低分子量堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子lmwfgf2的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種低分子量堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子LMWFGF2在制備抗肝臟纖維化藥物中的應(yīng)用；本發(fā)明低分子量堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子LMWFGF2能夠抑制HSCs活化標(biāo)志基因a平滑肌肌動(dòng)蛋白（a-SMA)和I型膠原[colI(a1)]表達(dá)，進(jìn)而能夠抑制肝星狀細(xì)胞活化、降低肝臟纖維化。
【專利說(shuō)明】低分子量堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子LMW FGF2的應(yīng)用 (一）
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種低分子量堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子LMW FGF2的應(yīng)用，特別涉及在 制備抗肝臟纖維化藥物中的應(yīng)用。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002] 肝纖維化和肝硬化是肝炎、肝代謝性疾病等慢性肝臟疾病的主要病理特征，嚴(yán)重 威脅健康和生命，是人類面臨的重大醫(yī)學(xué)難題。在我國(guó)，乙型肝炎尤其是慢性活動(dòng)性乙型肝 炎患者中，10% -15%的患者可能在5-10年內(nèi)發(fā)展為肝炎后肝硬化。在"慢性肝損傷一肝 纖維化一肝硬化"的慢性肝病發(fā)展過(guò)程中，肝纖維化的防治是關(guān)鍵，但對(duì)此目前仍缺乏行之 有效的方法。因此開(kāi)發(fā)有效的抗肝纖維化治療藥物和手段顯得十分迫切。
[0003] 肝臟纖維化通常源于肝組織中胞外基質(zhì)積聚和降解失衡，膠原等基質(zhì)成分過(guò)度 積累，而在此過(guò)程中，肝星狀細(xì)胞（HSCs)發(fā)揮了關(guān)鍵作用。正常情況下HSCs靜息于肝內(nèi) 竇狀間隙中，是一類具有脂肪性質(zhì)的細(xì)胞，受到肝損傷信號(hào)刺激，該類細(xì)胞丟失脂肪性質(zhì)， 活化為具有一定伸縮性的成肌纖維樣母細(xì)胞，并向肝實(shí)質(zhì)中遷移，同時(shí)表達(dá)細(xì)胞骨架蛋白 a -SMA并大量分泌I型膠原等胞外基質(zhì)，最終導(dǎo)致肝臟纖維化發(fā)生。因此，抑制HSC活化將 是抗肝纖維化治療的有效策略。
[0004] 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族中的一員，因?yàn)槌衫w維細(xì)胞生 長(zhǎng)因子2的等電點(diǎn)（9. 6)在溶液中位于堿性pH范圍內(nèi)，故又叫堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2對(duì)間充質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)來(lái)源和上皮來(lái)源的細(xì)胞具有有絲分裂促進(jìn)活性 的作用，還可以增加人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的體外增殖能力，在體內(nèi)、體外均有明顯的促進(jìn)新生 血管形成作用，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞具有強(qiáng)烈的有絲分裂作用，促進(jìn)血管平 滑肌細(xì)胞增殖和遷移作用，對(duì)新生血管形成過(guò)程中的多個(gè)環(huán)節(jié)如毛細(xì)血管底膜降解、內(nèi)皮 細(xì)胞遷移增殖、膠原合成及小血管腔形成等均有明顯的促進(jìn)作用。
[0005] 現(xiàn)有研究表明，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)平滑肌細(xì)胞前膠原基因 a l[I]mRNA 表達(dá)明顯增強(qiáng)（參見(jiàn)：周玉杰等.堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)血管平滑肌細(xì)胞及內(nèi)膜損傷 后血管I及III型膠原mRNA表達(dá)的影響.基礎(chǔ)研究.1998年2月.）。此外，還有研究表明， 將bFGF (堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子）與a SAM在肝纖維化中表達(dá)情況進(jìn)行相關(guān)性分析，可 以看出b表達(dá)強(qiáng)度與a SAM表達(dá)強(qiáng)度正相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)庫(kù)普弗細(xì)胞、肝纖維化附近炎癥細(xì) 胞、內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生并釋放大量的bFGF有助于HSC的分裂和增殖，增強(qiáng)HSC的游走性，而 HSC的激活即轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，表達(dá)a SAM并合成大量的細(xì)胞外基質(zhì)，從而推動(dòng)肝纖維 化不斷向前發(fā)展，說(shuō)明bFGF在促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生中具有重要作用，二者在促進(jìn)肝纖維化 演變過(guò)程中具有協(xié)同功效（參見(jiàn)：劉燕超等.堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和α-平滑肌肌動(dòng) 蛋白與慢性乙型肝炎病理分期的相關(guān)性.臨床薈萃.2008年7月5日，第23卷第13期.）。 到目前為止，低分子量堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子LMW FGF2對(duì)肝臟纖維化的作用仍不清楚。 (三）
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明目的是提供一種低分子量堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（簡(jiǎn)稱LMW FGF2)能夠 抑制HSCs活化標(biāo)志基因α平滑肌肌動(dòng)蛋白（a -SMA)和I型膠原[col I ( α 1)]表達(dá)的新 用途，進(jìn)而能夠抑制肝星狀細(xì)胞活化、降低肝臟纖維化。
[0007] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0008] 本發(fā)明提供一種低分子量堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子LMW FGF2在制備抗肝臟纖維 化藥物中的應(yīng)用。
[0009] 進(jìn)一步，所述的藥物為注射劑、口服制劑或其它形式本領(lǐng)域公知的藥物形式。
[0010] 進(jìn)一步，LMW FGF2的實(shí)際用法和用量如下：將LMW FGF2溶于IMDM培養(yǎng)液中，然后 按照40?100 μ g LMW FGF2/kg體重的劑量進(jìn)行靜脈注射（優(yōu)選60 μ g LMW FGF2/kg體 重）。一般情況下，每50 μ g的LMW FGF2溶解于3. 3ml的IMDM培養(yǎng)液中。
[0011] 本發(fā)明所述LMW FGF2能夠抑制肝纖維化，表現(xiàn)在體內(nèi)導(dǎo)入LMW FGF2能夠顯著抑 制HSCs活化標(biāo)志基因 α平滑肌肌動(dòng)蛋白（a -SMA)和I型膠原[col I ( α 1)]表達(dá)，并降 低肝臟中膠原特征性氨基酸羥脯氨酸含量，表明LMW FGF2能夠抑制肝臟膠原沉積，是抗纖 維化治療的有效制劑。
[0012] 在本發(fā)明中，低分子量堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子LMW FGF2(18kDa)可通過(guò)市購(gòu)方 式獲得。
[0013] 本發(fā)明利用0：14誘導(dǎo)的慢性肝纖維化小鼠模型，首次證明通過(guò)尾靜脈注射LMW FGF2能夠顯著抑制HSC活化、降低肝纖維化程度。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明低分子量堿性成纖維細(xì) 胞生長(zhǎng)因子LMW FGF2能夠抑制HSCs活化標(biāo)志基因 α平滑肌肌動(dòng)蛋白（a -SMA)和I型膠 原[col Ι(α1)]表達(dá)，進(jìn)而能夠抑制肝星狀細(xì)胞活化、降低肝臟纖維化，注射LMW FGF2能 夠顯著抑制HSC活化、降低肝纖維化。 (四）
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1是注射LMW FGF2后肝星狀細(xì)胞活化標(biāo)志檢測(cè)圖；圖1中，CCl4、medium和LMW FGF2分別表示CC1 4損傷組、CC14損傷后注射IMDM培養(yǎng)液（購(gòu)自Corning公司）的對(duì)照 組、CC1 4損傷后注射LMW FGF2的實(shí)驗(yàn)組。*表示實(shí)驗(yàn)組與CC14損傷組比較差異顯著（P < 0. 05)。左圖代表a-SMA(a平滑肌肌動(dòng)蛋白）mRNA表達(dá)變化，右圖代表col Ι(α 1) ( I型 膠原）mRNA表達(dá)變化。
[0016] 圖2是注射LMW FGF2后天狼猩紅染色檢測(cè)肝臟纖維化圖；圖2中，CCl4、medium和 LMW FGF2分別表示CC14損傷組、CC14損傷后注射IMDM培養(yǎng)液的對(duì)照組、CC14損傷后注射 LMW FGF2的實(shí)驗(yàn)組。A，肝組織天狼猩紅染色；B，對(duì)著色陽(yáng)性面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)的結(jié)果。**表示 實(shí)驗(yàn)組與CC14損傷組比較差異極顯著（P < 0. 01)。Bar = 50 μ m。
[0017] 圖3是注射LMW FGF2后羥脯氨酸含量檢測(cè)圖；圖3中CC14、medium和LMW FGF2 分別表示CC14損傷組、CC14損傷后注射IMDM培養(yǎng)液的對(duì)照組、CC1 4損傷后注射LMW FGF2 的實(shí)驗(yàn)組。*表示實(shí)驗(yàn)組與CC14損傷組比較差異顯著（P < 0.05)。 (五）
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0019] 實(shí)施例1 :慢性肝損傷小鼠模型制備
[0020] 利用10% (體積濃度）四氯化碳（溶劑為橄欖油）對(duì)八周鼠齡的C57BL/6J小鼠 (體重約30克）誘導(dǎo)化學(xué)肝損傷，每只小鼠腹腔注射0. 25ml 10 % CC14，每周2次，連續(xù)注射 4周，建立肝纖維化模型，注射后的小鼠在無(wú)菌環(huán)境下正常飼喂。
[0021] 實(shí)施例2 :LMW FGF2抑制HSC活化、降低肝臟纖維化
[0022] LMW FGF2 試劑：將 LMW FGF2 (購(gòu)自 P印rotech)溶于 MDM 培養(yǎng)液（購(gòu)自 Corning 公司）中，每50 μ g的LMW FGF2溶解于3. 3ml的IMDM培養(yǎng)液中。
[0023] 如實(shí)施例1所述的連續(xù)注射CC144周小鼠，按60 μ g/kg體重劑量對(duì)實(shí)驗(yàn)組小鼠尾 靜脈注射LMW FGF2,另外取對(duì)照組注射IMDM培養(yǎng)液，每周2次，注射1周。期間所有小鼠 繼續(xù)按實(shí)施例1所述方法進(jìn)行CC14肝損傷，最后一次注射LMW FGF2的3天后，取小鼠肝 臟組織，一部分用TRizoldnvetigen)提取總RNA，提取方法按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，然后用逆轉(zhuǎn)錄 試劑盒RNA PCR kit(AMV)Ver3.0(TaKaRa)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。real time-PCR檢測(cè)檢測(cè)肝星形 細(xì)胞活化的標(biāo)志性基因 α-SM和col Ι(α 1)表達(dá)，PCR反應(yīng)體系按照SYBRK Premix Ex TaqTM Kit(Takara)說(shuō)明書(shū)配制，按如下條件在Mastercycler? eprealplex突光定量PCR 儀（Eppendorf)上進(jìn)行反應(yīng)：95°C預(yù)變性4min ;95°C變性30s，60°C退火20s，68°C延伸20s， 共35個(gè)循環(huán)。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次?？俶RNA的量以β-actin作為內(nèi)參，法定量統(tǒng)計(jì) 結(jié)果。
[0024] -部分肝組織用羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）測(cè)定羥脯氨酸 含量，方法按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；另一部分肝臟石蠟包埋后進(jìn)行組織切片，切片厚度5 μ m，天狼猩 紅染色，直觀展示纖維化程度，并對(duì)陽(yáng)性面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。上述PCR引物分別是：
[0025] a -SMA, GGGAGTAATGGTTGGAATGG (sense)
[0026] GGCAGTAGTCACGAAGGAATAG(antisense),
[0027] col I ( a 1),AACTTTGCTTCCCAGATGTCCT(sense)
[0028] TCGGTGTCCCTTCATTCCAG(antisense)，由上海英俊公司合成。
[0029] 結(jié)果表明，LMW FGF2注射組小鼠肝星狀細(xì)胞活化標(biāo)志a -SMA和col I ( α 1)表達(dá) 顯著下降，表明肝星狀細(xì)胞活化受到抑制（如圖1所示），天狼猩紅染色證明肝臟纖維化程 度明顯得到改善（如圖2所示），羥脯氨酸檢測(cè)進(jìn)一步證明LMW FGF2注射組小鼠膠原沉積 顯著下降（如圖3所示）。由此說(shuō)明尾靜脈注射LMW FGF2能夠有效抑制肝星狀細(xì)胞活化、 降低肝臟纖維化。
[0030] 最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā) 明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容 直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種低分子量堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子LMW FGF2在制備抗肝臟纖維化藥物中的應(yīng) 用。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物為注射劑。
3. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物為口服制劑。
4. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于低分子量堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子LMW FGF2 的劑量為40-100 μ g/kg體重。
【文檔編號(hào)】A61K38/18GK104208660SQ201410394456
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年8月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月12日
【發(fā)明者】邵建忠, 潘若浪, 項(xiàng)黎新, 王萍, 劉小園 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)