來自丁酸梭菌的脂磷壁酸及其調(diào)節(jié)畜禽免疫應(yīng)答的用途
【專利摘要】本發(fā)明公開一種來自丁酸梭菌的脂磷壁酸及其調(diào)節(jié)畜禽免疫應(yīng)答的用途，先配制成質(zhì)量百分比為1.5-2.5％的TX-114溶液備用；然后取8-16mL經(jīng)45-50h培養(yǎng)的丁酸梭菌液離心分層得到菌體濕重；加入TX-114溶液離心得到脂磷壁酸的粗提取物；然后在DEAE-纖維素層析柱上過柱得到脂磷壁酸。本發(fā)明具有能夠改善畜禽的腸道免疫功能，抑制病原菌在腸粘膜細胞表面的粘附定植，降低腸道傳染病發(fā)病率，提高畜禽養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟效益的優(yōu)點。
【專利說明】來自丁酸梭菌的脂磷壁酸及其調(diào)節(jié)畜禽免疫應(yīng)答的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)畜禽免疫應(yīng)答的丁酸梭菌細胞壁脂磷壁酸，所述免疫應(yīng)答是由致病菌或其菌體成分誘導(dǎo)。
【背景技術(shù)】
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[0002]腸道傳染病是集約化畜禽養(yǎng)殖中最常見的傳染病之一，主要由致病性大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、傷寒桿菌、霍亂弧菌等病原引起。這類疾病的傳染性強，死亡率高，對畜禽養(yǎng)殖業(yè)的危害十分嚴重。這些腸道傳染病病原還可能從動物傳播到人，引發(fā)人體腸道疾病，對消費者的身體健康造成潛在威脅。目前，飼料中添加抗菌藥物仍是防治畜禽腸道傳染病的主要手段。但這一防治手段帶來的系列問題已成為社會關(guān)注的焦點:(I)長期使用抗菌藥物導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性，這給動物甚至人類傳染性疾病防控帶來了更大的困難；(2)會在畜禽肉蛋奶類產(chǎn)品產(chǎn)生抗菌藥物殘留，危害消費者的健康；(3)未被畜禽消化、吸收和降解的抗生素隨動物糞便排出體外，對土壤、水體造成污染，間接危害消費者的健康。在傳統(tǒng)的畜禽養(yǎng)殖過程中，畜禽腸道傳染病的發(fā)生率則很低。這是因為正常動物腸道中生存者大量共生菌，這些共生菌能夠通過群體效應(yīng)，抑制病原菌在腸道中的粘附、定植與侵染，調(diào)控動物腸道免疫應(yīng)答反應(yīng)，防止腸道傳染病的發(fā)生?；谶@一背景，人們開發(fā)了多種微生態(tài)制劑，通過調(diào)節(jié)動物腸道菌群結(jié)構(gòu)來防治動物腸道傳染病。微生態(tài)制劑具有不導(dǎo)致細菌產(chǎn)生耐藥性、無殘留、環(huán)境友好等優(yōu)點，但微生態(tài)制劑的作用效果受動物種類、年齡、養(yǎng)殖環(huán)境、飼料加工方式和投喂方式等多種因素影響，不易于實施。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種能夠改善畜禽的腸道免疫功能，抑制病原菌在腸粘膜細胞表面的粘附定植，降低腸道傳染病發(fā)病率，提高畜禽養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟效益的來自丁酸梭菌的脂磷壁酸。
[0004]本發(fā)明運用TritonX-114破碎丁酸梭菌細胞，再用離子交換樹脂分離純化脂磷壁酸，進而利用截留分子量為3500的半透膜進行透析，除去其中的雜質(zhì)，獲得純的脂磷壁酸；具體制備步驟包括:
[0005](I)向 40-60mmol/L、pH6-7 的 Tris-HCl 緩沖液中加 TritonX-114 (TRIT0NX-114CAS:9036-19-5)，配制成質(zhì)量百分比為1.5-2.5%的TX-114溶液(即TRIT0NX-114質(zhì)量百分比為1.5-2.5%的TRIT0NX-114溶液)，置于4°C冰箱保存，備用；
[0006](2)取8_16mL經(jīng)45_50h培養(yǎng)的丁酸梭菌液于若干支質(zhì)量已知的塑料離心管中，常溫、4500-5000rpm離心25_40min，除去上層培養(yǎng)液后再稱各管質(zhì)量，計算得到菌體濕重；
[0007](3)按照每Ig濕菌(步驟2的菌體)添加8-12mL步驟(I)的1.5-2.5 % %TX-114溶液的比例混合，磁力攪拌器攪拌裂解菌體25-40min，4°C靜置過夜；然后4°C、4500-5000rpm離心25-40min，去除細菌碎片，收集上層提取物；提取物置于45_50°C水浴中25-30min，然后常溫4500-5000rpm離心25_40min，收集上層水相，即為脂磷壁酸的粗提取物；
[0008](4)先用0.1M (mol/L) pH4.7的醋酸銨緩沖液預(yù)平衡DEAE-纖維素層析柱(2 X 20cm即直徑X長度)，然后向脂磷壁酸粗提取物中加入5倍其體積的0.1ΜρΗ4.7的醋酸銨緩沖液，稀釋后過柱；用同一緩沖液(0.1ΜρΗ4.7的醋酸銨緩沖液)洗脫，直到洗脫液275nm吸光度A275低于0.01，然后用1.0mol/LpH4.7醋酸銨緩沖液洗脫結(jié)合于柱上的脂磷壁酸，整個過程用試管收集洗脫液，A275監(jiān)測脂磷壁酸洗脫峰；得到脂磷壁酸。
[0009]作為優(yōu)選，本發(fā)明步驟(I)的Tris-HCl緩沖液為50mmol/L、pH6.5，TX_114溶液質(zhì)量百分比濃度為2%。
[0010]作為優(yōu)選，步驟(3)每Ig濕菌添加1mL的2% TX-114溶液。
[0011]本發(fā)明步驟(2)的丁酸梭菌液培養(yǎng)條件為:37°C厭氧培養(yǎng)，其培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基，MRS培養(yǎng)基配方:酪蛋白胨10g、牛肉浸膏10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、乙酸鈉5g、吐溫-801g、磷酸氫二鉀2g、七水硫酸錳0.2g、七水硫酸錳0.05g、碳酸鈣20g、蒸餾水100mL,ρΗ7.0。
[0012]本發(fā)明將丁酸梭菌脂磷壁酸用于畜禽養(yǎng)殖中進行應(yīng)用即來自丁酸梭菌的脂磷壁酸在畜禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用，該脂磷壁酸在畜禽飼料中的添加量以丁酸梭菌的量計，為18Cfu/g-1010cfu/g(是“108cfu/g-10lclcfu 丁酸梭菌菌體中的磷壁酸成分”的意思；也就是說，原來是直接添加菌體的，現(xiàn)在改為添加同樣數(shù)量菌體中的磷壁酸成分)。
[0013]本發(fā)明上述丁酸梭菌脂磷壁酸在調(diào)節(jié)畜禽免疫應(yīng)答中的應(yīng)用，所述的免疫應(yīng)答由致病性革蘭氏陽性菌和陰性菌或它們的衍生物所誘導(dǎo)。
[0014]本發(fā)明所述的脂磷壁酸與其他革蘭氏陽性菌的細胞壁脂磷壁酸結(jié)構(gòu)存在差異，該脂磷壁酸不會引起腸粘膜上皮細胞釋放炎癥因子，所述的炎癥因子為IL-2和TNF-α。
[0015]本發(fā)明的丁酸梭菌為日本米雅利桑株式會社的MIYAIRI II 588菌株。
[0016]本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果:
[0017]1.本發(fā)明從水產(chǎn)動物的免疫機能調(diào)節(jié)機制出發(fā)，研究了丁酸梭菌脂磷壁酸對病原菌脂多糖誘導(dǎo)的腸粘膜上皮細胞IL-2、TNF-α等炎癥因子分泌的影響，分析了丁酸梭菌脂磷壁酸對仔豬、肉雞攻毒試驗的保護作用，證明該脂磷壁酸能夠抑制病原技能脂多糖誘導(dǎo)的腸粘膜上皮細胞炎癥因子的釋放，顯著降低致病菌導(dǎo)致的仔豬、肉雞發(fā)明率和死亡率，具有成為新型畜禽免疫調(diào)節(jié)劑的潛力，市場前景十分看好。
[0018]2.本發(fā)明基于益生菌的益生作用機制，分離純化丁酸梭菌的細胞壁脂磷壁酸，用以調(diào)節(jié)畜禽腸道免疫機能，防治畜禽腸道傳染病。脂磷壁酸是革蘭氏陽性菌細胞壁的主要組成成分之一，是一類由多聚磷酸甘油酯或多聚磷酸核糖醇構(gòu)成的陰離子聚合物，其鏈上羥基往往被丙氨酸或N-乙酰葡萄糖胺修飾，因此通常還帶有正電荷，形成正、負電荷交替出現(xiàn)的鏈狀聚合物結(jié)構(gòu)。磷壁酸對革蘭氏陽性菌的生理功能主要包括:(I)維持細菌細胞壁中陽離子的濃度平衡；(2)保護細菌免受抗生素、表面活性劑、溶菌酶和熱應(yīng)激等的損傷；(3)參與細菌細胞分裂，并在參與細菌自溶過程；(4)在革蘭氏陽性菌與宿主細胞的互作及免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著十分重要的作用。不同細菌來源的脂磷壁酸結(jié)構(gòu)與性質(zhì)呈現(xiàn)很大差異。金黃色葡萄球菌脂磷壁酸能夠人全血細胞TNF-a、IL-1 β、IL-6和IL-10等因子的分泌(Morath 等，2001, The Journal of Experimental Medicine, 193 (3): 393-398 ;Hermann 等，2002, European Journal of Immunology, 32 (2): 541-551)。肺炎鏈球菌脂憐壁酸刺激機體細胞產(chǎn)生TNF- α的能力比金黃色葡萄球菌脂磷壁酸弱，這可能是二者結(jié)構(gòu)不同的緣故(HAN 等,2003, Infect1n and Immunity, , 71 (10): 5541-5548)。植物乳桿菌(Lactobacillus pi ant arum)脂磷壁酸則能夠抑制金黃色葡萄球菌磷壁酸誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生(Kim 等，2008, Journal of Microb1logy and B1technology, 18 (6): 1191-1196)。也有研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌磷壁酸能夠刺激巨噬細胞一氧化氮(NO)的產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗炎癥作用(Kang 等，2011, Molecular Immunology, 48:2170-2177)。
[0019]3.本發(fā)明分離純化腸道共生菌丁酸梭菌的脂磷壁酸，該脂磷壁酸能夠改善畜禽的腸道免疫功能，抑制病原菌在腸粘膜細胞表面的粘附定植，降低腸道傳染病發(fā)病率，提高畜禽養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟效益。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1、丁酸梭菌脂磷壁酸對大腸桿菌脂多糖誘導(dǎo)的腸粘膜上皮組織IL-2分泌的影響。
[0021]圖2、丁酸梭菌脂磷壁酸對大腸桿菌脂多糖誘導(dǎo)的腸粘膜上皮組織TNF- α分泌的影響。
[0022]圖3 丁酸梭菌脂磷壁酸對沙門氏菌感染肉仔雞回腸組織抗體水平的影響。
[0023]圖4 丁酸梭菌脂磷壁酸對EPEC誘導(dǎo)仔豬腸粘膜組織IL-1 β mRNA表達量的影響。
[0024]圖5 丁酸梭菌脂磷壁酸對EPEC誘導(dǎo)仔豬腸粘膜組織TNF- a mRNA表達量的影響。
[0025]圖6 丁酸梭菌脂磷壁酸對EPEC所致仔豬腹瀉率的影響。
[0026]圖7 丁酸梭菌脂磷壁酸的紅外光譜圖。
[0027]圖8 丁酸梭菌菌脂磷壁酸的IHNMR譜圖。
【具體實施方式】
[0028]下面通過實施例進一下詳細描述本發(fā)明，但本發(fā)明不僅僅局限于以下實施例。
[0029]1、丁酸梭菌脂磷壁酸的提取制備方法
[0030]以 50mmol/L、ρΗ6.5Tris_HCL 緩沖液加 TritonX-114 配制成 2 % TX-114 溶液，4°C冰箱保存，備用。取1mL經(jīng)48h培養(yǎng)的丁酸梭菌液(37°C厭氧培養(yǎng)，其培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基，MRS培養(yǎng)基配方:酪蛋白胨10g、牛肉浸膏10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、乙酸鈉5g、吐溫_801g、磷酸氫二鉀2g、七水硫酸錳0.2g、七水硫酸錳0.05g、碳酸鈣20g、蒸餾水100mL,pH7.0)于若干支質(zhì)量已知的塑料離心管中，常溫、5000rpm離心30min，除去上層培養(yǎng)液后再稱各管質(zhì)量，計算得到菌體濕重。按照每Ig濕菌添加10mL2% TX-114溶液的比例，磁力攪拌器攪拌裂解菌體30min，4°C靜置過夜。4°C、5000rpm離心30min，去除細菌碎片，收集上層提取物。提取物50°C水浴30min，常溫5000rpm離心30min，輕輕收集上層水相，即為磷壁酸的粗提取物。用0.1ΜρΗ4.7的醋酸銨緩沖液預(yù)平衡DEAE-纖維素層析柱(2 X 20cm)，磷壁酸粗提取物中加入5倍體積的醋酸銨緩沖液，稀釋后過柱。用同一緩沖液洗脫，直到洗脫液275nm吸光度A275低于0.01，用1.0mol/LpH4.7醋酸銨緩沖液洗脫結(jié)合于柱上的磷壁酸，整個過程用試管收集洗脫液，A275監(jiān)測磷壁酸洗脫峰。通過紅外和核磁檢測，如圖7和8所示，得出本發(fā)明上述方法獲得了丁酸梭菌脂磷壁酸。
[0031]2、腸粘膜組織的分離培養(yǎng)
[0032]新生仔豬心臟采血致死，肉仔雞則取19日雞胚。無菌操作取出回腸、結(jié)腸組織，以置于含2ug/mL抑肽酶(aprotinin)的ρΗ7.4的PBS中保存，用4°C pH7.4的PBS洗滌數(shù)次，小心地將組織切成Icm2的小塊。將組織塊置于細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，使其貼壁生長，用于后續(xù)研究。
[0033]3、按照相當于丁酸梭菌108cfu/mL到101(lCfU/mL的量，添加丁酸梭菌脂磷壁酸溶液到仔豬及肉雞腸粘膜組織培養(yǎng)板中，37°C孵育30min后，添加100ng/mL大腸桿菌脂多糖(1^5)，371:孵育24小時后，分析其11^-2、幾-8、了即-0等炎癥因子的水平。本試驗中，未經(jīng)任何處理的腸粘膜上皮組織為對照組(C)、大腸桿菌LPS處理組(TO)、相當于108cfu/mL 丁酸梭菌的脂磷壁酸+LPS組(Tl)、相當于109cfu/mL 丁酸梭菌的脂磷壁酸+LPS組(T2)、相當于101(lCfU/mL 丁酸梭菌的脂磷壁酸+LPS組(T3)。
[0034]IL-2水平的分析采用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。將標準品、待測樣本加入到預(yù)先包被雞(豬)白細胞介素2(IL-2)單克隆抗體透明酶標包被板中，溫育足夠時間后，洗滌除去未結(jié)合的成分，再加入酶標工作液，溫育足夠時間后，洗滌除去未結(jié)合的成分。依次加入底物A、B，底物(TMB)在辣根過氧化物酶(HRP)催化下轉(zhuǎn)化為藍色產(chǎn)物，在酸的作用下變成黃色，顏色的深淺與樣品中雞(豬)白細胞介素2(IL-2)濃度呈正相關(guān)，450nm波長下測定OD值，根據(jù)標準品和樣品的OD值，計算樣本中雞(豬)白細胞介素2(IL-2)含量。結(jié)果如圖1。
[0035]白細胞介素2(IL_2)是由多種細胞受到刺激后產(chǎn)生的一種前炎癥因子，能夠刺激機體發(fā)生炎癥反應(yīng)。由圖1可知，添加丁酸梭菌脂磷壁酸能夠顯著降低大腸桿菌LPS刺激的雞、豬腸粘膜上皮細胞炎癥因子IL-2的分泌，調(diào)節(jié)動物機體免疫應(yīng)激反應(yīng)，從而保護動物機體健康。
[0036]腫瘤壞死因子α (TNF-α)是一種重要的前炎性因子，能夠?qū)е聶C體發(fā)生炎癥反應(yīng)，致病菌脂多糖能夠通過刺激多種細胞分泌TNF-a，從而誘導(dǎo)機體發(fā)生炎癥。由圖2可知，丁酸梭菌脂磷壁酸能夠顯著抑制由大腸桿菌LPS導(dǎo)致的TNF-α的分泌，這說明丁酸梭菌的脂磷壁酸成分能夠通過抑制腸粘膜組織炎癥因子TNF- α的分泌，發(fā)揮抗炎癥作用。
[0037]4、按照相當于108cfu/g到101(lCfU/g的菌量，在畜禽飼料中添加丁酸梭菌脂磷壁酸，7日齡AA肉雞每只每天灌服5.0X 14Cfu沙門氏菌進行攻毒試驗，試驗期為14天，分析肉仔雞發(fā)病率、死亡率和腸道粘膜免疫應(yīng)答水平變化，確定丁酸梭菌脂磷壁酸對AA肉雞的保護作用。
[0038]表I 丁酸梭菌脂磷壁酸對AA肉雞病死率的影響)
[0039]
【權(quán)利要求】
1.一種來自丁酸梭菌的脂磷壁酸，其特征在于:該脂磷壁酸為由如下制備步驟制備而成的脂磷壁酸: (1)向40-60mmol/L、pH6_7的Tris-HCl緩沖液中加TritonX-114，配制成質(zhì)量百分比為1.5-2.5%的TX-114溶液，置于4°C冰箱保存，備用； (2)取8-16mL經(jīng)45_50h培養(yǎng)的丁酸梭菌液于若干支質(zhì)量已知的塑料離心管中，常溫、4500-5000rpm離心25_40min，除去上層培養(yǎng)液后再稱各管質(zhì)量，計算得到菌體濕重； (3)按照步驟⑵制得的每Ig濕菌添加8-12mL步驟⑴的1.5-2.5%% TX-114溶液的比例混合，磁力攪拌器攪拌裂解菌體25-40min，4°C靜置過夜；然后4°C、4500-5000rpm離心25-40min，去除細菌碎片，收集上層提取物；提取物置于45_50°C水浴中25_30min，然后常溫4500-5000rpm離心25_40min，收集上層水相，即為脂磷壁酸的粗提取物； (4)先用0.lmol/LpH4.7的醋酸銨緩沖液預(yù)平衡DEAE-纖維素層析柱，然后向脂磷壁酸粗提取物中加入5倍其體積的0.1ΜρΗ4.7的醋酸銨緩沖液，稀釋后過柱；用同一緩沖液洗脫，直到洗脫液275nm吸光度A275低于0.01，然后用1.0mol/LpH4.7醋酸銨緩沖液洗脫結(jié)合于柱上的脂磷壁酸，整個過程用試管收集洗脫液，A275監(jiān)測脂磷壁酸洗脫峰；得到脂磷壁酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的來自丁酸梭菌的脂磷壁酸，其特征在于:該脂磷壁酸與其他革蘭氏陽性菌的細胞壁脂磷壁酸結(jié)構(gòu)存在差異，該脂磷壁酸不會引起腸粘膜上皮細胞釋放炎癥因子，所述的炎癥因子為IL-2和TNF-α。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的來自丁酸梭菌的脂磷壁酸，其特征在于:步驟(I)的Tris-HCL緩沖液為50mmol/L、pH6.5，TX-114溶液質(zhì)量百分比濃度為2%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的來自丁酸梭菌的脂磷壁酸，其特征在于:步驟(3)中每Ig濕菌添加1mL的2% TX-114溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的來自丁酸梭菌的脂磷壁酸，其特征在于:步驟(2)的丁酸梭菌液培養(yǎng)條件為:37°C厭氧培養(yǎng)，其培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基，MRS培養(yǎng)基配方:酪蛋白胨10g、牛肉浸膏10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、乙酸鈉5g、吐溫_801g、磷酸氫二鉀2g、七水硫酸猛0.2g、七水硫酸錳0.05g、碳酸鈣20g、蒸餾水lOOOmL，pH7.0。
6.一種權(quán)利要求1所述的來自丁酸梭菌的脂磷壁酸在畜禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用，該脂磷壁酸在畜禽飼料中的添加量以丁酸梭菌的量計，為108cfu/g-1010cfu/g。
7.—種權(quán)利要求1所述的來自丁酸梭菌的脂磷壁酸在在調(diào)節(jié)畜禽免疫應(yīng)答中的應(yīng)用，所述的免疫應(yīng)答由致病性革蘭氏陽性菌和陰性菌或它們的衍生物所誘導(dǎo)。
【文檔編號】A61P31/04GK104161776SQ201410235117
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月29日
【發(fā)明者】王進波, 齊莉莉, 費明明, 梅樂和 申請人:浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院