一種具有靶向定位釋藥的介孔碳納米粒系統(tǒng)及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種由葉酸受體介導(dǎo)的葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒的胃腸道粘附促吸收給藥系統(tǒng)。葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒為首先通過(guò)硬模板法以球形介孔硅為模板制得均一化介孔碳球，再通過(guò)濕法氧化給均一化介孔碳球添加羧基，然后利用簡(jiǎn)單的靜電聚合作用將葉酸-聚乙烯亞胺復(fù)合物修飾在羧基化的碳球表面，即得葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒。葉酸-聚乙烯亞胺復(fù)合物是利用經(jīng)典的DCC-NHS酰胺反應(yīng)制得。本發(fā)明以均一化介孔碳球作為載體，以葉酸作為靶向分子，實(shí)現(xiàn)藥物的胃腸道粘附及促吸收。本發(fā)明能提高水難溶性藥物溶出速率，增加粘附時(shí)間，促進(jìn)藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，提高藥物的生物利用度，在口服給藥領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種具有靶向定位釋藥的介孔碳納米粒系統(tǒng)及其應(yīng)用
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種具有靶向定位釋藥的介孔碳納米粒系統(tǒng)及其應(yīng)用，具體涉及由葉酸受體介導(dǎo)的葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒的胃腸道粘附及促吸收給藥系統(tǒng)及其制備。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]眾所周知，口服給藥因用藥方便，易于被病人接受，已成為目前應(yīng)用最廣泛的給藥方式，也是大多數(shù)藥物的首選給藥途徑。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在收錄藥品最多的美國(guó)藥典中有1/3以上的藥物被列為難溶性藥物；在創(chuàng)新藥物研究中，約有40%的藥物為難溶性藥物；高通量篩選獲得的活性物質(zhì)中也有約40%的藥物是水難溶性藥物。提高該類(lèi)活性物質(zhì)的生物利用度是當(dāng)前藥物制劑發(fā)展過(guò)程中面臨的具有挑戰(zhàn)性且亟待解決的一大難題。對(duì)于該類(lèi)藥物，我們可以增大藥物在胃腸道內(nèi) 的溶出速率，增加藥物以被動(dòng)擴(kuò)散的形式進(jìn)入血液循環(huán)的幾率或增大制劑的胃腸道主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，再進(jìn)行釋放藥物等方式來(lái)提高口服給藥藥物生物利用度。
[0004]新興的納米技術(shù)為解決難溶性藥物的溶解和吸收問(wèn)題帶來(lái)了極好的機(jī)遇，納米技術(shù)可以降低藥物粒子大小至納米級(jí)，顯著增加粒子的比表面積，從而可以增加水難溶藥物的溶出速率；藥物粒子粒度的下降和比表面積的增高還會(huì)促進(jìn)納米粒子與生物膜的接觸，使得已溶解的藥物分子與特殊大小的納米粒子在胃腸道被高效吸收。目前，用納米技術(shù)提高難溶性藥物口服吸收的研究主要集中在:納米結(jié)晶、固體脂質(zhì)納米粒及微乳等制劑的制備。這些研究存在的主要不足，包括:載體疏水性強(qiáng)、比表面積低、載藥量低(通常不能滿(mǎn)足臨床用藥劑量)、不能抑制藥物再結(jié)晶或再聚積等。
[0005]無(wú)機(jī)多孔材料的出現(xiàn)，為納米藥物給藥系統(tǒng)的研發(fā)開(kāi)辟了蹊徑。根據(jù)國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC)的定義，無(wú)機(jī)多孔材料按照孔徑的大小分為三類(lèi):孔徑小于2nm的稱(chēng)為微孔材料，孔徑介于2nm-50nm之間的稱(chēng)為介孔(mesopore)材料,孔徑大于50nm的稱(chēng)為大孔材料。介孔材料作為藥物載體的研究起步較晚，Vallet-Regi等于2001年率先報(bào)道了以介孔分子篩作為藥物載體的研究，開(kāi)辟了介孔材料在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用研究。這一報(bào)道很快引起介孔材料和醫(yī)藥領(lǐng)域研究者的關(guān)注和興趣。不久相繼有幾個(gè)研究小組分別報(bào)道了以介孔分子篩作藥物載體的安全性、生物相容性、藥物分子的組裝及基因轉(zhuǎn)換器等方面的研究成果。
[0006]介孔孔徑的均一有序及特殊的孔道結(jié)構(gòu)，作為難溶性藥物的載體所具有的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)如下:1:納米級(jí)別的孔徑載藥后能夠限制難溶性藥物粒子的生長(zhǎng)，使藥物以納米粒的形式存在，維持較高的藥物的比表面積；f:空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的孔道能夠維持藥物粒子的分散狀態(tài)，阻止藥物粒子的再聚積，提高藥物的物理穩(wěn)定性納米級(jí)別的孔道能夠抑制藥物的再結(jié)晶過(guò)程，降低藥物的結(jié)晶度，使藥物以無(wú)定形或者亞穩(wěn)定型的狀態(tài)存在，提高藥物的溶解度；:1相互連通、開(kāi)放的三維孔道可降低難溶性藥物的擴(kuò)散阻力，可以使藥物以一定的規(guī)律溶出或釋放后，迅速被機(jī)體所吸收(BCS II類(lèi)藥物)。
[0007]口服緩控釋制劑可使藥物按一定規(guī)律緩慢或恒速地釋放，即可按需要在預(yù)定的期間內(nèi)向人體提供適宜的血藥濃度。具有降低給藥頻率；方便用藥，提高病人的順應(yīng)性；吸收完全，提高藥物療效；減小血藥濃度波動(dòng)；降低毒副作用；降低藥物對(duì)胃腸道的刺激；降低全程治療費(fèi)用及適于兒童及吞咽困難的老年患者等特點(diǎn)。我國(guó)于二十世紀(jì)八十年代初開(kāi)始研制緩釋控釋制劑，在過(guò)去的二十年里，由于緩控釋制劑開(kāi)發(fā)的復(fù)雜性及其所需費(fèi)用較大，至今上市的緩/控釋制劑數(shù)量有限。因此，近年來(lái)口服緩控釋制劑的研制已成為國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥發(fā)展的重要方向。
[0008]利用聚乙烯亞胺對(duì)介孔碳進(jìn)行修飾后，形成優(yōu)勢(shì)疊加:1:介孔碳具有較高的比表面積，載藥量明顯高于其他的載體；t通過(guò)調(diào)節(jié)聚乙烯亞胺吸附在介孔碳表面的用量可對(duì)藥物的釋放速率進(jìn)行程序調(diào)控；:1聚乙烯亞胺帶有的強(qiáng)正電性易于吸附在帶有負(fù)電的胃腸道表面從而延長(zhǎng)藥物的平均滯留時(shí)間，進(jìn)而增加或促進(jìn)藥物的吸收；④葉酸靶向因子能夠共價(jià)接枝在聚乙烯亞胺的氨基上，通過(guò)胃腸道表面的葉酸受體來(lái)促進(jìn)納米粒的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，提高藥物的生物利用度。
[0009]因此，本項(xiàng)目制備了葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒，在增加胃腸道粘附時(shí)間的同時(shí)，對(duì)藥物進(jìn)行緩慢釋放，降低給藥次數(shù)，并且通過(guò)葉酸受體的介導(dǎo)增加了制劑的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，多級(jí)提高候選活性物 質(zhì)的口服生物利用度。
[0010]
【發(fā)明內(nèi)容】
[0011]本發(fā)明的目的是提供一種具有靶向定位釋藥的介孔碳納米粒載藥系統(tǒng)，具體是制備一種由葉酸受體介導(dǎo)的葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒，以實(shí)現(xiàn)對(duì)裝載藥物的釋放速率進(jìn)行調(diào)控及增加胃腸道粘附時(shí)間，促進(jìn)藥物吸收。
[0012]所述的納米粒由荷正電的葉酸-聚乙烯亞胺復(fù)合物與荷負(fù)電的羧基化碳納米粒經(jīng)簡(jiǎn)單的靜電復(fù)合作用自組裝而成。
[0013]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
I)球形介孔娃的制備:
利用球形介孔硅為模板，在其孔道中添加碳源糠醇和引發(fā)劑草酸溶解在三甲苯中的混合物，經(jīng)過(guò)程序升溫，聚合、碳化得到碳硅復(fù)合物。
[0014]2)羧基化球形介孔碳的制備:
利用10-20%的氫氟酸進(jìn)行硅模板出去，再利用濕法氧化即得羧基化的均一化介孔碳球。
[0015]3)葉酸-聚乙烯亞胺修飾的介孔碳納米粒的制備:
利用經(jīng)典的DCC-NHS酰胺反應(yīng)將葉酸分子接枝在聚乙烯亞胺上，然后將該葉酸-聚乙烯亞胺復(fù)合物與荷負(fù)電的羧基化碳球通過(guò)靜電復(fù)合作用自組裝成葉酸-聚乙烯亞胺-介孔碳納米粒。
[0016]本發(fā)明所述的葉酸-聚乙烯亞胺修飾的介孔碳納米粒的制備中:
I)球形介孔娃的制備:本發(fā)明利用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)形成膠束作為致孔劑，正硅酸乙酯(TEOS)作為硅源，室溫下水解制得。
[0017]具體純化步驟如下所述:
精確稱(chēng)取0.5-0.8 g CTAB于200 mL的燒杯中，分別加入50-100 mL去離子水和10_30mL無(wú)水乙醇,500-1000 rpm磁力攪拌至透明狀態(tài),之后在上述混合溶液中加入10-30 mL無(wú)水乙醚,800-1200 rpm磁力攪拌至均勻分散乳液,隨后加入0.6-1.0 mL氨水,繼續(xù)攪拌2_6 h后逐滴加入2.0-3.0 mL TEOS,常溫下繼續(xù)攪拌12-24 h。之后過(guò)濾得到白色固體，蒸餾水充分洗滌后，于40-80° C烘箱內(nèi)充分干燥，最后，在500-700° C馬弗爐內(nèi)煅燒6_18 h除去有機(jī)組分，過(guò)80-120目篩，得白色產(chǎn)物即為介孔二氧化硅納米球(SW)。
[0018]2)羧基化球形介孔碳的制備:
本發(fā)明選用糠醇作為碳源試劑，具體制備方法如下所述:
首先利用比表面積分析測(cè)試球形介孔硅的比表面積和孔容，然后根據(jù)球形介孔硅的孔容乘以取得的球形介孔硅的質(zhì)量，得出一定質(zhì)量的球形介孔硅的總孔容，采用初濕浸潤(rùn)法添加其總孔容1.0-1.2倍體積的糠醇的草酸溶液(ImL糠醇中加入IOmg草酸)。經(jīng)過(guò)60-80°C的程序聚合后，在700-1200°C，氮?dú)鈿夥障绿蓟?，制得碳硅?fù)合物，用10-20%氫氟酸除去硅模板，得均一化介孔碳球，再通過(guò)濕法氧化得羧基化的球形介孔碳。具體過(guò)程是將300-700mg均一化介孔碳球放入20-50mL的0.5-1M過(guò)硫酸銨的硫酸(1-2M)溶液中，50-70°C回流反應(yīng)4-8小時(shí)，回流反應(yīng)結(jié)束后利用大量的去離子水和無(wú)水乙醇沖洗，即得羧基化球形介孔碳。Z eta電位結(jié)果顯示羧基化的介孔碳球帶有較強(qiáng)的負(fù)電性。 [0019]3)葉酸-聚乙烯亞胺修飾的介孔碳納米粒的制備:
葉酸-聚乙烯亞胺復(fù)合物的制備:
具體的制備步驟如下:
葉酸溶解在二甲基亞砜(DMSO)中，分別加入葉酸摩爾量1.0-1.5倍的N，N’ - 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)在室溫下攪拌過(guò)夜，進(jìn)行羧基活化，然后過(guò)濾，除去不溶的副產(chǎn)物二環(huán)己基脲，加入聚合物聚乙烯亞胺進(jìn)行酰胺化反應(yīng)。
[0020]將葉酸-聚乙烯亞胺和羧基化碳納米粒按質(zhì)量比為(0.5-2):1的比例接枝在碳納米粒的表面。
[0021]具體的制備步驟如下:
將0.2mg的羧基化介孔碳球加入10-40mL的0.1%的葉酸-聚乙烯亞胺的復(fù)合物水溶液中進(jìn)行超聲5-15min，攪拌2-4h，然后經(jīng)過(guò)離心、洗滌、干燥制得葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒。
[0022]本發(fā)明制備了葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒,粒徑分布為380_450nm,Zeta電位為+20-28mV在pH=7.2條件下。
[0023]本發(fā)明選用葉酸作為靶向分子，賦予納米粒主動(dòng)靶向的功能，增加納米粒的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)幾率，提高藥物的生物利用度。所述的藥物可以為:阿霉素，喜樹(shù)堿，紫杉醇等
以紫杉醇為例:
可以將紫杉醇裝載入步驟2)制備的羧基化球形介孔碳，然后再按照步驟3)制備含藥的葉酸-聚乙烯亞胺修飾的介孔碳納米粒。
[0024]紫杉醇裝載入羧基化球形介孔碳的制備:稱(chēng)取10-30 mg紫杉醇溶于10-20 mL的二氯甲燒中，稱(chēng)取10-30 mg羧基化介孔碳載體加入到紫杉醇的二氯甲烷溶液中；超聲分散5-10 min后，置于電磁恒溫?cái)嚢鑳x，攪拌子轉(zhuǎn)速為 100-300 rpm，恒溫 20°C攪拌 12_24h后，將混懸液于 12000-15000 rpm 離心 10_20min，沉淀納米粒子。棄去上層有機(jī)層，將沉淀納米粒子減壓干燥10-20 h后除去有機(jī)溶劑，既得載藥納米粒。
[0025]本發(fā)明制備的由葉酸受體介導(dǎo)的葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒在模擬小腸上皮細(xì)胞的Caco-2細(xì)胞的攝取實(shí)驗(yàn)中，修飾葉酸后被攝取量明顯增加。
[0026]共聚焦顯微鏡成像表明，本發(fā)明制備的由葉酸受體介導(dǎo)的葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米?？奢^大量的進(jìn)入表面表達(dá)有葉酸受體的Caco-2細(xì)胞,該結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果相符。
【專(zhuān)利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0027]圖1.實(shí)施例6制備的均一化介孔碳球的掃描電鏡結(jié)果(A)和透射電鏡結(jié)果(B)。
[0028]圖2.實(shí)施例6制備的球形介孔碳及羧基化球形介孔碳，實(shí)施例12制備的葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒的氮吸附吸附等溫線
?為均一化介孔碳球(UMCS)，.為羧基化的均一化介孔碳球(C00H-UMCS)，秦為葉酸-聚乙烯亞胺復(fù)合物修飾的均一化介孔碳球(FA-PE1-UMCS)。
[0029]圖3.實(shí)施例6制備的球形介孔碳及羧基化球形介孔碳，實(shí)施例12制備的葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒的氮吸附孔徑分布
?為均一化介孔碳球(UMCS)，f為羧基化的均一化介孔碳球(C00H-UMCS)，-去.為葉酸-聚乙烯亞胺復(fù)合物修飾的均一化介孔碳球(FA-PE1-UMCS))。
[0030]圖4.羧基化介孔碳及葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒的Zeta電位隨著pH變化的測(cè)試結(jié)果。
[0031]圖5.球形介孔碳(a)，羧基化球形介孔碳(b)與葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒(C)的紅外圖譜
結(jié)果表明球形介孔碳經(jīng)羧基化修飾后在1725CHT1出現(xiàn)羰基特征峰，經(jīng)葉酸-聚乙烯亞胺復(fù)合物修飾后，在leOO-HOOcnT1出現(xiàn)了明顯的酰胺鍵伸縮振動(dòng)峰。
[0032]圖6.紫杉醇原料藥(a)與羧基化球形介孔碳制劑組(b)，紫杉醇與羧基化球形介孔碳物理混合物(c)及空白載體(d)的X射線衍射圖譜
結(jié)果表明，與原料藥相比，載藥后制劑中藥物的全部以無(wú)定形的形式存在。
[0033]圖7.紫杉醇原料藥(a)與羧基化球形介孔碳制劑組(b)，紫杉醇與羧基化球形介孔碳物理混合物(C)及空白載體(d)的差示掃描量熱分析圖譜
結(jié)果表明，與原料藥相比，載藥后制劑中藥物的全部以無(wú)定形的形式存在。
[0034]圖8.紫杉醇的不同制劑在pH7.4的磷酸鹽緩沖液中的釋放曲線。(a)市售紫杉醇制劑Taxof，(b)紫杉醇裝載于羧基化介孔碳制劑，(C)紫杉醇裝載于葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒制劑，葉酸-聚乙烯亞胺復(fù)合物和介孔碳納米粒的質(zhì)量比為0.5:1, (d)紫杉醇裝載于葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒制劑，葉酸-聚乙烯亞胺復(fù)合物和介孔碳納米粒的質(zhì)量比為1:1，(e)紫杉醇裝載于葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒制劑，葉酸-聚乙烯亞胺復(fù)合物和介孔碳納米粒的質(zhì)量比為2:1，(f)紫杉醇原料藥。[0035]圖9.FA-PE1-FITC-UMCS和PEI_FITC_UMCS納米粒被Caco-2細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)的共聚焦成像結(jié)果。
[0036]圖10.不同的紫杉醇制劑的表觀滲透系數(shù)(Papp)，N=3，數(shù)據(jù)為平均值土標(biāo)準(zhǔn)差，*P〈0.05是與Taxol?比較，# Ρ〈0.05是與Taxol?和維拉帕米混合物及PTX-PE1-UMCS比)。
[0037]
【具體實(shí)施方式】
[0038]實(shí)施例1
精確稱(chēng)取0.5 g CTAB于200 mL的燒杯中，分別加入50 mL去離子水和10 mL無(wú)水乙醇，500 rpm磁力攪拌至透明狀態(tài),之后在上述混合溶液中加入20 mL無(wú)水乙醚,800 rpm磁力攪拌至均勻分散乳液，隨后加入0.6 mL氨水，繼續(xù)攪拌2 h后逐滴加入2.0 mL TEOS,常溫下繼續(xù)攪拌12h。之后過(guò)濾得到白色固體，蒸餾水充分洗滌后，于40° C烘箱內(nèi)下充分干燥，最后，在500° C馬沸爐內(nèi)煅燒6 h除去有機(jī)組分，過(guò)80目篩，得白色產(chǎn)物即為介孔二氧化硅納米球(SNM)。
[0039]實(shí)施例2
精確稱(chēng)取0.6 g CTAB于200 mL的燒杯中，分別加入60 mL去離子水和20 mL無(wú)水乙醇，600 rpm磁力攪拌至透明狀態(tài),之后在上述混合溶液中加入20 mL無(wú)水乙醚,900 rpm磁力攪拌至均勻分散乳液，隨后加入0.8 mL氨水，繼續(xù)攪拌4 h后逐滴加入2.5 mL TEOS,常溫下繼續(xù)攪拌18 h。之后過(guò)濾得到白色固體，蒸餾水充分洗滌后，于60° C烘箱內(nèi)下充分干燥，最后，在600° C馬沸爐內(nèi)煅燒12 h除去有機(jī)組分，過(guò)100目篩，得白色產(chǎn)物即為介孔二氧化硅納米球(SW)。
[0040]實(shí)施例3
精確稱(chēng)取0.7 g CTAB于200 mL的燒杯中，分別加入80 mL去離子水和20 mL無(wú)水乙醇，800 rpm磁力攪拌至透明狀態(tài),之后在上述混合溶液中加入20 mL無(wú)水乙醚,900 rpm磁力攪拌至均勻分散乳液，隨后加入0.8 mL氨水，繼續(xù)攪拌4 h后逐滴加入2.5 mL TEOS,常溫下繼續(xù)攪拌18 h。之后過(guò)濾得到白色固體，蒸餾水充分洗滌后，于60° C烘箱內(nèi)下充分干燥，最后，在600° C馬沸爐內(nèi)煅燒12 h除去有機(jī)組分，過(guò)100目篩，得白色產(chǎn)物即為介孔二氧化硅納米球(SW)。
[0041]實(shí)施例4
精確稱(chēng)取0.8 gCTAB于200 mL的燒杯中，分別加入100 mL去離子水和30 mL無(wú)水乙醇，1000 rpm磁力攪拌至透明狀態(tài),之后在上述混合溶液中加入30 mL無(wú)水乙醚，1200 rpm磁力攪拌至均勻分散乳液，隨后加入1.0 mL氨水,繼續(xù)攪拌6 h后逐滴加入3.0 mL TEOS,常溫下繼續(xù)攪拌24 h。之后過(guò)濾得到白色固體，蒸餾水充分洗滌后，于80° C烘箱內(nèi)下充分干燥，最后，在700° C馬沸爐內(nèi)煅燒18 h除去有機(jī)組分，過(guò)120目篩，得白色產(chǎn)物即為介孔二氧化硅納米球(SW)。
[0042]實(shí)施例5
稱(chēng)取實(shí)例I中合成的球形介孔硅74.5mg，利用比表面積分析儀測(cè)試，球形介孔硅的比表面積為1333.01m2/g和孔容為0.967cm3/g,0.967的1.0倍等于0.967。稱(chēng)取球形介孔硅Ig,量取糠醇0.97mL,稱(chēng)取草酸9.7mg,加到糠醇中溶解，混合均勻，采用初濕浸潤(rùn)法將1.0倍量的糠醇、草酸溶液添加到球形介孔硅的孔道中。將混合物放入在馬弗爐中，空氣氣氛下經(jīng)過(guò)60°C，15h和80°C，15h的程序聚合后，在700°C，氮?dú)鈿夥障绿蓟?h，制得碳硅復(fù)合物，用40mL的10%氫氟酸除去硅模板，得均一化介孔碳球。掃描電鏡結(jié)果顯示納米粒呈均勻的單分散球形，投射電鏡結(jié)果顯示介孔碳球具有均勻的裂縫狀孔道。配制0.5M的過(guò)硫酸銨的硫酸(IM)溶液20mL,稱(chēng)取均一化介孔碳球300mg,將碳球加入過(guò)硫酸銨溶液中，在50°C下回流反應(yīng)4h，過(guò)濾，用大量的去離子水沖洗，最后用乙醇淋洗，干燥，即得羧基化介孔碳球。Zeta電位結(jié)果顯示羧基化的介孔碳球帶有較強(qiáng)的負(fù)電性。
[0043]實(shí)施例6
稱(chēng)取實(shí)例I中合成的球形介孔硅74.5mg，利用比表面積分析儀測(cè)試，球形介孔硅的比表面積為1333.01m2/g和孔容為0.967cm3/g，0.967的1.1倍等于1.0637。稱(chēng)取球形介孔硅lg，量取糠醇1.06mL，稱(chēng)取草酸10.6mg，加到糠醇中溶解，混合均勻，采用初濕浸潤(rùn)法將1.1倍量的糠醇、草酸溶液添加到球形介孔硅的孔道中。將混合物放入在馬弗爐中，空氣氣氛下經(jīng)過(guò)60°C，15h和80°C，15h的程序聚合后，在900°C，氮?dú)鈿夥障绿蓟?h，制得碳硅復(fù)合物，用40mL的15%氫氟酸除去硅模板，得均一化介孔碳球。掃描電鏡結(jié)果顯示納米粒呈均勻的單分散球形，投射電鏡結(jié)果顯示介孔碳球具有均勻的裂縫狀孔道。配制IM的過(guò)硫酸銨的硫酸(2M)溶液20mL，稱(chēng)取均一化介孔碳球500mg，將碳球加入過(guò)硫酸銨溶液中，在60°C下回流反應(yīng)6h，過(guò)濾，用大量的去離子水沖洗，最后用乙醇淋洗，干燥，即得羧基化介孔碳球。Zeta電位結(jié)果顯示羧基化的介孔碳球帶有較強(qiáng)的負(fù)電性。其均一化介質(zhì)碳球的掃描電鏡結(jié)果和透射電鏡結(jié)果見(jiàn)圖1。
[0044]實(shí)施例7
稱(chēng)取實(shí)例I中合成的球形介孔硅74.5mg，利用比表面積分析儀測(cè)試，球形介孔硅的比表面積為1333.01m2/g和孔容為0.967cm3/g,0.967的1.2倍等于1.1604。稱(chēng)取球形介孔硅lg，量取糠醇1.16mL，稱(chēng)取草酸11.6mg，加到糠醇中溶解，混合均勻，采用初濕浸潤(rùn)法將
1.2倍量的糠醇、草酸溶液添加到球形介孔硅的孔道中。將混合物放入在馬弗爐中，空氣氣氛下經(jīng)過(guò)60°C，15h和80°C，15h的程序聚合后，在1200°C，氮?dú)鈿夥障绿蓟?h，制得碳硅復(fù)合物，用40mL的20%氫氟酸除去硅模板，得均一化介孔碳球。掃描電鏡結(jié)果顯示納米粒呈均勻的單分散球形，投射電鏡結(jié)果顯示介孔碳球具有均勻的裂縫狀孔道。配制IM的過(guò)硫酸銨的硫酸(2M)溶液20mL，稱(chēng)取均一化介孔碳球700mg，將碳球加入過(guò)硫酸銨溶液中，在70°C下回流反應(yīng)8h，過(guò)濾，用大量的去離子水沖洗，最后用乙醇淋洗，干燥，即得羧基化介孔碳球。Zeta電位結(jié)果顯示羧基化的介孔碳球帶有較強(qiáng)的負(fù)電性。
[0045]實(shí)施例8
13mg葉酸溶解在二甲基亞砜(DMSO)中，分別加入葉酸摩爾量1.0倍的N，N’ - 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)在室溫下攪拌過(guò)夜，進(jìn)行羧基活化，然后過(guò)濾，除去不溶的副產(chǎn)物二環(huán)己基脲，加入45mg聚合物聚乙烯亞胺，室溫?cái)嚢?2h，進(jìn)行酰胺化反應(yīng)，然后利用S^hadex G-100柱進(jìn)行純化，即得葉酸-聚乙烯亞胺復(fù)合物。
[0046]實(shí)施例9
13mg葉酸溶解在二甲基亞砜(DMSO)中，分別加入葉酸摩爾量1.1倍的N，N’ - 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)在室溫下攪拌過(guò)夜，進(jìn)行羧基活化，然后過(guò)濾，除去不溶的副產(chǎn)物二環(huán)己基脲，加入45mg聚合物聚乙烯亞胺，室溫?cái)嚢?2h，進(jìn)行酰胺化反應(yīng)，然后利用S^hadex G-1OO柱進(jìn)行純化，即得葉酸-聚乙烯亞胺復(fù)合物。
[0047]實(shí)施例10
13mg葉酸溶解在二甲基亞砜(DMSO)中，分別加入葉酸摩爾量1.5倍的N，N’ - 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)在室溫下攪拌過(guò)夜，進(jìn)行羧基活化，然后過(guò)濾，除去不溶的副產(chǎn)物二環(huán)己基脲，加入45mg聚合物聚乙烯亞胺，室溫?cái)嚢?2h，進(jìn)行酰胺化反應(yīng)，然后利用S^hadex G-100柱進(jìn)行純化，即得葉酸-聚乙烯亞胺復(fù)合物。
[0048]實(shí)施例11
配制葉酸-聚乙烯亞胺復(fù)合物的0.1%的去離子水溶液10mL，稱(chēng)取羧基化介孔碳球20mg加入上述溶液中，超聲混合物5min，然后攪拌0.5h,離心，用大量的去離子水洗，再離心，干燥，得葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒。
[0049]實(shí)施例12
配制葉酸-聚乙烯亞胺復(fù)合物的0.1%的去離子水溶液20mL，稱(chēng)取羧基化介孔碳球20mg加入上述溶液中，超聲混合物lOmin，然后攪拌0.5h，離心，用大量的去離子水洗，再離心，干燥，得葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒。
[0050]實(shí)施例13
配制葉酸-聚乙烯亞胺 復(fù)合物的0.1%的去離子水溶液40mL，稱(chēng)取羧基化介孔碳球20mg加入上述溶液中，超聲混合物15min，然后攪拌0.5h，離心，用大量的去離子水洗，再離心，干燥，得葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒。
[0051]實(shí)施例14
取球形介孔碳、羧基化球形介孔碳和葉酸-聚乙烯亞胺復(fù)合物修飾的碳納米粒利用比表面積儀分析，結(jié)果如圖2和圖3，比表面積在經(jīng)葉酸-聚乙烯亞胺復(fù)合物修飾后明顯下降而孔徑大小分布不變，說(shuō)明聚乙烯亞胺成功的包覆在羧基化球形介孔碳表面，而不是介孔孔道內(nèi)。分別取羧基化介孔碳球、和葉酸-聚乙烯亞胺修飾的羧基化介孔碳球lmg，分散在10_3mOl/L的氯化鈉溶液中，利用納米粒度及動(dòng)電電位測(cè)定儀馬爾文Nano ZS90測(cè)定其在不同PH條件下的動(dòng)電電位，結(jié)果如圖2。在羧基化介孔碳球表面修飾上葉酸-聚乙烯亞胺復(fù)合物后，電位有負(fù)逆轉(zhuǎn)為正，說(shuō)明葉酸-聚乙烯亞胺復(fù)合物成功地接枝在羧基化介孔碳球表面。球形介孔碳，羧基化球形介孔碳與葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒的紅外圖譜(圖5)結(jié)果表明球形介孔碳經(jīng)羧基化修飾后在1725CHT1出現(xiàn)羰基特征峰，經(jīng)葉酸-聚乙烯亞胺復(fù)合物修飾后，在leOO-HOOcnT1出現(xiàn)了明顯的酰胺鍵伸縮振動(dòng)峰，說(shuō)明葉酸-聚乙烯亞胺復(fù)合物成功地接枝在羧基化介孔碳球表面。
[0052]實(shí)施例15—采用溶劑揮發(fā)法載藥
取實(shí)施例6制備得到的羧基化球形介孔碳30mg。精密稱(chēng)取約IOmg紫杉醇、溶解于IOml 二氯甲烷中，得到藥物的二氯甲烷溶液。將30mg羧基化球形介孔碳加入到IOml藥物二氯甲烷溶液，使藥物:載體比例分別為1:3攪拌混合平衡12h，加熱至40°C揮發(fā)除去有機(jī)溶劑，真空干燥，得到載藥的羧基化球形介孔碳給藥系統(tǒng)。
[0053]實(shí)施例16—藥物在載體中存在狀態(tài)的表征
取實(shí)施例15中藥物與載體比例為1:3的載藥樣品，原料藥，物理混合物，空白載體做粉末X射線衍射，考察載體裝載藥物后，藥物結(jié)晶度的變化，詳細(xì)數(shù)據(jù)見(jiàn)附圖6。
[0054]取實(shí)施例15中藥物與載體比例為1:3的載藥樣品，原料藥，物理混合物，空白載體做差示掃描量熱分析，考察載體裝載藥物后，藥物結(jié)晶度的變化，詳細(xì)數(shù)據(jù)見(jiàn)附圖7。
[0055]實(shí)施例17—葉酸-聚乙烯亞胺修飾載藥后羧基化介孔碳納米粒
取實(shí)施例15中藥物與載體比例為1:3的載藥樣品，再按照實(shí)施例11、12、13將葉酸-聚乙烯亞胺復(fù)合物和羧基化球形介孔碳質(zhì)量比為0.5:1、1: 1、2:1的量修飾在載藥后羧基化球形介孔碳表面。
[0056]實(shí)施例18—葉酸受體介導(dǎo)的葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒裝載紫杉醇的體外釋放結(jié)果
取實(shí)施例17的葉酸-聚乙烯亞胺復(fù)合物和羧基化球形介孔碳質(zhì)量比為1:1的葉酸-聚乙烯亞胺修飾的PTX-介孔碳載藥顆粒適量，精密稱(chēng)取一定量(約相當(dāng)于PTX 0.5 mg )，以含有0.1%的tWeen80的200 mL pH7.4的磷酸鹽緩沖液作為溶出介質(zhì)，在溫度37±0.5 V,攪拌速率100±1 rpm，分別于預(yù)先設(shè)定的0.5、l、2、4、6、8、12、24h取樣200 μL，并同時(shí)補(bǔ)充等量等溫的溶出介質(zhì)；所取樣品經(jīng)13000 rpm離心后，吸取上清液，通過(guò)高效液相法，色譜柱為250mm的Kromasil C18柱，流動(dòng)相為乙腈:水=65:35，于227 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值；按外標(biāo)一點(diǎn)法進(jìn)行紫杉醇的釋放度測(cè)定。釋放結(jié)果如圖8所示。
[0057]紫杉醇原料藥在2 4h內(nèi)釋放緩慢，達(dá)不到有效的治療濃度，紫杉醇的市售制劑Taxol?在有機(jī)溶劑聚氧乙烯蓖麻油和乙醇的幫助下釋放迅速，但是聚氧乙烯蓖麻油具有較強(qiáng)的毒副作用，且Taxol?在胃腸道被P-gp的外排作用明顯。將紫杉醇包封在羧基化球形介孔碳中，由于藥物以無(wú)定型狀態(tài)存在，釋放速率明顯提高。將紫杉醇包封在葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒中，藥物具有一定的緩釋效果，且隨著葉酸-聚乙烯亞胺復(fù)合物和羧基化介孔碳納米粒質(zhì)量的增加，紫杉醇釋放速率逐漸降低，緩釋給藥系統(tǒng)減少了給藥次數(shù)，且納米粒在生理?xiàng)l件下，具有較強(qiáng)的正電性，與腸道的負(fù)電性表面產(chǎn)生較強(qiáng)的粘附作用，增加了給藥時(shí)間，促進(jìn)了藥效。
[0058]實(shí)施例19一葉酸受體介導(dǎo)的促進(jìn)FA-PE1-UMCS納米粒被Caco-2細(xì)胞的攝取增加 將密度為5 X IO5的Caco-2細(xì)胞接種在12孔板上12h，然后移除培養(yǎng)液，用pH 7.2的
PBS洗三遍，將濃度為10 Pg/mL的FA-PE1-FITC-UMCS和PE1-FITC-UMCS納米粒分別加入孔板中，在37° C下培養(yǎng)2 h。然后用4° C緩沖液PBS洗3遍，用4%多聚甲醛固定10 min，羅丹明-鬼筆環(huán)肽將細(xì)胞膜著色，Hochst 33342將細(xì)胞核著色，送測(cè)共聚焦顯微鏡，結(jié)果見(jiàn)圖9。
[0059]圖9，I為藍(lán)色通道成像，可見(jiàn)被Hoechst 33342染成藍(lán)色的細(xì)胞核，2為異硫氰酸熒光素(FITC)綠色通道成像，可見(jiàn)葉酸修飾的碳納米粒組細(xì)胞膜內(nèi)有大量的綠色熒光，而未被葉酸修飾的PE1-FITC-UMCS組顯示進(jìn)入Caco-2細(xì)胞中的綠色微弱，即葉酸對(duì)納米粒的攝取促進(jìn)作用顯著；3是肌動(dòng)蛋白為被羅丹明-鬼筆環(huán)肽著色的紅色通道成像；圖9，4為藍(lán)色通道+綠色通道+紅色通道成像。共聚焦顯微鏡成像表明，本發(fā)明制備的由葉酸受體介導(dǎo)的葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米?？奢^大量的被胃腸道細(xì)胞Caco-2吸收，提高裝載藥物的生物利用度。
[0060]實(shí)施例20—葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒促進(jìn)紫杉醇的Caco-2細(xì)胞單層膜跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)
將密度為5 X IO5的Caco-2細(xì)胞接種在12孔板的聚碳酸酯插槽中，在孵箱中培養(yǎng)21天，前7天兩天換一次培養(yǎng)液，后14天每天換液，待測(cè)得的電阻值達(dá)到500 Ω/cm2，說(shuō)明上皮細(xì)胞已形成，可以進(jìn)行小腸上皮細(xì)胞的模擬，對(duì)紫杉醇的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行考察。用PH 7.2的PBS對(duì)12孔板的上槽和下槽進(jìn)行沖洗，然后將1500 μL的PBS加到孔板的下槽，在上槽中分別加入500 μL的紫杉醇濃度為10 μΜ的Taxol?，Taxol?和100 mM的維拉帕米的混合物，PTX-PE1-UMCS,PTX-FA-PE1-UMCS 等不同制劑。在 0.5h, lh，2h，4h 從下槽中取樣 100 μL,同時(shí)補(bǔ)加100 PL緩沖液PBS，將取出樣品采用高效液相法進(jìn)行檢測(cè)。
[0061]圖10為不同紫杉醇制劑的表觀滲透系數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，電阻值沒(méi)有發(fā)生劇烈變化，說(shuō)明制劑沒(méi)有打開(kāi)Caco-2細(xì)胞單層膜的緊密連接，保持了其完整性，在下槽中測(cè)得的紫杉醇都是經(jīng)過(guò)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)得到。雖然表面活性劑聚氧乙烯蓖麻油對(duì)P-糖蛋白外排泵有一定的抑制作用，，Taxol?仍然表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)偷谋碛^滲透系數(shù)(Papp)。與維拉帕米(P-gp的抑制劑)聯(lián)合給藥后，紫杉醇的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)得到了明顯的提高。PTX-PE1-UMCS納米粒制劑的PTX跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)量是Taxol?的3.2倍，由于納米顆粒表面的正電性更易于粘附在腸道粘膜(負(fù)電性)上，因此增加納米顆粒的胞吞的幾率。同時(shí)，納米粒保護(hù)裝載的紫杉醇分子繞過(guò)P-gp的外排。由于葉酸受體在腸道中的豐富表達(dá)，促進(jìn)了 PTX-FA-PE1-UMCS納米顆粒攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)，藥物包封在葉酸修飾的納米粒中具有最好的滲透性，增加了 PTX的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)達(dá)5.7倍和Taxol?相比。
【權(quán)利要求】
1.一種具有祀向定位釋藥的介孔碳納米粒系統(tǒng)，其特征在于，所述的納米粒由荷正電的葉酸-聚乙烯亞胺復(fù)合物與荷負(fù)電的羧基化碳納米粒經(jīng)靜電復(fù)合作用自組裝而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米粒系統(tǒng)，其特征在于，所述的靜電復(fù)合作用為:將葉酸-聚乙烯亞胺復(fù)合物和羧基化碳納米粒分別分散在去離子水中，混合后，經(jīng)過(guò)超聲5-15min,制得納米粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2任何一項(xiàng)所述的納米粒系統(tǒng)，其特征在于，所述的聚乙烯亞胺重均分子量為20 kD-30KD。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的納米粒系統(tǒng)，其特征在于，所述的葉酸-聚乙烯亞胺復(fù)合物是將3-6個(gè)葉酸分子接枝在一個(gè)聚乙烯亞胺分子上。
5.制備權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)所述的納米粒系統(tǒng)的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)球形介孔娃的制備: (2)羧基化球形介孔碳的制備； (3)葉酸-聚乙烯亞胺修飾的介孔碳納米粒的制備。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的納米粒系統(tǒng)，其特征在于，步驟(1)利用十六烷基三甲基溴化銨形成膠束作為致孔 劑，正硅酸乙酯作為硅源，室溫下水解制得； 步驟(2)的制備方法包括如下步驟:將300-700mg均一化介孔碳球放入20_50mL的0.5-1M過(guò)硫酸銨的硫酸(1-2M)溶液中，50-70°C回流反應(yīng)4_8小時(shí)。
7.權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)所述的納米粒系統(tǒng)在促進(jìn)藥物吸收中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物優(yōu)選阿霉素，喜樹(shù)堿或紫杉醇。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，將藥物裝入權(quán)利要求5所述的步驟2)中的羧基化球形介孔碳中，然后按照步驟3)的方法制備含藥的葉酸-聚乙烯亞胺修飾的介孔碳納米粒。
10.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，取權(quán)利要求5所述的羧基化球形介孔碳，藥物、溶解于二氯甲烷中，得到藥物的二氯甲烷溶液，將羧基化球形介孔碳加入到藥物二氯甲烷溶液，使藥物:羧基化球形介孔碳比例分別為1:3攪拌混合平衡，加熱揮發(fā)除去有機(jī)溶劑，真空干燥，得到載藥的羧基化球形介孔碳給藥系統(tǒng)。
【文檔編號(hào)】A61K47/04GK103990133SQ201410191719
【公開(kāi)日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月7日
【發(fā)明者】王思玲, 姜同英, 萬(wàn)龍 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)藥科大學(xué)