一種制備重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的方法

一種制備重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種制備重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的方法，并進(jìn)一步提供了相關(guān)重組表達(dá)載體。本發(fā)明提供一種重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含有P1蛋白表達(dá)盒和3C蛋白表達(dá)盒，所述P1蛋白表達(dá)盒和3C蛋白表達(dá)盒位于同一個(gè)重組表達(dá)載體中或分別位于兩個(gè)重組表達(dá)載體中。本發(fā)明方法獲得的病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)上類似于脊髓灰質(zhì)炎病毒，可用作疫苗抗原，該抗原由多個(gè)單體構(gòu)成，分子量巨大，在電鏡下可觀察到顆粒狀重復(fù)性結(jié)構(gòu)，具有較強(qiáng)的免疫原性。
【專利說(shuō)明】一種制備重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種制備重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的方法，并進(jìn)一步提供了相關(guān)重組表達(dá)載體。
【背景技術(shù)】
[0002]脊髓灰質(zhì)炎(Poliomyelitis)是由脊髓灰質(zhì)炎病毒(Poliovirus)感染所引起的以肢體麻痹為主的急性腸道傳染病，主要通過(guò)糞-口傳播，影響五歲以下的兒童，俗稱小兒麻痹癥，發(fā)生麻痹癥的兒童多數(shù)留下跛行、終身致殘。目前脊髓灰質(zhì)炎無(wú)特效治療方法，只能以疫苗作為預(yù)防。
[0003]脊髓灰質(zhì)炎病毒屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬(Enteroviruse),內(nèi)含單股正鏈RNA基因，蛋白衣殼為二十面體立體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，無(wú)包膜。脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組RNA長(zhǎng)約7.5kb?；蚪M分為5’端非編碼區(qū)、多聚蛋白編碼區(qū)、3’端非編碼區(qū)和3’端Poly(A)尾四部分。其中多聚蛋白編碼區(qū)編碼產(chǎn)生一個(gè)多聚蛋白前體，分為P1、P2和P3區(qū)；P1區(qū)可經(jīng)蛋白酶水解產(chǎn)生衣殼蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，P2和P3區(qū)則可水解產(chǎn)生蛋白酶、RNA復(fù)制酶及用于識(shí)別細(xì)胞、調(diào)芐基因的其他蛋白。5個(gè)拷貝的VP1、VP2、VP3和VP4構(gòu)成了五聚體，12個(gè)五聚體構(gòu)成二十面體核殼。脊髓灰質(zhì)炎病毒有三個(gè)血清型，即1、I1、III型，各型之間無(wú)交叉免疫反應(yīng)。
[0004]口服脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗(oral polio vaccine, 0PV)在1958年研制成功在美國(guó)上市，后來(lái)推廣至全球。OPV的優(yōu)點(diǎn)包括接種簡(jiǎn)單(口服)、費(fèi)用低、可產(chǎn)生穩(wěn)定的腸道粘膜免疫、有效阻斷脊灰病毒傳播等。但隨著全世界消滅脊灰目標(biāo)的推進(jìn)，生物安全在遏制脊灰病毒傳播中的作用越來(lái)越重要。服用OPV后產(chǎn)生的疫苗相關(guān)麻痹型脊灰(Vaccine associated paralytic poliomyelitis, VAPP)病例，疫苗衍生脊灰病毒(Vaccine-derived poliovirus, VDPV)及其所引起的疫苗衍生脊灰病毒的循環(huán)(Circulating vaccine-derived polioviruses, cVDPVs)和免疫缺陷疫苗衍生脊灰病毒(Immunodeficient related vaccine-derived poliovirus, iVDPV)病例越來(lái)越受到關(guān)注。
[0005]Salk等人研制成功的脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗(Inactivated poliovirus vaccine,IPV)，用于生產(chǎn)的野毒株包括I型Mahoney株、II型MEF株、III型Saukett株。IPV的免疫原性和安全性都很理想，能有效預(yù)防脊灰爆發(fā)。并且IPV不存在引起VAPP、cVDPVs等風(fēng)險(xiǎn)，其群體免疫優(yōu)于0PV。雖然每支IPV的價(jià)格比OPV昂貴，但是考慮到常規(guī)脊灰免疫和加強(qiáng)免疫，現(xiàn)在仍在使用OPV的148個(gè)國(guó)家如果改用IPV免疫接種，也不會(huì)加重財(cái)政負(fù)擔(dān)。
[0006]目前國(guó)際上實(shí)際使用的IPV，都是通過(guò)用甲醛滅活的脊灰野病毒株生產(chǎn)的傳統(tǒng)脊灰滅活疫苗(Conventional inactivated poliovirus vaccine, cIPV)。全球消滅脊髓灰質(zhì)炎病毒后，將會(huì)更加嚴(yán)格管理脊灰野毒株，所以新一代脊髓灰質(zhì)炎疫苗的開發(fā)迫在眉睫。
[0007]很多病毒的病毒結(jié)構(gòu)蛋白重組表達(dá)后可以自發(fā)組裝成病毒樣顆粒，該病毒樣顆粒的抗原性與真病毒沒(méi)有區(qū)別，但缺少病毒核酸因而不具有感染性。病毒樣顆粒已經(jīng)成為開放安全有效的病毒性疾病疫苗的一個(gè)有效策略，因此，針對(duì)脊髓灰質(zhì)炎病毒的病毒樣顆粒有效制備是生產(chǎn)脊灰疫苗的有效途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種制備重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的方法，并進(jìn)一步提供了相關(guān)重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的重組表達(dá)載體，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題。
[0009]為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明第一方面提供一種重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含有Pl蛋白表達(dá)盒和3C蛋白表達(dá)盒，所述Pl蛋白表達(dá)盒和3C蛋白表達(dá)盒位于同一個(gè)重組表達(dá)載體中或分別位于兩個(gè)重組表達(dá)載體中。
[0010]優(yōu)選的，所述Pl蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述3C蛋白氨基酸序列如 SEQ ID NO:2 所示。
[0011]優(yōu)選的，所述Pl蛋白表達(dá)盒中，含有啟動(dòng)子以及受啟動(dòng)子調(diào)控的Pl蛋白的基因表達(dá)序列。Pl蛋白表達(dá)盒能夠表達(dá)Pl蛋白。
[0012]更優(yōu)選的，所述Pl蛋白表達(dá)盒中，Pl蛋白的基因表達(dá)序列如SEQ ID NO:3所示。所述Pl蛋白的基因表達(dá)序列的5’和3’端分別設(shè)有BstBI酶和KpnI酶的限制性酶切位點(diǎn)序列。
[0013]更優(yōu)選的，所述啟動(dòng)子為AOXl啟動(dòng)子(調(diào)控Pl蛋白的基因表達(dá)序列)。AOXl啟動(dòng)子序列具體可參見(jiàn)pPICZA, B, &C Pichia Vectors說(shuō)明書及載體信息(Lifetechnologies,貨號(hào) V190-20)。
[0014]更優(yōu)選的，Pl蛋白表達(dá)盒中，以AOXl (TT)為轉(zhuǎn)錄終止序列。AOXl (TT)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域序列具體可參見(jiàn)pPICZA, B, &C Pichia Vectors說(shuō)明書及載體信息(Lifetechnologies,貨號(hào) V190-20)。
[0015]進(jìn)一步優(yōu)選的，所述Pl蛋白表達(dá)盒中以5’至3’方向包括AOXl啟動(dòng)子、Pl蛋白的基因表達(dá)序列、AOXl (TT)轉(zhuǎn)錄終止序列。
[0016]優(yōu)選的，所述3C蛋白表達(dá)盒中，含有啟動(dòng)子以及受啟動(dòng)子調(diào)控的3C蛋白的基因表達(dá)序列。3C蛋白表達(dá)盒能夠表達(dá)3C蛋白。
[0017]更優(yōu)選的，所述3C蛋白表達(dá)盒中，3C蛋白的基因表達(dá)序列如SEQ ID NO: 4所示。所述3C蛋白的基因表達(dá)序列的5’和3’端分別設(shè)有BstBI酶和KpnI酶的限制性酶切位點(diǎn)序列。
[0018]更優(yōu)選的，所述啟動(dòng)子為截短型AOXl啟動(dòng)子(調(diào)控3C蛋白的基因表達(dá)序列)，所述截短型AOXl啟動(dòng)子的序列如SEQ ID NO:5所示。
[0019]更優(yōu)選的，3C蛋白表達(dá)盒中，以AOXl (TT)為轉(zhuǎn)錄終止序列。
[0020]進(jìn)一步優(yōu)選的，所述3C蛋白表達(dá)盒中以5’至3’方向包括截短型AOXl啟動(dòng)子、3C蛋白的基因表達(dá)序列、AOXl (TT)轉(zhuǎn)錄終止序列。
[0021]優(yōu)選的，所述Pl蛋白表達(dá)盒和3C蛋白表達(dá)盒位于同一個(gè)重組表達(dá)載體中，優(yōu)選為酵母表達(dá)載體。
[0022]當(dāng)PI蛋白表達(dá)盒和3C蛋白表達(dá)盒位于同一個(gè)重組表達(dá)載體中時(shí)，可以以5 ’至3 ’方向先后排列本發(fā)明的Pl蛋白表達(dá)盒和3C蛋白表達(dá)盒，也可以反過(guò)來(lái)排列。[0023]更優(yōu)選的，所述重組表達(dá)載體由Pl蛋白表達(dá)盒和3C蛋白表達(dá)盒插入pPICZB后獲得。
[0024]更優(yōu)選的，Pl蛋白表達(dá)盒和3C蛋白表達(dá)盒替換pPICZB的7-1411堿基。
[0025]進(jìn)一步優(yōu)選的，所述Pl蛋白表達(dá)盒和3C蛋白表達(dá)盒替換pPICZB的7-1411堿基的具體全序列如SEQ ID NO:8所示。所述SEQ ID NO:8中包含有Pl蛋白表達(dá)盒和3C蛋白
表達(dá)盒。
[0026]本發(fā)明第二方面提供所述重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的重組表達(dá)載體的制備方法，通過(guò)構(gòu)建能夠同時(shí)調(diào)控表達(dá)Pl蛋白和3C蛋白的真核表達(dá)載體制備。
[0027]優(yōu)選的，所述重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的重組表達(dá)載體通過(guò)構(gòu)建Pl蛋白受AOXl啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)、并且3C蛋白受截短型AOXl啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)的真核表達(dá)載體制備。
[0028]更優(yōu)選的，所述重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的重組表達(dá)載體是由pPICZB質(zhì)粒改造獲得，其具體的制備方法包括如下步驟:
[0029]DpPICZdA質(zhì)粒的構(gòu)建:構(gòu)建截短型AOXl啟動(dòng)子插入片段SEQ ID NO:5，將截短型AOXl啟動(dòng)子插入片段替換pPICZB中AOXl啟動(dòng)子片段，獲得質(zhì)粒pPICZdA ；
[0030]2)3C-pPICZdA質(zhì)粒的構(gòu)建:將3C蛋白的基因表達(dá)序列SEQ ID NO:4插入pPICZdA的多克隆位點(diǎn)，獲得3C-pPICZdA ；3C-pPICZdA中含有3C表達(dá)盒； [0031]3) Pl-pPICZ質(zhì)粒的構(gòu)建:將Pl蛋白的基因表達(dá)序列SEQ ID NO:3插入pPICZ的多克隆位點(diǎn)，獲得Pl-pPICZ ；
[0032]4)P13C_pPICZ質(zhì)粒的構(gòu)建:酶聯(lián)合處理P1-pPICZ得到Pl表達(dá)盒，并將Pl表達(dá)盒插入3C-pPICZdA，獲得P13C-pPICZ，插入位置位于3C表達(dá)盒之前或之后。
[0033]更優(yōu)選的，所述步驟I中，pPICZdA質(zhì)粒的構(gòu)建方法具體為:構(gòu)建左右兩端分別為BglII限制性酶切位點(diǎn)和BstBI限制性酶切位點(diǎn)，中間含有截短型AOXl啟動(dòng)子SEQ ID NO:5的截短型AOXl啟動(dòng)子插入片段；然后將BglII與BstBI聯(lián)合酶切處理截短型AOXl啟動(dòng)子插入片段和PPICZB，兩者連接后獲得質(zhì)粒pPICZdA。
[0034]更優(yōu)選的，所述步驟2中，3C_pPICZdA質(zhì)粒的構(gòu)建方法具體為酶和KpnI酶聯(lián)合處理3C蛋白的基因表達(dá)序列SEQ ID N0:4與pPICZdA，兩者連接后獲得3C-pPICZdA。
[0035]更優(yōu)選的，所述步驟3中，Pl-pPICZ質(zhì)粒的構(gòu)建方法具體為酶和KpnI酶聯(lián)合處理Pl蛋白的基因表達(dá)序列SEQ ID NO:3與pPICZ，兩者連接后獲得Pl-pPICZ。
[0036]更優(yōu)選的，所述步驟4中，P13C-pPICZ質(zhì)粒的構(gòu)建方法具體為=BamHI酶BglII酶聯(lián)合處理Pl-pPICZ得到Pl表達(dá)盒，再使用BamHI酶處理3C_pPICZdA，將酶處理后的3C-pPICZdA與Pl表達(dá)盒連接后獲得P13C-pPICZ。
[0037]進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟4中，在將酶處理后的3C_pPICZdA與Pl表達(dá)盒連接之前，還使用堿性磷酸酶處理使用BamHI酶處理3C_pPICZdA所得的產(chǎn)物。
[0038]本發(fā)明第三方面公開了一種重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的工程菌，為包含有所述重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的重組表達(dá)載體的重組工程菌。
[0039]優(yōu)選的，所述重組工程菌為酵母菌。
[0040]更優(yōu)選的，所述酵母菌選自釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)、脆壁克魯維氏酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克魯維氏酵母(Kluyveromyces Iactis),以及栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中的一種或多種的組合。
[0041]本發(fā)明第四方面提供一種制備重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的方法，包括如下步驟:
[0042]I)將所述重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，得到表達(dá)Pl基因和3C基因的重組酵母細(xì)胞；
[0043]2)使用步驟I所得的重組酵母細(xì)胞，通過(guò)酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)Pl和3C，純化后即獲得脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒。
[0044]本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，對(duì)步驟I所得的重組酵母細(xì)胞進(jìn)行篩選，并在篩選后對(duì)菌種進(jìn)行活化。
[0045]優(yōu)選的，所述篩選的具體步驟為:將菌液涂布YPD平板(Zeocin)，30°C過(guò)夜培養(yǎng)后挑取部分克隆劃線YB)平板(Zeocin)，30°C倒置培養(yǎng)2-3天，挑取生長(zhǎng)情況較好的一株作為發(fā)酵菌種。
[0046]優(yōu)選的，所述活化的具體步驟為:在恒溫振蕩培養(yǎng)器內(nèi)30°C振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基，測(cè)得活化液的0D_在1~2的范圍時(shí)停止培養(yǎng)，鏡檢無(wú)雜菌后將活化液轉(zhuǎn)接入YPD種子培養(yǎng)基,在恒溫振蕩培養(yǎng)器內(nèi)30°C培養(yǎng)過(guò)夜即得活化的種子培養(yǎng)液。
[0047]優(yōu)選的，所述酵母選自釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)、脆壁克魯維氏酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克魯維氏酵母(Kluyveromyces lactis),以及栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中的一種或多種的選擇。
[0048]本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，使用所述重組酵母細(xì)胞，采用適當(dāng)?shù)慕湍副磉_(dá)系統(tǒng)表達(dá)Pl和3C。
[0049]采用BSM培養(yǎng)基，初始溫度設(shè)定為30°C，初始pH5~6，DO值100%，添加PTMl痕量鹽類，初始增殖階段培養(yǎng)20~24小時(shí)，溶氧值20~40%，當(dāng)菌體濕重達(dá)到約60~90g/L時(shí)，補(bǔ)加甘油，維持溶氧值20~40%，補(bǔ)加4~8小時(shí)，檢測(cè)菌體濕重增加到100~200g/L時(shí)，停止補(bǔ)料；維持溶氧值高于20~40%，將溫度設(shè)定在30°C，pH值控制調(diào)為6±0.05，開始加入甲醇誘導(dǎo)，甲醇的補(bǔ)加速度為50~100mL/min，誘導(dǎo)40小時(shí)發(fā)酵結(jié)束。
[0050]優(yōu)選的，所述純化的具體方法為:對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行固液分離后棄上清，收集菌泥；將菌泥加入破菌用緩沖溶液，充分?jǐn)嚢韬螳@得菌體混懸液，高壓破碎菌體混懸液獲得破菌液；將破菌液離心分離，收集上清液并在上清液中加入固體硫酸銨(終濃度為
16.4g-22.6g/100ml)至飽和度為30~40%,放置過(guò)夜后,再次離心分離,棄去上清保留沉淀物；再加入緩沖溶液后充分?jǐn)嚢?，離心分離并收集離心上清樣品；密度梯度離心，收集所需梯度樣品并進(jìn)行膜過(guò)濾，即得純化的病毒樣顆粒蛋白樣品。
[0051]本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)判斷密度梯度離心時(shí)，目標(biāo)樣品所在的梯度。
[0052]更優(yōu)選的，所述密度梯度離心使用的介質(zhì)為蔗糖。
[0053]進(jìn)一步優(yōu)選的，所述密度梯度離心的具體方法為:在離心管內(nèi)由下至上依次緩慢加入60 %蔗糖溶液，50 %蔗糖溶液，40 %蔗糖溶液，30 %蔗糖溶液，所述離心上清樣品，液體石蠟，離心后收集50-60%蔗糖梯度中的樣品。
[0054]本發(fā)明第五方面提供所述重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的重組表達(dá)載體、工程菌，以及制備重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的方法在脊髓灰質(zhì)炎疫苗制備領(lǐng)域中的用途。[0055]本發(fā)明根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛(ài)性合成編碼Pl和3C蛋白的DNA序列，合成所得的兩條基因連接到畢赤酵母表達(dá)載體上，得到同時(shí)表達(dá)Pl前體蛋白和3C蛋白酶的雙表達(dá)質(zhì)粒(非分泌表達(dá)質(zhì)粒)。重組質(zhì)粒通過(guò)基因工程方法整合到畢赤酵母基因組中，經(jīng)大規(guī)模篩選得到高表達(dá)菌株，以此重組表達(dá)菌株為種子，發(fā)酵表達(dá)得到Pl和3C蛋白。3C酶在酵母細(xì)胞內(nèi)部將Pl前體蛋白裂解為VP1、VP3和VP0，三種衣殼蛋白亞基自組裝成為病毒樣顆粒(VLPs)。通過(guò)柱層析等純化方法獲得高純度、形態(tài)均一、性狀穩(wěn)定的VLPs，純化后的VLPs吸附適當(dāng)?shù)淖魟?如鋁佐劑)成為重組疫苗制劑。經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證含有本發(fā)明方法制備的脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的重組疫苗制劑具有較好的免疫原性。
[0056]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明通過(guò)使用不同的啟動(dòng)子，調(diào)節(jié)病毒衣殼蛋白Pl與蛋白酶3C的表達(dá)量，調(diào)控病毒樣顆粒前體蛋白Pl的剪切，從而獲得形態(tài)均一的病毒樣顆粒。本發(fā)明方法獲得的病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)上類似于脊髓灰質(zhì)炎病毒，可用作疫苗抗原，該抗原由多個(gè)單體構(gòu)成，分子量巨大，在電鏡下可觀察到顆粒狀重復(fù)性結(jié)構(gòu)，具有較強(qiáng)的免疫原性(0.01yg劑量的免疫組即有一定陽(yáng)轉(zhuǎn)率，而0.1 μ g劑量的免疫組小鼠陽(yáng)轉(zhuǎn)率即可達(dá)到83.3% );并且，本發(fā)明制備的疫苗抗原不含有病毒的遺傳物質(zhì)，不會(huì)有潛在的感染可能性，是更合適的疫苗候選抗原。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0057]圖1:P13C_pPICZdual 質(zhì)粒圖譜。
[0058]圖2:P13C-pPICZdual 酶切鑒定圖:
[0059]泳道1:Pl3C_pPICZdual 質(zhì)粒(未酶切);
[0060]泳道2:P13C-pPICZdual 質(zhì)粒(Bglll+SacI)；
[0061]泳道3:250bp DNA ladder (TAKARA)。
[0062]圖3:重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒Western-Blot檢測(cè)結(jié)果:
[0063]泳道1:X-33空宿主菌誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果；
[0064]泳道2:標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量Marker ；
[0065]泳道3:P13C-X33誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果。
[0066]圖4:重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒電鏡觀察(30000倍)。
【具體實(shí)施方式】
[0067]以下通過(guò)特定的具體實(shí)例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說(shuō)明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過(guò)另外不同的【具體實(shí)施方式】加以實(shí)施或應(yīng)用，本說(shuō)明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒(méi)有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。
[0068]在進(jìn)一步描述本發(fā)明【具體實(shí)施方式】之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語(yǔ)是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍；在本發(fā)明說(shuō)明書和權(quán)利要求書中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一”和“這個(gè)”包括復(fù)數(shù)形式。
[0069]當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說(shuō)明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本【技術(shù)領(lǐng)域】技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。
[0070]除非另外說(shuō)明，本發(fā)明中所公開的實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)方法、制備方法均采用本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說(shuō)明，具體可參見(jiàn)SambiOOk等 MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring HarborLaboratory Press,1989and Third edition, 2001 ；Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY,John ffiley&Sons,New York,1987and periodic updates ；the seriesMETHODS IN ENZYM0L0GY,Academic Press,San Diego ；ffolffe,CHROMATIN STRUCTURE ANDFUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998 ；METH0DS IN ENZYM0L0GY,Vol.304,Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.ffolffe,eds.),Academic Press,San Diego,1999 ;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker,ed.)Humana Press, Totowa, 1999 等。
[0071]實(shí)施例1病毒顆粒的制備
[0072]1.表達(dá)基因的選擇與密碼子的優(yōu)化設(shè)計(jì)
[0073]編碼脊髓灰質(zhì)炎I型Mahoney株P(guān)l蛋白與3C蛋白的DNA序列參照GeneBank:V01149.1，P1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，3C蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0074]對(duì)I型Mahoney株中編碼SEQ ID NO:1所示Pl蛋白和SEQ ID N0:2所示3C蛋白的野生型DNA序列進(jìn)行改造，密碼子盡可能采用畢赤酵母中使用頻率較高的密碼子，同時(shí)避免了可能影響表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)、重復(fù)序列和RNA高級(jí)結(jié)構(gòu)。密碼子優(yōu)化后得到編碼Pl蛋白的重組基因序列如SEQ ID NO:3所示，編碼3C蛋白的重組基因序列如SEQ IDNO:4所示。
[0075]2.P13C-pPICZdual重組表達(dá)載體的構(gòu)建
[0076]設(shè)計(jì)5’端和3’端分別含有BstBI酶切位點(diǎn)和KpnI酶切位點(diǎn)的Pl蛋白表達(dá)序列并進(jìn)行全基因合成，獲得SEQ ID N0:3所示序列的核苷酸片段；設(shè)計(jì)5’端和3’端別含有BstBI酶切位點(diǎn)和KpnI酶切位點(diǎn)的3C蛋白表達(dá)序列并進(jìn)行全基因合成，獲得SEQ ID NO:4所示序列的核苷酸片段。P13C_pPICZdual質(zhì)粒改造自pPICZ質(zhì)粒(Life Technologies),簡(jiǎn)述如下:
[0077] 采用SEQ ID NO:6_7所示序列的引物從pPICZB質(zhì)粒中擴(kuò)增得到截短型AOXl啟動(dòng)子插入片段。Bglll+BstBI聯(lián)合酶切處理截短型AOXl啟動(dòng)子(SEQ ID NO:5)插入片段和pPICZB，兩片段連接后得到pPICZdA。采用BstBI酶和KpnI酶的混合酶酶切處理Pl蛋白表達(dá)序列(SEQ ID NO:3)與pPICZB質(zhì)粒，兩片段連接后得到Pl-pPICZ。采用BstBI酶和KpnI酶的混合酶酶切3C蛋白表達(dá)序列與pPICZdA質(zhì)粒，兩片段連接后得到3C-pPICZdA。采用BglII酶和BamHI酶的混合酶酶切Pl-pPICZ質(zhì)粒，BamHI酶酶切3C_pPICZdA，再用堿性磷酸酶(BamHI+Bglll酶切使用的buffer3即堿性磷酸酶最適反應(yīng)buffer,無(wú)需更換或添加其他緩沖液)處理3C-pPICZdA，兩片段連接后得到P13C-pPICZdual (圖1)。P13C_pPICZdual酶切鑒定圖如圖2所示。
[0078]引物1:5’ -CCCCAGATCTCATTCCAATTCCTTCT-3，(SEQ ID NO:6)
[0079]引物2:5，-GGCCCCGTTTCGAATAATTAGTTG-3，(SEQ ID NO:7)
[0080]3.P13C-pPICZdual重組表達(dá)菌株構(gòu)建
[0081]畢赤酵母菌株X33購(gòu)自Life Technologies。將重組構(gòu)建的P13C_pPICZdual質(zhì)粒由SacI酶線性化，電轉(zhuǎn)畢赤酵母，電轉(zhuǎn)條件為1500V，120 Ω, 50 μ F0電轉(zhuǎn)后菌液涂布YPD平板(200μ g/mlZeocin)，3(TC過(guò)夜倒置培養(yǎng)。挑取部分克隆劃線YPD平板(1500μ g/mlZeocin)，30°C倒置培養(yǎng)2_3天，挑取生長(zhǎng)情況較好的一株作為發(fā)酵菌種，命名為P13C-X33。
[0082]4.重組蛋白的發(fā)酵罐培養(yǎng)
[0083]采用YH)培養(yǎng)基對(duì)重組表達(dá)菌株P(guān)13C-X33進(jìn)行活化，在恒溫振蕩培養(yǎng)器內(nèi)200rpm，30°C培養(yǎng)過(guò)夜，振蕩培養(yǎng)20小時(shí)左右測(cè)得活化液的OD6tltl在I~2的范圍，停止培養(yǎng)。
[0084]鏡檢無(wú)雜菌后取Iml活化液轉(zhuǎn)接入500ml種子培養(yǎng)基(YPD)，在恒溫振蕩培養(yǎng)器內(nèi)以200rpm，30°C培養(yǎng)過(guò)夜。鏡檢無(wú)雜菌后按1:15接種發(fā)酵罐。
[0085]使用BIOENGINEERING RALF Basic發(fā)酵罐，發(fā)酵采用基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基BSM。發(fā)酵初始溫度設(shè)定為30°C，初始pH5~6，轉(zhuǎn)速300rpm，通氣量0.5vvm, DO值100%，添加PTMl痕量鹽類(PTM1母液配方:硫酸銅0.6 %，碘化鈉0.008 %，硫酸錳0.3 %，鑰酸鈉0.02 %，硼酸0.002 %，氯化鈷0.12%，硫酸鐵6.5%，氯化鋅2.0%，硫酸0.5%，生物素0.02% (質(zhì)量體積比)，發(fā)酵中PTMl母液濃度為12ml/L)。初始增殖階段培養(yǎng)20~24小時(shí)左右，通過(guò)調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速、空氣流量、罐壓和補(bǔ)加純氧維持溶氧值20~40%。當(dāng)菌體濕重達(dá)到約60~90g/L時(shí)，補(bǔ)加50%甘油溶液(質(zhì)量百分比濃度)200-300克。維持溶氧值20~40%，補(bǔ)加4~8小時(shí)。檢測(cè)菌體濕重增加到100~200g/L時(shí)，停止補(bǔ)料。將溫度設(shè)定在30°C，pH值控制調(diào)為6±0.05,開始加入甲醇誘導(dǎo)，甲醇的補(bǔ)加速度為50~100mL/min。維持溶氧值高于20~40%，溫度設(shè)定在30°C，pH值控制為6±0.05，誘導(dǎo)40小時(shí)發(fā)酵結(jié)束。
[0086]采用冷凍離心機(jī)對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行固液分離，離心轉(zhuǎn)速8000rpm，離心10分鐘。離心結(jié)束后棄上清，收集菌泥 ，收獲的菌泥放在_20°C冰箱內(nèi)凍存。
[0087]5.病毒樣顆粒純化
[0088]取200g發(fā)酵菌體，加入4°C預(yù)冷的破菌用緩沖溶液(50mM ΡΒ,Ο.2Μ NaCl,0.5%Tween-80,pH7.0) 800ml,于磁力攪拌器上攪拌至完全混勻，獲得菌體混懸液。采用高壓均質(zhì)機(jī)(ATS AH-100B)高壓破碎制備的菌體混懸液，調(diào)節(jié)均質(zhì)閥，控制破菌壓力為1200bar。重復(fù)以上高壓破碎過(guò)程3~4次，收集破菌液。
[0089]采用高速冷凍離心機(jī)(ThermoFisher lynx4000)離心澄清破菌液，設(shè)定條件1000Orpm, 30min,8°C，離心分離，收集離心后的上清液。上清液中加入固體硫酸銨(終濃度為 16.4g-22.6g/100ml)至飽和度為 30 ~40%，4°C放置過(guò)夜后，按 10000rpm、30min、8°C條件第二次離心分離，棄去上清保留沉淀物，加入緩沖溶液(50mM PB pH7.0) 100ml，攪拌2~4h。最后再次按10000rpm、30min、8°C條件離心分離,保留上清用于下一步的分離。
[0090]在離心管中由下至上依次緩慢加入60%蔗糖溶液1ml，50%蔗糖溶液1ml，40%蔗糖溶液1ml，30%蔗糖溶液1ml，上述離心上清樣品0.5ml，液體石蠟0.5ml。使用BeckmanCoulter Optima Max臺(tái)式超速離心機(jī)，MLS-50轉(zhuǎn)子,在4°C，40000rpm離心4小時(shí)。收集50% -60%蔗糖梯度中樣品，用100KD超濾管(Millipore公司)去除蔗糖并濃縮20倍，用
0.45um膜過(guò)濾，即得純化的病毒樣顆粒蛋白樣品。
[0091]6.病毒樣顆粒性質(zhì)鑒定
[0092]純化的病毒樣顆粒蛋白樣品經(jīng)過(guò)Western-blot檢測(cè)，可與脊髓灰質(zhì)炎病毒VPl的多克隆抗體(本實(shí)施例多抗采用CalBioreagents公司產(chǎn)品,貨號(hào)P046, 二抗采用北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)SH-0071辣根酶標(biāo)記兔抗山羊IgG)呈特異性的顯色反應(yīng)(圖
3)。純化的病毒樣顆粒蛋白樣品，加入20g/L磷酸鶴染液染色0.5-1分鐘，自然晾干后電鏡觀察，電鏡(Philips)觀察呈現(xiàn)病毒樣顆粒(圖4)。 [0093]實(shí)施例2病毒顆粒的抗原性能檢測(cè)
[0094]1.病毒樣顆粒疫苗制備
[0095]將純化獲得的脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒蛋白吸附鋁佐劑(50μ g蛋白:500μ g，鋁佐劑)，制備獲得具有免疫原性的脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗。
[0096]2.脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒免疫原性的測(cè)定
[0097]選取6~8周齡的SPF級(jí)BALB/c小鼠，分為4組，每組6只小鼠。其中I組小鼠用含有鋁佐劑的緩沖液(50mM PB pH7.0)進(jìn)行免疫(作為陰性對(duì)照組)，其它3組每次免疫劑量為I μ g/只、0.1 μ g/只、0.01 μ g/只(此處免疫劑量是指病毒樣顆粒蛋白量的質(zhì)量)，分別于第O、14天皮下注射免疫，共免疫兩次，第二次免疫后兩周采血。將采集得到的血液于4°C放置過(guò)夜后，5000g離心10min，吸取上清，即得到鼠多抗血清，于_20°C存放，并檢測(cè)該鼠多抗血清的陽(yáng)轉(zhuǎn)率，具體方法如下:
[0098]用包被液(0.1M pH9.8NaHC03)稀釋純化的脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒蛋白至I μ g/ml,向酶標(biāo)板每個(gè)孔中各加0.lml，4°C包被過(guò)夜。除去包被液，洗板。每孔加入0.3ml封閉液(5%脫脂奶粉+PBST)于37°C保溫2小時(shí)。除去包被液，每孔加入用稀釋緩沖液(2%脫脂奶粉+PBST)以1:1000稀釋的被檢血清各0.1ml，于37°C保溫I小時(shí)，除去血清液，洗板。然后向每孔加入用稀釋緩沖液(2%脫脂奶粉+PBST)以1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(鼎國(guó)，貨號(hào)SH-0011辣根酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG)各0.lml，37°C保溫0.5小時(shí)后除去酶標(biāo)液，洗板；然后向每孔中加入0.1ml DAB顯色液,室溫避光作用10分鐘后加2MH2SO40.05ml終止液終止反應(yīng)，并用酶標(biāo)比色儀測(cè)定OD45tl值，三個(gè)檢測(cè)組的陽(yáng)轉(zhuǎn)率結(jié)果如表I所示。Cutoff值為陰性對(duì)照被檢血清抗體的OD45tl值的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差，OD45tl值大于Cutoff值的小鼠判定為陽(yáng)性，OD450值小于Cutoff值的小鼠判定為陰性。
[0099]表1脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒陽(yáng)轉(zhuǎn)率結(jié)果
[0100]
【權(quán)利要求】
1.一種重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含有Pl蛋白表達(dá)盒和3C蛋白表達(dá)盒，所述Pl蛋白表達(dá)盒和3C蛋白表達(dá)盒位于同一個(gè)重組表達(dá)載體中或分別位于兩個(gè)重組表達(dá)載體中。
2.如權(quán)利要求1所述的一種重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述Pl蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述3C蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.如權(quán)利要求1所述的一種重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述Pl蛋白表達(dá)盒中，含有啟動(dòng)子以及受啟動(dòng)子調(diào)控的Pi蛋白的基因表達(dá)序列。
4.如權(quán)利要求3所述的一種重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述Pl蛋白表達(dá)盒中，Pl蛋白的基因表達(dá)序列如SEQ ID NO:3所示，所述啟動(dòng)子為AOXl啟動(dòng)子，以AOXl (TT)為轉(zhuǎn)錄終止序列。
5.如權(quán)利要求4所述的一種重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述Pl蛋白表達(dá)盒中以5’至3’方向包括AOXl啟動(dòng)子、Pl蛋白的基因表達(dá)序列、AOXl(TT)轉(zhuǎn)錄終止序列。
6.如權(quán)利要求1所述的一種重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述3C蛋白表達(dá)盒中，含有啟動(dòng)子以及受啟動(dòng)子調(diào)控的3C蛋白的基因表達(dá)序列。
7.如權(quán)利要求6所述的一種重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述3C蛋白表達(dá)盒中，3C蛋白的基因表達(dá)序列如SEQ ID NO:4所示，所述啟動(dòng)子為截短型AOXl啟動(dòng)子，所述截短型AOXl啟動(dòng)子的序列如SEQ ID NO:5所示，以AOXl (TT)為轉(zhuǎn)錄終止序列。
8.如權(quán)利要求7所述的一種重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述3C蛋白表達(dá)盒中以5’至3’方向包括截短型AOXl啟動(dòng)子、3C蛋白的基因表達(dá)序列、AOXl (TT)轉(zhuǎn)錄終止序列。
9.如權(quán)利要求1所述的一種重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述PI蛋白表達(dá)盒和3C蛋白表達(dá)盒位于同一個(gè)酵母表達(dá)載體中，所述重組表達(dá)載體由Pl蛋白表達(dá)盒和3C蛋白表達(dá)盒插入pPICZB后獲得。
10.如權(quán)利要求9所述的一種重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的重組表達(dá)載體，其特征在于，Pl蛋白表達(dá)盒和3C蛋白表達(dá)盒替換pPICZB的第7-1411堿基。
11.如權(quán)利要求10所述的一種重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述Pl蛋白表達(dá)盒和3C蛋白表達(dá)盒替換pPICZB的第7-1411堿基的具體全序列如SEQID NO:8 所示。
12.如權(quán)利要求1-11任一權(quán)利要求所述的重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的重組表達(dá)載體的制備方法，所述重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的重組表達(dá)載體是由PPICZB質(zhì)粒改造獲得，其具體的制備方法包括如下步驟: DpPICZdA質(zhì)粒的構(gòu)建:構(gòu)建截短型AOXl啟動(dòng)子插入片段SEQ ID NO:5，將截短型AOXl啟動(dòng)子插入片段替換PPICZB中AOXl啟動(dòng)子片段，獲得質(zhì)粒pPICZdA ； 2)3C-pPICZdA質(zhì)粒的構(gòu)建:將3C蛋白的基因表達(dá)序列SEQ ID NO:4插入pPICZdA的多克隆位點(diǎn)，獲得3C-pPICZdA ；3C-pPICZdA中含有3C表達(dá)盒； 3)Pl-pPICZ質(zhì)粒的構(gòu)建:將Pl蛋白的基因表達(dá)序列SEQID NO:3插入pPICZ的多克隆位點(diǎn)，獲得Pl-pPICZ ； 4)P13C-pPICZ質(zhì)粒的構(gòu)建:酶聯(lián)合處理Pl-pPICZ得到Pl表達(dá)盒，并將Pl表達(dá)盒插入3C-pPICZdA,獲得 P13C-pPICZ。
13.如權(quán)利要求12所述的制備方法，其特征在于，所述步驟I中，pPICZdA質(zhì)粒的構(gòu)建方法具體為:構(gòu)建左右兩端分別為BglII限制性酶切位點(diǎn)和BstBI限制性酶切位點(diǎn)，中間含有截短型AOXl啟動(dòng)子SEQ ID NO:5的截短型AOXl啟動(dòng)子插入片段；然后將BglII與BstBI聯(lián)合酶切處理截短型AOXl啟動(dòng)子插入片段和pPICZB，兩者連接后獲得質(zhì)粒pPICZdA。
14.如權(quán)利要求12所述的制備方法，其特征在于，所述步驟2中，3C-pPICZdA質(zhì)粒的構(gòu)建方法具體為:BstBI酶和KpnI酶聯(lián)合處理3C蛋白的基因表達(dá)序列SEQ ID NO:4與pPICZdA，兩者連接后獲得3C-pPICZdA。
15.如權(quán)利要求12所述的制備方法，其特征在于，所述步驟3中，Pl-pPICZ質(zhì)粒的構(gòu)建方法具體為=BstBI酶和KpnI酶聯(lián)合處理Pl蛋白的基因表達(dá)序列SEQ ID NO:3與pPICZ，兩者連接后獲得P1-pPICZ。
16.如權(quán)利要求12所述的制備方法，其特征在于，所述步驟4中，P13C-pPICZ質(zhì)粒的構(gòu)建方法具體為=BamHI酶BglII酶聯(lián)合處理Pl-pPICZ得到Pl表達(dá)盒，再使用BamHI酶處理3C-pPICZdA，將酶處理后的3C-pPICZdA與Pl表達(dá)盒連接后獲得P13C_pPICZ。
17.—種重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的工程菌,為包含有如權(quán)利要求1-11任一權(quán)利要求所述的重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的重組表達(dá)載體的重組工程菌。
18.一種制備重組脊 髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的方法，包括如下步驟: 1)將如權(quán)利要求1-11任一權(quán)利要求所述的重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，得到表達(dá)Pl基因和3C基因的重組酵母細(xì)胞； 2)通過(guò)酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)Pl和3C，獲得脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒。
19.如權(quán)利要求18所述的一種制備重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的方法，其特征在于，所述酵母選自釀酒酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤酵母、脆壁克魯維氏酵母、乳酸克魯維氏酵母，以及栗酒裂殖酵母中的一種或多種的選擇。
20.如權(quán)利要求1-11任一權(quán)利要求所述的重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的重組表達(dá)載體、如權(quán)利要求17所述的工程菌，以及如權(quán)利要求18-19任一權(quán)利要求所述的制備重組脊髓灰質(zhì)炎病毒樣顆粒的方法在脊髓灰質(zhì)炎疫苗制備領(lǐng)域中的用途。
【文檔編號(hào)】A61K39/125GK103993032SQ201410185984
【公開日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年5月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月5日
【發(fā)明者】沈瓊, 傅文彬 申請(qǐng)人:上海博唯生物科技有限公司