蟾飼五谷蟲(chóng)抗菌肽的醫(yī)藥用途
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及蟾飼五谷蟲(chóng)抗菌肽的新用途，具體涉及蟾飼五谷蟲(chóng)抗菌肽在制備抑菌劑中的應(yīng)用。蟾飼五谷蟲(chóng)抗菌肽對(duì)銅綠假單胞菌，甲型傷寒沙門(mén)桿菌，和腸炎沙門(mén)桿菌，志賀桿菌具有抑制作用，尤其針對(duì)銅綠假單胞菌，甲型傷寒沙門(mén)桿菌，和腸炎沙門(mén)桿菌具有明顯的抑制作用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】蟾飼五谷蟲(chóng)抗菌肽的醫(yī)藥用途
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】:
本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及蟾飼五谷蟲(chóng)抗菌肽的新用途，具體涉及蟾飼五谷蟲(chóng)抗菌肽在制備抑菌劑中的應(yīng)用。
[0002]【背景技術(shù)】:
蟾飼五谷蟲(chóng)是以蟾蜍科屬中華大蟾蜍(Bufobufogargarizans Cantor)或黑眶蟾蛛(B.melanostictus Schneider)等尸體為培養(yǎng)基質(zhì),人工培養(yǎng)的麗蠅科昆蟲(chóng)大頭金蠅或其近緣昆蟲(chóng)的干燥幼蟲(chóng)。主產(chǎn)于華中、華東地區(qū)，我國(guó)各地區(qū)均有分布，一年四季均可采收。蟾飼五谷蟲(chóng)含蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為62.70%、脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11.20%、幾丁聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%，氨基酸18種，含抗菌肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.264%。另外還含有華蟾蜍毒基和羥基華蟾蜍毒基等成分。
[0003]抗菌肽(antibacterial peptides)廣義上是指存在于生物體內(nèi)具有抵抗外界微生物侵害、消除體內(nèi)突變細(xì)胞的一類(lèi)小分子多肽(Prates MV, Sforca ML, Regis ffc,The NWR-derived solution structure of a new cationic antimicrobial peptidesfrom the skin secretion of the anuran Hyla Punctana [J].J Biol Chem.2004,279(13):13018-13026.)
?？咕膹V泛存在于動(dòng)物的免疫細(xì)胞(如吞噬細(xì)胞)、各種臟器的粘膜、皮膚以及植物的花、果、葉中?？咕囊脖怀蔀樯锏牡诙烙w系，家蠅抗菌肽的產(chǎn)生是由于外界環(huán)境的干擾，或者經(jīng)過(guò)免疫誘導(dǎo)等方式，讓家蠅體內(nèi)產(chǎn)生一種免疫小分子即抗菌肽，但是免疫方式操作繁瑣，工作量 大。
[0004]不同的抗菌肽抑菌種類(lèi)和抑菌效果往往不盡相同，因此可以采用不同的受試菌研究蟾飼五谷蟲(chóng)抗菌肽的抑菌結(jié)果，選擇抑菌活性較強(qiáng)的受試菌，從而使其更有效地得以利用。
[0005]
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題是提供蟾飼五谷蟲(chóng)抗菌肽的新用途，具體涉及其在制備抑菌劑中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
蟾飼五谷蟲(chóng)抗菌肽對(duì)銅綠假單胞菌，甲型傷寒沙門(mén)桿菌，和腸炎沙門(mén)桿菌，志賀桿菌具有抑制作用，尤其針對(duì)銅綠假單胞菌，甲型傷寒沙門(mén)桿菌，和腸炎沙門(mén)桿菌具有明顯的抑制作用。
[0008]其中，蟾飼五谷蟲(chóng)抗菌肽通過(guò)如下方法獲得:
(I)提取
蟾飼五谷蟲(chóng)為沸水處理過(guò)的干燥蟲(chóng)體，稱(chēng)取50g兩份，一份用磷酸鹽緩沖溶液溶劑(0.05mol/L 的 NaH2P04 81.7 ml 與 0.05mol/L Na2HP04 12.3ml，調(diào) PH 為 6)處理，另一份用0.05mol/L乙酸銨溶劑(用乙酸調(diào)節(jié)PH為5)處理。樣品干燥蟲(chóng)體和溶劑比為1:2，用勻漿機(jī)攪拌半個(gè)小時(shí)，放置一個(gè)晚上，樣品液分別記號(hào)為I號(hào)和2號(hào)。放置過(guò)夜的樣品，將I號(hào)液采用低速離心機(jī)以5000r/min的速度離心15min，得上清液，除去大顆粒雜質(zhì)，將上清液繼續(xù)用0.22um的濾膜減壓過(guò)濾,得到的濾液用高速離心機(jī)15000r/min的速度離心30min,除去細(xì)胞器雜質(zhì)等物質(zhì)，濾液繼續(xù)用0.22um的濾膜過(guò)濾的濾液，得到的I號(hào)澄清濾液。2號(hào)樣品液仍然采用相同的處理方法。即得到2號(hào)澄清樣品液。
[0009](2)樣品的除脂
以2號(hào)液磷酸鹽緩沖溶液所提樣品進(jìn)行除脂處理，首先用相同體積的正己烷萃取12h，，然后得到的水層采用相同體積的乙酸乙酯液離心。離心后得到的水層采用4攝氏度冰箱保存。
[0010](3)樣品的濃縮
鹽析，是在蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽，破壞蛋白質(zhì)的水化膜，而達(dá)到使蛋白質(zhì)沉淀的作用，常用的中性鹽有氯化鈉，硫酸銨，由于硫酸銨在水溶液中溶解度大，且比較容易除去，所以我們采用硫酸銨鹽析的方式。
[0011]實(shí)驗(yàn)中我們以80%的硫酸銨沉淀，慢慢的加入硫酸銨，防止局部過(guò)濃，引起蛋白質(zhì)變性，I號(hào)和2號(hào)液均采取這樣的方式處理，鹽析半個(gè)小時(shí)。
[0012](4)樣品的再溶解 鹽析過(guò)的I號(hào)和2號(hào)蛋白液,利用高速離心機(jī),15000r/min離心15min,除去上清液,I號(hào)采用磷酸鹽緩沖溶液溶解，2號(hào)采用乙酸銨緩沖溶液溶解,溶解液備用。
[0013](5)樣品溶液除菌
在無(wú)菌操作臺(tái)下，用可以滅菌的0.22um的濾膜，用無(wú)菌的注射器，吸取I號(hào)和2號(hào)溶液，過(guò)濾膜，得到樣品無(wú)菌液。
[0014]蟾飼五谷蟲(chóng)抗菌肽對(duì)銅綠假單胞菌，甲型傷寒沙門(mén)桿菌，和腸炎沙門(mén)桿菌，志賀桿菌具有抑制作用，尤其針對(duì)銅綠假單胞菌，甲型傷寒沙門(mén)桿菌，和腸炎沙門(mén)桿菌具有明顯的抑制作用。
[0015]試驗(yàn)結(jié)果表明，蟾飼五谷蟲(chóng)抗菌肽可以用于制備抑菌劑。
[0016]
【專(zhuān)利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1為甲型沙門(mén)傷寒桿菌抑菌結(jié)果；
圖2為志賀桿囷的抑囷結(jié)果；
圖3為甲型沙門(mén)桿菌的抑菌結(jié)果；
圖4為對(duì)照組抑菌結(jié)果；
圖5為腸炎沙門(mén)桿菌的抑菌結(jié)果；
圖6為金黃色葡萄球菌的抑菌結(jié)果；
圖7為大腸桿菌的抑菌結(jié)果；
圖8為枯草桿菌的抑菌結(jié)果；
圖9為蘇云金芽孢桿菌的抑菌結(jié)果；
圖10為蘇云金芽孢桿菌亞型的抑菌結(jié)果；
圖11為陰溝腸桿菌抑菌結(jié)果。[0018]
【具體實(shí)施方式】
[0019]實(shí)施例1:
蟾飼五谷蟲(chóng)抗菌肽的制備:
(I)提取
蟾飼五谷蟲(chóng)為沸水處理過(guò)的干燥蟲(chóng)體，稱(chēng)取50g兩份，一份用磷酸鹽緩沖溶液溶劑(0.05mol/L 的 NaH2P04 81.7 ml 與 0.05mol/L Na2HP04 12.3ml，調(diào) PH 為 6)處理，另一份用0.05mol/L乙酸銨溶劑(用乙酸調(diào)節(jié)PH為5)處理。樣品干燥蟲(chóng)體和溶劑比為1:2，用勻衆(zhòng)機(jī)攪拌半個(gè)小時(shí)，放置一個(gè)晚上，樣品液分別記號(hào)為I號(hào)和2號(hào)。
[0020]放置過(guò)夜的樣品，將I號(hào)液采用低速離心機(jī)以5000r/min的速度離心15min，得上清液，除去大顆粒雜質(zhì)，將上清液繼續(xù)用0.22um的濾膜減壓過(guò)濾，得到的濾液用高速離心機(jī)15000r/min的速度離心30min,除去細(xì)胞器雜質(zhì)等物質(zhì),濾液繼續(xù)用0.22um的濾膜過(guò)濾的濾液，得到的I號(hào)澄清濾液。2號(hào)樣品液仍然采用相同的處理方法。即得到2號(hào)澄清樣品液。[0021](2)樣品的除脂
以2號(hào)液磷酸鹽緩沖溶液所提樣品進(jìn)行除脂處理，首先用相同體積的正己烷萃取12h，，然后得到的水層采用相同體積的乙酸乙酯液離心。離心后得到的水層采用4攝氏度冰箱保存。
[0022](3)樣品的濃縮
鹽析，是在蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽，破壞蛋白質(zhì)的水化膜，而達(dá)到使蛋白質(zhì)沉淀的作用，常用的中性鹽有氯化鈉，硫酸銨，由于硫酸銨在水溶液中溶解度大，且比較容易除去，所以我們采用硫酸銨鹽析的方式。
[0023]實(shí)驗(yàn)中我們以80%的硫酸銨沉淀，慢慢的加入硫酸銨，防止局部過(guò)濃，引起蛋白質(zhì)變性，I號(hào)和2號(hào)液均采取這樣的方式處理，鹽析半個(gè)小時(shí)。
[0024](4)樣品的再溶解
鹽析過(guò)的I號(hào)和2號(hào)蛋白液,利用高速離心機(jī),15000r/min離心15min,除去上清液,I號(hào)采用磷酸鹽緩沖溶液溶解，2號(hào)采用乙酸銨緩沖溶液溶解,溶解液備用。
[0025](5)樣品溶液除菌
在無(wú)菌操作臺(tái)下，用可以滅菌的0.22um的濾膜，用無(wú)菌的注射器，吸取I號(hào)和2號(hào)溶液，過(guò)濾膜，得到樣品無(wú)菌液。
[0026]實(shí)施例2:
抑菌試驗(yàn):
(1)抑菌試驗(yàn)的前處理
抑菌試驗(yàn)所需的培養(yǎng)皿，移液管，三角爬，接種針，瓊脂片都需要滅菌，我們?cè)O(shè)置滅菌鍋溫度為121.3 C，滅圃30rnin.(2)培養(yǎng)基的配置:
配置固體培養(yǎng)基，牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCL5g,瓊脂15g，水1000ml，用NaOH調(diào)節(jié)PH7.0-7.2，配置完的固體培養(yǎng)基倒入250ml錐形瓶中，密封瓶口，放入滅菌鍋中和其它儀器一起滅菌。滅菌條件同上。
[0027](3)抗菌肽溶液濃度的測(cè)定
采用考馬斯亮蘭法(Bradofrd法)，蛋白標(biāo)液:準(zhǔn)確稱(chēng)取結(jié)晶牛血清白蛋白50mg,用
0.9 %NaCL溶液配成濃度為400ug/mL的溶液。顯色液:稱(chēng)取考斯亮蘭G250400mg，置于玻璃研缽中,加入0.5mL高氯酸研磨約30分鐘后，再加入1.0mL高氯酸，繼續(xù)充分研磨至完全溶解。加入約194mL水4.5mL高氯酸，混勻，用三角漏斗過(guò)濾。以3%的高氯酸溶液將濾液在465nm處的吸光度調(diào)至1.3 — 1.5之間(Icm比色杯)。避光存放顯色液。
[0028]標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:取6支潔凈試管，分別按下表加入試劑，各管混勻后，以蒸餾水作參比，測(cè)定各管在波長(zhǎng)595nm和波長(zhǎng)465nm處吸光度A值。計(jì)Ai=0D595/0D465之值，以Ai’ = Ai — Al為縱坐標(biāo),蛋白濃度為橫坐標(biāo),繪制蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。并計(jì)算Ai’ =Ai 一Al，于標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)蛋白濃度。
[0029]
【權(quán)利要求】
1.蟾飼五谷蟲(chóng)抗菌肽在制備抑菌劑中的應(yīng)用。
2.蟾飼五谷蟲(chóng)抗菌肽在制備抑制銅綠假單胞菌，甲型傷寒沙門(mén)桿菌或腸炎沙門(mén)桿菌制劑中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求1或2任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的蟾飼五谷蟲(chóng)抗菌肽通過(guò)如下方法制備: (1)提取 蟾飼五谷蟲(chóng)為沸水處理過(guò)的干燥蟲(chóng)體，稱(chēng)取50g兩份，一份用磷酸鹽緩沖溶液溶劑(0.05mol/L 的 NaH2P04 81.7 ml 與 0.05mol/L Na2HP04 12.3ml，調(diào) PH 為 6)處理，另一份用0.05mol/L乙酸銨溶劑(用乙酸調(diào)節(jié)PH為5)處理； 樣品干燥蟲(chóng)體和溶劑比為1:2，用勻漿機(jī)攪拌半個(gè)小時(shí)，放置一個(gè)晚上，樣品液分別記號(hào)為I號(hào)和2號(hào)； 放置過(guò)夜的樣品，將I號(hào)液采用低速離心機(jī)以5000r/min的速度離心15min，得上清液，除去大顆粒雜質(zhì)， 將上清液繼續(xù)用0.22um的濾膜減壓過(guò)濾，得到的濾液用高速離心機(jī)15000r/min的速度離心，除去細(xì)胞器雜質(zhì)物質(zhì)，濾液繼續(xù)用0.22um的濾膜過(guò)濾的濾液，得到的I號(hào)澄清濾液，2號(hào)樣品液仍然采用相同的處理方法，即得到2號(hào)澄清樣品液； (2)樣品的除脂 以2號(hào)液磷酸鹽緩沖溶液所提樣品進(jìn)行除脂處理，首先用相同體積的正己烷萃取，然后得到的水層采用相同體積的乙酸乙酯液離心，離心后得到的水層采用4攝氏度冰箱保存； (3)樣品的濃縮 以80%的硫酸銨沉淀，慢慢的加入硫酸銨，I號(hào)和2號(hào)液均采取這樣的方式處理，鹽析半個(gè)小時(shí)； (4)樣品的再溶解 鹽析過(guò)的I號(hào)和2號(hào)蛋白液，利用高速離心機(jī)，15000r/min離心，除去上清液，I號(hào)采用磷酸鹽緩沖溶液溶解，2號(hào)采用乙酸銨緩沖溶液溶解,溶解液備用； (5)樣品溶液除菌 在無(wú)菌操作臺(tái)下，用可以滅菌的0.22um的濾膜，用無(wú)菌的注射器，吸取I號(hào)和2號(hào)溶液，過(guò)濾膜，得到樣品無(wú)菌液。
【文檔編號(hào)】A61K38/00GK103948632SQ201410190050
【公開(kāi)日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月7日
【發(fā)明者】張國(guó)剛 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)藥科大學(xué)