一種協(xié)同增效治療腦膠質(zhì)瘤的組合藥物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥制備【技術(shù)領(lǐng)域】,涉及一種能夠協(xié)同增強(qiáng)抑制腦膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的新型組合藥物;其有效藥物成分為海兔素和替莫唑胺,將兩者按一定質(zhì)量配比混合后采用浸取、萃取和分離純化等常規(guī)加工工藝配制成片劑、粉劑或采用膠囊包裝結(jié)構(gòu);其制備工藝簡(jiǎn)單,組合成份單純,使用安全可靠,療效明顯,醫(yī)用環(huán)境友好,原料加工制備工藝成熟,無(wú)副作用。
【專利說(shuō)明】一種協(xié)同增效治療腦膠質(zhì)瘤的組合藥物
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥制備【技術(shù)領(lǐng)域】,涉及一種能夠協(xié)同增強(qiáng)抑制腦膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的新型組合藥物。
【背景技術(shù)】
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[0002]腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤,手術(shù)難以切除干凈,復(fù)發(fā)率、死亡率高,其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤平均生存期只有10-12個(gè)月,術(shù)后輔以放療化療,效果亦不理想,因此尋找好的治療膠質(zhì)瘤的藥物成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn);替莫唑胺是目前治療腦膠質(zhì)瘤效果較好的化療藥,臨床上廣泛應(yīng)用,具有較寬的抗腫瘤譜,易于透過(guò)血腦屏障,酸性環(huán)境下穩(wěn)定,現(xiàn)已作為一線化療藥物在臨床推廣應(yīng)用,但部分膠質(zhì)瘤對(duì)其反應(yīng)不敏感,治療效果差,能否有新的藥物與替莫唑胺聯(lián)合用藥,增強(qiáng)其抗瘤作用成為一個(gè)新的關(guān)注焦點(diǎn);海兔素是一種天然的海洋藥物,它是一種海藻溴代倍半萜,從海洋三列凹頂藻中提取的脂溶性化合物,分子式為C15H19BrO,分子量?jī)H為295 ;海兔素已經(jīng)被證實(shí)對(duì)乳腺癌、胃癌有很好的治療作用。[天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2012 ;24:1201-1205,中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2010 ;26 (3):333-337];替莫唑胺與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用治療腦膠質(zhì)瘤是目前提高膠質(zhì)瘤化療效果的重要方法,但是目前還沒(méi)有關(guān)于海兔素聯(lián)合替莫唑胺治療膠質(zhì)瘤的研究報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
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[0003]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn),尋求提供一種治療腦膠質(zhì)瘤的抗腫瘤組合藥物,具體的說(shuō)是一種含有海兔素和替莫唑胺的治療腦膠質(zhì)瘤的抗腫瘤組合藥物。
[0004]為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明所述的治療腦膠質(zhì)瘤的組合藥物,其有效藥物成分為海兔素和替莫唑胺,其質(zhì)量配比為(10-20):1 ;混合后采用常規(guī)加工工藝配制成片劑、粉劑或采用膠囊包裝結(jié)構(gòu);其使用的海兔素為常規(guī)工藝制取的白色化合物,分子式為C15H19BrO,分子量為295 ;使用的替莫唑胺為市售產(chǎn)品藥物。
[0005]本發(fā)明涉及的組合藥物與現(xiàn)有技術(shù)相比,其制備工藝簡(jiǎn)單,組合成份單純,使用安全可靠,療效明顯,醫(yī)用環(huán)境友好,原料加工制備工藝成熟,無(wú)副作用。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
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[0006]圖1為本發(fā)明涉及的海兔素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
[0007]圖2為本發(fā)明涉及的海兔素對(duì)膠質(zhì)瘤的抑制作用的MTT結(jié)果顯示。
[0008]圖3為海兔素誘導(dǎo)U-87MG細(xì)胞及星形細(xì)胞的凋亡結(jié)果。
[0009]圖4為海兔素能明顯減少U87及U251細(xì)胞克隆數(shù)量。
[0010]圖5為細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn),海兔素能明顯抑制膠質(zhì)瘤的侵襲。
[0011]圖6(a)為海兔素和替莫唑胺及組合物對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞活性影響
[0012]圖6 (b)為海兔素和替莫唑胺及組合物對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響
[0013]圖6 (C)為海兔素和替莫唑胺及組合物對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞克隆數(shù)影響
[0014]圖6 (d)為海兔素和替莫唑胺及組合物對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲的影響
[0015]圖7為海兔素和替莫唑胺及組合物對(duì)大鼠生存時(shí)間的影響
【具體實(shí)施方式】
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[0016]下面結(jié)合附圖并通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0017]實(shí)施例1:
[0018]本實(shí)施例所述的治療腦膠質(zhì)瘤的組合藥物,其有效藥物成分為海兔素和替莫唑胺,其質(zhì)量配比為(10-20):1 ;采用常規(guī)加工工藝混合配制成片劑、粉劑或采用膠囊包裝結(jié)構(gòu);其使用的海兔素為常規(guī)工藝加工制取的白色化合物,分子式為C15H19BrO,分子量為295 ;使用的替莫唑胺為市售產(chǎn)品的粉狀藥物。
[0019]本實(shí)施例所述海兔素的制備工藝包括浸取、萃取和分離純化三個(gè)步驟:
[0020](I)浸取:先將三列凹頂藻樣品在常溫下風(fēng)干后,稱取5kg,按1:2~5的重量比例用體積分?jǐn)?shù)為0.95的乙醇室溫下浸泡3天,并反復(fù)浸泡提取3次,合并提取液后經(jīng)減壓濃縮并控制溫度低于40°C,得到乙醇提取物325g ;
[0021](2)萃取:再將乙醇提取物懸浮于蒸餾水中,用乙酸乙酯萃取,有機(jī)相回收溶劑得到乙酸乙酯萃取物105g;
[0022](3)分離純化:取上述乙酸乙酯萃取物,干法上樣,進(jìn)行正相硅膠柱色譜分離,用石油醚丙酮梯度洗脫,薄層色譜檢查,合并相同部分,洗脫液經(jīng)過(guò)反復(fù)正相硅膠、生物膠B1-beads、凝膠S印hadex LH-20柱色譜和反相HPLC分離純化,得到白色化合物,為溴代倍半萜海兔素單體(Aplysin),測(cè)其分子式為C15H19BrO,分子量為295。
[0023]本發(fā)明提取的海兔素(C15H19BrO)的特征如下:無(wú)色針晶(石油醚),mp96~98 0C ;IR vKBrmax cm-1:2952,2864,1577,1487, 1460,1375, 1308, 1267,1234,1192,1007,904,881862 ;E1-MS m/z ( % ):296 [M (81Br)] + (100),294[M(79Br)] + (100),281[M(81Br) -CH3] + (95), 279 [M(79Br) -CH3] + (95), 239 (45), 237 (45), 200 [M—Br] + (35),160(16),115(12),109(10),69(5) ;1H_NMR(CD3C0CD3,500MHz) δ:1.06 (3H, d, J = 6.5Hz,H-9),1.04 ~1.08 (1H, m, H_2a),1.27 (3H, s’ H-10),1.33 (3H, s’ H-12),1.60 ~1.68 (2H,m, H-2b, la),1.81 ~1.86 (2H, m, H_lb,3),2.26 (3H, s’ H-1I) ,6.60 (1H, s’ H_5),7.2(1H,s’ H-8) ;13C-NMR(CD3C0CD3,125MHz) δ:43.0 (C_l),31.9 (C_2),46.6(C_3),100.4(C_3a),159.4 (C-4a) , 110.5 (C_5) , 137.5 (C_6) , 114.3 (C_7) , 127.3 (C_8) , 137.4 (C_8a),55.l(C-8b),13.3(C-9),23.1 (C-1O), 23.4 (C-1l), 20.1 (C-12);上述數(shù)據(jù)與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的海兔素一致,因此確定所提取到的化合物為海兔素,見(jiàn)圖1。
[0024]實(shí)施例2:
[0025]本實(shí)施例所制得的海兔素應(yīng)用效果檢測(cè),其涉及的材料來(lái)源是:
[0026]人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系:現(xiàn)71^,似5謹(jǐn)6川3731^ and M059J購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù);
[0027]U87MG-TR細(xì)胞:每?jī)芍軐87MG細(xì)胞用含替莫唑胺培養(yǎng)基培養(yǎng),共4個(gè)月,獲得對(duì)替莫唑胺耐藥的U87MG細(xì)胞;
[0028]星形膠質(zhì)細(xì)胞:采用原代培養(yǎng)方法,將腦組織剪成碎塊,去除腦膜組織,胰酶消化,金屬濾網(wǎng)過(guò)濾后培養(yǎng)在含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,用GFAP免疫熒光染色進(jìn)行鑒定;
[0029]海兔素作用膠質(zhì)瘤細(xì)胞活性測(cè)定:將U87MG、U251MG、U373MG、M059J和星形膠質(zhì)細(xì)胞分別植入96孔板中,每孔植入5X 103個(gè)細(xì)胞,不同濃度的海兔素(OdOdOμg/ml)分別加入96孔板中,作用48小時(shí),MTT法測(cè)定細(xì)胞活性,海兔素對(duì)膠質(zhì)瘤的抑制作用隨劑量的增高而增強(qiáng),成劑量依賴性,海兔素對(duì)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞無(wú)抑制作用,說(shuō)明海兔素能選擇性抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增值,見(jiàn)圖2 ;
[0030]海兔素誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的測(cè)定:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膠質(zhì)瘤細(xì)胞,以I X 107ml密度接種,用不同濃度海兔素(0、5、10、20、40μ8/πι1)共同培養(yǎng)48h,收集各組細(xì)胞數(shù),磷酸緩沖液洗2次,棄上清,加Iml碘化丙啶(PI)避光30min,細(xì)網(wǎng)過(guò)濾,流式細(xì)胞儀上進(jìn)行熒光檢測(cè),分析細(xì)胞凋亡情況,海兔素誘導(dǎo)U-87MG細(xì)胞凋亡,隨濃度的增加凋亡增多,呈劑量依賴性,對(duì)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞無(wú)作用,說(shuō)明海兔素能選擇性誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤的凋亡,見(jiàn)圖3 ;
[0031]海兔素抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲測(cè)定:Matrigel25 μ I加入transwell板上室,使Matrigel聚合成膠。用無(wú)血清培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液,5 X 14個(gè)細(xì)胞/ml ;胎盤(pán)蘭拒染實(shí)驗(yàn),細(xì)胞活力需大于95% JranswelI培養(yǎng)板上室加入100 μ I細(xì)胞懸液并加入無(wú)血清培養(yǎng)基200ul ;TranswelI培養(yǎng)板下室加入500 μ I趨化因子,37°C , 5% CO2培養(yǎng)48h ;甲醇固定30min,蘇木素染色I(xiàn)min,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,將聚碳酯膜自上室基底切取下來(lái),中性樹(shù)脂封片,細(xì)胞在高倍鏡下(X200)隨機(jī)取10個(gè)視野計(jì)數(shù),取平均數(shù),海兔素能明顯減少U87及U251細(xì)胞克隆數(shù)量,明顯抑制膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng),抑制作用隨劑量的增高而增強(qiáng),成劑量依賴性,見(jiàn)圖4;細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)說(shuō)明,海兔素能明顯抑制膠質(zhì)瘤的侵襲,抑制作用隨劑量的增高而增強(qiáng),成劑量依賴性,如圖5 ;
[0032]海兔素和替莫唑胺對(duì)細(xì)胞增殖影響:
[0033]收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87細(xì)胞,以IXlOfVml的密度加入96孔板內(nèi),5 % CO2,37°C恒溫條件培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液;設(shè)4組,分別加入相應(yīng)反應(yīng)物,A組對(duì)照組;B組為替莫唑胺(4 μ g/ml) ;C組為海兔素(40 μ g/ml) ;D組為海兔素(40 μ g/ml)和替莫唑胺(4 μ g/ml)組合物,對(duì)照組加入等體積含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,每組均設(shè)6個(gè)重復(fù)孔,培養(yǎng)48h ;每孔加入20 μ I MTT,4h后棄上清,每孔加入150μ I DMS0,充分震蕩后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定490nm處的吸光度值,繪制細(xì)胞增殖曲線,計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(Inhibitory Rate, IR),細(xì)胞增殖抑制率IR% = (1-實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值)X 100 %。海兔素和替莫唑胺組合物對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖抑制作用明顯高于單用海兔素或替莫唑胺,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05),見(jiàn)表1 ;
[0034]表1海兔素和替莫唑胺對(duì)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響(0D值T±s )
[0035]
【權(quán)利要求】
1.一種協(xié)同增效治療腦膠質(zhì)瘤的組合藥物,其特征在于有效藥物成分為海兔素和替莫唑胺,其質(zhì)量配比為(10-20):1 ;混合后采用常規(guī)加工工藝配制成片劑、粉劑或采用膠囊包裝結(jié)構(gòu);其使用的海兔素為常規(guī)工藝制取的白色化合物,分子式為C15H19BrO,分子量為295 ;使用的替莫唑胺為市售產(chǎn)品藥物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的協(xié)同增效治療腦膠質(zhì)瘤的組合藥物,其特征在于制備工藝包括浸取、萃取和分離純化三個(gè)步驟: (1)浸取:先將三列凹頂藻樣品在常溫下風(fēng)干后,稱取5kg,按1:2~5的重量比例用體積分?jǐn)?shù)為0.95的乙醇室溫下浸泡3天,并反復(fù)浸泡提取3次,合并提取液后經(jīng)減壓濃縮并控制溫度低于40°C,得到乙醇提取物325g ; (2)萃取:再將乙醇提取物懸浮于蒸餾水中,用乙酸乙酯萃取,有機(jī)相回收溶劑得到乙酸乙酯萃取物105g ; (3)分離純化:取上述乙酸乙酯萃取物,干法上樣,進(jìn)行正相硅膠柱色譜分離,用石油醚丙酮梯度洗脫,薄層色譜檢查,合并相同部分,洗脫液經(jīng)過(guò)反復(fù)正相硅膠、生物膠B1-beads、凝膠S印hadex LH-20柱色譜和反相HPLC分離純化,得到白色化合物,為溴代倍半萜海兔素單體(Aply sin),測(cè)其分子式為C15H19BrO,分子量為295。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK104069103SQ201410317024
【公開(kāi)日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2014年7月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月4日
【發(fā)明者】宮安靜, 竇梅, 梁惠, 賀娟 申請(qǐng)人:青島大學(xué)附屬醫(yī)院