一種miR-27a的應(yīng)用及其診斷試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，提供了一種miR-27a在制備結(jié)腸癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移診斷試劑盒中的應(yīng)用，還提供了一種miR-27a在制備抑制結(jié)腸癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用，還提供了一種結(jié)腸癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移診斷試劑盒，試劑盒含有miR-27a的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，所述引物分別為：上游引物序列為：5’-TTCGGTTCACAGTGGCTAA?G-3’；通用下游引物序列為：5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。本發(fā)明提供的試劑盒通過檢測(cè)miR-27a的表達(dá)，可以對(duì)結(jié)腸癌發(fā)生進(jìn)行早期診斷，通過檢測(cè)其表達(dá)水平與臨床分期以及轉(zhuǎn)移的關(guān)系，對(duì)病人預(yù)后作出評(píng)價(jià)。
【專利說明】—種miR-27a的應(yīng)用及其診斷試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種miR-27a對(duì)結(jié)腸癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移診斷的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)腸癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的原因尚未完全清楚。結(jié)腸癌的淋巴轉(zhuǎn)移和其他臟器遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌病人死亡的主要原因，結(jié)腸癌遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的患者預(yù)后極差，因此，對(duì)結(jié)腸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移的研究一直是基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)。結(jié)腸癌的常規(guī)治療手段主要是手術(shù)治療、放化療。近年來迅速發(fā)展的免疫治療和基因治療顯示了巨大的應(yīng)用潛力。近年來研究表明表觀遺傳的改變和癌信號(hào)分子的激活是惡性病變發(fā)生和進(jìn)展的主要原因。表觀修飾尤其是miRNAs的異常表達(dá)與腫瘤的形成、轉(zhuǎn)移相關(guān)，并在腫瘤治療中起關(guān)鍵作用。miciORNAs (miRNAs)是一類內(nèi)源性小分子非編碼RNA，結(jié)構(gòu)高度保守，具有表達(dá)時(shí)序性和組織特異性，通過與靶基因3’非編碼區(qū)互補(bǔ)序列特異性結(jié)合，導(dǎo)致翻譯抑制或mRNA降解，從而調(diào)芐基因的表達(dá)?；趍iRNA的以上特點(diǎn)，以及隨著大規(guī)模、高通量miRNA檢測(cè)技術(shù)的推廣應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)新的miRNA不僅為腫瘤的診斷和預(yù)后提供了頗具價(jià)值的標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)也為尋找新的腫瘤生物治療靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。
[0003]miR-27a位于19號(hào)染色體，其表達(dá)水平和生物功能隨腫瘤類型而異，一些研究報(bào)道m(xù)iR-27a是一種癌基因，例如，在乳腺癌、結(jié)腸癌細(xì)胞系，肝細(xì)胞腺癌細(xì)胞中表達(dá)增高，而且miR-27a的高表達(dá)與乳腺癌的進(jìn)展和不良預(yù)后密切相關(guān)。另外一些研究也發(fā)現(xiàn)miR_27a通過促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子特異蛋白(Sp)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體I (VEGFRl)的表達(dá)來發(fā)揮其作為癌基因的功能。另一方面miR-27a也扮演著抑癌基因的角色，例如，miR-27a在食管癌、口腔鱗癌和非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)降低。在非小細(xì)胞肺癌中，miR-27a靶作用于MET和EGFR的3’ UTR導(dǎo)致MET和EGFR的表達(dá)降低。
[0004]我們的研究發(fā)現(xiàn)，miR-27a在結(jié)腸癌組織中表達(dá)顯著降低(41例結(jié)腸癌標(biāo)本中33例miR-27a表達(dá)降低)，另外miR-27a的低表達(dá)和結(jié)腸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(二者正相關(guān))以及臨床分期(3-4期的表達(dá)低于1-2期)密切相關(guān)。miR-27a通過靶作用于smad2、SGPPl抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。我們對(duì)miR-27a在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平以及其生物功能的研究尚屬首次，該研究對(duì)結(jié)腸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移以及治療具有重大的意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)不足，本發(fā)明的目的是提供一種miR_27a的應(yīng)用及其診斷試劑盒。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種miR_27a在制備結(jié)腸癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明還提供了一種miR_27a在制備抑制結(jié)腸癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明還提供了一種結(jié)腸癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移診斷試劑盒，試劑盒含有miR_27a的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，所述引物分別為:[0009]上游引物序列為:5’-TTCGGTTCACAGTGGCTAAG-3’，如 SEQ ID NO:1 所示；
[0010]通用下游引物序列為:5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’，如 SEQ ID NO:2 所示。
[0011]該試劑盒還包括PCR反應(yīng)常用的酶和試劑。作為優(yōu)選，試劑盒包括:組織總RNA提取試劑、RNA加polyA試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑、定量PCR試劑。
[0012]其中，逆轉(zhuǎn)錄試劑中包括miR-27a的特異逆轉(zhuǎn)錄引物，其序列為:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTT GCGGAAjn SEQ ID NO:3 所示；
[0013]內(nèi)參snord47 的逆轉(zhuǎn)錄引物，其序列為:GTGCAGGGTCCGAG GTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTAACCTdn SEQ ID NO:4 所示；
[0014]定量PCR試劑中包括miR_27a的特異引物:
[0015]上游引物:TTCGGTTCACAGTGGCTAAGjnSEQ ID NO:1 所示；
[0016]內(nèi)參snord47的特異引物:
[0017]上游引物:CGCCAA TGATGTAATGATTCTGjnSEQ ID NO:5 所示；
[0018]通用下游引物:CAGTGCAGGGTCCGAGGTjnSEQ ID NO:2 ；
[0019]通用Taqman 探針:56-FAM/CAGAGCCAC/ZEN/CTGGGCAAT TT/3 IABkFQ0
[0020]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明提供的試劑盒通過檢測(cè)miR_27a的表達(dá)，可以對(duì)結(jié)腸癌發(fā)生進(jìn)行早期診斷，通過檢測(cè)其表達(dá)水平與臨床分期以及轉(zhuǎn)移的關(guān)系，對(duì)病人預(yù)后作出評(píng)價(jià)?；趍iR-27a靶作用于smad2、SGPPl的特點(diǎn)，可以設(shè)計(jì)抑制腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的干預(yù)策略，提出了 miR-27a在制備抑制結(jié)腸癌腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移藥物中的作用。本發(fā)明在醫(yī)學(xué)和生物制藥領(lǐng)域有重大實(shí)際意義和巨大的應(yīng)用價(jià)值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1為miR_27a在41例標(biāo)本中的表達(dá)情況；
[0022]圖2為miR_27a轉(zhuǎn)染HCTl 16細(xì)胞后劃痕實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；
[0023]圖3為SGPPl和smad2在結(jié)腸癌組織和鄰近正常組織中表達(dá)的免疫組化染色結(jié)果;
[0024]圖4為P-STAT3在結(jié)腸癌組織和鄰近正常組織中表達(dá)的免疫組化染色結(jié)果；
[0025]圖5為miR_27a轉(zhuǎn)染HCTl 16細(xì)胞后SGPPl的表達(dá)變化；
[0026]圖6為miR_27a轉(zhuǎn)染HCTl 16細(xì)胞后smad2的表達(dá)變化；
[0027]圖7為psiCHECKTM-2載體的圖譜；
[0028]圖8為miR_27a轉(zhuǎn)染HCTl 16細(xì)胞后SGPPl和smad2報(bào)告基因活性的變化；
[0029]圖9為MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR_27a轉(zhuǎn)染SW480、HCTl 16、Caco2后細(xì)胞增殖情況；
[0030]圖10為miR_27a轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的凋亡變化；
[0031]圖11 為 miR_27a 轉(zhuǎn)染 HCTl 16 和 SW480 細(xì)胞后影響 STAT3 和 Caspase3 水平；
[0032]圖12為miR_27a轉(zhuǎn)染HCTl 16細(xì)胞后抑制SGPPl和Smad2蛋白水平；
[0033]圖13為miR_27a轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后抑制SGPPl和Smad2蛋白水平；
[0034]圖14為實(shí)驗(yàn)組(miR_27a轉(zhuǎn)染)和對(duì)照組(陰性對(duì)照miRNA轉(zhuǎn)染)小鼠在腫瘤細(xì)胞接種后增生物的體積隨時(shí)間的變化情況；
[0035]圖15為實(shí)驗(yàn)組(miR_27a轉(zhuǎn)染)和對(duì)照組(陰性對(duì)照miRNA轉(zhuǎn)染)小鼠中增生物的重量情況(NC 為 negative control)；[0036]圖16為實(shí)驗(yàn)組(miR_27a轉(zhuǎn)染)和對(duì)照組(陰性對(duì)照miRNA轉(zhuǎn)染)小鼠中增生物的情況；
[0037]圖17為實(shí)驗(yàn)組(miR_27a轉(zhuǎn)染)和對(duì)照組(陰性對(duì)照miRNA轉(zhuǎn)染)小鼠中增生物的miR-27a的表達(dá)情況。
【具體實(shí)施方式】
[0038]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件。
[0039]實(shí)施例lmiR_27 a在結(jié)腸癌組織標(biāo)本中的差異性表達(dá)
[0040]1、人結(jié)腸組織標(biāo)本收集
[0041]從新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院和新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，收集2012年11月至2013年12月間的共41例結(jié)腸癌標(biāo)本及其臨近的正常結(jié)腸組織標(biāo)本。一部分儲(chǔ)存于液氮、-80°C冰箱中，提取RNA和蛋白質(zhì)用來做實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡。另一部分用10%福爾馬林固定，后用石蠟包埋。病人的臨床和病理信息如表1所示。所有病人均書面告知，標(biāo)本收集均經(jīng)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院倫理審查委員會(huì)同意。
[0042]表lmiR-27a與臨床病理資料間的聯(lián)系
【權(quán)利要求】
1.miR-27a在制備結(jié)腸癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移診斷試劑盒中的應(yīng)用。
2.miR-27a在制備抑制結(jié)腸癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。
3.一種結(jié)腸癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移診斷試劑盒，其特征在于，試劑盒含有miR-27a的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，所述引物分別為: 上游引物序列為:5，-TTCGGTTCACAGTGGCTAAG-3’，如 SEQ ID NO:1 所示； 通用下游引物序列為:5’ -CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’，如SEQ ID NO:2所示。
4.根據(jù)權(quán)利 要求3所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括PCR反應(yīng)常用的酶和試劑。
【文檔編號(hào)】A61K48/00GK103966327SQ201410191811
【公開日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月7日
【發(fā)明者】鮑永華, 楊萬才, 郭永臣, 李澤信, 薛會(huì)朝, 朱紹輝, 徐紅偉, 游焜, 陳志國(guó), 趙鐵索, 李凱, 王倩 申請(qǐng)人:新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院