柔嫩艾美耳球蟲(chóng)入侵相關(guān)蛋白Et CHP559基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種柔嫩艾美耳球蟲(chóng)基因，該基因?yàn)镋t CHP559基因，包含SEQ ID NO.1所示的開(kāi)放閱讀框核苷酸序列。本發(fā)明的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)基因，是柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子階段高表達(dá)的新基因，與子孢子入侵宿主細(xì)胞相關(guān)，對(duì)開(kāi)發(fā)抑制子孢子入侵宿主細(xì)胞、阻斷球蟲(chóng)生活史的新疫苗或新藥具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】柔嫩艾美耳球蟲(chóng)入侵相關(guān)蛋白EtCHP559基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種柔嫩艾美耳球蟲(chóng)入侵相關(guān)蛋白Et CHP559基因及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 雞球蟲(chóng)病是幾種艾美耳球蟲(chóng)寄生腸道所引起的一種危害極其嚴(yán)重的全球性寄生 蟲(chóng)病，嚴(yán)重危害雞的生長(zhǎng)發(fā)育，是集約化養(yǎng)雞業(yè)危害最大的疾病之一，每年給養(yǎng)雞業(yè)造成巨 大的經(jīng)濟(jì)損失。柔嫩艾美耳球蟲(chóng)（Eimeriatenella)是致病性最為嚴(yán)重的雞球蟲(chóng)之一，它 主要寄生于盲腸及其附近區(qū)域，能夠引起出血性腸炎，對(duì)雛雞危害最大，嚴(yán)重時(shí)能引起較高 的死亡率。目前控制雞球蟲(chóng)病的方法主要以在飼料中添加抗球蟲(chóng)藥物預(yù)防為主，但由于抗 球蟲(chóng)藥的長(zhǎng)期使用，雞球蟲(chóng)耐藥性的產(chǎn)生已成為無(wú)法避免的問(wèn)題，任何一種抗球蟲(chóng)藥在使 用一定時(shí)間后都會(huì)引起球蟲(chóng)的耐藥性，使得許多抗球蟲(chóng)藥的防治效果顯著降低，甚至完全 失效，即使提高藥物濃度也無(wú)濟(jì)于事，仍然爆發(fā)球蟲(chóng)病，給養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)了無(wú)法彌補(bǔ)的損失。 同時(shí)因球蟲(chóng)產(chǎn)生耐藥性，使好不容易篩選出來(lái)的抗球蟲(chóng)藥使用年限大大縮減，新藥開(kāi)發(fā)速 度已趕不上耐藥株出現(xiàn)的速度。而且抗球蟲(chóng)藥作為飼料添加劑的潛在危害又逐漸成為人們 關(guān)注的對(duì)象，食品安全日益受到關(guān)注，很多曾經(jīng)效果很好的抗球蟲(chóng)藥都被劃入禁用之列，因 此，人們期待用更理想的方法來(lái)替代抗球蟲(chóng)藥物的使用。球蟲(chóng)活卵囊疫苗的成功研制和應(yīng) 用提供了一種可以替代藥物控制雞球蟲(chóng)病的技術(shù)手段。但活疫苗不可避免地存在難保存、 散毒及潛在的致病威脅等缺點(diǎn)，未能在雞場(chǎng)得到廣泛使用，所以迫切需要尋找新的防治手 段來(lái)控制雞球蟲(chóng)病。而研制新疫苗和新藥物的關(guān)鍵在于尋找到合適的蟲(chóng)體抗原基因或基因 產(chǎn)物作為防治球蟲(chóng)病的作用靶標(biāo)。
[0003] 雞球蟲(chóng)是屬于頂復(fù)器門(mén)（Apicomplexa)艾美耳屬（Eimeria)的一類寄生于雞腸 道的原蟲(chóng)。頂復(fù)器原蟲(chóng)多數(shù)是專一性的細(xì)胞內(nèi)寄生蟲(chóng)，包括瘧原蟲(chóng)（Plasmodium)、弓形蟲(chóng) (Toxoplasma)、艾美耳球蟲(chóng)（Eimeria)、隱孢子蟲(chóng)（Cryptosporidium)等，有復(fù)雜的生活史， 需入侵宿主細(xì)胞，完成生活史循環(huán)需要更替一個(gè)或多個(gè)宿主，或更換不同的細(xì)胞和組織，因 而成功地入侵宿主細(xì)胞是這類寄生蟲(chóng)感染建立的前提。雖然頂復(fù)器原蟲(chóng)入侵的宿主細(xì)胞不 同，包括紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和消化道細(xì)胞等，但都有一個(gè)共同的高度保守的入侵 機(jī)制，需要頂復(fù)器（微線、棒狀體和致密顆粒）分泌一系列蛋白參與，這些蛋白相互作用，在 宿主細(xì)胞膜與蟲(chóng)體表面形成一個(gè)高度保守的運(yùn)動(dòng)結(jié)構(gòu)（MovingJunction,MJ),對(duì)蟲(chóng)體入侵 宿主細(xì)胞起至關(guān)重要的作用。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明要解決針對(duì)藥物防治球蟲(chóng)病極易產(chǎn)生耐藥性的問(wèn)題急需開(kāi)發(fā)新型疫苗和 新藥的技術(shù)問(wèn)題，提供一種柔嫩艾美耳球蟲(chóng)入侵相關(guān)蛋白EtCHP559基因，該EtCHP559在 柔嫩艾美耳球蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞過(guò)程中起著重要作用，對(duì)開(kāi)發(fā)防治雞球蟲(chóng)病的新疫苗或新藥 具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
[0005] 此外，還需要提供一種柔嫩艾美耳球蟲(chóng)入侵相關(guān)蛋白Et CHP559基因的應(yīng)用。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種柔嫩艾美耳球蟲(chóng)基因，該基因?yàn)镋t CHP559基 因，包含SEQ ID NO. 1所示的開(kāi)放閱讀框核苷酸序列。
[0008] 優(yōu)選的，所述基因具有SEQIDN0. 2所示的核苷酸序列。
[0009] 在本發(fā)明的另一方面，提供了一種重組載體，包含編碼Et CHP559蛋白氨基酸序列 的核苷酸序列，所述Et CHP559蛋白氨基酸序列如SEQ ID N0. 3所示。
[0010] 所述重組載體包括重組克隆載體或重組表達(dá)載體，重組表達(dá)載體包括重組原核表 達(dá)載體、重組真核表達(dá)載體。
[0011] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種重組蛋白，該重組蛋白是由上述重組載體經(jīng) 表達(dá)而制得。
[0012] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種多克隆抗體，該多克隆抗體是用上述重組蛋 白免疫兔子而制得。
[0013] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述柔嫩艾美耳球蟲(chóng)基因的應(yīng)用，用于制備 預(yù)防或治療雞球蟲(chóng)病的疫苗或藥物。
[0014] 所述疫苗或藥物通過(guò)抑制柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子入侵宿主細(xì)胞而阻斷球蟲(chóng)生活 史來(lái)發(fā)揮作用。
[0015] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述柔嫩艾美耳球蟲(chóng)基因的應(yīng)用，用于篩選 預(yù)防或治療球蟲(chóng)病的藥物。
[0016] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種疫苗，包含上述重組蛋白，或上述重組載體， 該重組載體為真核表達(dá)載體。
[0017] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種作用靶標(biāo)為Et CHP559蛋白的抗球蟲(chóng)藥物。
[0018] 本發(fā)明柔嫩艾美耳球蟲(chóng)入侵相關(guān)蛋白Et CHP559基因，是柔嫩艾美耳球蟲(chóng) (Eimeria tenella)的一個(gè)新基因。Western-blot分析表明本發(fā)明Et CHP559的原核表達(dá) 產(chǎn)物和真核表達(dá)產(chǎn)物都具有良好的免疫原性；免疫熒光定位實(shí)驗(yàn)和體外抑制試驗(yàn)結(jié)果顯示 Et CHP559與子孢子的入侵相關(guān)，在球蟲(chóng)子孢子入侵宿主細(xì)胞時(shí)發(fā)揮了重要作用。因此，本 發(fā)明的Et CHP559基因，為開(kāi)發(fā)抑制子孢子入侵、阻斷球蟲(chóng)生活史的新疫苗或新藥提供了 新思路。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0019] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0020] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例1柔嫩艾美耳球蟲(chóng)Et CHP559基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定圖；
[0021] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例2實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Et CHP559基因在柔嫩艾美耳球蟲(chóng)不同 發(fā)育階段的表達(dá)圖；
[0022] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例3重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T_Et CHP559的雙酶切鑒定圖；
[0023] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例3重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-Et CHP559不同時(shí)相表達(dá)蛋白的 SDS-PAGE電泳圖；
[0024] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例3純化的Et CHP559重組蛋白分析圖；
[0025] 圖6是本發(fā)明實(shí)施例3重組原核表達(dá)質(zhì)粒Pcold-TF-Et CHP559的酶切鑒定圖；
[0026] 圖7是本發(fā)明實(shí)施例3重組原核表達(dá)質(zhì)粒Pcold-TF-EtCHP559的誘導(dǎo)表達(dá)圖；
[0027] 圖8是本發(fā)明實(shí)施例3純化的His-EtCHP559重組蛋白分析圖；
[0028] 圖9是本發(fā)明實(shí)施例5的EtCHP559蛋白免疫原性分析圖；
[0029] 圖10是本發(fā)明實(shí)施例6免疫熒光檢測(cè)EtCHP559蛋白在柔嫩艾美耳球蟲(chóng)不同發(fā) 育階段的分布和定位圖；
[0030] 圖11是本發(fā)明實(shí)施例7體外抑制試驗(yàn)結(jié)果圖；
[0031] 圖12是本發(fā)明實(shí)施例8重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1-flag-EtCHP559的PCR鑒 定和雙酶切鑒定圖；
[0032] 圖13是本發(fā)明實(shí)施例8重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1-flag-EtCHP559轉(zhuǎn)染DF-1 細(xì)胞的表達(dá)結(jié)果圖；
[0033] 圖14是本發(fā)明實(shí)施例8重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1-flag-Et CHP559轉(zhuǎn)染DF-1 細(xì)胞表達(dá)后Western-Blot檢測(cè)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 下列實(shí)施例中，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)條件，如《分子克隆實(shí)驗(yàn) 指南》（J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著，黃培堂，汪嘉璽，朱厚礎(chǔ)，等譯.第3版，北京：科學(xué) 出版社，2002)中所述的方法進(jìn)行。
[0035] 本發(fā)明以柔嫩艾美耳球蟲(chóng)為研究對(duì)象，篩選鑒定參與柔嫩艾美耳球蟲(chóng)入侵宿主細(xì) 胞的相關(guān)蛋白。在前期實(shí)驗(yàn)室以柔嫩艾美耳球蟲(chóng)頂體膜蛋白l(EtAMAl)為誘餌，篩選柔嫩 艾美耳球蟲(chóng)子孢子酵母雙雜交cDNA文庫(kù)獲得可能與之相互作用蛋白的EST序列基礎(chǔ)上， 選擇編號(hào)為559基因的EST序列，利用RACE(末端快速擴(kuò)增）技術(shù)擴(kuò)增獲得了含一個(gè)完整 0RF(開(kāi)放閱讀框）的基因全長(zhǎng)序列，在原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)該蛋白， 并通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明EtCHP559與子孢子的入侵相關(guān)。
[0036] 實(shí)施例1柔嫩艾美耳球蟲(chóng)EtCHP559基因全長(zhǎng)cDNA的克隆及分析
[0037]1?材料
[0038] 蟲(chóng)株和體外培養(yǎng)細(xì)胞：柔嫩艾美耳球蟲(chóng)（E.tenella)是由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸 醫(yī)研究所保存、繁殖提供。DF-1 (雞胚成纖維細(xì)胞）細(xì)胞用于感染、抑制、免疫熒光試驗(yàn)和轉(zhuǎn) 染真核表達(dá)重組質(zhì)粒。
[0039]2?方法
[0040] 2. 1 總RNA提取
[0041] 實(shí)驗(yàn)前將干凈的金屬提取器皿單獨(dú)使用錫箔紙包好，180°C烤箱內(nèi)烘烤6h。操作臺(tái) 和離心管架等均用75%酒精消毒，保證無(wú)RNase污染。所用移液槍、槍頭和離心管均專一用 于RNA的提取。
[0042] 子孢子總RNA的提取參照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)操作，具體詳細(xì)步驟為：
[0043] 1)取保存于液氮中的E.tenella子孢子，加入適量Trizol試劑并充分混勻，室溫 靜置6min。
[0044] 2)向步驟1)中加入氯仿（按lmLTrizol加200iiL氯仿），蓋緊離心管蓋，用手 顛倒混勻數(shù)次，再室溫靜置15min。
[0045] 3) 4°C12000r/min離心 15min。
[0046] 4)從離心機(jī)中小心取出離心管，此時(shí)勻漿液分為三層，即：無(wú)色的上清液、中間的 白色蛋白層及帶有顏色的下層有機(jī)相。吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中（切忌吸出白 色中間層）。
[0047] 5)向上清中加入等體積的異丙醇，顛倒離心管充分混勻后，在15?30°C下靜置 10mim〇
[0048]6)fC，12000r/min離心lOmin，RNA沉于管底。
[0049] 7)小心棄上清，緩慢地沿離心管壁加入75 %的乙醇1mL(DEPC水配制），溫和振蕩 沉淀。
[0050] 8)4°C, 12000r/min離心5min后小心棄去乙醇，沉淀室溫干燥至無(wú)乙醇?xì)馕?，用?量DEPC水溶解沉淀。電泳分析，并測(cè)定其濃度和分析其純度。
[0051] 2. 2RACE擴(kuò)增cDNA模板的制備：按照GeneRacer?Kit(美國(guó)Invitrogen公司） 說(shuō)明書(shū)操作步驟將提取的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，制備擴(kuò)增 5'RACE和3'RACE的cDNA模板，利用RACE技術(shù)擴(kuò)增基因的全長(zhǎng)cDNA序列。
[0052] 2. 3柔嫩艾美耳球蟲(chóng)EtCHP559基因的5'RACE擴(kuò)增
[0053] 在前期實(shí)驗(yàn)室利用柔嫩艾美耳球蟲(chóng)頂體膜蛋白l(EtAMAl)為誘餌，篩選柔嫩艾美 耳球蟲(chóng)子孢子酵母雙雜交cDNA文庫(kù)，獲得可能相互作用蛋白的ESTs序列基礎(chǔ)上，本發(fā)明選 擇其中一個(gè)基因的EST序列，該EST序列含3'末端的Ploy(A)尾。Blast分析與柔嫩艾美 耳球蟲(chóng)保守的假象蛋白（hypotheticalprotein,conserved)同源，該EST序列編號(hào)為559。
[0054] 5 '端RACE引物設(shè)計(jì)合成：
[0055] 根據(jù)獲得含3'端Ploy(A)的EST序列，利用PrimerPremier5. 00軟件設(shè)計(jì)5' 端的引物，5'端RACE擴(kuò)增引物見(jiàn)下表1。
[0056] 表1 5'端RACE擴(kuò)增引物序列
[0057]
【權(quán)利要求】
1. 一種柔嫩艾美耳球蟲(chóng)基因，其特征在于，所述基因?yàn)镋t CHP559基因，包含SEQ ID NO. 1所示的開(kāi)放閱讀框核苷酸序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)基因，其特征在于，所述基因具有SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
3. -種重組載體，其特征在于，包含編碼Et CHP559蛋白氨基酸序列的核苷酸序列，所 述Et CHP559蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
4. 一種重組蛋白，其特征在于，該重組蛋白是由權(quán)利要求3所述重組載體經(jīng)表達(dá)而制 得。
5. -種多克隆抗體，其特征在于，該多克隆抗體是用權(quán)利要求4所述重組蛋白免疫兔 子而制得。
6. 權(quán)利要求1所述柔嫩艾美耳球蟲(chóng)基因的應(yīng)用，其特征在于，用于制備預(yù)防或治療雞 球蟲(chóng)病的疫苗或藥物。
7. 權(quán)利要求1所述柔嫩艾美耳球蟲(chóng)基因的應(yīng)用，其特征在于，用于篩選預(yù)防或治療雞 球蟲(chóng)病的藥物。
8. 權(quán)利要求4所述重組蛋白的應(yīng)用，其特征在于，用于制備預(yù)防或治療雞球蟲(chóng)病的疫 苗或藥物。
9. 一種疫苗，其特征在于，包含權(quán)利要求4所述重組蛋白，或權(quán)利要求3所述重組載體， 該重組載體為真核表達(dá)載體。
10. -種作用靶標(biāo)為Et CHP559蛋白的抗球蟲(chóng)藥物。
【文檔編號(hào)】A61P33/02GK104328130SQ201410383964
【公開(kāi)日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年8月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月6日
【發(fā)明者】韓紅玉, 黃兵, 翟頎, 董輝, 趙其平, 朱順海, 梁思婷, 李莎, 楊斯涵 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所