疫苗組合物及其在腫瘤治療中的用途
【專利摘要】本申請涉及一種治療腫瘤的疫苗組合物，具體地，是包含E75肽和gp96蛋白的疫苗組合物。本申請還涉及制備上述疫苗組合物的方法以及上述疫苗組合物在治療腫瘤中的用途。
【專利說明】疫苗組合物及其在腫瘤治療中的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本申請涉及一種治療腫瘤的疫苗組合物，具體地，是包含E75肽和gp96蛋白的疫苗組合物。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著對免疫應(yīng)答分子機(jī)制的深入研究，人們已經(jīng)意識到機(jī)體的免疫細(xì)胞并不是一一對應(yīng)于各種各樣的病原體或天然抗原的整體分子，而是針對各種各樣抗原分子的抗原表位，蛋白質(zhì)抗原通過其表位來體現(xiàn)其免疫特異性。基于抗原分子的免疫干預(yù)手段已不再停留在病原體或天然抗原的整體水平，而是開始向表位水平過渡。腺病毒和慢病毒載體目前已廣泛應(yīng)用于腫瘤的免疫治療中，并且取得不錯的抗腫瘤免疫效應(yīng)，但是這類疫苗最大問題在于病毒載體本身所帶來的一系列安全性問題。相對于病毒載體疫苗，多肽疫苗具有便于設(shè)計(jì)合成，價格低廉，安全性能好等優(yōu)點(diǎn)。
[0003]HER2/neu是表皮生長因子受體家族的成員并且編碼185kd參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長及繁殖的酪氨酸激酶受體。在很多類型的腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了 HER/neu的過表達(dá)和/或擴(kuò)增。通過臨床研究，發(fā)現(xiàn)可以靶向HER2/neu的腫瘤相關(guān)抗原(TAA)上的表位的細(xì)胞免疫應(yīng)答的接種疫苗和有效免疫治療。E75 (KIFGSLAFL，HER2/neu，369-377)是HER2/neu原癌基因家族肽序列，能夠刺激細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)來破壞癌細(xì)胞，已用作預(yù)防和治療腫瘤的疫苗，特別適用于乳腺癌。但是E75屬于短肽，分子量小，表位單一，并不能很有效地刺激免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。
[0004]熱休克蛋白gp96 (又稱GRP94)是位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的熱休克蛋白90家族中的一員，在天然免疫和獲得性免疫中發(fā)揮著重要作用。正常情況下，gp96在細(xì)胞中呈持續(xù)性低水平表達(dá)，應(yīng)激條件下其表達(dá)明顯增加。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，由于腫瘤組織生長快，致使腫瘤缺血、缺氧及局部酸中毒，這些應(yīng)激條件誘使腫瘤組織產(chǎn)生熱休克蛋白，高水平的熱休克蛋白可保護(hù)腫瘤細(xì)胞戰(zhàn)勝機(jī)體內(nèi)各種不利的生理環(huán)境，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。加熱、放療等刺激因素可使gp96等HSP的表達(dá)水平提高，同時也使腫瘤的免疫原性增加，且表達(dá)量隨腫瘤免疫原性增強(qiáng)而增強(qiáng)，因此gp96能作為分子伴侶結(jié)合細(xì)胞中的腫瘤抗原、病毒抗原或胞內(nèi)細(xì)菌抗原，并將結(jié)合的抗原表位呈遞給抗原遞呈細(xì)胞的MHCI類和II類分子，從而啟動特異性T細(xì)胞⑶8+和⑶4+T細(xì)胞免疫應(yīng)答。另一方面，gp96分子本身作為免疫活性分子通過與Toll樣受體(TLR)作用，促進(jìn)CD8+和CD4+T細(xì)胞細(xì)胞增殖和分泌細(xì)胞因子，并促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞成熟并增強(qiáng)其功能。已有實(shí)驗(yàn)室研究gp96的生物學(xué)功能和其作為疫苗佐劑開發(fā)的潛能。但目前尚未公開過有關(guān)包含E75肽和gp96蛋白的疫苗組合物的研究。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明為了解決現(xiàn)有E75肽在用作腫瘤疫苗時表位單一、免疫原性不強(qiáng)，治療效果不好的缺點(diǎn)，開發(fā)研制了包含E75肽和gp96蛋白的疫苗組合物。
[0006]本發(fā)明的一個技術(shù)方案涉及一種疫苗組合物，包含E75肽和gp96蛋白。
[0007]如上所述的疫苗組合物，其中E75的含量為1-1000微克/毫升。并且E75肽與gp96蛋白的含量比例為1:1。
[0008]本發(fā)明的另一個技術(shù)方案涉及制備上述疫苗組合物的方法。
[0009]本發(fā)明的另一個技術(shù)方案涉及上述疫苗組合物在治療腫瘤中的用途。腫瘤類型包括乳腺癌，前列腺癌，肺癌和淋巴癌。優(yōu)選肺癌和前列腺癌。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010]附圖1:測定各組成熟樹突細(xì)胞對不同細(xì)胞株的殺傷作用，以無關(guān)多肽COl組為對照，由圖可知，分別使用C01、gp96以及C01+gp96誘導(dǎo)成熟的樹突細(xì)胞對各種細(xì)胞均無明顯的殺傷作用；E75和E75+gp96組表現(xiàn)出了殺傷腫瘤細(xì)胞株的效果，而E75+gp96組的殺傷作用遠(yuǎn)高于E75組。同時，所有組的樹突細(xì)胞對非腫瘤細(xì)胞HEK293均無明顯的殺傷作用。(相對于 COl 組，*ρ〈0.05，**ρ〈0.01，_ρ〈0.001)
【具體實(shí)施方式】
[0011]本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】通過下面的實(shí)施例體現(xiàn)。但需要注意的是，盡管出于理解的清楚通過【具體實(shí)施方式】描述了本發(fā)明但對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見的是，鑒于這一發(fā)明的教導(dǎo)，可以對其進(jìn)行某些改變和修飾而不悖離本發(fā)明權(quán)利要求的精神和范圍。
[0012]實(shí)施例1Ε75肽的制備
[0013]Ε75肽通過多肽合成儀合成，經(jīng)RP-HPLC純化，HPLC-質(zhì)譜聯(lián)用鑒定產(chǎn)生分子量為995，與本多肽理論分子量相符，純度達(dá)95%以上。另合成一段隨機(jī)短肽COl作為對照。
[0014]實(shí)施例2gp9蛋白的制備
[0015]已有研究證明，腫瘤細(xì)胞在熱應(yīng)激誘導(dǎo)下，gp96蛋白將迅速表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)gp96濃度迅速增加，而其他蛋白表達(dá)趨于停止。將腫瘤細(xì)胞置于42°C環(huán)境中培養(yǎng)25min，檢測gp96的濃度。利用反復(fù)凍融使腫瘤細(xì)胞裂解釋放gp96蛋白，采用ConA-Sepharose親和層析、G25過濾層析和DEAE-S印harose離子交換層析收集，NaCl鹽溶液洗脫脫鹽分離純化gp96蛋白，并經(jīng)SDS-PAGE及Westernblot鑒定。
[0016]實(shí)施例3樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)
[0017]取外周血100ml，低滲破除紅細(xì)胞后密度梯度離心分離白膜，以含10%小牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得貼壁單個核細(xì)胞，將細(xì)胞調(diào)至IxlO6Ail后，加入含GM-CSF100ng/ml、IL_420ng/ml的培養(yǎng)液，培養(yǎng)板中培養(yǎng)3天后作細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和S-100染色，獲得樹突狀細(xì)胞。
[0018]實(shí)施例4樹突狀細(xì)胞的誘導(dǎo)
[0019]將純化的COl短肽添加至樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)液中至終濃度為500微克/毫升，繼續(xù)培養(yǎng)3天，將未成熟樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)為成熟樹突狀細(xì)胞。
[0020]將純化的E75短肽添加至樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)液中至終濃度為500微克/毫升，繼續(xù)培養(yǎng)3天，將未成熟樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)為成熟樹突狀細(xì)胞。
[0021]將純化的gp96蛋白添加至樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)液中至終濃度為500微克/毫升，繼續(xù)培養(yǎng)3天，將未成熟樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)為成熟樹突狀細(xì)胞。
[0022]將純化的E75短肽+gp96蛋白添加至樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)液中至終濃度均為500微克/毫升，繼續(xù)培養(yǎng)3天，將未成熟樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)為成熟樹突狀細(xì)胞。
[0023]實(shí)施例5抗腫瘤效應(yīng)檢測
[0024]5.1靶細(xì)胞的準(zhǔn)備
[0025]Raji淋巴瘤，MCF-7乳腺癌，PC-3前列腺癌，SBC-5小細(xì)胞肺癌，HEK-293購于ATCC。
[0026]5.2效應(yīng)細(xì)胞的制備培養(yǎng)
[0027]將實(shí)施例4制備的各組DC細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞按1:5比例共同培養(yǎng)3天后，收集懸浮細(xì)胞作為細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)。
[0028]5.3CTL對腫瘤細(xì)胞殺傷活性的檢測
[0029]采用MTT法，取對數(shù)生長期的Raji淋巴瘤細(xì)胞，MCF7乳腺癌細(xì)胞，PC3前列腺癌細(xì)胞，SBC5小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，HEK293細(xì)胞，細(xì)胞濃度為I X 105/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，10ul/孔。將上述制備的各組效應(yīng)細(xì)胞按照效靶比(E/T)為20:1與三組靶細(xì)胞混合，同時設(shè)置只加入相應(yīng)T細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)對照組，37°C,5% CO2條件下培養(yǎng)6?8h，吸去上清，加入PBS漂洗除去懸浮細(xì)胞后，重新加入200ul新鮮培養(yǎng)基，加入MTT溶液(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，吸去上清，加入DMSO終止反應(yīng)，570nm波長處測吸光值(OD)，計(jì)算殺傷活性。每組均為5復(fù)孔測定。
[0030]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，按實(shí)施例3-5中所述方法測定各組成熟樹突細(xì)胞對不同細(xì)胞株的殺傷作用，以無關(guān)多肽COl組為對照，由圖可知，分別使用C01、gp96以及C01+gp96誘導(dǎo)成熟的樹突細(xì)胞對各種細(xì)胞均無明顯的殺傷作用；E75和E75+gp96組表現(xiàn)出了殺傷腫瘤細(xì)胞株的效果，而E75+gp96組的殺傷作用遠(yuǎn)高于E75組。同時，所有組的樹突細(xì)胞對非腫瘤細(xì)胞HEK293均無明顯的殺傷作用。(相對于COl組，*ρ〈0.05，**ρ〈0.01，_ρ〈0.001)。
【權(quán)利要求】
1.一種疫苗組合物，包含E75肽和gp96蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其中E75的含量為1-1000微克/毫升。
3.如權(quán)利要求1或2所述的疫苗組合物，其中E75肽與gp96蛋白的含量比例為1:1。
4.制備權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述疫苗組合物的方法。
5.如權(quán)利要求1-3所述疫苗組合物在制備治療腫瘤的制劑中的用途，其中腫瘤類型包括乳腺癌，前列腺癌，肺癌和淋巴癌，優(yōu)選肺癌和前列腺癌。
【文檔編號】A61K39/00GK104174015SQ201410419432
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月22日
【發(fā)明者】蘇韻鑒 申請人:廣州安辰醫(yī)藥科技有限公司