix)RNA的序列信息來設(shè)計分子信標(biāo)，分子信標(biāo)的具體設(shè)計依據(jù)網(wǎng)站(www.molecular-beacons.0rg)中分子信標(biāo)的設(shè)計原則來進(jìn)行,環(huán)狀探針結(jié)構(gòu)設(shè)計原則為:長度在15?30個堿基之間；與目標(biāo)miRNA能互補(bǔ)配對。莖狀序列結(jié)構(gòu)設(shè)計原則:探針序列的長度為5?7個堿基；GC含量一股在70?80%之間；融鏈溫度比檢測溫度要7?10°C;G堿基不能連接發(fā)光基團(tuán)。發(fā)光基團(tuán)與萃滅基團(tuán)的選擇:發(fā)光基團(tuán)能被相應(yīng)的萃滅基團(tuán)所萃滅，兩個基團(tuán)有一高的信號背景比(2.0以上)。根據(jù)以上原則本發(fā)明為抵御活細(xì)胞內(nèi)核酸酶的降解作用，本發(fā)明對設(shè)計好的分子信標(biāo)中的部分堿基進(jìn)行鎖核酸修飾。鎖核酸(Lockednucleic acid, LNA)是一種新型的核苷酸衍生物,其結(jié)構(gòu)中β-D-呋喃核糖的2’ -0,4’ -C位通過縮水作用形成環(huán)形的氧亞甲基橋這一剛性的縮合結(jié)構(gòu)，改變了核苷酸的幾何和立體性質(zhì)，減小了核糖結(jié)構(gòu)的柔韌性，從而顯著地提高了它的穩(wěn)定性，該構(gòu)象不僅顯著提高了核酸的抗酶切能力，而且提高了雜交親和性。LNA修飾的堿基數(shù)目不應(yīng)超過6個，否則與miRNA結(jié)合速度較慢。本發(fā)明將人miR-221分子信標(biāo)中的4個堿基進(jìn)行了 LNA修飾，上述分子信標(biāo)環(huán)狀序列中的大寫字母即做了 LNA修飾。
[0029]為了進(jìn)一步提高分子信標(biāo)定量檢測的靈敏度和穩(wěn)定性，采用磁性納米微球來提取和純化本發(fā)明所述的分子信標(biāo)。磁性納米微球提取DNA的原理是:在磁性納米顆粒表面包被富含正電荷化學(xué)基團(tuán)的高分子材料(如聚乳酸-羥基乙酸共聚物)，制備成帶正電荷的磁性納米微球。把磁性納米微球加入到DNA提取液中，在偏酸性(PH6.5)的緩沖液中，溶液中的DNA能吸附在帶正電荷納米微球上。采用磁性納米微球做為分子信標(biāo)的載體，提取相應(yīng)DNA，可以去除許多影響PCR擴(kuò)增的雜質(zhì)，提高PCR擴(kuò)增的穩(wěn)定性。此外，一定量的磁性納米微球可以吸附一定量的DNA，有助于獲得相對恒量的模板DNA，提高熒光分子信標(biāo)探針定量檢測的準(zhǔn)確性。
[0030]磁性納米顆粒(MNPs)形成以磁性材料為中心，可包被生物分子的核殼結(jié)構(gòu)，不但具備良好的磁導(dǎo)向性，也具有良好的生物相容性，可與多種功能分子結(jié)合，在活細(xì)胞和活體組織成像方面得到廣泛應(yīng)用。但未經(jīng)修飾的納米顆粒對活細(xì)胞有金屬毒性，故要對納米顆粒進(jìn)行表面修飾。
[0031]進(jìn)一步,所述磁性納米顆粒是Fe3O4磁性納米顆粒。
[0032]Fe3O4磁性納米顆粒便于核磁共振(MRI)顯像，分子信標(biāo)便于熒光顯微鏡顯像，該納米技術(shù)具有雙重顯像功能。
[0033]進(jìn)一步，所述磁性納米復(fù)合物是表面經(jīng)聚乙二醇處理的磁性納米復(fù)合物。
[0034]聚乙二醇(PEG)修飾后的納米顆粒有很好的長循環(huán)穩(wěn)定性，可逃避吞噬系統(tǒng)吞噬，能提高體內(nèi)和體外的生物相容性。
[0035]一種用于肺癌治療的磁性納米復(fù)合物的制備方法，包括以下步驟:
[0036]A.設(shè)計需要合成的分子信標(biāo):確定人miR-221序列為5’ -AGCTACATTGTCTGCTGGGTTTC-3’，設(shè)計人miR-221的分子信標(biāo)環(huán)狀序列為GAAACCCAGCAGACAATGTAGCT,發(fā)光基團(tuán)為Alexa488，萃滅基團(tuán)為BHQl ;選定4個環(huán)狀序列中需要進(jìn)行LNA修飾的堿基，則設(shè)計分子信標(biāo)其序列確定為5’ -Aleax488-CCAGCG-gaaacc+Cagc+Aga+Caa+Tgtagct-CGCTGG-BHQ1-3 ’，其中環(huán)狀序列中用大寫表示的堿基即確定為要進(jìn)行鎖核酸修飾處理的堿基；
[0037]根據(jù)上述確定的分子信標(biāo)序列可采用分子生物學(xué)技術(shù)(如使用DNA剪切酶，聚合酶等)進(jìn)行合成，也可以在DNA合成儀上采用化學(xué)合成方式進(jìn)行合成；；
[0038]B.制備磁性納米Fe3O4顆粒:將20mL的KOH溶液倒入燒瓶中攪拌，再將20mL的KNO溶液加入其中，充分?jǐn)嚢韬?，?mL的FeS04溶液加入，直至反應(yīng)溶液呈墨綠色，并產(chǎn)生一些絮狀物質(zhì)；
[0039]充分?jǐn)嚢枭鲜龇磻?yīng)溶液后移入90°C的水浴中陳化4h，得到黑色Fe3O4凝膠溶液。將上述凝膠溶液置于磁場中，進(jìn)行Fe3O4磁性顆粒與溶液的分離；采用去離子水清洗分離得到的Fe3O4磁性顆粒；將清洗好的Fe3O4顆粒真空干燥出黑色的Fe3O4顆粒粉末。
[0040]C.制備磁性納米微球:用聚乙二醇對上步驟最后得到的Fe3O4顆粒進(jìn)行表面處理，然后將處理后的Fe3O4顆粒分散到10mL無水乙醇中，形成磁流體；將磁流體倒入三口燒瓶中并加入十二燒基硫酸鈉0.3g、10mL苯乙烯,攪拌Ih ;然后在N2環(huán)境下加入與Fe3O4顆粒的質(zhì)量比為1:1的聚乳酸-羥基乙酸共聚物以及ImL的二乙烯基苯，水浴加熱至60°C反應(yīng)Ih ;升溫至75°C，在堿性條件(用0.lmol/L NaOH溶液控制至pH = 10)下進(jìn)行懸浮聚合1h;進(jìn)而在90°C下陳化，陳化后使用乙醇和水洗滌，最后進(jìn)行磁分離，分離出磁性納米微球；
[0041]D.采用吸附法將制備的磁性納米微球與合成的分子信標(biāo)、miR-221特異性抑制劑組成磁性納米復(fù)合物。
[0042]本發(fā)明的磁性納米復(fù)合物的使用方法:在100 μ L PBS中配制250nmol/L的miR-221分子信標(biāo)，加入3 μ I脂質(zhì)體，于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)共同孵育20min ;制作人體肺癌細(xì)胞切片將含分子信標(biāo)和脂質(zhì)體的PBS直接加到活肺癌細(xì)胞中，并于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育60min，再用5mg/L的DAPI復(fù)染1min后應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察活肺癌細(xì)胞miR-221的表達(dá)。
[0043]共聚焦結(jié)果可見A549、SPC-Al肺癌細(xì)胞內(nèi)可見較強(qiáng)的綠色熒光，主要位于胞漿內(nèi)，胞核可見微弱的少量的點(diǎn)狀熒光信號，背景很低。用Real-time PCR驗證分子信標(biāo)檢測的miR-221表達(dá)的結(jié)果。共聚焦結(jié)果提示肺癌組織均可見到強(qiáng)度不等的綠色熒光，主要見于腫瘤細(xì)胞胞漿，核內(nèi)也可見到少量點(diǎn)狀的熒光信號，背景很低。通過細(xì)胞和組織miR-221表達(dá)水平的檢測結(jié)果，說明本發(fā)明設(shè)計的分子信標(biāo)的可行性和實(shí)用性。復(fù)合物DNase I保護(hù)實(shí)驗和細(xì)胞蛋白孵育實(shí)驗觀察復(fù)合物的生物穩(wěn)定性及釋放效應(yīng)，磁性納米復(fù)合物實(shí)時成像A549和SPC-Al肺癌細(xì)胞，用激光共聚焦觀察成像結(jié)果。這可進(jìn)一步證實(shí)了 miR-221分子信標(biāo)的可行性和實(shí)用性。
[0044]上述磁性納米復(fù)合物制備方法中b步驟采用的是溶膠一凝膠法制備磁性納米Fe3O4顆粒，其優(yōu)點(diǎn)是能夠保證嚴(yán)格控制化學(xué)計量比，易實(shí)現(xiàn)高純化；工藝簡單，反應(yīng)周期短，反應(yīng)溫度低；產(chǎn)物粒徑小，分布均勻，分散性好。另外對b步驟生成的Fe3O4顆粒粉末可用TEM觀察生成的Fe3O4納米顆粒的形貌；用電子衍射(ED)和XRD測量其晶體的結(jié)構(gòu)；用VSM測量其磁性；測量合格后，再進(jìn)行c步驟。對c步驟最后分離出磁性納米微球，可用用X射線儀觀察磁性顆粒內(nèi)Fe3O4磁核的晶形是否完整，并粗略計算Fe3O4的粒徑.用透射電鏡觀察Fe3O4磁核和磁性顆粒的結(jié)構(gòu)和形貌，用紅外光譜儀測定磁性顆粒的官能團(tuán)組成，用振動樣品磁強(qiáng)計測定磁性顆粒的磁飽和強(qiáng)度。d步驟所述“吸附法”是指寡核苷酸探針或靶分子通過次級鍵(例如離子鍵)與固相基質(zhì)表面相連并固定，或者是以非共價鍵作用將寡核昔酸探針或靶分子直接或恒電位吸附到固相基質(zhì)的表面，或者由本發(fā)明探針中的磷酸根負(fù)離子與固相基質(zhì)表面帶正電荷的修飾層通過靜電作用而固定。
[0045]以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的【技術(shù)領(lǐng)域】，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種用于肺癌治療的磁性納米復(fù)合物，其特征在于:包括磁性納米微球以及吸附在磁性納米微球上的分子信標(biāo)，所述分子信標(biāo)其序列為5’-Aleax488-CCAGCG-gaaacc+Cagc+Aga+Caa+Tgtagct-CGCTGG-BHQl-3’，其中 CCAGCG 為 5’ 端莖狀序列，CGCTGG 為 3’ 端莖狀序列，發(fā)光基團(tuán)為Aleax488,萃滅基團(tuán)為BHQ1, gaaacc+Cagc+Aga+Caa+Tgtagct為環(huán)狀序列，其中環(huán)狀序列中用大寫表示的堿基是進(jìn)行鎖核酸修飾處理后的堿基；所述磁性納米微球包括磁性納米顆粒以及在包被磁性納米顆粒表面的聚乳酸-羥基乙酸共聚物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于肺癌治療的磁性納米復(fù)合物，其特征在于:所述磁性納米顆粒是Fe304磁性納米顆粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于肺癌治療的磁性納米復(fù)合物，其特征在于:所述磁性納米復(fù)合物是表面經(jīng)聚乙二醇處理的磁性納米復(fù)合物。
4.一種用于肺癌治療的磁性納米復(fù)合物的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: A.設(shè)計需要合成的分子信標(biāo):確定人miR-221序列為5’ -AGCTACATTGTCTGCTGGGTTTC-3’，設(shè)計人miR-221的分子信標(biāo)環(huán)狀序列為GAAACCCAGCAGACAATGTAGCT，發(fā)光基團(tuán)為Alexa488，萃滅基團(tuán)為BHQ1 ;選定4個環(huán)狀序列中需要進(jìn)行LNA修飾的堿基，則設(shè)計分子信標(biāo)其序列確定為5’ -Aleax488-CCAGCG-gaaacc+Cagc+Aga+Caa+Tgtagct-CGCTGG-BHQl-3’，其中環(huán)狀序列中用大寫表示的堿基即確定為要進(jìn)行鎖核酸修飾處理的堿基； 根據(jù)上述確定的分子信標(biāo)序列可采用分子生物學(xué)技術(shù)(如使用DNA剪切酶，聚合酶等)進(jìn)行合成，也可以在DNA合成儀上采用化學(xué)合成方式進(jìn)行合成； B.制備磁性納米Fe304顆粒:將20mL的KOH溶液倒入燒瓶中攪拌，再將20mL的KNO溶液加入其中，充分?jǐn)嚢韬?，?0mL的FeS04溶液加入，直至反應(yīng)溶液呈墨綠色，并產(chǎn)生一些絮狀物質(zhì)； 充分?jǐn)嚢枭鲜龇磻?yīng)溶液后移入90°C的水浴中陳化4h，得到黑色Fe304凝膠溶液。將上述凝膠溶液置于磁場中，進(jìn)行Fe304磁性顆粒與溶液的分離；采用去離子水清洗分離得到的Fe304磁性顆粒；將清洗好的Fe304顆粒真空干燥出黑色的Fe304顆粒粉末。 C.制備磁性納米微球:用聚乙二醇對上步驟最后得到的Fe304顆粒進(jìn)行表面處理，然后將處理后的Fe304顆粒分散到lOOmL無水乙醇中，形成磁流體；將磁流體倒入三口燒瓶中并加入十二烷基硫酸鈉0.3g、10mL苯乙烯，攪拌lh ;然后在N2環(huán)境下加入與Fe304顆粒的質(zhì)量比為1: 1的聚乳酸-羥基乙酸共聚物以及l(fā)mL的二乙烯基苯，水浴加熱至60°C反應(yīng)lh;升溫至75°C，在堿性條件下進(jìn)行懸浮聚合10h ;進(jìn)而在90°C下陳化，陳化后使用乙醇和水洗滌，最后進(jìn)行磁分離，分離出磁性納米微球； D.采用吸附法將制備的磁性納米微球與合成的分子信標(biāo)、miR-221特異性抑制劑組成磁性納米復(fù)合物。
【文檔編號】A61K49/18GK104293921SQ201410478038
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月18日
【發(fā)明者】姚權(quán), 張濤, 李華, 蘇曉妹, 許川, 李 東, 徐紅玉, 朱亞杰 申請人:中國人民解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院