用于腹腔開(kāi)放治療及修復(fù)的仿生腹膜及其制備方法

用于腹腔開(kāi)放治療及修復(fù)的仿生腹膜及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于腹腔開(kāi)放治療及修復(fù)的仿生腹膜及其制備方法，包括水凝膠，搭載于該水凝膠上的聚乳酸－羥基乙酸微球，以及覆蓋于水凝膠及聚乳酸－羥基乙酸微球上的納米纖維膜，通過(guò)在水凝膠上搭載聚乳酸－羥基乙酸微球，微球?yàn)閯?chuàng)面修復(fù)所需生長(zhǎng)因子的來(lái)源，其上覆蓋一層納米纖維膜形成雙層膜結(jié)構(gòu)，構(gòu)建“人工仿生腹膜”應(yīng)用于腹腔開(kāi)放創(chuàng)面；仿生腹膜既可保護(hù)腸管，又可作為控釋微球的載體，有機(jī)結(jié)合創(chuàng)面保護(hù)和藥物釋放功能，參與創(chuàng)面修復(fù)；仿生腹膜可能通過(guò)以下機(jī)制發(fā)揮促進(jìn)愈合作用，分化參與新生組織形成，或旁分泌細(xì)胞因子促進(jìn)新生組織形成；人工腹膜和微球的協(xié)同作用，在直接參與缺損組織再生的同時(shí)，并能動(dòng)員機(jī)體本身的再生修復(fù)機(jī)制，最終實(shí)現(xiàn)腹腔開(kāi)放創(chuàng)面的快速修復(fù)。
【專利說(shuō)明】用于腹腔開(kāi)放治療及修復(fù)的仿生腹膜及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及腹腔開(kāi)放治療修復(fù)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種用于腹腔開(kāi)放治療及修復(fù)的仿生腹膜及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]腹腔開(kāi)放創(chuàng)面修復(fù)是創(chuàng)面修復(fù)的重要課題之一，創(chuàng)傷、感染及腹部外科大手術(shù)均有可能導(dǎo)致腹壁的相對(duì)和絕對(duì)缺損，進(jìn)而引起腸管外露和腸管破裂，有極高的致死率和致殘率，嚴(yán)重腹腔感染是腹部創(chuàng)傷、胃腸道穿孔、重癥胰腺炎的常見(jiàn)并發(fā)癥。根據(jù)國(guó)內(nèi)外研究表明，對(duì)腹腔感染的治療分為以下幾個(gè)階段:上世紀(jì)三十年代外科手術(shù)治療將腹腔感染患者的死亡率由90%降低至50%左右；此后五十年，盡管抗生素普遍使用，但死亡率一直徘徊在50%左右。因此，促進(jìn)腹腔開(kāi)放創(chuàng)面的早期修復(fù)與腹壁重建是現(xiàn)代腹部外科需要解決的關(guān)鍵性技術(shù)難題之一。
[0003]目前，對(duì)于腹腔開(kāi)放治療是聯(lián)合營(yíng)養(yǎng)支持、機(jī)械通氣、連續(xù)性腎臟替代療法(CRRT)、人工肝及體外膜氧合系統(tǒng)(ECMO)等促進(jìn)嚴(yán)重腹腔感染合并臟器功能障礙或衰竭病人的恢復(fù)，但這些臟器功能支持系統(tǒng)亦有不足，如機(jī)械通氣合并呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎，CRRT可能引起氨基酸等營(yíng)養(yǎng)底物的丟失，如不能通過(guò)外科手術(shù)控制感染源，病人最終會(huì)因感染不斷加重而死于臟器功能衰竭與免疫系統(tǒng)抑制。
[0004]腹腔間隙綜合征(ACS)是腹腔感染進(jìn)一步進(jìn)展的結(jié)果。創(chuàng)傷、腹腔感染、膿毒癥休克及繼之的液體復(fù)蘇均可導(dǎo)致腹腔內(nèi)容物的增加、腸功能障礙和腸內(nèi)容物的增加以及組織間隙的水腫，最終引起腹腔內(nèi)壓(IAP)升高。當(dāng)IAP超過(guò)20mmHg且合并有心肺功能障礙時(shí)即表現(xiàn)為ACS。ACS又可使腹腔感染進(jìn)一步加重，兩者可互為因果并形成惡性循環(huán)。作為嚴(yán)重腹腔感染的主要死亡原因，ACS 一旦發(fā)生，預(yù)后極差，故也稱腹部的ARDS (成人呼吸窘迫綜合征)。
[0005]腹腔開(kāi)放療法(Open abdomen therapy)是近十年來(lái)腹部外科領(lǐng)域的突破性進(jìn)展，成為腹腔感染、ACS和腹部創(chuàng)傷的革命性治療方法，是降低嚴(yán)重腹腔感染發(fā)生率與死亡率的重要手段。但開(kāi)放后腹腔局部創(chuàng)面處理成為外科醫(yī)生的“夢(mèng)魘”，繼發(fā)的腸管破裂與腹壁缺損的修復(fù)是對(duì)現(xiàn)行外科理論與技術(shù)的巨大挑戰(zhàn)！
[0006]腹腔開(kāi)放最初源于被動(dòng)開(kāi)放，即腹內(nèi)壓過(guò)高所導(dǎo)致的切口自然崩開(kāi)導(dǎo)致腹腔無(wú)法關(guān)閉。腹腔被動(dòng)開(kāi)放是腹部外科的極端情況，早期可出現(xiàn)腸瘺、出血與多臟器功能障礙等并發(fā)癥，后期可合并腸外瘺與腹壁缺損，一旦發(fā)生，有極高的致死率與致殘率，外科醫(yī)生往往對(duì)此束手無(wú)策。
[0007]在復(fù)雜腹腔感染病人中，腹腔被動(dòng)開(kāi)放日益增多。臨床實(shí)踐中也發(fā)現(xiàn)，在腹腔開(kāi)放后，腹腔壓力得到釋放，肝腎心肺的灌注壓得到改善，如局部創(chuàng)面處理得當(dāng)，腹腔開(kāi)放后的病人生存率反而較同類沒(méi)有開(kāi)放的病人高。而隨著人們認(rèn)識(shí)水平提高與經(jīng)驗(yàn)的增加，主動(dòng)腹腔開(kāi)放療法將會(huì)不斷增多，將成為嚴(yán)重腹腔感染與ACS的重要治療方法。
[0008]無(wú)論是被動(dòng)開(kāi)放還是主動(dòng)開(kāi)放，均可造成腹壁缺損，腸管外露。其原因有二:一是腹壁實(shí)質(zhì)性缺損，如爆炸傷、槍傷所致的腹壁缺失，壞死性筋膜炎清創(chuàng)術(shù)后；二是腹壁的相對(duì)缺損，由腹內(nèi)壓增高后，腹壁向兩側(cè)回縮所致。
[0009]腹腔開(kāi)放后腸管外露最直接的后果是腸管損傷，甚至腸外瘺，特別是腸空氣瘺(EAF)。與傳統(tǒng)的內(nèi)瘺和后期的唇狀瘺與管狀瘺相比，EAF很難控制，腸液大量外溢，消化周邊組織，導(dǎo)致嚴(yán)重感染與出血，無(wú)法及時(shí)開(kāi)展腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)，導(dǎo)致多臟器功能障礙與重度營(yíng)養(yǎng)不良，病人最終不可控制地走向死亡。
[0010]預(yù)防腸管破裂形成EAF是腹腔開(kāi)放創(chuàng)面早期的主要任務(wù)。如能給予有效臟器保護(hù)，可早期恢復(fù)腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)。一旦腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)恢復(fù)，腸源性感染將迅速降低，死亡率也隨之降低。此外早期創(chuàng)面封閉也可促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)和防止腹壁的無(wú)限制回縮，降低今后腹壁重建的難度。
[0011]針對(duì)開(kāi)放的腹腔，人們采用了各種方法臨時(shí)封閉腹腔以期減少腸外瘺的發(fā)生以及腹壁的無(wú)限制開(kāi)放，這一方法也稱臨時(shí)性關(guān)腹措施(TAC)。早年主要是采取各種補(bǔ)片，如滌綸布、聚丙烯網(wǎng)、可吸收網(wǎng)片、去細(xì)胞骨架人皮或豬皮，但這些補(bǔ)片的共同特點(diǎn)就是逐漸磨損腸壁，導(dǎo)致腸管破裂。雖然加用表皮生長(zhǎng)因子或采用真空負(fù)壓吸引技術(shù)可在一定程度上促進(jìn)腸管間肉芽組織生長(zhǎng)，但不能恢復(fù)正常的腸管微循環(huán)血流量，最終仍然導(dǎo)致腸管破裂、創(chuàng)面遲遲不能愈合。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種促進(jìn)開(kāi)放腹腔修復(fù)的仿生腹膜，克服了現(xiàn)有技術(shù)中創(chuàng)面修復(fù)難度大，易破裂的缺陷。
[0013]本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問(wèn)題在于，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種仿生腹膜的制備方法，通過(guò)該方法可制得開(kāi)放腹腔修改和治療用的仿生腹膜，該仿生腹膜可以是不同三維空間的結(jié)構(gòu)，其強(qiáng)度和性能可調(diào)節(jié)。
[0014]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案是:提供一種用于腹腔開(kāi)放治療及修復(fù)的仿生腹膜，包括水凝膠，搭載于該水凝膠上的聚乳酸一羥基乙酸微球，以及覆蓋于水凝膠及聚乳酸一羥基乙酸微球上的納米纖維膜。
[0015]本發(fā)明進(jìn)一步的優(yōu)選方案是:所述的水凝膠包括纖維連接蛋白與細(xì)胞作用位點(diǎn)的聚乙二醇雙馬來(lái)酸單酯、I型膠原與細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)的聚乙二醇雙丙烯酸酯和光引發(fā)劑艷固佳(Irgacure)。
[0016]本發(fā)明進(jìn)一步的優(yōu)選方案是:所述的聚乳酸一羥基乙酸微球是由乳酸和羥基酸聚合而成的聚乳酸一羥基乙酸共聚物。
[0017]本發(fā)明進(jìn)一步的優(yōu)選方案是:所述的納米纖維膜包括聚乙二醇聚醚氨酯脲和富血小板血漿，其體積比為1:1-1。
[0018]本發(fā)明進(jìn)一步的優(yōu)選方案是:所述的納米纖維膜還包括可復(fù)合骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞，所述的納米纖維膜為多孔材料，干細(xì)胞的含量為每100 μ I培養(yǎng)液含2.5X 15BMSCs,每100 μ I培養(yǎng)液加入每孔底層納米纖維膜介質(zhì)。
[0019]本發(fā)明另一技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案是:提供一種仿生腹膜的制備方法，其包括以下步驟:
[0020]SI制備水凝膠:將濃度分別為1% (w/v) ,9% (w/v)和0.1% (w/v)的聚乙二醇雙馬來(lái)酸單酯、聚乙二醇雙丙烯酸酯和Irgacure溶入PBS中，置于紫外燈下15_18cm處照射10-15min，成膠完全后，PBS溶液漂洗3-5次；
[0021]S2在水凝膠上搭載聚乳酸一羥基乙酸微球:該聚乳酸一羥基乙酸微球是由乳酸和羥基酸聚合而成的聚乳酸一羥基乙酸共聚物，并將該共聚物搭載于水凝膠上；
[0022]S3制備納米纖維膜:將聚乙二醇聚醚氨酯脲加入到六氟異丙醇中，攪拌至溶解，得到濃度為12% (w/v)的聚合物溶液，并通過(guò)紡絲設(shè)備制得納米纖維膜；
[0023]S4覆膜:將上述納米纖維膜覆蓋于搭載有聚乳酸一羥基乙酸微球的水凝膠上，得到仿生腹膜。
[0024]上述技術(shù)方案進(jìn)一步的優(yōu)選方案是:上述步驟(3)中，所述的紡絲設(shè)備為靜電紡絲機(jī)，通過(guò)注射器吸取聚合物溶液固定于靜電紡絲機(jī)上微量推進(jìn)進(jìn)行紡絲和噴涂制得納米纖維膜。
[0025]上述技術(shù)方案進(jìn)一步的優(yōu)選方案是:上述步驟(3)中，分別用注射器吸取富血小板血漿與聚合物溶液一起進(jìn)行紡絲和噴涂得到納米纖維膜上。
[0026]上述技術(shù)方案進(jìn)一步的優(yōu)選方案是:所述的步驟(3)中，將含2.5X 15BMSC的100 μ I干細(xì)胞培養(yǎng)液加入每孔底層介質(zhì)，在5% CO2, 370C的條件下培養(yǎng)，每隔一天更換培養(yǎng)液一次，得到干細(xì)胞培養(yǎng)液。
[0027]上述技術(shù)方案進(jìn)一步的優(yōu)選方案是:所述的干細(xì)胞培養(yǎng)液通過(guò)注射器吸取后，與聚合物溶液一起紡絲和噴涂制得納米纖維膜。
[0028]上述技術(shù)方案進(jìn)一步的優(yōu)選方案是:所述的聚乙二醇聚醚氨酯脲在靜電紡織機(jī)上紡絲的參數(shù)設(shè)置為:微量推進(jìn)速度:1.5ml/h ;毛細(xì)管電壓:+12KV ;靜電紡織機(jī)的噴頭和滾筒距離:20cm。
[0029]上述技術(shù)方案進(jìn)一步的優(yōu)選方案是:所述的干細(xì)胞培養(yǎng)液在靜電紡織機(jī)上噴涂的參數(shù)設(shè)置為:微量推進(jìn)速度:0.2ml/min ;毛細(xì)管電壓:+7KV ;靜電紡織機(jī)的噴頭和滾筒距離:4cm。
[0030]上述技術(shù)方案進(jìn)一步的優(yōu)選方案是:所述滾筒參數(shù)設(shè)置為:滾筒電壓:-4KV ;滾筒旋轉(zhuǎn)速度:250rmp/min ;橫向移動(dòng)速度:0.15cm/s ;橫向移動(dòng)幅度:8cm。
[0031]上述技術(shù)方案進(jìn)一步的優(yōu)選方案是:所述的聚乳酸一羥基乙酸微球制備方法包括:
[0032]S21將重量比為1:1的乳酸和羥基酸共10mg溶解在4ml 二氯甲烷(CH2Cl2)中，制成油相；
[0033]S22將成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子樣品溶于500 μ I去離子水中形成水相；
[0034]S23將該水相加入到油相中，混合物用超聲探針震蕩處理，勻化后形成初乳(Wl/O)，將0.5gPVA加入10ml去離子水中形成含0.5% (w/v)PVA的油相(W2)，將初乳倒入油相(W2)中，機(jī)械攪拌器400rpm攪拌4h，攪拌過(guò)程中溶劑蒸發(fā)，得到膠態(tài)懸浮的聚乳酸一羥基乙酸微球。
[0035]本發(fā)明的有益效果在于，通過(guò)在水凝膠上搭載聚乳酸一羥基乙酸微球，微球?yàn)閯?chuàng)面修復(fù)所需生長(zhǎng)因子的來(lái)源，其上覆蓋一層納膜形成雙層膜結(jié)構(gòu)，構(gòu)建“人工仿生腹膜”應(yīng)用于腹腔開(kāi)放創(chuàng)面；仿生腹膜既可保護(hù)腸管，又可作為控釋微球的載體，有機(jī)結(jié)合創(chuàng)面保護(hù)和藥物釋放功能，參與創(chuàng)面修復(fù)；仿生腹膜可能通過(guò)以下機(jī)制發(fā)揮促進(jìn)愈合作用，分化參與新生組織形成，或旁分泌細(xì)胞因子促進(jìn)新生組織形成；人工腹膜和微球的協(xié)同作用，在直接參與缺損組織再生的同時(shí)，并能動(dòng)員機(jī)體本身的再生修復(fù)機(jī)制，最終實(shí)現(xiàn)腹腔開(kāi)放創(chuàng)面的快速修復(fù)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0036]下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，附圖中:
[0037]圖1是本發(fā)明實(shí)施例制備仿生腹膜的流程示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0038]現(xiàn)結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明。
[0039]本發(fā)明實(shí)施例提供一種用于腹腔開(kāi)放治療及修復(fù)的仿生腹膜，其包括水凝膠，搭載于該水凝膠上的聚乳酸一羥基乙酸微球(簡(jiǎn)稱PLGA微球)，以及覆蓋于水凝膠及聚乳酸一羥基乙酸微球上的納米纖維膜；所述的水凝膠包括纖維連接蛋白與細(xì)胞作用位點(diǎn)的聚乙二醇雙馬來(lái)酸單酯(RGD - PEGMA)、I型膠原與細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)的聚乙二醇雙丙烯酸酯(GIA — PEGDA)和光引發(fā)劑艷固佳(Irgacure);所述的聚乳酸一輕基乙酸微球是由乳酸(LA)和羥基酸(GA)聚合而成的聚乳酸一羥基乙酸共聚物。
[0040]本發(fā)明實(shí)施例所述的納米纖維膜包括聚乙二醇聚醚氨酯脲(簡(jiǎn)稱PEUU)、富血小板血漿和可復(fù)合骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞，聚乙二醇聚醚氨酯脲、富血小板血漿體積比為1:1-1。所述的納米纖維膜為多孔材料，干細(xì)胞的含量為每100 μ I培養(yǎng)液含2.5X 15BMSCs,每100 μ I干細(xì)胞培養(yǎng)液加入每孔底層納米纖維膜介質(zhì)，該干培養(yǎng)液是低糖型DMEM培養(yǎng)基。
[0041]本發(fā)明實(shí)施例的PLGA微球是通過(guò)現(xiàn)有物理或化學(xué)的方法將藥物分散、吸附或者溶解在高分子載體材料中，形成微小球狀實(shí)體稱微球。PLGA微球既能夠保護(hù)藥物免遭破壞，又能與某些細(xì)胞組織具有特殊的親和性，集中在靶區(qū)逐步釋放藥物或被溶酶體中的酶降解而釋放藥物。本實(shí)施例的聚乳酸-輕基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolicacid), PLGA)是一種可降解的高分子有機(jī)化合物，由兩種乳酸(LA)和羥基乙酸(GA)隨機(jī)聚合而形成，具有良好的穩(wěn)定性、靶向性等優(yōu)點(diǎn)。PLGA微球水解后的兩種產(chǎn)物乳酸和羥基乙酸，是人體代謝途徑的副產(chǎn)物，對(duì)人體安全無(wú)毒，因此其生物安全性高，反復(fù)給藥后隨人體代謝，而不在體內(nèi)蓄積，是一種良好的藥物載體，PLGA微球的生長(zhǎng)因子可調(diào)節(jié)組織的創(chuàng)傷修復(fù)。
[0042]本實(shí)施例所述的水凝膠能在水中溶脹形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，保持水分但又不溶解，能夠保護(hù)藥物不被酶解，又可通過(guò)改變結(jié)構(gòu)而延緩藥物釋放，本實(shí)施例結(jié)合PLGA微球的藥物釋放能力以及纖維蛋白膠的細(xì)胞增殖能力，制備纖維蛋白膠/控釋微球復(fù)合材料，來(lái)實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)因子的長(zhǎng)期釋放以及細(xì)胞的長(zhǎng)入增殖，即用微球裝載生長(zhǎng)因子，再用纖維蛋白膠搭載富含生長(zhǎng)因子的PLGA微球。
[0043]本實(shí)施例所述的聚乙二醇聚醚氨酯脲(PEUU)是一種具有彈性和附著能力的物質(zhì)，它有很多微孔道，為細(xì)胞的附著和生長(zhǎng)提供了空間，已用于心外膜和角膜的重建。
[0044]如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例提供一種仿生腹膜的制備方法，其包括以下步驟:
[0045]SI制備水凝膠:將濃度分別為I % (w/v)、9 % (w/v)和0.1 % (w/v)的聚乙二醇雙馬來(lái)酸單酯、聚乙二醇雙丙烯酸酯和Irgacure溶入PBS中，置于波長(zhǎng)365nm，強(qiáng)度為5-10mff/cm2的紫外燈下15-18cm處照射10_15min，成膠完全后，PBS溶液漂洗3_5次；
[0046]S2在水凝膠上搭載聚乳酸一羥基乙酸微球:該聚乳酸一羥基乙酸微球是由乳酸和羥基酸聚合而成的聚乳酸一羥基乙酸共聚物，并將該共聚物搭載于水凝膠上；
[0047]S3制備納米纖維膜:將聚乙二醇聚醚氨酯脲加入到六氟異丙醇中，攪拌至溶解，得到濃度為12% (w/v)的聚合物溶液，即聚乙二醇聚醚氨酯脲聚合物，并通過(guò)紡絲設(shè)備制得納米纖維膜；
[0048]S4覆膜:將上述納米纖維膜覆蓋于搭載有聚乳酸一羥基乙酸微球的水凝膠上，得到仿生腹膜。
[0049]本實(shí)施例所述的紡絲設(shè)備為靜電紡絲機(jī)，通過(guò)注射器吸取聚合物溶液固定于靜電紡絲機(jī)上微量推進(jìn)進(jìn)行紡絲和噴涂制得納米纖維膜。
[0050]上述技術(shù)方案進(jìn)一步的優(yōu)選方案是:所述的步驟(3)中，將含2.5X 15BMSC的100 μ I干細(xì)胞培養(yǎng)液加入每孔底層介質(zhì)，在5% C02，37°C的條件下培養(yǎng)，每隔一天更換干細(xì)胞培養(yǎng)液一次，得到干細(xì)胞培養(yǎng)液，該干細(xì)胞培養(yǎng)液通過(guò)注射器吸取后，與聚合物溶液一起紡絲和噴涂制得納米纖維膜。
[0051]本發(fā)明實(shí)施例中，制備裝置干細(xì)胞納米纖維膜的方法包括以下兩種:
[0052]一、濕紡裝載干細(xì)胞的新型納米纖維膜:所謂“濕紡”，即為聯(lián)合應(yīng)用靜電紡絲(electrospinning)和靜電噴涂(electrospray)技術(shù)進(jìn)行納米纖維膜制備。具體步驟如下所述:分別用5ml注射器吸取配制好的聚合物溶液和干細(xì)胞懸液，固定在靜電紡絲機(jī)微量推進(jìn)泵上，末端連接金屬毛細(xì)管，其直徑為1.2mm,作為紡絲噴頭，可調(diào)速鋁制滾筒(直徑:20cm,寬:2cm)作為收集裝置。電紡PEUU參數(shù)設(shè)置:所述的聚乙二醇聚醚氨酯脲在靜電紡織機(jī)上紡絲的參數(shù)設(shè)置為:微量推進(jìn)速度:1.5ml/h ;毛細(xì)管電壓:+12KV ;靜電紡織機(jī)的噴頭和滾筒距離:20cm。
[0053]二、干紡彈性可降解納米纖維膜:用5ml注射器吸取配制好的聚合物溶液，固定在靜電紡絲機(jī)微量推進(jìn)泵上，末端連接金屬毛細(xì)管(直徑:1.2mm)作為紡絲噴頭，可調(diào)速鋁制滾筒(直徑:20cm，寬:2cm)作為收集裝置。所述的干細(xì)胞培養(yǎng)液在靜電紡織機(jī)上噴涂的參數(shù)設(shè)置為:微量推進(jìn)速度:0.2ml/min ;毛細(xì)管電壓:+7KV ;靜電紡織機(jī)的噴頭和滾筒距離:4cm。所述滾筒參數(shù)設(shè)置為:滾筒電壓:-4KV ;滾筒旋轉(zhuǎn)速度:250rmp/min ;橫向移動(dòng)速度:
0.15cm/s ;橫向移動(dòng)幅度:8cm。
[0054]本發(fā)明實(shí)施例所述的富含血小板血漿的納米纖維膜的制備步驟包括:
[0055]一、富含血小板血漿的制備:取新鮮血10ml，加入3.8wt %的檸檬酸鈉抗凝劑，血液與檸檬酸鈉溶液的體積比為9:1，采用改良二次離心法，首先，在4°C，1700rmp (450g)下離心lOmin，收集上層清液和棕黃膜層，再以2300rmp (850g)離心15分鐘濃縮血小板，棄去上部不含血小板的血漿，即制得富血小板血漿(PRP)。
[0056]二、濕紡荷載自體血小板血漿/表皮生長(zhǎng)因子的納米纖維膜:聯(lián)合應(yīng)用靜電紡絲和靜電噴涂技術(shù)進(jìn)行納米纖維膜制備。具體步驟如下所述:分別用5ml注射器吸取配制好的聚合物溶液和富血小板血漿，固定在靜電紡絲機(jī)微量推進(jìn)泵上，末端連接金屬毛細(xì)管，其直徑:1.2mm作為紡絲噴頭，可調(diào)速鋁制滾筒，其直徑:20cm，寬:2cm作為收集裝置，該收集裝置的參數(shù)與制備裝載干細(xì)胞納米纖維膜的一致。
[0057]本實(shí)施例制備納米纖維膜的方法，其設(shè)備簡(jiǎn)單，涂層均勻，可在室溫下進(jìn)行，且涂層厚度和微觀結(jié)構(gòu)可控。干紡聯(lián)合應(yīng)用靜電噴涂技術(shù)，通過(guò)噴涂干細(xì)胞懸液或富含血小板血漿，可以解決細(xì)胞黏附活性差的現(xiàn)狀。
[0058]本發(fā)明實(shí)施例所述的聚乳酸一羥基乙酸微球制備方法包括:
[0059]S21將重量比為1:1的乳酸和羥基酸共10mg溶解在4ml 二氯甲烷(CH2Cl2)中，制成油相；
[0060]S22將成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子樣品溶于500 μ I去離子水中形成水相；
[0061]S23將該水相加入到油相中，混合物用超聲探針震蕩處理，勻化后形成初乳(Wl/O)，將0.5gPVA加入10ml去離子水中形成含0.5% (w/v)PVA的油相(W2)，將初乳倒入油相(W2)中，機(jī)械攪拌器400rpm攪拌4h，攪拌過(guò)程中溶劑蒸發(fā)，得到膠態(tài)懸浮的聚乳酸一羥基乙酸微球。
[0062]在本發(fā)明中，RGD-PEGMA和GIA-PEGDA購(gòu)于上海炎怡生物科技有限公司，聚乙二醇聚醚氨酯脲poly (ester urethane) urea (PEUU)購(gòu)于美國(guó)匹斯堡大學(xué)McGowan再生醫(yī)學(xué)研究所。
[0063]應(yīng)當(dāng)理解的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以對(duì)上述實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而所有這些修改和替換，都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種用于腹腔開(kāi)放治療及修復(fù)的仿生腹膜，其特征在于:包括水凝膠，搭載于該水凝膠上的聚乳酸一羥基乙酸微球，以及覆蓋于水凝膠及聚乳酸一羥基乙酸微球上的納米纖維膜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于腹腔開(kāi)放治療及修復(fù)的仿生腹膜，其特征在于:所述的水凝膠包括纖維連接蛋白與細(xì)胞作用位點(diǎn)的聚乙二醇雙馬來(lái)酸單酯、I型膠原與細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)的聚乙二醇雙丙烯酸酯和光引發(fā)劑艷固佳。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于腹腔開(kāi)放治療及修復(fù)的仿生腹膜，其特征在于:所述的聚乳酸一羥基乙酸微球是由乳酸和羥基酸聚合而成的聚乳酸一羥基乙酸共聚物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于腹腔開(kāi)放治療及修復(fù)的仿生腹膜，其特征在于:所述的納米纖維膜包括聚乙二醇聚醚氨酯脲和富血小板血漿，其體積比為1:1-1.5。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于腹腔開(kāi)放治療及修復(fù)的仿生腹膜，其特征在于:所述的納米纖維膜還包括可復(fù)合骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞，所述的納米纖維膜為多孔材料，干細(xì)胞的含量為每100 μ I細(xì)胞培養(yǎng)液含2.5 X 15BMSCs,每100 μ I細(xì)胞培養(yǎng)液加入每孔底層納米纖維膜介質(zhì)。
6.一種仿生腹膜的制備方法，其包括以下步驟: SI制備水凝膠:將濃度分別為0.5-2% (w/v),8-10% (w/v)和0.05-0.2% (w/v)的聚乙二醇雙馬來(lái)酸單酯、聚乙二醇雙丙烯酸酯和光引發(fā)劑Irgacure溶入磷酸鹽緩沖液PBS中，置于紫外燈下15-18cm處照射10-15min，成膠完全后，PBS溶液漂洗3_5次； S2在水凝膠上搭載聚乳酸一羥基乙酸微球:該聚乳酸一羥基乙酸微球是由乳酸和羥基酸聚合而成的聚乳酸一羥基乙酸共聚物，并將該共聚物搭載于水凝膠上； S3制備納米纖維膜:將聚乙二醇聚醚氨酯脲加入到六氟異丙醇中，攪拌至溶解，得到濃度為10-15% (w/v)的聚合物溶液，并通過(guò)紡絲設(shè)備制得納米纖維膜； S4覆膜:將上述納米纖維膜覆蓋于搭載有聚乳酸一羥基乙酸微球的水凝膠上，得到仿生腹膜。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的仿生腹膜的制備方法，其特征在于:所述的步驟(3)中，所述的紡絲設(shè)備為靜電紡絲機(jī)，通過(guò)注射器吸取聚合物溶液固定于靜電紡絲機(jī)上微量推進(jìn)進(jìn)行紡絲和噴涂制得納米纖維膜。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的仿生腹膜的制備方法，其特征在于:所述的步驟(3)中，分別用注射器吸取富血小板血漿與聚合物溶液一起進(jìn)行紡絲和噴涂得到納米纖維膜上。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的仿生腹膜的制備方法，其特征在于:所述的步驟(3)中，將含2.5 X 15BMSC的100μ I細(xì)胞培養(yǎng)液加入每孔底層介質(zhì)，在5 % C02，37°C的條件下培養(yǎng)，每隔一天更換培養(yǎng)液一次，得到干細(xì)胞培養(yǎng)液。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的仿生腹膜的制備方法，其特征在于:所述的干細(xì)胞培養(yǎng)液通過(guò)注射器吸取后，與聚合物溶液一起紡絲和噴涂制得納米纖維膜。
11.根據(jù)權(quán)利要求8或10所述的仿生腹膜的制備方法，其特征在于:所述的聚乙二醇聚醚氨酯脲在靜電紡織機(jī)上紡絲的參數(shù)設(shè)置為:微量推進(jìn)速度:1.5ml/h ;毛細(xì)管電壓:+12KV ;靜電紡織機(jī)的噴頭和滾筒距離:20cm。
12.根據(jù)權(quán)利要求8或10所述的仿生腹膜的制備方法，其特征在于:所述的干細(xì)胞培養(yǎng)液在靜電紡織機(jī)上噴涂的參數(shù)設(shè)置為:微量推進(jìn)速度:0.2ml/min ;毛細(xì)管電壓:+7KV ;靜電紡織機(jī)的噴頭和滾筒距離:4cm。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的仿生腹膜的制備方法，其特征在于:所述滾筒參數(shù)設(shè)置為:滾筒電壓:-4KV ;滾筒旋轉(zhuǎn)速度:250rmp/min ;橫向移動(dòng)速度:0.15cm/s ;橫向移動(dòng)幅度:8cm。
14.根據(jù)權(quán)利要求6所述的仿生腹膜的制備方法，其特征在于:所述的聚乳酸一羥基乙酸微球制備方法包括: S21將重量比為1:1的乳酸和羥基酸共10mg溶解在4ml 二氯甲烷(CH2Cl2)中，制成油相； S22將成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子樣品溶于500 μ I去離子水中形成水相； S23將該水相加入到油相中，混合物用超聲探針震蕩處理，勻化后形成初乳(Wl/Ο)，將0.5gPVA加入10ml去離子水中形成含0.5% (w/v)PVA的油相(W2)，將初乳倒入油相(W2)中，機(jī)械攪拌器400rpm攪拌4h，攪拌過(guò)程中溶劑蒸發(fā)，得到膠態(tài)懸浮的聚乳酸一羥基乙酸微球。
【文檔編號(hào)】A61L27/56GK104162186SQ201410346300
【公開(kāi)日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2014年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月18日
【發(fā)明者】任建安, 王革非, 吳秀文, 陳國(guó)璞, 周波, 陳軍, 顧國(guó)勝, 黎介壽 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院